与具有顺磁性质的小颗粒相连接的各种化学库
[0001]本申请主张在2005年3月23日递交的美国临时专利申请第60/664,794号，以及同日递交的名为“Method of purifying proteins”(Boschetti and Lomas)的PCT专利申请的权利，其公开内容在此以引用的方式全文引入。
技术领域
[0002]本发明涉及组合化学、蛋白化学和生物化学领域。
背景技术
[0003]分子的大集合(例如库)已逐渐显现成为用于成功鉴别有用的化合物的重要工具。如此的库通常利用此处将进一步描述的组合方法进行合成。组合库是多种含有更小亚单元或单体的化学化合物的集合，例如由氨基酸残基组成的组合肽库或由核苷组成的组合核酸库。组合库拥有不同大小，从数百个至数百万种化学化合物。例如由18种天然氨基酸制备的直线性六肽库含有34×106中不同的化学结构。当还包括氨基酸类似物和异构体时，可能的结构的数目实际上是无限的。所述化学方法也促进了环状肽和支化肽的合成。也有多种库的类型，包括由诸如肽、糖、核酸、寡核苷酸和小有机分子等组成的寡聚库和高聚库。
[0004]通过化学合成(Houghten et al，1991，Nature 354：84-6)或基因表达(Marks et al，1991，JMolBiol 222：581-97)已制得数千个，甚至数百万种的任意寡核苷酸的库，陈列在色谱载体上(Lam et al，1991，Nature354：82-4)、在细菌细胞中(Colas et al，1996，Nature380：548-550)、在细菌纤毛上(Lu，1990，Bio/Technology 13：366-372)或噬菌体中(Smith，1985，Science 228：1315-7)。也已制得蛋白质(Ladner，U.S.Pat.No.4,664,989)、甘氨酸氨基取代的阳离子寡聚合物(peptoids)(Simon et al，1992，尸rocNatl Acad Sci USA 89：9367-71)、核酸(Ellington and Szostak，1990，Nature246：818-22)、糖和小有机分子(Eichler et al，1995，Med Res Rev15：481-96)的库。此外，在固体载体上直接合成了环肽、肽酰胺、肽醛等(Barany etal.，1987，Int.J Peptide Protein Res 30：705-739；Fields et al.，1990，Int.JPeptide Protein Res 35：161-214；Lloyd-Williams et al，1993，Tetrahedron49：11065-11133；Wang，1973，JAmer Chem Soc 95：1328；Barlos et al，1989，Tetrahedron Letters 30：3947；Beebe et al，1995，J Org Chem 60：4204；Rink，1987，Tetrahedron Letters 28：3787；Rapp et al，in″Peptides 1988″，Proc.20th European Peptide Symposium，Jung G.and Boyer E.(Eds.)，Walker deGruyter，Berlin，pp 199 1989]。
[0005]为制备组合库，将固体载体(树脂)与一种以上的化合物亚单元以及与一种以上的试剂在仔细控制，预定顺序的化学反应中反应。换言之，所述库亚单元在固体载体上“生长”。固体载体通常是表面经功能化能连接亚单元或单体形成所述库的化合物的聚合物体。一个库的合成通常涉及大量的固体载体。在本领域中已知的固体载体包括除别的以外的聚苯乙烯树脂小珠、棉线和聚四氟乙烯(“PTFE”)的膜片材。
[0006]组合库拥有多种用途，例如鉴别和表征化配体，所述配体能结合受体分子或者能介导所关心的生物活性(Scott and Smith，1990，Science 249：386-390；Salmon et al，1993，Proc Natl Acad Sci USA90：11708-11712；)；结合抗肽抗体(Fodor et al，1991，Science 251：767-773；Needles et al，1993，Proc NatlAcad Sci USA 90：10700-10704；Valadon etal，1996，JMol Biol 261：11-22)；进行筛选以与多种靶结合，所述靶包括细胞蛋白(Schmitz et al，1996，JMol Biol 260：664-677)、病毒蛋白(Hongand Boulanger，1995，EMBO J 14：4714-4727)、细菌蛋白(Jacobsson andFrykberg，1995，Biotechniques 18：878-885)、核酸(Cheng et al，1996，Gene171：1-8)、塑料(Siani et al，1994，J Chem InfComput Sci34：588-593)和具有生物功能的分子(Hammon et al.，U.S.patent application No.2004/0101830)。
[0007]大配体库的另一重要用途是在蛋白质组学中，更具体而言，用于减小在复杂生物混合物如血清中分析物的浓度范围。该方法也被称作“均衡”，涉及将固相固定的配体库暴露于来自样品的蛋白质。当使用大库时，样品中的大多数或者所有蛋白质被所述库中至少一种独特的配体结合。通过限制所使用的库的大小，即配体的总实际数目，含量丰富的蛋白质将使其配体饱和，而稀有蛋白质则不能。将没有足够的配体与之结合的蛋白质冲洗掉，被保留的蛋白质具有被压缩的浓度范围-最丰富的蛋白质的相对量与所述稀有的蛋白质的相对量相近。该方法例如在EP 1 580 559 A1(Boschetti)中得以描述。在实施该方法时，当将被“均衡”的样品仅能少量提供时，小体积的配体库是有用的。
发明内容
[0008]本发明的一个目的是提供一种解决方法以解决在对于复杂蛋白质化合物的分析和纯化蛋白质有用的“等分-偶联-重组”(split-couple-and-recombine)组合化学合成中对非常小的颗粒的操作问题。在本发明的一个方面，一种方法涉及提供具有顺磁性质的小颗粒，在其上将进行所述“等分-偶联-重组”组合化学合成，并通过磁力例如使用磁体对所述颗粒进行操作。
[0009]在本发明的优选实施方式中，提供了制备与颗粒相连的各种化学结构的组合库的方法。该方法包括利用具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒集合和大量不同的化学部分进行多次循环的“等分-偶联-重组”化学合成的步骤，其中每次“等分-偶联-重组”化学合成循环加入一种化学部分到化学结构中，并涉及对所述具有顺磁性质的颗粒的磁性操作，以及其中循环数足以建立具有至少100,000种独特的化学结构的库。
[0010]在某个实施方式中，所述具有顺磁性质的颗粒具有约300nm～约5μm或者1μm～3μm的直径。
[0011]许多化学结构可用于实施本发明的方法和制备本发明的组合物。优选的化学结构是肽、寡核苷酸、寡糖或合成有机分子。
[0012]所述库拥有多种多样的大量独特的化学结构。优选为本发明的库拥有至少1百万种独特的化学结构的多样性，还更优选为所述库具有其中拥有至少100,000,000种化学结构的大小。
[0013]在化学结构是肽的实施方式中，所述库拥有至少3百万种独特的肽的多样性，优选为至少6千4百万种独特的肽。
[0014]优选的的是基本含有组合库的所有成员的库。
[0015]采用具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒，在优选实施方式中，库尤其是肽库少于约100微升。
[0016]具有顺磁性质的颗粒可以按不同方法制造。在一个实施方式中，所述具有顺磁性质的颗粒包含其中嵌有顺磁材料的聚合物材料。所述具有顺磁性质的颗粒也可包含多孔颗粒，其中所述顺磁材料容纳在这些颗粒的孔中。
[0017]在本发明的其他方面，提供了与具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒的集合相连的各种化学结构的库。所述化学结构包括大量不同的化学部分，并且与每个个别的具有顺磁性质的颗粒相连的化学结构基本上具有相同的结构，以及所述库拥有至少100,000种独特的化学结构的多样性(a diversity of at least 100,000 unique chemicalstructures)。
[0018]在优选实施方式中，所述颗粒基本是单分散的，所述化学结构是肽，并且所述库拥有多种多样的(a diversity of)至少300,000种独特的肽。还优选的是拥有多种多样的至少3,000,000种独特的肽，优选为多种多样的至少30,000,000种独特的肽，更优选为多种多样的至少64,000,000种独特的肽，甚至更优选为多种多样的至少100,000,000种独特的肽。优选的库是基本包含所述组合库的所有成员的库。
[0019]所述颗粒可含有多种交联合成聚合物或天然聚合物。优选的是其中交联合成聚合物或天然聚合物是聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚氨酯或聚糖的颗粒。
[0020]在本发明的另一方面，提供了与具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒的集合相连的各种化学结构的库，其中所述化学结构包括大量不同的化学部分，所述库拥有多种多样的至少100,000种独特的化学结构，并且各个具体的微粒与各种化学结构中的大部分相连。
[0021]本发明还提供了试剂盒。优选的本发明的试剂盒含有本发明的库。例如，本发明的试剂盒可用于减小在混合物中分析物的浓度范围，用于检测混合物中的分析物或用于纯化蛋白质。因此，所述试剂盒附有一份或者多份使用说明用于使用所述库减小在混合物中分析物的浓度范围，用于检测混合物中的分析物或用于纯化蛋白质。可选的是，试剂盒也包括盛有缓冲液的容器。其他的本发明的试剂盒的实施方式包括可选的功能性成分使得本领域普通技术人员能实施此处描述的任何方法变化。
[0022]本发明的组合物可用于实施许多不同的方法。本发明的组合物的优选用途是用于减小在混合物中分析物的浓度范围的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供第一样品，所述第一样品含有以第一浓度范围存在于所述第一样品中的大量不同的分析物物种(analyte species)；(b)将所述第一样品与一定量的与具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒的集合相连的各种化学结构的库相接触，其中所述化学结构包括大量不同的化学部分，并且与每个个别的具有顺磁性质的颗粒相连的化学结构基本上具有相同的结构，以及所述库拥有多种多样的至少100,000种独特的化学结构；(c)利用所述不同的化学结构从所述第一样品中俘获一定量的不同分析物物种并除去未结合的分析物物种；以及(d)将俘获的分析物物种与所述化学结构分离以制备第二样品，所述第二样品含有以第二浓度范围存在于所述第二样品中的大量不同的分析物物种；其中所述库的量经选择以俘获一定量的不同分析物物种从而使所述第二浓度范围小于所述第一浓度范围。
[0023]在该方法的一个方面，所述俘获的分析物物种的分离包括逐步洗脱以制备大量等分试样。
[0024]可选的是，该方法包括检测所述已分离的分析物的步骤。检测可由质谱或电泳完成。
[0025]在优选实施方式中，分离所述俘获的分析物包括将分析物从所述颗粒上洗脱至具有吸附表面的生物芯片上，其中所述吸附表面结合来自洗出液的分析物。
[0026]在本发明的还一个方面，提供了一种检测混合物中的分析物的方法。在优选实施方式中，该方法包括以下步骤：(a)提供第一样品，所述第一样品含有以第一浓度范围存在于所述第一样品中的大量不同的分析物物种；(b)将所述第一样品与一定量的与具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒的集合相连的各种化学结构的库相接触，其中所述化学结构包括大量不同的化学部分，并且与每个个别的具有顺磁性质的颗粒相连的化学结构基本上具有相同的结构，以及所述库拥有多种多样的至少100,000种独特的(unique)化学结构；(c)利用所述不同的化学结构从所述第一样品中俘获一定量的不同分析物物种并除去未结合的分析物物种；(d)将带有被俘获的分析物的颗粒放入质谱仪中；(e)利用激光解吸附质谱检测所述被俘获的分析物。
[0027]此外，本发明提供了纯化目标蛋白质组(target protein group)的方法。在优选实施方式中，该方法包括以下步骤：(a)将含有至少95％和至多5％污染蛋白质(contaminating proteins)的样品与连接于具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒集合的各种化学结构的库(library)相接触，其中所述化学结构包括大量不同的化学部分，并且与每个个别的具有顺磁性质的颗粒相连的化学结构基本上具有相同的结构，以及所述库拥有多种多样的至少100,000种独特的(unique)化学结构，其量足以结合污染蛋白质和少量的目标蛋白质组；(b)将所述污染蛋白质和少量的目标蛋白质组与化学结构库相连接；(c)从与所述化学结构库相连的污染蛋白质和目标蛋白质组中分离未结合的目标蛋白质组；以及(d)从样品中收集未结合的目标蛋白质组；由此所收集的目标蛋白质组比所述样品中的目标蛋白质更纯。
附图说明
[0028]图1描述了SDS-PAGE分析显示使用普通小珠(泳道b)和磁化小珠(泳道c)的均衡方法的对比分析结果。泳道a显示的是分子标记。细节在实施例1中提供。
[0029]图2描述了血清样品的SDS-PAGE分析，所述样品用磁化固相六肽配体库(泳道c)和普通小珠(泳道b，数据来自于实施例1)和初始人血清蛋白(泳道a)。细节在实施例2中提供。
[0030]图3描述了来自14种不同血清处理试验的样品的SELDIMS分析。所使用的蛋白质芯片阵列(ProteinChip Array)是Q10。显示的分子量范围从约5kDa～约20kDa。细节在实施例3中提供。
具体实施方式
[0031]提供给研究者的生物样品如血清、脑脊髓液等可能仅有不超过数毫升的量。在筛选实验中，优选为尽可能少地使用这些珍贵的材料。一种分析生物样品的方法涉及将所述样品暴露于例如通过“等分-偶联-重组”方法制得的与颗粒相连的多样化化学库。然而，通常用于制备如此的化学库的颗粒在40微米～100微米的大小范围内。完全的20种氨基酸的六肽组合库具有各种各样的约6千4百万种独特的肽种类。附着在具有40微米～100微米尺度范围的小珠上时，所述库的体积约为16毫升。通常，所述向小珠加入最少10体积的血清，对应于160mL或者9600mg蛋白质。为处理100μL的血清体积，需要10μL的配体库。这样的库仅拥有各种各样的30,000种独特的六肽种类，这对于俘获在复杂生物样品如血清中的各种蛋白质是不理想的。此外，当从由数千万种组合构成的大量储备材料中取样出10μL这样的库，每一个单独的样品将相互不同。因此最终结果的再现性将是可疑的。
解决该问题的一种方法是使用极小的颗粒，例如直径在200nm～10μm的范围内。在第一种情况下，10μl这样的小珠将含有1.25×1012个小珠。；在第二种情况下，相同体积将含有约107个小珠，如此大小的小珠是非常难以操作的。尤其是，组合化学的等分-偶联-重组法通常涉及在流通柱中进行化学反应，随后过滤分离溶剂和过量的反应物。小颗粒将贴在这些柱子里的过滤器上，使之不能洗涤所述颗粒并在化学偶合后收集所述颗粒。
[0033]本发明提供了在等分-偶联-重组组合化学合成中对极小颗粒进行操作的问题的解决方法。所述方法包括提供具有顺磁性质的小颗粒，化学反应在其上进行，并利用磁性例如使用磁体对所述颗粒进行操作。
[0034]本发明还提供了与颗粒相连的配体库，其中所述库的独特的成员中的大部分或者基本全部均附在各自独立的颗粒上。
I.具有顺磁性质的小颗粒
A.顺磁性和非顺磁性材料
[0035]本发明的颗粒具有顺磁性质。即，所述颗粒具有可与外部磁场对齐的原子磁性偶极。因此，本发明的颗粒可被磁铁吸引并在磁场作用下类似普通磁体一样具有磁吸引力。所述颗粒通常为单分散，其直径可为100nm～1000nm。在操作中，这些小珠保持悬浮；随后它们能被磁场分离。“基本为单分散”是指所述颗粒直径范围的标准偏差不超过2％。
[0036]本发明的具有磁性的颗粒通常包括顺磁材料和非顺磁材料，所述化学结构与之化学地通常为共价地相连。
[0037]所述顺磁材料由非常精细的具有顺磁性的矿物氧化物如磁铁矿(混合氧化铁)、赤铁矿(氧化铁)、铬铁矿(铁和铬的盐)和所有其他可被电磁石的永久磁铁所吸引的材料的颗粒构成。同样，也可以使用铁酸盐如四氧化三铁(Fe3O4)、γ-三氧化二铁(γ-Fe2O3)、MnZn-铁酸盐、NiZn-铁酸盐、YFe-石榴石、GaFe-石榴石、Ba-铁酸盐和Sr-铁酸盐；金属诸如铁、锰、钴和镍；铁、锰、钴、镍等合金，但并不局限于此。优选材料是磁铁矿，这是因为其容易获得并且成本低廉。以大小不同、干燥的颗粒或者以稳定的水悬浮液提供。
[0038]这些颗粒分散在聚合物网络中并使整个颗粒具有被永久磁石或者电磁石吸收的性质。
[0039]其上附有化学结构的非顺磁材料由聚合材料制成。其中最常用的聚合材料是交联丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙烯、尼龙和聚糖。更具体的是，这些聚合材料包括通过聚合可聚合单体所制备的有机聚合物：所述单体包括苯乙烯类可聚合单体例如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、对正丁基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯、对正己基苯乙烯、对正辛基苯乙烯、对正壬基苯乙烯、对正癸基苯乙烯、对正十二烷基苯乙烯、对甲氧基苯乙烯和对苯基苯乙烯苯乙烯；丙烯酸类可聚合单体例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苯甲酯、丙烯酸二甲基磷酸乙酯、丙烯酸二乙基磷酸乙酯、丙烯酸二丁基磷酸乙酯和丙烯酸2-苯甲酰氧乙酯；甲基丙烯酸类可聚合单体例如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、甲基丙烯酸二乙基磷酸乙酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺及其衍生物；甲基丙烯酸二丁基磷酸乙酯；亚甲基脂肪族单羧酸酯单体诸如乙烯酯、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、丁酸酯、苯甲酸乙酯、甲乙烯酯；乙烯醚诸如乙烯基甲基醚、乙烯基己基醚和乙烯基异丙基醚；和乙烯酮诸如乙烯基甲基酮、乙烯基己基酮和乙烯基正丁基酮。其他可聚合结构的例子是由无极固体构成的可聚合结构，包括粘土材料诸如高岭土、斑脱土、滑石和云母等；金属氧化物诸如氧化铝、二氧化钛和二氧化锌；不溶性无机盐诸如硅胶、羟磷灰石和磷酸钙胶；金属诸如金、银、铂和铜；和半导体化合物诸如GaAs、GaP和ZnS。所述材料并不局限于此。所述可聚合结构可以两种以上组合使用。
[0040]这些非顺磁性聚合性网络可以是致密的或多孔的。在第一种情况下，外表面区域用于与分析物相互作用，在第二种情况下如果所述孔对于分析物的自由扩散而言足够大，则所有多孔性结构将用于分子相互作用。
B.微颗粒固体载体的尺寸
[0041]本发明的优选实施方式采用微小的、珠状微颗粒化固体载体，其小于10μm，优选直径为200nm～10μm，300nm～5μm或1μm～3μm。(非球形颗粒的直径指最长尺度的长度。)由于微颗粒固体载体与较大的小珠相比具有增加的表面积体积比，因此是合意的。微颗粒固体载体也减少了包含全部组合库所必需的载体的体积，因此可以使用更复杂和有效的库。
C.制造具有顺磁性质的微小珠状材料
[0042]可用于本发明的具有顺磁性质的颗粒可由多个商业供应商提供。其中包括例如Dynal(Invitrogen)(Carlsbad，CA)，Ademtech(PessacFrance-superparamagnetic nanoparticles)和Spherotech(Libertyville，IL)。
[0043]本发明的具有顺磁性质的微小珠状材料可采用多种方法制造。
[0044]在本发明的一个具体实施方式中，可将磁铁矿颗粒或者聚集颗粒包封在聚合物外层中，组合配体可附在所述聚合物外层上。
[0045]在本发明的另一个具体实施方式中，可通过用顺磁颗粒如磁铁矿的胶状水悬浮液充填已有的非顺磁性多孔聚合物小珠得到顺磁材料。这些后述顺磁颗粒逐渐扩散进入多空聚合物小珠并被捕获在所述多孔结构中形成内部聚集体。未在所述聚合物小珠内被捕获的过量顺磁材料随后使用合适的溶剂洗去。可在组合库的配体附着到所述聚合物小珠之前或之后完成该顺磁材料的“充填”。
[0046]在另一个具体实施方式中，可通过将顺磁材料与聚合物或者单体混合，然后聚合或者交联所述聚合物或者单体得到所述具有顺磁性质的颗粒。在第一种情况下，将微小顺磁性材料加入到丙烯酸或者乙烯单体溶液中并在适宜的搅拌下保持悬浮。然后将所述溶液倒入非易混合的溶剂中以保持小液滴的悬浮。所述小液滴的尺寸及其分布取决于搅拌方法。一旦所述小液滴悬浮液达到期望的尺寸，使单体聚合并且小液滴变为小珠。该方法称为“乳液聚合”。所述顺磁材料的颗粒因此包封在所述聚合物网络中。在第二种情况下，将微小顺磁性材料(例如颗粒)加入到多糖溶液(例如琼脂糖、葡聚糖)中并在适宜搅拌下保持悬浮，同时加入合适的交联剂(例如bisepxoyrance、二乙烯基砜)并调节pH满足交联条件。随后将所述多糖与悬浮态颗粒的溶液导入非易混合的溶剂中以保持小液滴的悬浮。所述小液滴的尺寸及其分布取决于搅拌方法。一旦所述小液滴悬浮液达到期望的尺寸，将所述悬浮液保持在预定温度下直至交联反应完成。微小水性液滴逐渐变为小珠。所述顺磁材料的颗粒从而包封在所述聚合物网络中使所得材料具有顺磁性质。
D.固体载体
[0047]用于本发明，尤其是用于合成肽库的固体载体材料的适用性可根据以下条件进行评价：(a)在所述固体载体上合成肽的能力(所述固体载体应当对于在所述组合肽库的合成中使用的所有溶剂稳定)；(b)所述固体载体应该包含游离氨基，或者合适的稳定的但可切割的连接基团(然而，应当注意的是可切割连接基团并非必须)；(c)所述固体载体应当在合成、筛选和处理中机械稳定；(d)所述固体载体的尺寸应当足够大使之可以进行手工操作，或者任何可以作为替换的操作方法；(e)所述小珠的肽容量应当至少为每个小珠上约10pmole肽，或者是任何在测序和检测技术中切实可行的更低限(优选为约100pmole的容量)；和(f)所述固体载体应当大体上表现出对所选择的配体和蛋白的较低程度的非特异性吸附。本领域普通技术人员应当理解这些条件不应当被理解为绝对的要求。
[0048]用于本发明的可接受的固体载体多种多样。固体载体可以是多孔的或者非多孔的，但优选为多孔的。可以是连续的或者非连续的，柔性的或者非柔性的。固体载体可以由包括陶瓷、玻璃、金属、有机聚合材料或者其组合在内的各种材料制成。
[0049]所述微颗粒载体的形状可以是诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、二乙酸酯、三乙酸酯、玻璃纸、纤维素、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚酯等塑料材料膜的形状；诸如聚氯乙烯、聚乙烯醇、乙酰纤维素、聚碳酸酯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯或者特氟龙(Teflon)等聚合物多孔膜；木板；玻璃板；硅基板；由诸如棉、人造纤维、丙烯酸纤维、丝和聚酯纤维等材料形成的织物；以及由诸如无原木纸、中等质量纸(medium-qualitypaper)、加工印刷纸、证券纸、再生纸、钡白纸、铸涂纸、皱纹板纸和树脂涂覆纸等纸片材。自然地，所述载体的形状并非局限于此。膜形状或者片材形状的材料可具有光滑的表面或者粗糙的表面，只要所述磁性物质能保持在其上。
[0050]优选的固体载体包括有机聚合物载体诸如颗粒化或者珠状载体，也可以使用聚丙烯酰胺和矿石载体诸如硅酸盐和金属氧化物。特别优选的实施方式包括球状或不规则状小珠或颗粒的固体载体。
[0051]因为多孔性材料提供巨大的表面积，所以是有用的。所述多孔型材料可以是合成的或者天然的，有机的或者无机的。合适的固体载体与用于蛋白分离的色谱吸附剂非常相似，具有至少约1.0纳米(nm)的孔径和至少约0.1立方厘米/克(cm3/g)的孔体积的多孔性结构。优选的是，所述孔径为至少30nm，这是因为更大的孔对扩散的限制性越小。优选的是，所述孔体积至少为0.5cm3/g以具有更大的潜在容量，这是由于围绕所述孔更大的表面积。优选的多孔载体包括颗粒化或者珠状载体，诸如琼脂糖、亲水性聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、矿物氧化物，包括球状和不规则小珠和颗粒。
[0052]由于明显的优点，用于化学结构的固体载体优选为亲水性的。优选为，所述亲水聚合物是水溶胀性的以渗透更多的分析物。如此的载体的例子包括天然多糖例如纤维素、改性纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、氨基修饰交联葡聚糖、瓜尔胶、改性瓜尔胶、黄原胶、槐豆胶和水凝胶。其他例子包括交联合成亲水聚合物诸如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)和改性聚乙二醇。优选的聚合材料是根据其组成能与用于构建所述组合库的溶剂相容的材料。
[0053]通常，具有顺磁性质的颗粒含有反应性基团如氨基或羧基，或者普遍已知的用于制备其上将连接化学部分的亲和色谱载体的反应性基团。
[0054]在表面上的未反应交联基团可与小化合物如巯基乙醇反应以防止其进一步反应。此外，表面可经进一步处理以防止蛋白质的非特异性粘附。
[0055]所述微颗粒固体载体包括顺磁性颗粒，能够简单地一步将未结合目标蛋白质基团和与所述顺磁性小珠上连接的化学结构相结合的蛋白分离。
II.化学结构库
[0056]用在本发明中的化学结构库包括至少100,000种不同化学结构的集合。在某些具体实施方式中，所述化学结构库拥有至少300,000，1,000,000，3,000,000，10,000,000，50,000,000或者至少100,000,000种独特的化学结构。优选为，在所述库中的至少一种结构识别在将被分析的化合物中各自的分析物。优选为，所述化学结构库至少包括与样品中的分析物相同数量的不同化学结构。
[0057]通常，以及如下详细描述，化学结构库与不溶性固体载体或者颗粒材料相连。每种固体载体或者不溶性颗粒优选粘附多份拷贝的相同化学结构，而每一种颗粒类型连接不同的化学结构。
[0058]本发明的化学结构库可使用本领域技术人员所知的任何技术。例如，化学结构库可以是化学合成的，从天然来源中获得的，或者在化学结构库是生物有机聚合物的情况下使用重组技术制造的。然而，在优选实施方式中，通过利用已知的“等分-偶联-重组”法的组合合成制备的所述化学结构库。
[0059]也可购买预先与所述固体载体连接的，或者使用标准方法间接连接或者直接固定在所述固体载体上的化学结构(参见例如，Harlow and Lane，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1988)；Biancala et al，Letters in Peptide Science2000，7(291)：297；MacBeath et al，Science2000，289：1760-1763；Cass et al，ed.，Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium；Leiden，Escom，975-979(1994)；美国专利第5,576,220号；Cook et al，TetrahedronLetters 1994，35：6777-6780；andFodor et al，Science 1991，251(4995)：767-773))。
A.组合库
[0060]在本发明的一个实施方式中，所述化学结构库是组合库或其部分。组合化学结构库是通过化学合成或者生物合成，通过以所有可能的组合将大量化学“构建块”组合生成的化合物的集合。例如，完整的线性组合化学库，诸如多肽库是通过将一套化学构建块(氨基酸)以指定化合物长度(即在多肽化合物中氨基酸的数目)以每种可能的方式组合形成的。举例，如果所述构建块的数目为5，而所述构造由5块组成，则可能的线性组合的数目为55或者3125种。在该情况下，所述构建块(A、B、C、D和E)线性地装配，例如：A-A-A-A-A；A-A-A-A-B；A-A-A-A-C；A-A-A-B-A；A-A-A-B-B；A-A-A-B-C；A-A-B-A-A；A-A-B-A-B；A-A-B-A-C；E-E-E-E-C；E-E-E-E-D；E-E-E-E-E。“基本全部的”组合库的的成员是至少95％的所述库的独特的成员。
[0061]组合库的其他形式是脚手架类的。这些结构是基于单一中心分子或核心，具有可被构建块选择性地和/或依次地取代的位置。例子可举出可连接数个取代基的三氯三嗪(三个选择性温度依赖性取代位置)。如果取代基的数目为三，可能的组合数为10。也可能考虑每个取代基的相对位置；在该情况下组合数更大。
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脚手架型的另外一个例子可举出赖氨酸，其中所述三个取代位置(羧基、α-氨基和ε-氨基)可被选择性的保护并因此可被粘合块选择性地取代。
[0062]作为第三水平，可将线性组合库和脚手架型库组合，其中后者的取代基是组合线性顺序。
[0063]可通过如此组合性混合化学构建块合成百万种化学化合物。对于肽化学结构，所述长度优选限制为15、10、8、6或4个氨基酸。本发明的聚核苷酸化学结构具有至少为4的优选长度，更优选为6、8、10、15或者至少20个核苷酸。寡糖在长度上优选为至少5个单糖单元，更优选为8、10、15、20、25个或者更多的单糖单元。
[0064]组合库可以是完整的或者不完整的。生物聚合物的完整组合库是对于指定聚合物长度和组成的单体，拥有每种可能的单体排列的代表的那些库。不完整的库是对于指定聚合物长度缺少一种以上可能的单体排列的那些库。
[0065]在本领域中已知的组合和合成化学技术能生成拥有数百万成员的库(Lam et al.，Nature 354：82-84(1991)和国际专利申请(PCT)WO 92/00091)，每一个具有独特的结构。例如由18种天然氨基酸制备的线性六肽库包含34×106种不同的结构，例如由20种氨基酸制备的库包含64×106种不同的结构。当还包括氨基酸类似物和异构体时，可能结构的数目实际上是无限的。组合库的成员可在固体载体如小珠上合成或者与之相连，每个小珠在其表面上主要含有数百万拷贝的库成员。由于不同的小珠可与不同的库成员相连，因此用于与库成员相连的小珠总数巨大，能与连接在小珠上的库成员结合的不同分子的可能数目非常巨大。
[0066]Hammond et al.，US 2003/0212253(2003年11月13日)描述了沿以下线路的组合库。可由相对于天然氨基酸而言稳定性提高的氨基酸合成肽化学结构库。例如，可从库中去掉半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，而加入诸如2-naphyl丙氨酸和正亮氨酸等非天然氨基酸。所述N-端氨基酸可以是D-异构体或者乙酰化以在氨基-肽酶存在下提供更高的化学稳定性。所述化学结构密度必须足以提供与目标分子充分的结合，但不能过高使得所述化学结构与其自身而不是目标分子发生反应。每克干重量的载体上0.1μmol～500μmol的化学结构密度是理想的，并更优选为每克载体上10μmol～100μmol的化学结构密度是理想的。在Toyopearl-AF氨基650M树脂(Tosoh USA，Grove City，OH)上合成6肽库。所述树脂小珠的尺度为酶小珠60mm～130mm。所述起始树脂的初次取代由Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH(1:3.8摩尔比)的混合物的偶联完成。在偶联后，用纯TFA充分地除去Boc保护基。所得脱保护氨基随即乙酰化。通过保留在所述树脂小珠上的Fmoc-Ala-OH位点组装肽链。采用标准Fmoc合成策略。在一个实施方式中典型的试验，用20％哌啶/DMF(2×20分钟)将六克Fmoc-Ala-(Ac-Ala-)Toyopearl树脂脱保护，然后用DMF洗涤(8次)并平均分为18份单独的反应容器。在每个单独的容器中，单一的Fmoc-氨基酸与所述树脂(BOP/NMM，5-10倍过量)偶联4～7小时。清洗单独的树脂并采用“分离/混合”库技术进行组合(Furkaet al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)；International Patent Application WO 92/00091(1992)；U.S.Pat.No.5,010,175；U.S.Pat.No.5,133,866；and U.S.Pat.No.5,498,538)。重复脱保护和偶联循环直至完成氨基酸序列(对于六聚体库为六个循环)。在最后的偶联循环中，在独立的反应容器中用20％哌啶/DMF从肽树脂上除去最终的Fmoc。用TFA处理2小时以除去侧链保护基团。充分地洗涤树脂并在真空下干燥。获得的肽密度通常为0.06mmol～0.12mmol/g树脂。
[0067]肽配体树脂小珠复合物的测序和肽组成得到确认，由在Commonwealth Biotechnologies，Inc.，Richmond，Va的量化氨基酸分析计算所述树脂的取代度。在Protein Technologies Laboratories，Texas A&MUniversity，使用Hewlett PackardG1005A通过埃德曼降解进行测序。
[0068]用于组合库制备的装置可市售获得(参见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，许多组合库本身是可市售获得的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，etc.)。
[0069]组合库，尤其是肽库可通过引入各种取代基进行化学修饰。例如，具有端伯胺基的肽库可被许多分子取代使之具有独特的附加性质。暴露的氨基(端基和赖氨酸侧链)可与大量具有反应性部分如环氧化物、醛、羧基、酐、酰氯、异氰酸酯、乙烯砜、甲苯磺酸盐、内酯以及其他部分的分子反应。当所述反应性部分与所述库的伯胺基反应时，其加入到库中以及加入更多的结构。因此所述库可由具有生物化学功能的化合物封端，所述具有生物化学功能的化合物可对初始库进行补充。
[0070]例如伯胺端基肽与琥珀酰酐反应，在两个亚甲基的间隔基的底部得以引入端酰基。所得库的全部性质由其初始主要的阳离子特性变为净负离子特性。该变化明确地引入不同行为以减小复杂混合物的成分浓度范围。伯胺端基库也可以有利地与酰端基库混合，并具有潜在的更大范围的适用性。
[0071]另一种修饰肽库的可用伯胺的方法是引入端基糖；在该情况下，可获得更好的亲水性，同时也获得俘获对糖有亲和性的物种的可能性，由于存在来自于所述组合肽链的结构，所述对糖的亲和性得以增强。
[0072]在另一个例子中，螯合剂可与所述端伯胺基相连接。当这些化学官能团与过渡金属离子一起加入时，整个库的行为被改变，并可处理更多的能与金属离子相互作用的特异性蛋白。在该情况下，所述库在通过使用特异性置换剂如螯合剂具体为EDTA对蛋白质进行选择性吸附时，将具有更多的可利用的特征。
[0073]制备衍生物的化学反应不仅仅局限于组合肽，而且可用于所有其他库如组合寡核苷酸和寡糖。
1.小有机分子
[0074]在本发明的优选实施方式中，所述方法包括使样品与化学结构库相接触的步骤，其中所述库是小有机分子的组合库。
[0075]因此，也可补充小分子作为用在本发明的方法和试剂盒中的化学结构库。通常，小有机分子具有特性使之与分析物之间有离子、疏水或亲和相互作用。小有机分子库包括在色谱方法中传统使用的化学基团，例如单甲基、二甲基和三甲基氨基乙基基团、单乙基、二乙基和三乙基氨基乙基基团、磺酰基、磷酰基、苯基、羧甲基等。例如库可以使用苯并二氮(参见例如Bunin et al，Proc Natl Acad Sci USA 1994，91：4708-4712)和肽酰胺(参见例如Simon et al，Proc Natl Acad Sci USA1992，89：9367-9371；Gilon et al，Biopolymers 1991，31：745-750)))。肽酰胺是其中肽键(-NHCO-)被类似结构例如-NRCO-替代的肽类似物。在另一个具体实施中，所述化学结构是染料或三嗪衍生物。该名单是不可穷尽的，正如本领域普通技术人员可以容易地鉴别出数千种具有离子、疏水或亲和性质的化学功能性基团，可相容地用作本发明的方法中的化学结构库。
[0076]在本发明的优选实施方式中，所述小有机分子的组合库与固体载体，优选为大量的小珠共价相连。如此处进一步的描述，小有机分子的组合库可与所述固体载体直接地或者通过连接基团相连。
2.生物聚合物
[0077]在本发明的优选实施方式中，所述方法包括使样品与化学结构库相接触的步骤，其中所述库是生物聚合物的组合库。
[0078]在本发明的一个实施方式中，生物聚合物选自由聚肽、聚核苷酸、脂和聚糖构成的组。
[0079]对于本发明的生物聚合物化学结构库，线性长度优选为4个～50个单体单元，特别为不超过15个，不超过10个，理想地为8、7、6、5、4或者3个单体单元。对于肽库，所述长度优选限制为不超过15、10、8、6或者4个氨基酸。核酸库的优选长度为至少4个，更优选为至少6、8、10、15或者至少20个核苷酸。寡糖优选为至少5个单糖单元的长度，更优选为至少8、10、15、20、25或者更多的单糖单元。
[0080]在本发明的优选实施方式中，所述小有机分子的组合库与固体载体，优选为大量的小珠共价相连。如此处进一步的描述，生物聚合物的组合库可与所述固体载体直接地或者通过连接基团相连。
a)肽
[0081]在本发明的优选实施方式中，生物聚合物是肽。特别优选的化学结构库包括含有不超过50、40、30、25、20、15、10、8、6或4个氨基酸的肽，采用重组或者固相化学技术可以容易地制造。此外，肽结构化学库能以某种意义上使其方便地用于本发明的方法的方式进行制造。例如，可重组地制备肽作为噬菌体展示库，其中所述肽作为噬菌体外壳的一部分。(参见例如Tang et al，J Biochem 1997，122(4)：686-690)。在本文中，所述肽可与固体载体，噬菌体相连。制备适用于所主张的本发明的肽化学结构库的其他方法对于本发明技术人员也是已知的，例如所述“等分-偶联-重组”法(参见例如Furka et al，Int J PeptideProtein Res 1991，37：487-493；Fodor et al，Science 1991，251：767-773；Houghton et al，Nature 1991，354：84-88；Lam et al，Nature 1991，354：82-84；国际专利申请WO 92/00091；和美国专利第5,010,175号，第5,133,866号，和5,498,538，所有均在此以参考的方法整体引入。)或者其他在本领域中已知的方法。所述肽库的表达也在Devlin etal，Science 1990，249：404-406得以描述。
[0082]可以使用二十种基因编码的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸盐、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸合成组合肽库，诸如组合六肽库。其中，所有的甘氨酸可以是光学异构的，但是在人体中仅发现L-型。然而，这些氨基酸的D-型也具有生物重要性；例如，D-Phe是已知的止痛剂。因此，这些氨基酸的D-型和L-型均可用作组合肽库的构建块。
[0083]许多其他氨基酸也是已知的并可用作肽库的构建块，包括：2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸(哌啶酸)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链赖氨素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丁酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。
[0084]可由相对于天然氨基酸而言稳定性提高的氨基酸合成肽化学结构库。例如，可从库中去掉半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，而加入诸如2-naphyl丙氨酸和正亮氨酸等非天然氨基酸。所述N-端氨基酸可以是D-异构体或者乙酰化以在氨基-肽酶存在下提供更高的化学稳定性。所述化学结构密度必须足以提供与目标分子充分的结合，但不能过高使得所述化学结构与其自身而不是目标分子发生反应。每克干重量的载体上0.1μmol～500μmol的化学结构密度是理想的，并更优选为每克载体上10μmol～100μmol的化学结构密度是理想的。
[0085]在标准“Merrifield”合成中，侧链保护的氨基酸由其羧基端与载体材料如微颗粒树脂偶联。加入侧链和氨基端被保护的氨基酸试剂，其羧基端与固定氨基酸暴露的氨基端反应形成肽键。随后将所得肽的氨基端脱保护，并加入新的氨基酸试剂。重复所述循环直至已合成所需的肽。所述技术的概述，参看Geisaw，1991，Trends Biotechnol 9：294-95)。
[0086]在该程序的常规应用中，所述氨基酸试剂尽可能的纯。然而，如果需要需要肽混合物，在一个或多个循环中采用的氨基酸试剂可以是氨基酸混合物，在循环与循环之间，该混合物可以是相同或者不同。因此，如果Ala与所述固体载体相连，然后加入Glu、Cys、His和Phe的混合物，则可以形成二肽Ala-Glu、Ala-Cys、Ala-His和Ala-Phe。
[0087]肽库可基本仅由相同长度的肽组成，或者可以包括不同长度的肽。所述库的肽可以包括在任何不定的残基位置的任何所需的氨基酸。可能的组包括但不局限于：(a)所有基因编码的氨基酸，(b)除半胱氨酸(引起形成二硫交联的能力)之外的所有基因编码的氨基酸，(c)所有基因编码的氨基酸，及其D-型形式；(d)所有天然氨基酸(包括例如羟基脯氨酸)；(e)所有亲水氨基酸；(f)所有疏水氨基酸；(g)所有带电荷的氨基酸；(f)所有不带电荷的氨基酸等。所述肽库也可包括支化和/或环肽。
[0088]在一些组合肽库实施方式中，所述肽在重组噬菌体的表面上表达以制备大型库。使用“噬菌体法”(Scott and Smith，Science249：386-390，1990；Cwirla，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：6378-6382，1990；Devlin et al，Science，49：404-406，1990)，可以构建非常巨大的库(106-108化学个体)。第二种方法主要使用化学法，例子可举出Geysen法(Geysenet al，Molecular Immunology 23：709-715，1986；Geysen et al，J.Immunologic Method 102：259-274，1987；和Fodor法，Fodor et al.(Science251：767-773，1991)。Furka et al.(14th International Congress ofBiochemistry，Volume #5，Abstract FR：013，1988；Furka，Int.J.PeptideProtein Res.37：487-493，1991)，Houghton(美国专利第4,631,211号，1986年12月授权)和Rutter et al.(美国专利第5,010,175号，1991年4月23日授权)描述了能被检测为促效剂或拮抗剂的肽的制备方法。
[0089]在本发明的优选实施方式中，所述方法包括使样品与化学结构库接触的步骤，其中所述化学结构库包括抗体库(参见例如Vaughnet al，Nature Biotechnology 1996，14(3)：309-314；PCT/US96/10287)。在本发明的优选实施方式中，所述方法包括是样品与展示在噬菌体颗粒上的抗体库接触的方法。
b)聚核苷酸
[0090]核酸是另一种优选的生物聚合物化学结构库。如同肽一样，可以采用本领域技术人员已知的合成或者重组技术制备核酸。术语“聚核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此处是可以相互替换使用的，指单链形式或者双链螺旋的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合形式。核酸分子也可含有经修饰的核酸分子，诸如甲基化核酸分子和核酸分子类似物。嘌呤和嘧啶的类似物在本领域中已知。核酸可以是天然产生的，例如DNA或者RNA，或者可以是在本领域中已知的合成的类似物。因其优异的稳定性，这些类似物可优选用作化学结构。对天然结构的修饰，包括骨架、糖或者杂环碱基的变化已显示出提高了分子内稳定性和结合亲和性。其中在所述骨架化学上的有用变化是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中非桥接氧原子均被硫取代；氨基磷酸酯；烷基磷酸三酯和硼磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3′-O′-5′-S-硫代磷酸酯、3′-S-5′-O-硫代磷酸酯、3′-CH2-5′-O-磷酸酯和3′-NH-5′-O-氨基磷酸酯。肽核酸利用肽键替代整个核糖磷酸二酯骨架。
[0091]当所述生物聚合物是核酸时，可以采用传统的DNA或RNA合成和测序方法。正常碱基是嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤，以及嘧啶，胸腺嘧啶(对RNA而言是尿嘧啶)和胞嘧啶。然而，诸如以下这些非常见的碱基也可加入到合成中，或者通过使用突变剂的合成后处理生成：4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羟基甲基)尿嘧啶核苷、2′-O-甲基胞嘧啶核苷、5-羧甲基氨基甲基-2-thioridine、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、二氢尿嘧啶核苷、2′-O-甲基假尿嘧啶核苷、β，D-半乳糖基queosine、2′-O-甲基鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤核苷、1-甲基腺嘌呤核苷、1-甲基假尿嘧啶核苷、1-甲基鸟嘌呤核苷、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟嘌呤核苷、2-甲基腺嘌呤核苷、2-甲基鸟嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺嘌呤核苷、7-甲基鸟嘌呤核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、β，D-甘露糖queosine、5-甲氧羰基甲基尿嘧啶核苷、5-甲氧基尿嘧啶核苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤核苷、N-((9-β-D-呋喃核糖-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶核苷、queosine、2-硫代胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫代尿嘧啶核苷-2-硫代尿嘧啶核苷、4-硫代尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)氨基甲酰基)threonine、2′-O-甲基-5-甲基尿嘧啶核苷、2′-O-甲基尿嘧啶核苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶核苷。
[0092]优选的核酸化学结构是长度至少为4个，更优选为至少为6、8、10、15或者20个核苷酸。核酸化学结构包括与特异性分子标靶，例如蛋白质或代谢物结合的双链DNA或单链DNA分子(例如核酸适体)。
c)寡糖
[0093]生物聚合物可以是寡糖。因此，寡糖化学结构也可考虑用在本发明的方法和试剂盒中。寡糖化学结构优选为长度至少为5个单糖单元，更优选为长度至少为8、10、15、20、25或者更多个单糖单元。
[0094]在聚合糖类库中的单糖可以是醛糖、酮糖或者衍生物。它们可以是四糖、五糖、六糖或者更复杂的糖。它们可以是D型或者L型。合适的D-糖包括D-甘油醛、D-赤藓糖、D-苏糖、D-阿拉伯糖、D-核糖、D-来苏糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-阿卓糖、D-阿洛糖、D-塔罗糖、D-半乳糖、D-艾杜糖、D-古洛糖、D-鼠李糖和D-海藻糖。合适的L-糖包括上述D-糖的L型。
d)脂质
[0095]生物聚合物可以是脂质。如在此所使用，术语“脂质”指疏水或两性部分。因此，脂质化学结构也可考虑用在本发明的方法和试剂盒中。合适的脂质包括C14～C50脂肪族、芳基、芳基烷基、芳基烯基或芳基炔基部分，其可包括至少一种选自由氮、硫、氧和磷构成的组的杂原子。其他合适的脂质包括磷酸甘油酯、糖基甘油酯、神经鞘脂、甾醇、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丙醇胺。脂质化学结构优选为长度至少为5个单元，更优选为长度至少为8、10、15、20、25或者更多个单元。
III.化学结构附着至固体载体
A.采用“等分-偶联-重组”方法在具有顺磁性质的颗粒上组装化学结构
[0096]“等分-偶联-重组”是已知的组合合成方法，其涉及许多轮如下过程：将固体载体均分为大量等分部分；将一部分例如单体偶联至所述载体或者偶联至在前一轮中已连在所述固体载体上的化学结构；然后收集所述固体载体已进行混合。以下是所述方法更详细的描述。
[0097]将一定量的直径小于10微米的磁性小珠和合适的连接物分为具有相同量的很多组。组数与将用于构建所述库的构建块的数目相同。例如，如果使用标准腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷(guanidine？)构建寡核苷酸库，小珠的组数将为4，与单核苷的数目相同。所述构建块将被称为“a”、“b”、“c”、“d”。在第一组小珠上将连接构建块“a”。构建块“b”、“c”和“d”将分别连接在第二、第三和第四组小珠上。一旦在平缓的搅动下在悬浮液中完成4个不同的操作，副产品和合成使用过的溶剂将被清洗掉。
[0098]该操作不能通过过滤完成，这是因为具有小于10微米直径的颗粒太小而将阻塞所述过滤器。本发明通过提供具有顺磁性质的颗粒并在所述等分-偶联-重组过程中使用磁力对这些颗粒进行操作解决了这个问题。将其分离的一种模式是依靠外置永磁体将具有顺磁性质的颗粒保留在所述合成容器中，然后通过容器简单的旋转排出液体从而移除溶剂。作为另外一种选择，也可通过将通电的电磁体放入悬浮液中使所有的顺磁材料粘附其上，从而将具有顺磁性质的颗粒与液体溶剂分离。一旦充分洗涤并与最终洗涤溶液分离之后，重新混合所述小珠。该操作可通过在常规容器里释放被电磁体俘获的顺磁颗粒而完成。通过所述电磁体的简单断电即可释放小珠。一旦使用传统搅拌器充分细致地混合所有小珠以后，再次均分为四组。在第一组上将连接构建块“a”，而构建块“b”、“c”和“d”将分别连接在第二、第三和第四组具有顺磁性质的颗粒上。随后是如上所述的类似操作：在再次均分前洗涤，分离和混合。重复次数取决于所需配体库的长度。典型地为对于氨基酸，最常用的使用的构建块数目为6(六肽)，而对于寡核苷酸，则可在15～30之间变化。
[0099]固体载体可来自于完全构建完毕的化学结构库，即通过将先前构建好的化学结构库与所述载体相连接。作为另外一种选择，化学结构库可如下在固体载体上形成，即将前体分子连接到固体载体上并随后利用所述第一前体分子将其他前体分子连接到与所述固体载体相连的正在成长的链上。这种在所述固体载体上建立吸附剂的机制在所述化学结构是聚合物时特别有用，尤其是生物聚合物诸如多肽、多核苷酸或多糖分子。采用本领域内已知方法，通过持续地加入单体组分(例如氨基酸、核苷酸或单糖)可将生物聚合物化学结构提供给已连接在所述固体载体的第一单体组分上。参见例如美国专利第5,445,934号(Fodor etal)，以引用的方式在此将其全文引入。
[0100]所述库的“多样性”是在所述库中独特的化学结构式的预计数目。
[0101]所述库的“大小”是其中化学结构分子的估计值。所述大小取决于构建块的初始数目以及最终组合配体的长度。在所用采用均分-偶联-重组合成的情况中，构建库所需的小珠数目必须超过多样性种类的最终数目。例如，如果使用15种构建块构建库并且最终配体是9聚体，则最终库将由159种结构构成(这对应于4×1010种结构或者多样性种类)。在此情况下，如果具有顺磁性质的颗粒具有6μm的直径(每μL紧密放置的具有顺磁性质的颗粒对应于4.6×106个小珠)，将使用的小珠的最小体积必然超过10mL的具有顺磁性质的颗粒。在使用连接在直径2.8μm的具有顺磁性质的颗粒上的20种不同氨基酸制备六肽的情况下，具有顺磁性质的颗粒的体积必然超过1.5μL。在某些实施方式中，所述库中的小珠的数目足以使得至少2种不同的小珠，至少4种不同的小珠或者至少8种不同的小珠，每一种含有相同的特有化学结构。例如，约2亿5千万的小珠的库可包括四种小珠，每一种含有相同结构的具有6千4百万成员的库。
[0102]少至一种，多至10、100、1,000、10,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、1,000,000,000或者更多种的化学结构可偶联至单一的固体载体。在优选实施方式中，所述固体载体为小珠的形式，在每个小珠上连接有单一、不同的化学结构。例如，在肽化学结构库中，代表氨基酸的一种排列的肽可连接于一颗小珠，代表另一种排列的肽可连接与另外一颗小珠，等等。
[0103]可采用可逆或不可逆反应将化学结构偶联至固体载体。例如，不可逆反应可采用如下的载体进行，所述载体具有至少一个与所述化学结构相连的反应性官能团，诸如羟基、羧基、巯基或者氨基，可选地为通过间隔基。合适的官能团包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酰酯、碘乙酰基、醛、环氧化物、咪唑基氨基甲酸酯和溴化氰和其他卤素活化载体。可通过各种已知技术将这些官能团提供给载体。例如，按已知方法可用氨基丙基三乙氧硅烷处理玻璃表面。在一些实施方式中，在本领域技术人员公知的合成(例如固相肽合成和固相核酸合成)过程中将化学结构偶联至固体载体。
[0104]作为另外一种选择，可使用与所述固体载体和/或所述化学结构相连的连接物部分从而进行固体载体和化学结构间的可逆相互反应。已知多种适用于本发明的连接物，其中一些将在此进行讨论。连接物部分应用于偶联不同试剂对于本领域普通技术人员是公知的，所述本领域普通技术人员可应用该常识形成适用于本发明的固体载体/化学结构偶联物而不需要更多的例行试验。
[0105]在另一实施方式中，每一种不同的化学结构可偶联至不同的固体载体。例如，当采用所述等分-偶联-重组方法在小珠上构建组合库时即为这种情况。作为另外一种选择，化学结构的集合可偶联至一堆小珠，因此每颗小珠可连接许多不同的化学结构。这可以例如通过如下过程完成，即在第一批载体上建立组合库，将所述化学结构从所述载体上切下，然后将其重新偶联至第二批载体。
[0106]在一个优选的方面，本发明提供了一种建立多种化学结构的组合库的方法，所述多种化学结构与具有顺磁性质的直径为约100nm～约10μm的颗粒的集合相连，所述方法包括以下步骤：(a)提供大量不同化学部分；(b)使用具有活化基团的颗粒集合进行第一轮的等分-收集-重组化学合成，其中所述第一轮的等分-收集-重组化学合成将所述大量不同的化学部分的第一化学部分连接到所述颗粒集合的活化基团上；(c)磁性操作所述具有顺磁性质的颗粒集合；以及(d)进行第二轮的等分-收集-重组化学合成，其中所述第二轮的等分-收集-重组化学合成将所述大量不同的化学部分的第二化学部分连接到与所述颗粒集合的活化基团相连的第一化学部分上；其中等分-收集-重组化学合成的回合数足以组装具有多种多样的至少100,000种独特的化学结构的库。
B.具有顺磁性质的颗粒，其中，所述多种多样的化学结构中的大多数与每一颗独立的具有顺磁性质的颗粒相连
[0107]在本发明的另一实施方式中，所述库的化学结构在其合成之后连接到颗粒上。在该方法中，每颗具体的颗粒将连接有大量不同的化学结构，并且每颗颗粒将连接组合库的大部分或者基本所有成员。在一种构建方法中，2微升具有顺磁性质并在其聚合物部分具有反应性基团的颗粒用碳酸盐缓冲液在pH9.5下反复洗涤。通过由永磁体产生的磁场将液相与所述颗粒分离。一旦洗涤步骤完成，将所述颗粒与1500微克的可溶性六肽库相接触。室温下摇晃所述悬浮液过夜以促进肽通过其主要可用的氨基化学偶联着床。加入赖氨酸或乙醇胺破坏颗粒上过量的反应基团。
IV.降低样品中的相对分析浓度
A.相互作用力
[0108]不希望受限制于理论，但可认为多种相互作用影响着分析物如何被连接在固相载体上的化学结构库所俘获。蛋白质被磁性小珠配体库所俘获，这是连接在每颗小珠上的配体结构的功能。根据定义，每个配体是由具有复杂构象的结构所构成，并且不同配体的集合是非常多种多样的。例如，如果所述库由六肽组成，所述构建块(氨基酸)含有芳香环、杂环、正负电荷、疏水部分。
[0109]在蛋白质及其配体伴侣间建立的相互作用的类型类似于稳定所述大分子构象的力。它们通常比共价键小一个量级。这些弱相互作用涉及吸引或排斥原子或原子团以使构象能量最小。它们可分类为：离子-离子、氢键、偶极-偶极、色散和疏水相互作用。所述永久偶极-永久偶极；永久偶极-诱导偶极和诱导偶极-诱导偶极相互作用共同列举在范德华力相互作用名下。微弱存在的诱导偶极-诱导偶极相互作用被称为吸引伦敦色散力。
[0110]这些吸引力取决于二者间的距离，其能量反比于距离或者距离的某次幂，所述距离将蛋白质抗原决定基的原子排列与所述组合配体的原子构象分隔开。随着所述与距离成反比关系的幂次增加，所述相互作用非常快地接近0。直接与此类型的吸引相对的是空间位阻排斥，其不允许两个原子在同一时间占据同一空间。二者共同作用，所述吸引色散和排斥作用确定了分隔两个原子的最佳距离，处于该距离使得相互作用能量最小。
[0111]与长距离相互作用(例如电荷-电荷、电荷-偶极)相关的能量取决于环境介质。例如，在两个带电原子间的相互作用在极性介质中受到屏蔽并因此变弱。所述长距离相互作用的能量的表达式全部反比于所述介质的介电常数并因此在高度可极化介质如水中变弱。所述介质的组成附加地影响其他重要的弱相互作用，例如氢键和疏水相互作用。这既是为什么当用六聚配体库俘获蛋白质时，所述过程在天然生理pH和离子条件下进行。其中由蛋白质和配体(例如肽)二者的原子所处位置产生的强相互作用是氢键和疏水缔合。
[0112]存在大量的氢键促进所述六聚配体与天然蛋白质的相互作用：＝NH和沿着α螺旋的肽键的羰基氧之间的；＝NH与-OH之间的；＝NH和咪唑环之间的的；＝NH和羧基氧之间，以及最后两个-OH基团(例如Ser、Thr和Tyr的-OH基团)之间的相互作用。
[0113]通常是由伴随疏水性结构的存在相互靠近而形成疏水缔合。大量的氨基酸含有如此的结构：异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸是主要的例子。根据亲水指数分类也可分为相对疏水的氨基酸是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，这可能是由于其芳香环。
B.合适的试样
[0114]本发明的试样可以是能让存在于所述试样中的分析物与本发明的结合部分相接触的任何形式，如此处所述。合适的试样包括气体、液体、悬浮液、乳状液、可渗透或者粉末固体等。优选的测试溶液是液体。可以直接由来源获取试样，并用于本发明的方法而不需要任何预先操作。例如，可直接从含水层中获取水样品然后直接使用此处描述的方法进行处理。
[0115]作为另外一种选择，可按多种方法制备原始样品以提高其测试适用性。如此的样品制备包括去掉某些分析物、浓缩、研磨、提取、渗透等。例如，可将固体样品粉碎为粉末，然后用水或者有机溶剂提取。所述粉末的提取物可随后用于本发明。气体样品可鼓泡入或者渗入溶液以在将所述溶液用于本发明的方法之前使气体成分溶解和/或浓缩。
[0116]试样优选含有至少1000、100,000、1,000,000、10,000,000或者更多的所关心的分析物。在一些情况下，适用于采用本发明的方法的操作的试样可包括数百或者数千所关心的分析物。优选的是，在试样中存在的分析物的浓度横跨至少一个量级，更优选为两个、三个、四个或者更多的量级。一旦用于本发明的方法，可由至少一种检测方法检测到的分析物的浓度范围将至少降低至1/2，更优选为1/10、1/20、1/50、1/100或者更低。
[0117]例如，已知血清含有最多以1mg/ml和最少pg/ml存在的分析物。这是横跨至少109的量级的浓度范围。然而，在使用本发明降低浓度以后，浓度范围可减小1个～4个或者更多个量级。
[0118]可采用任何合适的方法收集试样。例如，可通过浸取、摘取、汲取、吸取或捕集等收集环境样品。可通过拭抹、scapping、手术或者使用皮下注射器获取等收集生物样品。在每种情况下的收集方法高度取决于样品源以及环境，有许多本领域的技术人员公知的可以替代的适用收集技术。
[0119]可以从潜在包含所关心的分析物的任何来源获取试样，包括环境样品如空气、水、尘土、提取物等。本发明的优选试样是生物样品，优选为生物流体。本发明可处理的生物样品包括羊水、血液、脑脊髓液、关节内液、眼内液、淋巴液、乳汁、汗液(perspiration plasma)、唾液、精液、血清、痰、滑液、泪液、脐带液、尿液、活组织切片匀浆、细胞培养液、细胞提取物、细胞匀浆、条件培养基、发酵液、组织匀浆及其衍生物。在生物样品中所关心的分析物包括蛋白质、脂质、核酸和多糖。更具体而言，所关心的分析物是在动物体内正常存在的，或者与疾病或者感染状态如癌症、病毒感染寄生物感染、病毒感染等相关的细胞代谢物。特别令人感兴趣的分析物是作为细胞应激标志的分析物。指示动物处于应激下的分析物是许多疾病状态包括某些精神疾病、心肌梗塞和感染的指示
[120]所关心的分析物还包括对于动物是外来的，但在动物组织内发现的分析物。在这点上，特别令人感兴趣的分析物包括治疗药物包括其中许多以不同的对映异构体存在的抗生素，由感染有机体产生的或者由动物从环境中获取并含在体内的毒素。例如，样品可以是蛋白或者E.coli提取物。
C.运用化学结构库从试样中俘获分析物
[0121]可通过将所述试样与结合部分在允许每个结合部分与其相应的分析物偶联的条件下相接触从而俘获在试样中存在的分析物。如上所指出，结合部分可与试样直接接触，或者所述结合部分首先与固体载体如测深尺、SELDI探针，或者不溶性聚合物小珠、膜或粉末相接触。
[0122]也可利用所述颗粒的顺磁性质对其进行操作从而进行这些过程。即，在将所述颗粒与样品混合和温育之后，通过施加磁力以吸引所述颗粒并将其从液体中分离，从而使附着有分析物的颗粒与液体分离。可以通过例如移液管移除所述液体。然后，为洗涤可加入新液体，与颗粒混合，然后再次通过施加磁力将颗粒与洗涤液分离。
[0123]在其中结合部分是小珠库的一部分的情况下，磁性小珠的体积与复杂样品如血清的样品体积之比可以例如在1:150～1:1之间。小珠与样品之比越小，增加低丰度或者稀有分析物物种的相对浓度的能力越强。小珠：样品体积的优选恒定比例为约1:10。
[0124]可通过将两者混合、将试样抹在所述结合部分上、使所述试样流过其中附着有结合部分的固体载体，以及其他对于本领域的普通技术人员显而易见的方法实现所述结合部分与所述试样的接触。所述结合部分和所述分析物保持接触一定的时间以足以是结合部分达到与所述样品的结合平衡。在典型的实验室条件下这至少为10分钟。
D.移除未结合的分析物
[0125]本发明的一个特征是除减小分析物浓度之间的差异之外，根据此处描述的方法进行的分析物的处理优选浓缩并部分纯化已结合的分析物。完全实现该特征包括可选地从与固体载体上结合部分相结合的分析物中冲洗掉任何和结合的分析物。
[0126]优选通过将与结合部分相结合的分析物与温和洗涤溶液接触以清洗掉未结合的分析物。所述温和洗涤溶液经设计可除去在起初含有所述分析物的试样中常常发现的杂质和未结合的分析物。典型地是，洗涤液具有生理pH和离子强度，并且所述洗涤将在室温条件的温度和压力下进行。
[0127]适用于本发明的洗涤溶液的配制可由本领域技术人员进行而不需要非必要的试验。除去杂质的方法包括低严格性洗涤法已发表，例如在V.Thulasiraman et al.，Electrophoresis，26，(2005)，3561-3571；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；Ausubel，et al.(1987 and periodic supplements)；Current Protocols in Molecular Biology；Deutscher(1990)＂Guide to Protein Purification＂in Methods in Enzymologyvol.182，以及该系列的其他卷中。
E.从结合部分上分离俘获的分析物
[0128]尤其是当其在简单结构中相连时，存在明确的蛋白质-配体相互作用在所述磁性小珠俘获方法中扮演重要角色。正是对于这些力的分析和了解才可能区分洗脱剂，所述洗脱剂可用于从非常复杂的化合物如血清中分离俘获的蛋白质。
[0129]已考虑所述相互作用力的重要性，可设计出洗脱剂。通过所述途径或者可以全部一起释放蛋白或者根据其相互作用的主要类型继续释放。对于离子-离子相互作用为主的情况(这是当所述肽配体主要由或者全部由酸性氨基酸如天冬氨酸或者谷氨酸构成的情况)，可用盐溶液诸如1M氯化钠溶液洗脱蛋白质，正如通常在离子交换色谱中完成的一样。通常，此过程应当可分离天然形式的蛋白质，因此可进行进一步的监测。利用合适的电场破坏离子键也可实现与存在盐相类似的效果，该过程也可保持蛋白质的整体性。
[0130]为温和地破坏蛋白质和具有顺磁性质的颗粒的配体之间的疏水相互作用，可以使用50％乙二醇(如同亲合色谱)。然而，对于强疏水缔合(六肽主要由亮氨酸、异亮氨酸或者缬氨酸构成)，优选在水中含有异丙醇、乙腈以及类似溶剂的水-有机混合物。其他类型的蛋白质洗脱液是pH2.5的200mM甘氨酸-HCl：典型地是采用该洗脱液以破坏可能与构象结构相关的牢固相互作用，诸如在免疫-亲合柱内出现的抗原-抗体相互作用。这些相互作用是许多同时存在的协同力的结果。在该情况下，通过相对高的离子强度，非常低的pH可助于使蛋白质抗原决定基变形因此减小所述相互作用，从而使其变弱。
[0131]在水中的2M硫脲、7M尿素、4％CHAPS的混合物似乎是对于吸附在肽库上的蛋白质的优异的洗脱剂。这是混合模式的洗脱剂，能同时破坏氢键以及疏水缔合因此释放大量蛋白质。也可使用在酸性或碱性pH下的尿素浓缩水溶液，而具有几乎定量的蛋白质脱附效率。最后，为全部洗脱蛋白质，可使用pH6的6M盐酸胍(GuHCl)。由于其强离液作用以及其高离子强度，该溶液可被视作通用洗脱剂，并破坏所有键并简化所有的蛋白质为随机聚合物盘绕物。如果所有蛋白质不得不立刻脱附，或者用作最终步骤，在顺序洗脱级联过程最后GuHCl可用作单独洗脱步骤(参见例如Scopes，Protein Purification：Principles andPractice(1982)；和Deutscher(1990)＂Guide to Protein Purification＂inMethods in Enzymology vol.182，以及该系列的其他卷)。
[0132]从具有顺磁性质的颗粒上分组脱附蛋白质的典型顺序是首先通过加入氯化钠提高离子强度，100mM～300mM的谷氨酸-盐酸，pH2.2～2.6的酸性溶液用作第二洗脱液，之后是异丙醇-乙腈-水的水-有机混合物。最后，在还有一些蛋白质仍吸附在小珠上的情况下，推荐使用pH3.3的9M尿素。
[0133]合适的洗脱缓冲液的例子包括改变分析物和/或结合部分的表面电荷的洗脱缓冲液，诸如pH缓冲溶液。通过改变酸性用于破坏表面电荷的pH缓冲溶液优选为强缓冲液，足以保持溶液的pH在酸性范围，即在低于7的pH下，优选低于6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或者3.0；或者在pH高于7的饯行范围内，优选高于7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、9.3、10.0或者11.0。在某些实施方式中，所述洗脱缓冲液可包括pH3的9M尿素，pH11的9M尿素或者6.66％MeCN/13.33％IPA/79.2％H2O/0.8％TFA的混合物。选择一种而不是另一种方法取决于用于均等样品的分析方法。
[0134]作为另外一种选择，也可以使用具有足够的离子强度以掩蔽所述分析物和/或结合部分的电荷性质的高盐浓度溶液。在这点上，尤其优选具有多价离子的盐，例如结合碱土金属或过渡金属反离子的硫酸盐和磷酸盐，虽然解离出一个或多个单价离子的盐也适用与本发明，倘若所得溶液的离子强度至少为0.1，优选为0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.75、1.0mol/l或者更高。通过实施例，许多蛋白质分析物/结合部分相互作用对其环境的离子强度的变化敏感。因此，通过将已结合的分析物与盐溶液，优选为无机盐溶液如氯化钠的接触可从所述结合部分上分离分析物。这可采用多种方法实现，例如将所述分析物与之结合的固体载体浸泡、浸透或浸入洗脱缓冲液中，或者用所述洗脱缓冲液冲洗、喷射或者洗涤所述固体载体。这样的处理将所述分析物从偶联在固体载体的结合部分上释放。然后从所述洗脱缓冲液中分离分析物。
[135]离液剂，诸如胍或尿素破坏包围在所述结合部分和已结合分析物四周的水包膜的结构，引起所述分析物和结合部分的复合物的离解。适用作本发明的洗脱缓冲液的离液盐溶液是应用专一性的，并可由本领域技术人员通过例行试验进行配制。例如，合适的离液洗脱缓冲液可含有浓度为0.1M～9M的尿素或胍。
[136]去污剂类洗脱缓冲液在表面张力和分子复合结构方面改变亲合分子的选择性。适合用作洗脱缓冲液的去污剂包括离子和非离子去污剂。非离子去污剂通过改变溶液的介电常数破坏分子间的疏水相互作用，而离子性去污剂通常以使容纳分子带上均匀电荷的方式将其覆盖，使得被覆盖的分子排斥类似被覆盖的分子。例如，离子性去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)以使其带上均匀负电荷的方法覆盖蛋白质。非离子去污剂的例子包括Triton X-100、TWEEN、NP-40和辛基糖苷。两性离子去污剂的例子包括CHAPS。
[0137]另一类通过改变溶液介电常数破坏疏水相互作用的类去污剂化合物包括乙二醇、丙二醇和诸如乙醇、丙醇、乙腈和甘油等有机溶剂。
[0138]本发明的一种缓冲液包含适用于质谱的基质材料。基质材料可包含在所述洗提缓冲液中。本发明的一些实施方式可选地包括从结合部分上洗脱分析物直接至质谱探针，例如蛋白质或者生物芯片。在本发明的其他实施方式中，所述基质与从结合部分上洗脱的分析物混合。另外的实施方式包括直接洗脱分析物至SEND或SEAC/SEND蛋白质芯片，所述SEND或SEAC/SEND蛋白质芯片包括预先分布在所述蛋白质芯片上的能量吸收基质。在这些后述实施方式中，不再需要在所述洗脱缓冲液中存在其他的基质材料。
[0139]其他适用于本发明的洗提缓冲液包括上述缓冲液成分的组合。由两种或者两种以上的前述洗提缓冲液成分配制的洗提缓冲液根据多重洗脱特性能改变复合物的亚单元之间的分子相互作用的选择性。
[0140]在一中实施方式中，被俘获的分析物被具有连续梯度或者分步梯度的洗脱缓冲液洗脱。例如，可首先使用仅能洗脱轻微吸附的分析物的洗提缓冲液。然后使用能洗脱结合得更强的分析物的缓冲液，依此类推。按此方式，所述分析物的子集合能洗脱为不同的等分试样。
[0141]使用本发明分离的分析物将具有的分析物浓度或者分析物之间的浓度差异比在所述试样中最初具有的分析物浓度范围或者浓度差异更小。例如，经过使用本发明的方法的处理，与所述试样经过在此处描述的任何方法处理之前，在所述试样中存在的相同分析物之间的浓度差异相比，被分离的分析物将具有的分析物浓度范围或者与其他被分离的分析物的浓度差异与将至少降低至1/2，更优选为1/10、1/20、1/25、1/50、1/100、1/1000或者更低。优选为，采用最少量的洗脱缓冲液执行本发明的方法以确保在所述洗脱缓冲液中的被分离分析物的浓度最大。更优选为，至少一种被分离的分析物在洗脱缓冲液中的浓度将高于之前在试样中的浓度。
[0142]在分离被俘获的分析物后，依照一些化学或者物理性质诸如分子量、等电点或者与化学或生物化学配体的结合力等，通过浓缩或者分提对所述分析物进行进一步的处理。核酸、蛋白质、脂质和多糖的分提法在本领域内公知并在例如Scopes，Protein Purification：Principlesand Practice(1982)；Sambrook et al.，Molecular Cloning—A LaboratoryManual(2nd ed.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，N.Y.，(Sambrook)(1989)；和Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel et al.，eds.，Current Protocols，a joint venturebetween Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(1994Supplement)(Ausubel)中进行了讨论。
F.检测被分离的分析物
[0143]在分析物经洗脱并与结合部分分离之后，所述分析物可被检测、量化或者运用任何可供本领域技术人员使用的技术进行其他的特征化。对复杂试样运用本发明的分析技术的特点在于，相对于在原始试样中发现的分析物浓度的宽范围，被分离的分析物的分析物浓度差异的动态减小。与使用原始样品本身所提供的供分析的百分比例相比，所述分析物浓度范围的减小使得在原始试样中发现的分析物以更大的百分比被检测和特征化而不需要重新校准检测设备。实际达到的分析物浓度范围减小取决于多种因素，包括所述原始试样的性质，以及所使用的结合部分的性质和多样性。通常，采用此处描述的技术的分析物浓度差异的减小足以使得至少25％，更优选为至少30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％的分析物经分离检测而无需进行仪器再校准。理想地是，本发明使得至少90％、95％、98％或更多的分析物经分离检测也无需仪器再校准。
[0144]可运用任何适合的本领域普通技术人员公知的方法检测采用此处描述的技术分离的分析物。例如，采用染料的比色测定是广泛可用的。作为另外一种选择，可通过光谱实现检测。光谱检测器依赖于折射率的变化；紫外和/或可见光吸收，或用合适的波长激发后的荧光来检测反应成分。示例性的检测方法包括荧光计、吸收光谱、反射光谱和透射光谱。检测的其他例子则依据抗体的使用(例如，ELISA和蛋白质印迹法)。双折射、折射率或衍射的变化也可用于检测复合物形成或反应进程。特别有用的检测分子相互作用的技术包括表面等离子体共振、椭圆光度法、共振镜技术、光栅偶合波导技术和多极共振光谱。这些以及其他技术是公知的并能容易地由本领域技术人员应用于本发明，而无需不适当的试验。许多这样的或者其他方法可在例如＂SpectrochemicalAnalysis＂Ingle，J.D.and Crouch，S.R.，Prentice Hall Publ.(1988)and＂Analytical Chemistry＂Vol.72，No.17中找到。
[0145]优选的检测方法是通过质谱。质谱技术包括但并不局限于离子化(I)技术如基质辅助激光解附(MALDI)、连续或脉冲电喷雾(ESI)及相关方法(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY)，或者massive cluster imapct(MCI)；这些离子源可与检测方式相配合，所述检测方式包括线性或非线性发射飞行时间(TOF)，单个或多个四极杆，单个或多个磁性扇，傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)，离子阱及其组合(例如，离子阱/飞行时间)。对于离子化，可采用多种基质/波长组合(MALDI)或溶剂组合(ESI)。例如采用ESI(Valaskovic，G.A.etal.，(1996)Science 273：1199-1202)质谱或MALDI(Li，L.et al.，(1996)J.Am.Chem.Soc.118：1662-1663)质谱可检测分析物的subattomole水平。ESI质谱由Fenn et al.(J.Phys.Chem.88，4451-59(1984)；PCT申请号WO90/14148)提出并且在最近的综述文章(R.D.Smith et al.，Anal.Chem.62，882-89(1990)and B.Ardrey，Electrospray Mass Spectrometry，Spectroscopy Europe，4，10-18(1992))中总结了其当前的应用。MALDI-TOF质谱由Hillenkamp等提出(＂Matrix Assisted UV-LaserDesorption/Ionization：A New Approach to Mass Spectrometry of LargeBiomolecules，＂Biological Mass Spectrometry(Burlingame and McCloskey，editors)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，pp.49-60，1990)。利用ESI，由于存在多重离子峰用于质量计算，在毫微微摩尔量的样品中的分子量测定是非常准确。本发明的优选分析方法利用表面增强激光解附/离子化(SELDI)，如在U.S.Pat.No.6,020,208中所讨论的。对于那些其中分析物的洗脱液直接至质谱探针或者生物芯片，或者其中洗脱缓冲液含有基质材料或洗脱缓冲液在分析物从结合部分上洗脱以后与基质材料混合的本发明的实施方式，质谱是特别优选的方法。
[0146]另一种不同的将被具有顺磁性质的组合小珠俘获的蛋白质洗脱的模式可与所述蛋白质的分析相结合。例如当所述小珠的尺寸小到足以使所有的配体多样性在数μL的体积之内，与蛋白质相连的具有顺磁性质的颗粒样品可直接加载到MALDI探针或者ProteinChip(蛋白质芯片)分析点上。加入所述基质(存在溶剂和酸)使蛋白质和配体的相互作用减弱，向该化合物发射的激光将使蛋白质离子化并因此可由质谱对其进行检测。
[0147]另一种广泛采用的检测方法是根据所关心的分析物的一种或多种物理性质的电泳分离。特别优选的用于多肽和蛋白质分析物的实施方式是二维电泳。优选的应用在第一维上通过等电点分离所述分析物，然后在第二维上通过尺寸分离。分析物的电泳分析方法随所研究的分析物而广泛变化，但判断适用于给定分析物的特定电泳方法的技术对本领域技术人员是公知的。
V.利用生产小珠库的蛋白质纯化
[0148]非常常见其性质未知的污染蛋白质与目标蛋白质共同纯化至一定程度，并非常难以从目标蛋白质中去除。例如，在治疗性蛋白质溶液的情况下，即使痕量的污染蛋白质也可对被施用所述治疗性蛋白质的患者产生灾难性的作用。如此的作用包括严重的过敏或免疫反应。经常这些作用是由来自于用于重组性表达所述治疗性蛋白质的真核或原核细胞的污染蛋白质引起的。这些污染蛋白质已知为HCP(宿主细胞蛋白质)。根据定义，HCP是非常多种多样的并且采用现有技术的方法不能在单一方法中除去。因此将其除去是在一系列步骤中能发生但并非一定发生的，所述一系列的步骤也使所关心的治疗性蛋白质的总产率降低。因此，本发明的再一个目的是提供采用此处描述的组合物纯化感兴趣的蛋白质。
A.将样品与化学结构库相接触以及相结合
[0150]本发明提供了用于纯化目标蛋白质组的方法。这些方法包括步骤(a)将含有至少95％所述目标蛋白质组和至多5％污染蛋白质的样品与与具有至少100种不同的化学结构的化学结构库相接触，所述化学结构库的量足以结合污染蛋白质和少量目标蛋白质组；(b)将所述污染蛋白质和少量的目标蛋白质组与化学结构库相连接。
[0150]再次，在所述方法中利用磁力操作具有顺磁性质的颗粒使之能洗涤所述颗粒并移除液体，而在所述过程中不损失所述颗粒。
[0151]当被放置与含有各种各样分析物的样品接触时，所述化学结构将与所述样品中的各种杂质如污染蛋白质结合。含量丰富的分析物如所关心的目标蛋白质组的存在量将远超过使其对应的化学结构饱和所需的量。因此，这些含量丰富的分析物总量的高百分比例将保持未结合状态，而仅有少量将与化学结构结合。相反，含量较少的痕量分析物，诸如所述污染蛋白质，指那些不能使其所有可用的化学结构饱和的蛋白质。因此，所述污染蛋白质的原始量的大部分将与其对应的化学结构结合。
[0152]在样品中存在的分析物，目标蛋白质组和污染蛋白质与具有至少100,000种不同化学结构的化学结构库在在以下条件下接触，即，使每种化学结构与其相应的如果在样品中存在的分析物结合。通常，样品与化学结构库在以下条件下相接触，即，能使污染蛋白质和少量目标蛋白质组与所述化学结构结合。纯化目标蛋白质组所需的条件将根据各种参数变化，所述参数包括所述目标蛋白质组的固有性质，所述污染蛋白质的性质等。
[0153]可通过多种方法将样品与化学结构库相接触。在优选方法中，所述样品与磁性材料混合并温育足够的时间以使所述杂质与所述化学结构结合。然后，利用磁力将结合有杂质的具有顺磁性质的颗粒与溶液分离。所述溶液与颗粒分离，并含有经纯化的蛋白。
[0154]典型地，所述样品和化学结构存在于结合缓冲液中。合适的结合缓冲液的非限制性实施例包括含有50mM磷酸钠和0.15MNaCl，pH7的溶液；含有50mM磷酸钠和0.15M NaCl，pH8的溶液等。合适的结合缓冲液包括，例如，Tris类缓冲液、硼类缓冲液、磷类缓冲液、咪唑、HEPES、PIPES、MOPS、MOPSO、MES、TES、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等。
[0155]合适的结合缓冲液包括那些改变分析物和/或化学结构的表面电荷的结合缓冲液，例如pH缓冲液。pH缓冲液优选为强缓冲液，足以使溶液的pH保持在酸性范围内，即，pH低于7，优选为低于6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或3.0；或者在pH高于7的碱性范围内，优选为高于7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、9.3、10.0或11.0。适于从含有目标蛋白质组和污染蛋白质的样品中纯化所述目标蛋白质组的pH条件为约3.5～约11，约4.0～约10.0，约4.5～约9.5，约5.0～约9.0，约5.5～8.5，约6.0～约8.0或者约6.5～约7.5。典型地，结合缓冲液具有约6.5～约7.5的pH。在可作为另外一种选择的的实施方式中，结合缓冲液具有约6.5～约8.5的pH。
[0156]作为另外一种选择，可以使用各种盐浓度的结合缓冲液。适用于从含有目标蛋白质组和污染蛋白质的样品中纯化所述目标蛋白质组的示例性NaCl盐浓度为约0.01M NaCl～约3M NaCl，约0.05MNaCl～约1.5M NaCl，约0.1M NaCl～约1.0M NaCl或者约0.2MNaCl～约0.5M NaCl。优选的结合缓冲液具有约0M～约0.25M的盐浓度。其他适合在结合缓冲液中的盐是KCl或者NaHOAc。
[0157]其他适用于本发明的结合缓冲液包括上述缓冲液成分的组合。由两种或者两种以上的上述结合缓冲液成分配制的结合缓冲液能改变所述污染蛋白质和化学结构间分子相互作用的选择性。
[0158]本领域普通技术人员能理解的是，用于蛋白质纯化的温度条件根据被纯化的所关心的目标蛋白质组的性质而变化。典型地，适用于从含有目标蛋白质组和污染蛋白质的样品中纯化所述目标蛋白质组的温度条件为约4℃～约40℃，约15℃～约40℃，约20℃～约37℃或约22℃～约25℃。典型的温度条件为约4℃～约25℃。一个优选温度是约4℃。
[0159]经过一段足以使污染蛋白质和少量目标蛋白质与所述化学结构库结合的时间完成使样品与化学结构库接触并使分析物与所述化学结构结合。典型地，所述化学结构库与所述含有目标蛋白质组和污染蛋白质的样品共同温育至少约10分钟，通常为至少20分钟，更优选为至少30分钟，更优选为至少约60分钟。温育时间也可以为数个小时，例如长达至12小时，但典型地为不超过约1小时。当例如采用柱进行本发明的方法时，样品与化学结构库接触的时间称为驻留时间。典型的驻留时间为约1分钟～约20分钟。
[0160]一旦分析物已经与化学结构结合，所希望的是将所述分析物洗脱以进行进一步的分析。其中有效的洗脱缓冲液是在表1中所描述的洗脱缓冲液。它们可以单独使用或者按照预先确定的顺序使用(例如，先是起离子交换作用的洗脱液，然后是能解开疏水缔合的洗脱液等)。
表1：用于吸附在固相肽库上的蛋白质的不同洗脱方案列表
洗脱剂组成被解离的键
盐1M氯化钠离子相互作用
二醇50％在水中的乙二醇弱疏水缔合
酸性pH200mM甘氨酸-HCl pH2.5氢键，构象变化
解离-去污剂2M硫脲-7M尿素-4％CHAPS混合模式，疏水缔合，氢键
变性剂6M胍-HCl pH6所有类型的相互作用
水-有机乙腈(6.6)-异丙醇(33.3)-三氟乙酸(0.5)-水(49.5) 强疏水缔合
酸性解离剂9M尿素，2％CHAPS，柠檬酸至pH3.0-3.5 氢键，离子相互作用
碱性解离剂9M尿素，2％CHAPS，氨水至pH11 离子相互作用，氢键
[0161]本发明的一种缓冲液包含适用于质谱的基质材料。在所述洗提缓冲液中包含基质材料，本发明的一些实施方式可选地包括从结合部分上洗脱分析物直接至质谱探针，例如蛋白质或者生物芯片。在本发明的其他实施方式中，所述基质与从结合部分上洗脱的分析物混合。另外的实施方式包括直接洗脱分析物至SEND或SEAC/SEND蛋白质芯片，所述SEND或SEAC/SEND蛋白质芯片包括预先分布在所述蛋白质芯片上的能量吸收基质。在这些后述实施方式中，不再需要在所述洗脱缓冲液中存在其他的基质材料。
[0162]在一种实施方式中，是通过施加磁力从与所述化学结构相结合的污染蛋白质和目标蛋白质组中分离未结合的目标蛋白质组，其中所述化学结构与磁性小珠相连。与所述化学结构/磁性小珠相结合的蛋白质将被拉离未结合的目标蛋白质组。所述未结合的目标蛋白质组将存在于上清液中，并从其中得以收集。典型地，磁性小珠包括铁磁氧化物颗粒，诸如铁磁性氧化铁、磁赤铁矿、磁铁矿或铁酸锰锌(参见例如U.S.专利号6,844,426)
VI.试剂盒
[0163]本发明还提供用于纯化目标蛋白质组的试剂盒。所述试剂盒包括能使本领域普通技术人员实施此处描述的方法的成分。在优选实施方式中，所述试剂盒包括具有至少100种不同化学结构的化学结构库和通过将含有至少95％的目标蛋白质组和至多5％污染蛋白质的样品与所述化学结构库相接触纯化目标蛋白质的说明书。
[0164]在本发明的另一实施方式中，试剂盒包括此处所描述的可用于减小混合物中分析物浓度范围的组合物。在另一实施方式中，试剂盒包括此处所描述的可用于检测混合物中分析物的组合物。
[0165]可选地，本发明的试剂盒包括应用所述组合物以实践本发明的方法的说明书。所述说明书可以以各种形式的附属试剂盒存在，在所述试剂盒中可有一个或者一个以上的说明书。所述说明书可以以在合适介质或基材，例如纸，上的印刷信息存在，例如在其上印刷有如何通过将含有至少95％的目标蛋白质组和至多5％污染蛋白质的样品与所述化学结构库相接触纯化目标蛋白质组的信息。其他形式可以是电脑可读的介质，诸如CD或磁盘，在其上记录有如何通过将含有至少95％的目标蛋白质组和至多5％污染蛋白质的样品与所述化学结构库相接触纯化目标蛋白质组的信息。另一种形式可以是网页地址，试剂盒的用户可通过互联网使用该网页地址获得如何通过将含有至少95％的目标蛋白质组和至多5％污染蛋白质的样品与所述化学结构库相接触纯化目标蛋白质组的信息。其他说明书描述除此处描述的方法之外的组合物的用途。
[0166]在本发明的另一实施方式中，本发明的试剂盒进一步包括复数个容器盛有用于使所述样品与所述化学结构库或者一根或一根以上的柱子如分提柱相接触的温育缓冲液。
[0167]本发明的试剂盒也可包括复数个容器盛有用于样品制备和分析物分离的成分。该种类的示例性成分包括一种或一种以上的溶液足以从颗粒上移除未结合的材料，和至少一种洗脱溶液足以释放与化学结构特异性结合的分析物。
[0168]在本发明的一些试剂盒实施方式中，提供与固体载体，优选为不溶性小珠相连的化学结构库。在其他实施方式中，所述固体载体和化学结构库是分别提供的。当分别提供时，所述化学结构库和/或固体载体包括连接部分和/或补充性连接部分使得本发明的操作者能在此处所描述的本发明的实践过程中将所述化学结构与所述固体载体相连。提供独立的化学结构库和固体载体的试剂盒可选地包括进行连接所述化学结构库至所述固体载体试剂所必需的其他试剂。
[0169]此外，本发明的试剂盒可包括色谱介质用于从先前的样品中纯化目标蛋白质，用于随后使用本发明的结构化学库进行修饰。
[0170]其他本发明的试剂盒包括可选的功能性成分诸如磁体，将是的本领域普通技术人员能实施此处描述的任何方法变化。
[0171]虽然为清楚和理解的目的，上述发明已通过描述和实施例的方式略为详细地进行了描述，但对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是根据本发明的教学，不必背离本发明的精神和范围可做出某些变体、改变、修改以及替代等价物。因此结果，此处描述的实施方式可经过各种修改、改变等，而本发明的范围仅仅决定于参考引用所述的权利要求。本领域的技术人员可容易地意识到许多非关键性的参数能被变化、改变或修改以获得基本类似的结果。
[0172]当本发明的每一种要素在此处描述为含有多种实施方式时，应当理解的是，除非另外指明，本发明的每一指定要素的每一种实施方式是能够与本发明的其他要素的每一种实施方式共同应用，并且每一种如此应用旨在形成本发明的截然不同的实施方式。
[0173]从上述公开显而易见的是，本发明具有广泛多样化的应用。通过以下实施例进一步描述本发明，所述实施例仅仅是描述性的而并非旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。
[0174]在本发明的优选实施方式中，在化学结构库，例如组合库中的独立化学结构的数目是如此巨大，因此假设样品中存在的每种蛋白对所述独立化学结构中的至少一种具有亲合性。典型地，所述化学结构与固体载体例如小珠相连。当含有所感兴趣的需经纯化的目标蛋白质组和许多污染蛋白质的样品与这样的组合库相接触时，独立的化学结构结合蛋白质结合伴侣，包括目标蛋白质组和污染蛋白质。所述组合库的多种多样性提供了对样品中每一种蛋白质即对于感兴趣的目标蛋白质组和污染蛋白质具有特异性的化学结构。然而，由于适用于单个蛋白质物种的小珠的有限容量，最少量的所述目标蛋白质组将被结合并随后从样品中除去。理论上，如果加入到样品中的连接在小珠上的多样性组合库的量是充分计算的，则所有污染蛋白质应当被除去而感兴趣的目标蛋白质组将被很少被除去。未结合的感兴趣的目标蛋白质组将留在所述上清液中并通过过滤、离心或其他方法与结合在所述化学结构库上的蛋白质分离。在分离后，收集所述目标蛋白质组。所收集的目标蛋白质组比在样品中的目标蛋白质组更纯。
[0175]从含有感兴趣的目标蛋白质组和污染蛋白质的样品中纯化目标蛋白质组是有利的，但有经验的技术人员也应理解本发明的方法也可被实施用于从含有目标蛋白质组和非多肽杂质或杂质的样品中分离感兴趣的目标蛋白质组。
VII.实施例
[0176]磁性固相配体库的制备可采用两种不同的方法完成：使用常规珠性吸附剂，并在其上构建库，随后引入顺磁材料，或者首先制造磁性颗粒然后在其上构建配体库。
[0177]第一种方法已简化用于实践，采用如下过程：
将肽库小珠装填入色谱柱形成约10cm长的基体。
用生理缓冲液使所述小珠柱子平衡。
将一体积或者两体积的磁铁矿悬浮液推入流过所述柱基体。
然后使用最初的生理缓冲液充分清洗所述柱以除去过量的磁铁矿。
然后用当前用于所述库的溶液如呈酸性或碱性pH的浓缩尿素溶液、浓缩胍-盐酸水溶液、硫脲-尿素-去污剂混合物、水-有机混合物等完成再次的清洗。
[0178]所得预先载有肽配体的小珠具有顺磁性质，并能通过磁场方式从液体中分离。约100埃的磁性颗粒的胶状悬浮液(可用阴离子或者阳离子表面活性剂稳定)缓慢地从所述柱的顶部载入。
实施例1：磁性固相肽配体库的制备以及用于减小人血清中蛋白质浓度差异(“均衡”)的非磁性固相肽配体库和磁性固相肽配体库的评估
[0179]在初始样品中，对非磁性和磁性颗粒使用六肽库，进行并排比较以确定存在磁铁矿对在均衡方法中使用具有顺磁性质的颗粒是否有任何不利的影响。由预先存在的非磁化材料开始制备固相配体库，如在WO 05094467 A2中所描述的(该库由每粒小珠上连有一种具有端伯胺基的肽类型构成；“OLOB”)。然后如下对部分非磁化材料进行磁化。10mL的粒径为40微米～110微米的非磁化材料装填在色谱柱中，用生理缓冲液(磷酸缓冲的盐水)充分冲洗。然后用20mL的磁性胶状颗粒悬浮液(EMG 807来自Ferrofluidics，德国)填入柱中，并放置一小时，，用相同的缓冲液充分冲洗直至移除过量的磁性胶状颗粒。用含有最终浓度50mM的柠檬酸的9M尿素第二次充分冲洗。最后在生理缓冲液中使小珠平衡。所得小珠非常容易受到磁场影响；通过简单地使用几秒钟的磁体即可将其从液体中分离。
[0180]1mL这些磁化小珠和和1ml非磁化小珠，每种已于所述六肽库相连接，然后与10mL人血清混合并在平缓搅动下放置30分钟。采用永磁体分离磁性肽组合配体小珠并弃去上清液。采用标准技术对非磁化小珠进行操作，诸如过滤和离心。在使用生理缓冲液进行数次洗涤之后，用9M尿素(柠檬酸调至pH3.3)洗脱吸附在所述磁性小珠上的蛋白质。收集的蛋白质随后用电泳(SDS-PAGE)和质谱(SELDI MS)进行分析，与相同非磁性小珠进行对比。如在图1中所看到的，非磁性小珠和具有顺磁性质的小珠均显示出相似的已结合的分析物的图案，所述已结合的分析物从与每种固体载体相连的六肽库上分离得到。此外，没有观察到明显的分析物与具有顺磁性质的颗粒的非特异性结合。
实施例2：用于减小人血清中蛋白质浓度差异的磁性固相肽配体库的制备和评估
[0181]使用磁力棒将悬浮在2ml体积溶液中的1mL直径为1μm的具有顺磁性质的反应性颗粒(来自Dynal)从上清液中分离，然后用100mM硼酸钠，pH9.5清洗多次。分别地，60mg组合六肽库溶解在由3mL的100mM硼酸钠，pH9.5，1.3mL的乙醇和1mL的DMSO构成的混合物中。所述经处理沉淀的具有顺磁性质的颗粒(1mL)加入到所述六肽溶液中。然后加入2.75mL的在100mM硼酸钠，pH9.5中的3.0M硫酸铵。在轻微晃动下将所述混合物在37℃温育25小时。
[0182]当所述小珠由于施加磁场而保持在所述容器内时，用含有0.1M乙醇胺的生理缓冲液替换所述上清液以封闭任何残留的活性基团。在37℃过夜完成该封端操作。最后，用生理缓冲液充分清洗所得偶联小珠直至完全除去试剂和副产品。所构建的库包括在单个小珠上的所有具有游离端羧基的肽(“ALOB”，所有配体在一粒小珠上，all-ligands-one-bead)。
[0183]如实施例1所述，对所得的在具有顺磁性质的小珠上的组合肽库进行评估。简言之，80μL的磁化小珠与800μL的人血清混合并在平缓搅动下放置30分钟。采用永磁体分离磁性肽组合配体小珠并弃去上清液。在使用生理缓冲液进行数次洗涤之后，用柠檬酸调至pH3.3的9M尿素洗脱吸附在所述磁性小珠上的蛋白质。收集的蛋白质随后用电泳(SDS-PAGE)和质谱(SELDI MS)进行分析。
[0184]显示在图2中的实验结果表明，与在更大尺寸的小珠上俘获的蛋白质(图1，泳道c)或者与用非磁性小珠俘获的蛋白质(图1，泳道b，图2，泳道b)相比，在1μm直径的磁性小珠上俘获类似的蛋白质(泳道c)。此外，与较大的磁性小珠的观察一样，在1μm直径的磁性小珠上没有观察到明显的非特异性结合。
实施例3：用连有肽配体库的具有顺磁性质的颗粒进行样品处理的再现性
[0185]来自于实施例2的覆盖有组合肽配体的磁性1μm直径的小珠用于对比性研究以核查血清处理的再现性。
[0186]14份10μL的小珠从储备悬浮液中取出并分放在14根不同的小试管中。向每根试管中加入800μL的血清并在平缓搅动下将所有试管温育30分钟。如以上实施例1和2所述分离每根试管中的上清液，并用生理缓冲液充分洗涤。随后，用含有50mM柠檬酸的9M尿素水溶液，pH3.3从每根试管的小珠上洗脱吸附的蛋白质。收集的蛋白质溶液用SELDI MS分析。图3显示出该分析的良好重现性。
实施例4：用于减小人血清中蛋白质浓度差异(“均衡”)的磁性固相肽配体库的制备和评估
[0187]来自于Dynal的直径为2.8μm的具有顺磁性质的反应性颗粒经修饰以引入伯胺。这根据供应商的推荐利用偶联乙二胺实现。所述活泼衍生物用磷酸缓冲的盐水以及用去离子水充分洗涤。然后逐渐用二甲基甲酰胺洗涤所得衍生物数次以完全除去水。在该阶段，所述小珠用于传统组合方式(等分-偶联-重组)的固相肽合成以得到最终六肽库。该库具有端伯胺。所有操作例如固液分离均采用外部磁场完成以将小珠保留在容器中。
[0188]最终产品用以下系列的溶液充分洗涤：100％DMF、50％-50％DMF-水、100％水、生理缓冲液并最终保存在含有20％乙醇的1M氯化钠溶液中。随后将所述最终悬浮液储存在+4℃。按此方法构建的库包括在单个小珠上的一种具有端伯氨基的肽。
[0189]含有约10μL已沉淀的具有顺磁性质的颗粒的20μL的小珠悬浮液用生理缓冲液充分洗涤并加入到200μL人血清中。在室温下晃动所述悬浮液30分钟。从所述悬浮液中，通过小磁体的方式除去具有顺磁性质的颗粒并放入小试管中洗涤直至从所述上清液中除去未结合的蛋白质。带有从血清中俘获的蛋白质的小珠随后用由经过加入2M柠檬酸钠酸化至pH3.3的9M尿素构成的洗脱缓冲液处理。在这些条件下，俘获的蛋白质从小珠上解附并分别收集。分离的蛋白质随后通过此处描述的SDS-PAGE和SELDI MS分析。预计结果显示蛋白质组成与初始样品相似，然而，作为初试样品中蛋白质浓度差异减小的结果，预计检测到更多的蛋白质物种。
引用参考的引入
[0190]在本说明书中引用的所有公报、专利和专利申请在此处以引用的方式将其整体引入，并达到与将各单独的公报、专利和专利申请具体地、个别地指出并以引用的方式引入相同的程度。