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使用新的杂交缓冲液用于检测染色体畸变的组合物和方法
    发明领域 本发明一般而言涉及用于在体内、 体外和原位检测染色体畸变的组合物和方法。 本发明还涉及用于杂交、 尤其是用于原位杂交 (ISH) 的组合物， 所述组合物包含用于检测 特定核苷酸序列 ( 包括正常序列和与染色体畸变和 / 或感染性疾病相关的序列 ) 的分子探 针和包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合物。
     在一个实施方案中， 本发明涉及用于例如细胞学、 组织学和分子生物学领域的分 子探针， 并涉及包含这种分子探针的试剂盒。 在其它实施方案中， 本发明涉及使用这种分子 探针来检测染色体畸变或感染性疾病的方法， 使用这种分子探针来诊断遗传缺陷或疾病状 态的方法， 以及使用这种分子探针来提供预后的方法。
     背景和描述
     许多病理性状态， 先天性缺陷和后天性疾病， 都与染色体畸变有关， 例如扩增、 非 整倍性、 潜在断点、 插入、 倒位、 缺失、 重复、 重排和易位。此外， 致病性感染通常会导致受感 染生物体内存在感染性细菌、 病毒或真菌的核酸序列。
     通过基因组 DNA、 染色体、 染色体片段或基因的体内、 体外或原位分析， 确定与先天 性缺陷、 后天性疾病或感染性病原体相关的核苷酸序列的存在与否， 可有助于临床医生作 出合适诊断。例如， 脆性 X 精神发育迟缓 -1(fragile X mental retardation-1， FMR1) 基 因的 mRNA5′ UTR( 非翻译区 ) 中的 CGG 三核苷酸重复序列的扩增允许临床医生诊断脆性 X 综合征。这种扩增导致基因转录沉默。然而， 其它机制， 例如 FMR1 的缺失和突变， 也可能 会导致脆性 X 综合征。其结果， 基因产物 FMRP 不存在或数量减少而导致疾病， 与扩增所导 致的沉默和基因缺失是一样。由数目异常所导致的疾病的一个实例是唐氏综合征 (Down Syndrome)， 也称为三性体 21( 唐氏综合征个体具有 3 拷贝的染色体 21， 而不是 2 拷贝 )。 特纳氏综合征 (Turner Syndrome) 是单性体的一个实例， 其中个体出生时就只有一条性染 色体 X。其它实例包括由染色体 4 部分缺失所致的 Wolf-Hirschhorn 综合征和也称为末端 11q 缺失症的 Jacobsen 综合征。某些综合征， 例如 Charcot-Marie-Tooth 病 1A 型可因例如 染色体 17 上编码周围髓鞘质蛋白 22(PMP22) 的基因重复而导致。在其它综合征例如罗伯 逊易位 (Robertsonian translocation) 中， 一条完整染色体与另一条在着丝粒处连接。罗 伯逊易位仅发生在染色体 13、 14、 15、 21 和 22， 罗伯逊易位的杂合载体的后代可能例如遗传 不平衡的三性体 21， 而引起唐氏综合征。
     通过基因组 DNA、 染色体、 染色体片段或基因的体内、 体外或原位分析， 确定与先天 性缺陷、 后天性疾病或感染性病原体相关的核苷酸序列的存在与否， 对于临床医生在已经 诊断出疾病状态之后选择合适治疗进程而言， 也是很有价值的。例如， HER2 基因已扩增的 TM 乳癌患者可从 Herceptin ( 曲妥单抗， 能识别 HER2 蛋白的单克隆抗体 ) 治疗中受益。在另 一个实例中， 临床医生可选择给予 EGFR 基因已扩增的结直肠癌患者 ( 西妥昔单 TM 抗 ) 或 Vectibix (panitumumab)( 特异性识别表皮生长因子受体 (EGFR) 的治疗性单克隆 抗体 )。
     通过基因组 DNA、 染色体、 染色体片段或基因的体内、 体外或原位分析， 确定与先天
     性缺陷、 后天性疾病或感染性病原体相关的核苷酸序列的存在与否， 也有助于临床医生提 供预后。因此， TOP2A 基因已扩增或缺失的乳癌患者比那些未扩增或缺失的患者而言， 预后 更差。
     对核苷酸序列存在与否的检测通常需要通过杂交、 或需要通过相对链上碱基间的 氢键结合 (A+T 或 G+C) 的核苷酸双螺旋结构的稳定化， 来识别序列。在杂交的基础实例中， 核酸片段或序列与互补核酸片段或序列结合。 通过杂交的检测通常涉及使用经设计可与核 酸靶标例如 DNA 或 RNA 序列结合或 “杂交” 的核酸探针。
     分子生物学领域已经有众所周知的技术， 用于检测染色体畸变。然而， 迄今为止， 还没有允许广泛而常规检测染色体畸变的快速、 方便、 便宜和用户友好的可用的测试。
     核酸杂交测定的效率和准确度主要取决于以下 3 个因素中的至少一个 ： a) 变性 ( 即例如两条核酸链的分离 ) 条件， b) 复性 ( 即例如两条核酸链重新退火 ) 条件， 和 c) 杂 交后的洗涤条件。
     传统的杂交实验， 例如 ISH 测定， 使用含甲酰胺的缓冲液， 以使双链核酸链变性。 甲酰胺是一种溶剂， 它通过置换松散而均匀结合的水合分子而对例如 DNA、 RNA 及其类似物 的螺旋状态具有去稳定效应。此外， 甲酰胺通过碱基 Watson-Crick 结合位点的 ‘甲酰胺化’ 而使 DNA、 RNA 及其类似物的卷曲状态稳定。 变性步骤之后是两条核酸链互补链的重新退火， 这是使用杂交的测定中最耗时间 的。例如， 在传统的荧光原位杂交 (FISH) 方案中， 重新退火需要 14-24 小时， 并且甚至至多 需要 72 小时。传统杂交时间的实例见图 1 和图 2。
     迄今为止， 认为使用干扰核酸碱基 Watson-Crick 结合位点并因而破坏互补核酸 碱基间氢键的离液剂， 例如甲酰胺 ( 其它离液剂包括胍离子 (guanidinium hydrogen) 和尿 素 )， 是降低互补链的解链温度 (Tm) 的唯一方式， 如同变性步骤中所必需的一样。然而， 尽 管使用离液剂降低了 Tm， 这些试剂看来与在不含离液剂的含水溶液中进行的杂交相比， 明 显延长了杂交时间。
     甲酰胺在长时间处理中具有缺点。甲酰胺是有毒有害物质， 其使用和废料都受到 严格的法规管制。此外， 使用高浓度甲酰胺看来会导致细胞结构、 核结构和 / 或染色体结构 的形态学上的破坏。
     本文所述的含水组合物允许在比现有技术具有若干潜在优势的条件下进行核酸 序列检测， 所述优势例如更快的杂交时间， 更低的杂交温度和更少毒性的杂交组合物。
     发明概述
     本发明提供用于检测染色体畸变相关的核酸序列的组合物和方法。本发明的组 合物和方法可用于使用碱基配对而杂交或结合的任何杂交技术和任何分子系统， 例如 DNA、 RNA、 PNA、 LNA 及其合成和天然类似物。本发明的组合物和方法允许用于染色体畸变相关核 酸序列的高灵敏度的、 技术简单的、 灵活可靠和 / 或快速的检测。在一个实施方案中， 本发 明通过比用现有技术方法程度大得多地改变杂交反应的温度， 提供定制杂交时间的能力。 本发明的杂交组合物和方法保持了生物样品的形态学， 提供了无毒杂交组合物和程序， 提 供了低蒸发杂交技术， 降低和 / 或取消了对封闭非特异性结合的需求， 和 / 或允许使用多相 探针， 而无需封闭、 去除或用其它方法破坏例如生物样品中的重复序列的结合。
     在一个实施方案中， 本发明提供的组合物包含检测染色体畸变相关核苷酸序列的
     第一分子探针， 以及包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的 含水组合物。在另一个实施方案中， 本发明提供包含这种组合物的试剂盒。在又一个实施 方案中， 本发明提供包含第一组合物和第二组合物的试剂盒， 其中所述第一组合物包含检 测染色体畸变相关核苷酸序列的第一分子探针， 第二组合物是包含足以变性双链核苷酸序 列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合物。
     本文所提供的组合物和试剂盒可用于例如基因组 DNA、 染色体、 染色体片段和基 因等的核酸的体内、 体外和 / 或原位分析， 其使用例如以下技术 ： PCR、 原位 PCR、 RNA 印 迹、 DNA 印迹、 流式细胞术、 放射自显影、 荧光显微镜术、 化学发光、 免疫组织化学、 虚拟核型 (virtual karyotype)、 基因测定、 DNA 微阵列 ( 例如阵列比较基因组杂交 ( 阵列 CGH))、 基因表达谱、 基因 ID、 叠瓦阵列 (Tiling array)、 凝胶电泳、 毛细管电泳和原位杂交例如 FISH、 SISH、 CISH。在一个实施方案中， 所述组合物和试剂盒可用于核酸的体内、 体外或原 位分析， 用于分析正常状态或疾病 ( 例如先天性疾病、 癌症或感染 ) 相关的染色体畸变， 例 如非整倍性、 潜在断点、 插入、 倒位、 缺失、 重复、 基因扩增、 重排和易位。本文所提供的组合 物和试剂盒也可用于检测 RNA 表达水平例如 mRNA 及其互补 DNA(cDNA) 的变化。本发明的 组合物和试剂盒可用于体外、 体内或原位样品 ( 包括例如哺乳动物样品例如人类样品 )， 例 如骨髓涂片、 血涂片、 石蜡包埋的组织制备物、 酶解的组织样品、 骨髓、 羊水细胞、 细胞离心 (cytospin) 制备物、 印迹 (imprint) 等。 其它用途包括使用 FRET 和其它猝灭技术的基于溶液的杂交测定 ； 用链霉抗生物 TM 素缀合物检测生物素标记， 例如使用原位 DakoGenPoint 扩增的检测系统或 Tyramide 信号 放大 (TSA) 系统 (K0620， Dako) ； 或者用金属 ( 例如金和银 ) 直接标记。
     在一个实施方案中， 本发明提供检测染色体 DNA 中的靶标的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供与染色体 DNA 中的靶标杂交的至少一种分子探针，
     - 提供染色体 DNA，
     - 提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交 组合物， 其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)，
     - 将所述分子探针、 所述染色体 DNA 和所述杂交组合物混合在一起， 其时间至少足 以使所述分子探针与所述靶标杂交， 和
     - 检测所述靶标。
     在另一个实施方案中， 本发明提供确定核酸序列中染色体畸变存在的方法， 所述 方法包括 ：
     - 提供至少一种分子探针，
     - 提供所述核酸序列，
     - 提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交 组合物， 其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)，
     - 将所述分子探针、 所述核酸序列和所述杂交组合物混合在一起， 其时间至少足以 使所述分子探针与所述核酸序列杂交， 和
     - 检测所述至少一种分子探针，
     - 并确定染色体畸变的存在。
     在又一个实施方案中， 本发明提供确定核酸序列中染色体畸变存在的方法， 所述
     方法包括 ：
     - 提供所述核酸序列，
     - 提供包含至少一种分子探针和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极 性非质子溶剂的杂交组合物，
     - 将所述杂交组合物用于所述核酸， 其时间至少足以使所述分子探针与核酸序列 杂交， 和
     - 检测所述至少一种分子探针，
     - 并确定染色体畸变的存在，
     其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)。
     在另一个实施方案中， 本发明提供确定核酸序列中染色体畸变存在的方法， 所述 方法包括 ：
     - 提供所述核酸序列，
     - 将权利要求 1-50 中任一项的组合物用于所述核酸序列， 其时间至少足以使所述 分子探针与核酸序列杂交， 和
     - 确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。 在又一个实施方案中， 本发明提供诊断染色体畸变相关的先天性遗传疾病、 癌症 或感染的方法， 所述方法包括提供来自受试者的组织样品， 其中所述组织样品包含核酸序 列， 确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中， 和如果染色体畸变存在于所述组织样品 中则诊断所述先天性遗传疾病、 癌症或感染。所述样品可以是哺乳动物样品。在一个实施 方案中， 所述样品是人类样品。
     本发明的杂交组合物和方法可例如不用甲酰胺或减少对甲酰胺的依赖性。例如， 本发明的方法和组合物可降低杂交的能障， 而不用甲酰胺。降低能障可减少杂交所需时间 和 / 或降低杂交所需温度。例如， 本发明可允许在较低温度 ( 包括室温 ) 杂交， 或可允许在 较高温度快速杂交。因此， 在某些方面， 本发明克服了杂交测定中的主要耗时步骤。
     本发明一方面是用于杂交的组合物或溶液。 用于本发明的组合物包括含有至少一 种核酸序列和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合 物。变性双链核苷酸序列的有效量是能够杂交的量。例如， 用于测定极性非质子溶剂的量 是否对杂交有效的一个方式就是， 确定所述极性非质子溶剂， 当用于本文所述的杂交方法 和组合物例如实施例 1 时， 是否能产生可检测信号和 / 或扩增的核酸产物。
     极性非质子溶剂有效量的非限制性实例包括例如约 1％至约 95％ (v/v)。在某些 实施方案中， 极性非质子溶剂的浓度为 5％至 60％ (v/v)。在其它实施方案中， 极性非质子 溶剂的浓度为 10％至 60％ (v/v)。在再一些实施方案中， 极性非质子溶剂的浓度为 30％至 50％ (v/v)。1％至 5％、 5％至 10％、 10％、 10％至 20％、 20％至 30％、 30％至 40％、 40％至 50％、 或 50％至 60％ (v/v) 的浓度也是合适的。在某些实施方案中， 极性非质子溶剂的浓 度可以是 0.1％、 0.25％、 0.5％、 1％、 2％、 3％、 4％或 5％ (v/v)。在其它实施方案中， 极性 非质子溶剂的浓度可以是 7％、 7.5％、 8％、 8.5％、 9％、 9.5％、 10％、 10.5％、 11％、 11.5％、 12％、 12.5％、 13％、 13.5％、 14％、 14.5％、 15％、 15.5％、 16％、 16.5％、 17％、 17.5％、 18％、 18.5％、 19％、 19.5％或 20％ (v/v)。
     依据本发明的另一方面， 包含极性非质子溶剂的含水组合物具有降低的毒性。例
     如， 比传统杂交溶液毒性更低的组合物可包含组合物， 前提条件是所述组合物不含甲酰胺， 或条件是所述组合物含有小于 10％、 或小于 5％、 或小于 2％、 或小于 1％、 或小于 0.5％、 或 小于 0.1％、 或小于 0.05％、 或小于 0.01％甲酰胺。一种低毒的组合物也可包含组合物， 条 件是所述组合物不含二甲亚砜 (DMSO)， 或条件是所述组合物含有小于 10％、 5％、 2％、 或小 于 1％、 或小于 0.5％、 或小于 0.1％、 或小于 0.05％、 或小于 0.01％的 DMSO。
     在本发明的一方面， 可根据极性非质子溶剂的 Hansen 溶度参数， 来选择用于本 发明的合适极性非质子溶剂。例如， 合适的极性非质子溶剂可具有的分散溶度参数介于 1/2 17.7-22.0MPa 之间， 极性溶度参数介于 13-23MPa1/2 之间， 氢键溶度参数介于 3-13MPa1/2 之间。
     依据本发明的一方面， 用于本发明的合适极性非质子溶剂是环状化合物。环状化 合物具有环状基本结构。实例包括本文所公开的环状化合物。在其它实施方案中， 所述极 性非质子溶剂可选自下式 1-4 ：
     其中 X 为 O， R1 为烷基二基。 依据本发明的另一方面， 用于本发明的合适极性非质子溶剂可选自下式 5 ：
     其中 X 是任选的， 如果存在则选自 O 或 S ； 其中 Z 是任选的， 如果存在则选自 O 或 S ； 其中 A 和 B 独立地为 O 或 N 或 S 或烷基二基的一部分或伯胺 ； 其中 R 为烷基二基 ； 和 其中 Y 为 O 或 S 或 C。 式 5 的合适极性非质子溶剂的实例在下式 6-9 中提供 ：其中 ： X 不存在 ； A、 B和Z为O； Y为C； 和 R 为乙烷 -1， 2 二基 ；其中 ： 其中 ： Z和X为O； X 不存在 A 和 B 为烷基二基 A 为烷基二基的 的一部分 ； 一部分 ； Y为S； 和 Y为C； R 为丁烷 -1， 4基； B和Z为O； 和 R 为丙烷 -1， 3 二基 ；其中 ： X 不存在 ； A 为烷基二基的 一部分 ； Y为C； B 为甲胺 ； Z为O； 和 R 为丙烷 -1， 3 二基。依据本发明的又一实施方案， 所述极性非质子溶剂具有内酯、 砜、 腈、 亚硫酸或碳 酸官能团。这类化合物的特征是具有相当高的介电常数、 高偶极距和水溶性。
     依据本发明的另一方面， 具有内酯官能团的极性非质子溶剂是 γ- 丁内酯 (GBL)， 具有砜官能团的极性非质子溶剂是环丁砜 (SL)， 具有腈官能团的极性非质子溶剂是乙腈 (AN)， 具有亚硫酸官能团的极性非质子溶剂是亚硫酸乙二醇酯 (GS)， 具有碳酸官能团的极 性非质子溶剂是碳酸亚乙酯 (EC)、 碳酸异丙二醇酯 (PC) 或硫代碳酸亚乙酯 (ETC)。
     附图简述
     图 1 描绘了用第一标记的 FISH 探针对甲醛固定的石蜡包埋的组织切片 ( 组织学 标本 ) 进行单基因座检测的典型时间进程。条带代表用传统溶液进行的杂交 ( 上 ) 和用本 发明组合物进行的杂交 ( 下 ) 的典型时间进程。每个时间进程的左边第一条带代表脱蜡步 骤； 第二条带代表加热 - 预处理步骤 ； 第三条带代表消化步骤 ； 第四条带代表变性和杂交步 骤； 第五条带代表严格性洗涤步骤 ； 和第六条带代表封固步骤。
     图 2 描绘了用第一标记的 FISH 探针对细胞学标本进行单基因座检测的典型时间 进程。条带代表用传统溶液进行的杂交 ( 上 ) 和用本发明组合物进行的杂交 ( 下 ) 的典型 时间进程。每个时间进程的左边第一条带代表固定步骤 ； 第二条带代表变性和杂交步骤 ； 第三条带代表严格性洗涤步骤 ； 和第四条带代表封固步骤。
     发明详述
     I. 定义
     在本发明范围内， 下列术语可理解如下 ：
     “生物样品” 可理解为一种或多种细胞或细胞碎片的任何体内、 体外或原位样品。 它可以是例如单细胞生物或多细胞生物、 组织切片、 细胞学样品、 染色体铺片、 纯化的核酸 序列、 通过例如基于生物的系统或通过化学合成而制备的人工制备核酸序列、 微阵列或其 它形式的核酸芯片。在一个实施方案中， 样品是哺乳动物样品， 例如人、 小鼠、 猫、 大鼠或犬 的样品。
     “核酸” 、 “核酸链” 和 “核酸序列” 是指利用碱基配对而结合或杂交的任何核酸， 包 括具有由天然存在核苷酸和 / 或包含非标准核碱基 (nucleobase) 的核酸类似物而形成的 主链和 / 或非标准主链 ( 例如肽核酸 (PNA) 或锁核酸 (LNA)) 或核酸的任何衍生形式的寡 聚物或聚合物。
     本文所用的术语 “肽核酸” 或 “PNA” 是指具有携带悬垂核碱基 ( 天然的和经修饰 的 ) 的聚酰胺主链的合成聚合物， 包括但不限于例如在以下文献中涉及或声称是肽核酸 的任何寡聚物或聚合物区段 ： 美国专利号 5,539,082、 5,527,675、 5,623,049、 5,714,331、5,718,262 、 5,736,336 、 5,773,571 、 5,766,855 、 5,786,461 、 5,837,459 、 5,891,625 、 5,972,610、 5,986,053、 6， 107,470、 6,201， 103、 6,228,982 和 6,357,163、 WO96/04000， 所有 文献或其中所引用的任何参考文献都通过引用结合到本文中。PNA 上的悬垂核碱基例如嘌 呤碱基或嘧啶碱基， 可通过接头与主链连接， 所述接头例如在 PCT/US02/30573 或其中所引 用的任何参考文献中提及的接头之一。在一个实施方案中， PNA 具有 N-(2- 氨基乙基 )- 甘 氨酸 ) 主链。可按照 PCT/US02/30573 或其中所引用的任何参考文献所述， 来合成 ( 并任选 标记 )PNA。PNA 与 DNA 和 RNA 杂交紧密， 并具有高度序列特异性， 因为 PNA 主链不带电荷。 因此， 短 PNA 探针可表现出与较长 DNA 或 RNA 探针相当的特异性。PNA 探针在与互补 DNA 或 RNA 结合中也可表现出更高特异性。
     本文所用的术语 “锁核酸” 或 “LNA” 是指包含至少一个或多个 LNA 亚基的寡聚物 或聚合物。本文所用的术语 “LNA 亚基” 是指含有连接核糖的 2′ - 氧与 4′ - 碳的亚甲基 桥的核糖核苷酸。通常可参见 Kurreck， Eur.J.Biochem.， 270 ： 1628-44(2003)。
     核酸和核酸类似物的实例也包括核苷酸单体聚合物， 所述单体包括双链和单链脱 氧核糖核苷酸 (DNA)、 核糖核苷酸 (RNA)、 其 α- 异头物形式、 其合成和天然类似物等。核酸 链可完全由脱氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、 肽核酸 (PNA)、 锁核酸 (LNA)、 其合成或天然类似 物、 或其混合物组成。DNA、 RNA 或本文所定义的其它核酸都可用于本发明的方法和组合物。 “极性非质子溶剂” 是指有机溶剂， 其偶极距为约 2 德拜单位或更高， 在或邻近环 境温度即约 20℃时水溶性为至少约 5％ ( 体积 )， 并且在大约中性 pH( 即 5-9 的范围， 或在 6-8 的范围 ) 不经历明显的氢交换。 极性非质子溶剂包括以下所讨论的按照 Hansen 溶度参 数定义的那些。
     “烷基二基” 是指通过从母体烷、 烯或炔的两个不同碳原子中的各自除去一个氢原 子而得到的、 具有两个一价基团中心的饱和或不饱和、 支链、 直链或环状烃基。
     “含水溶液” 可理解为含有水、 甚至少量水的溶液。例如， 含 1％水的溶液就可理解 为含水溶液。
     除非另有说明， 否则 “杂交” 可理解为结合了杂交过程的变性和重新退火步骤。
     “杂交组合物” 是指用于进行杂交过程 ( 例如使探针与核酸序列结合 ) 的本发明 含水溶液。杂交组合物可包含例如至少一种极性非质子溶剂、 至少一种核酸序列和杂交溶 液。杂交组合物不包含酶或其它成分， 例如用于扩增生物样品中的核酸的三磷酸脱氧核苷 (dNTP)。
     “杂交溶液” 是指用于本发明杂交组合物的含水溶液。杂交溶液的详细讨论如下， 并且可包含例如缓冲剂、 促进剂、 螯合剂、 盐、 去垢剂和封闭剂。
     “PCR 组合物” 是指用于进行杂交程序以扩增核酸序列的本发明含水溶液。PCR 组 合物可包含例如至少一种极性非质子溶剂、 至少一种用于扩增核酸的酶、 一组核酸寡核苷 酸引物、 dNTP 混合物和 PCR 溶液。
     “PCR 溶液” 是指用于本发明 PCR 组合物的含水溶液。PCR 溶液可包含例如缓冲剂、 促进剂、 螯合剂、 盐和去垢剂。
     术语 “检测” 当用于例如检测染色体畸变相关核苷酸序列的分子探针时， 是指分子 探针与至少部分核苷酸序列或所述序列邻近的核苷酸序列杂交， 这允许使用者确定所述序 列的存在与否。
     术语 “标记” ， 例如染色体畸变的标记， 是指与染色体畸变相关的、 并且在使用或不 用一种或多种其它标记时可用于检测染色体畸变存在与否的任何序列。
     “Hansen 溶度参数” 和 “HSP” 是指以下内聚能 ( 溶解度 ) 参数 ： (1) 分散溶度参数 (δD， “D 参数” )， 其度量得自原子力的非极性相互作用 ； (2) 极性溶度参数 (δP， “P 参数” )， 其度量永久偶极 - 永久偶极之间的相互作用 ； 和 (3) 氢键溶度参数 (δH， “H 参数” )， 其度量 电子交换。Hansen 溶度参数进一步定义如下。
     “重复序列” 可理解为是指快速重新退火 ( 大约 25％ ) 和 / 或中速重新退火 ( 大约 30％ ) 的哺乳动物基因组组分。快速重新退火组分含有小的 ( 长度为几个核苷酸 ) 高度重 复序列， 通常以串联形式存在 ( 例如卫星 DNA)， 而中速重新退火组分含有散在分布的重复 DNA。散在分布的重复序列可分为 SINE( 短散在分布的重复序列 ) 或 LINE( 长散在分布的 重复序列 )， 这两者都属于灵长类的反转录转座子。SINE 和 LINE 包括但不限于 Alu 重复序 列、 Kpn 重复序列、 二核苷酸重复序列、 三核苷酸重复序列、 四核苷酸重复序列、 五核苷酸重 复序列和六核苷酸重复序列。 Alu 重复序列构成大部分人类 SINE， 其特征是大约 280-300bp 的共有序列， 由两个类似序列排列成头尾相连的二聚体而组成。除了 SINE 和 LINE 之外， 重 复序列也存在于染色体末端的染色体端粒和染色体着丝粒， 其含有仅存在于染色体中心区 的独特重复序列。 然而， 不同于随机分散在整个基因组、 端粒和着丝粒中的 SINE 和 LINE， 重 复序列位于染色体的某区域内。 对于甲酰胺的毒性标识， “无毒” 和 “降低的毒性” 是按照 “1999 年 5 月 31 日欧洲 议会和委员会的各成员国涉及危险制剂的分类、 包装和标识的法律、 法规和管理规定的指 令 1999/45/EC” (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf)(“指令 (Directive)” )来 定义的。按照该指令， 用以下分类级别来定义毒性 ： T+“剧毒” ； T“有毒” ； C“腐蚀” ； Xn“有 害” ； Xi“刺激” 。风险术语 (“R 术语” ) 描述了所分类毒性的风险。甲酰胺被列为 T( 有 毒 ) 和 R61( 对未出生胎儿可导致伤害 )。下列所有化学品的毒性均低于甲酰胺 ： 乙腈 (Xn、 R11、 R20、 R21、 R22、 R36) ； 环丁砜 (Xn、 R22) ； γ- 丁内酯 (Xn、 R22、 R32) ； 和碳酸亚乙酯 (Xi、 R36、 R37、 R38)。在本申请的提交时， 三硫代碳酸亚乙酯和亚硫酸乙二醇酯尚未被标记。
     “分子探针” 是指 “核酸” 探针或 “核酸类似物” 探针。本文所用的术语 “探针” 可 理解为能检测特定核苷酸序列的核酸链， 其可完全由 DNA、 RNA、 PNA、 LNA、 其合成或天然类 似物、 或其混合物组成。另外， 探针中的碱基可通过并非磷酸二酯键的其它键而连接， 只要 它不阻止杂交。检测特定突变的分子探针是与具有该突变特征的靶序列结合的探针。术语 “结合” 是 “杂交” 的同义词。当两个分子杂交时， 它们通过一种或多种类型的化学键、 通过 互补碱基配对或通过形成氢键， 而形成两个分子的组合。术语 “靶序列” 是指有待检测的核 碱基序列。
     “染色体畸变” 或染色体异常是指正常染色体序列的变异形式， 例如染色体数目上 的改变 ( 非整倍性 )、 基因拷贝数的改变 ( 扩增、 缺失、 重复、 非整倍性 )、 潜在断点、 插入、 倒 位、 重排或易位。
     II. 组合物
     本发明提供用于杂交的组合物， 所述组合物包含分子探针和含水组合物 ( 包含足 以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂 )。 一般而言， 这种组合物可包 含本文所述的任何分子探针和任何含水组合物。
     A. 分子探针
     适用于本发明的分子探针描述于例如美国专利公布号 2005/0266459， 其通过引 用结合到本文中。一般而言， 分子探针通常是双链或单链核酸， 包括例如 DNA、 RNA、 PNA 和 LNA。探针可以是任何合适长度， 用于检测靶标。通常， 探针是由不同大小的较小片段组成 ( 例如各自约 50bp 至约 500bp)， 使得探针总共跨越约 30kb 至约 2Mb。例如， 探针长度可 以 是 1-100、 1-10、 7-15、 10-200、 10-20、 10-30、 10-50、 20-40、 30-50、 40-60、 50-70、 50-100、 50-150、 60-80、 70-90 或 80-100kb。探针可用于检测、 定量、 识别或分析核酸分子或与探针 结合的其它分子。
     一般而言， 探针可制备如下 ： 即通过化学合成或通过克隆扩增特定 DNA 序列， 将所 述 DNA 插入载体， 并在合适宿主细胞中扩增载体和插入片段。常用载体包括细菌质粒、 粘 粒、 细菌人工染色体 (BAC)、 PI 衍生的人工染色体 (PAC) 或酵母人工染色体 (YAC)。然后提 取所扩增的 DNA 并纯化， 用作探针。用于制备和 / 或合成探针的方法是本领域已知的， 例如 公开于 PCT/US02/30573。
     在一个实施方案中， 用于本发明方法和组合物的探针包括独特片段以及重复片 段。核酸类似物探针， 例如 PNA 探针， 通常是较短的意义明确的探针， 通常包含 10-15 个核 碱基。PNA 探针通常由若干单独探针组成， 各自具有 10-25 个核碱基单位。
     在一个实施方案中， 本发明提供单一分子探针。 在另一个实施方案中， 本发明提供 一对分子探针。在其它实施方案中， 本发明提供 2、 3、 4、 5、 10 个或更多探针或探针对。在一 个实施方案中， 使用不同且对称的探针对 (distinct and balanced pair of probes)， 正如 美国专利号 6,730,474 所述， 其通过引用结合到本文中。不同且对称的探针对各自可与例 如涉及易位的不同染色体杂交， 或与潜在断点侧翼区杂交。 在另一个实施方案中， 可使用两 组杂交探针， 其一组或多组包含 PNA 探针， 正如美国专利号 7,105,294 所述， 其通过引用结 合到本文中。 在一个实施方案中， 使用至少两组杂交探针， 至少一组能与染色体中潜在畸变 相关的特定核酸序列杂交， 而至少另一组能与另一个或同一个染色体中潜在畸变相关的特 定核酸序列杂交。
     有 若 干 类 型 的 探 针 可 用 于 与 核 酸 样 品 杂 交 ( 通 常 可 参 见 Szeles， Acta Microbiol.Immunol.Hungarica， 49 ： 69-80(2002))。这些探针包括基因组 DNA 或 cDNA 的短 序列， 整条染色体涂染 (Chromosome paint)、 染色体重复序列和整个基因组。 就基因组探针 而言， 哺乳动物基因组中的频繁重复序列具有相当少的进化保守性。因此， 整个核 DNA 或基 因组 DNA 可用作物种特异性探针。染色体涂染是收集源自单一染色体类型的 DNA 序列， 并 可识别分裂中期和间期核中的特定染色体类型。不同染色体类型也具有独特重复序列， 其 可被靶向用于探针杂交 ( 参见 Cremer 等， Hum.Genet.， 74 ： 346-52(1986))。靶向独特单拷 贝序列的大的插入探针是可用于杂交测定的探针种类的另一实例。这些探针可以在粘粒、 细菌人工染色体 (BAC)、 PI 衍生的人工染色体 (PAC) 或酵母人工染色体 (YAC) 中。有了这 些大探针， 杂交效率与探针大小成反比。但是， 可使用小至 2kb 的探针 ( 参见同上 )。
     一般而言， 探针类型决定了探针可检测的特征类型。沿着整条染色体杂交的探针 ( 整条染色体涂染 ) 用于统计某条染色体的数目， 显示易位或识别染色体外染色质片段。 较 小的探针也可用于检测畸变， 例如缺失、 扩增、 倒位、 重复和非整倍性。在另一个实例中， 基 因座特异性探针混合物可用于检测和统计特定染色体。 两个或更多个不同颜色的基因座特异性探针可用于例如通过信号分离原位杂交来检测易位， 而重复序列特异性着丝粒探针混 合物可用于检测和统计特定染色体。
     一般而言， 区分密切相关序列的能力与杂交探针的长度成反比， 因为随着探针长 度增加， 野生型复合物和突变型复合物之间的热稳定性差异下降。通常需要长度大于 10bp 的探针以获取正确识别独特有机体或目标临床状态所需的序列多样性。例如， 可使用长度 15kb 的探针， 对特异性 DNA 序列 ( 例如 ABL 基因 ) 进行可靠的染色。另一方面， 与非靶序列 相比， 非常短的寡聚物 ( ＜ 10 个碱基对 ) 中精细至单个碱基 ( 点突变 ) 的序列差异都足以 区别与互补核酸靶序列的杂交。
     在一个实施方案中， 至少一组原位杂交探针可包含一种或多种 PNA 探针， 正如美 国专利号 7,105,294 所述。PNA 是具有肽 (N-(2- 氨基乙基 )- 甘氨酸 ) 主链并带有悬垂嘌 呤和嘧啶碱基的合成聚合物。因为与 DNA 和 RNA 相反， PNA 主链不带电荷， 所以 PNA/DNA 和 PNA/RNA 的相互作用比相应的 DNA/DNA 或 DNA/RNA 的相互作用更强。因此， PNA 探针可以比 DNA 探针或 RNA 探针更短， 同时还保留类似的特异性。PNA 探针在与互补 DNA 或 RNA 结合中 还表现出更高特异性， 因为 PNA/DNA( 或 PNA/RNA) 碱基错配比起 DNA/DNA( 或 RNA/RNA) 双 链体中的类似错配而言， 更不稳定。另外， PNA 对蛋白酶和核酸酶的酶促降解具有相当的耐 受性。
     或者， 或另外， 上述任何技术中的至少一组杂交探针可包含一种或多种锁核酸 (LNA) 探针， 正如 WO 99/14226 所述， 其通过引用结合到本文中。LNA 含有 2′和 4′碳之 间的额外桥连键， 导致刚性 3′ - 内桥构象和随之而来的用于杂交的核苷酸主链的预组织。 LNA/DNA 和 LNA/RNA 的相互作用比相应的 DNA/DNA 和 DNA/RNA 的相互作用更强烈， 正如更高 解链温度所示。因此， 降低杂交所需能量的本发明的方法和组合物特别适用于用 LNA 探针 的杂交。
     在一个实施方案中， 探针可包含可检测标记 ( 提供分析可识别信号并允许检测探 针 - 靶杂合体的分子 )。本文所用的可检测标记是指可与寡聚物或聚合物直接或间接连接 并因而可通过仪器或方法来检测寡聚物或聚合物的部分。 本领域技术人员已知的任何标记 方法， 包括酶促方法和化学方法， 都可用于标记本发明方法和组合物所用的探针。
     在一个实施方案中， 可检测标记可与探针直接连接。 在另一个实施方案中， 可检测 标记可与探针间接连接， 例如通过使用接头。在其它实施方案中， 探针可以不被标记。
     可检测标记可以是例如荧光染料、 生色团、 自旋标记、 放射性同位素、 酶、 半抗原、 量子点 (Quantum Dot)、 小珠、 氨基己基、 芘和化学发光化合物， 例如吖啶橙。可用于本发明 方法的荧光染料包括但不限于 IR 染料、 Dyomics 染料、 藻红蛋白、 颜料蓝 (cascade blue)、 俄勒岗绿 488、 pacific blue、 罗丹明绿、 5(6)- 羧基荧光素、 花青染料 ( 即 Cy2、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、 Cy7)( 二乙基 - 氨基 ) 香豆素、 荧光素 ( 即 FITC)、 四甲基罗丹明、 丽丝胺、 德克萨 斯红、 AMCA、 TRITC 和 Alexa 染料。 可用于本发明的半抗原包括但不限于 5(6)- 羧基荧光素、 2， 4- 二硝基苯基、 地高辛配基、 罗丹明、 溴脱氧尿苷、 乙酰氨基芴 (acetylaminoflurene)、 苦味酸汞、 雌二醇和生物素。 可用于本发明的酶包括但不限于大豆过氧化物酶、 碱性磷酸酶 31 33 和辣根过氧化物酶。在一个实施方案中， 标记可以是放射性标记， 例如 P、 P 或 32S。在另 一个实施方案中， 可用半抗原例如地高辛配基或生物素来标记探针。也可用重金属颗粒或 具有显色或荧光底物的酶来标记探针。 还可用本领域技术人员已知的任何其它标记来标记探针。 当存在不止一种探针时， 可用不同标记来标记每种探针。例如， 在一个实施方案 中， 当进行 FISH 并且杂交混合物含有不同且对称的探针对组时， 如美国专利号 6,730,474 所述， 可用相对强度不同的标记来标记探针。
     在使用显色原位杂交 (CISH) 的实施方案中， 杂交混合物可含有设计为用一种或多 种常规有机显色剂来检测的至少一组探针， 对于银染原位杂交 (SISH)， 杂交混合物可含有 设计为用银颗粒检测的至少一组探针， 正如以下文献所述 ： Powell RD 等， “Metallographic in situ hybridization( 金相原位杂交 )， ” Hum.Pathol.， 38 ： 1145-59(2007)。
     在一个实施方案中， 一旦加入显色剂后， 就可以检测探针 - 核酸序列杂合体的形 成， 所述显色剂例如抗体 ( 其可以是单克隆抗体， 并且其自身可包含标记 )、 酶的荧光或显 色底物、 或技术人员已知的任何其它合适显色剂。
     在某些实施方案中， 探针可用于通过检测样品染色模式与正常对照样品相比的变 化， 来检测染色体结构中的变化。可用分子探针来检测的染色体改变的非详尽的实例包括 非整倍性、 基因扩增、 缺失 ( 包括基因缺失 )、 基因融合、 易位、 重复、 插入或倒位。本文所用 的非整倍性是指与正常整倍体状态相比的任何偏差， 或者具有少于或多于正常染色体二倍 体数目的状态。本文所用的扩增是指特定 DNA 片段拷贝数的增加。这种 DNA 片段包括例如 基因或一整条染色体。 本文所用的缺失是指遗传事件， 其中核酸序列从染色体中被除去。 本 文所用的基因融合是指两个基因的 DNA 的意外连接。基因融合可通过易位或倒位而发生， 并可产生杂合蛋白或者因一个基因的顺式调节元件 ( 例如增强子或启动子 ) 的并列而错误 调节另一个基因转录。本文所用的易位是指遗传事件， 其中一条染色体的一部分核酸序列 从该染色体上移出并连接到不同染色体上。 本文所用的重复是指在染色体或染色体区段中 核苷酸序列的重复。重复可导致核苷酸序列以与所复制序列线性并列的方式重复。本文所 用的插入是指遗传事件， 其中核酸序列被引入到染色体中的两点之间。本文所用的倒位是 遗传事件， 其中核酸序列在染色体中的方向被颠倒了。本文所用的染色体断点是指染色体 中染色体断裂成两片的位置。
     在某些实施方案中， 分子探针可侧接例如基因两侧的约 500,000bp 的区域。用 于 TYMS 标 记 并 包 含 约 500,000bp 侧 翼 区 的 探 针 实 例 是 ： CTD-2304H22 ； RP11-841C6 ； RP11-464L8 ； RP11-631M21 ； CTD-2573M23 ； CTD-3162G8G8 ； CTD-3232F7 ； RP11-170J2 ； RP11-252G7 ； RP11-699P24 ； RP11-805B24 ； CTD-3237F7 ； RP11-230P17 ； CTD-2359H18 ； RP11-1120H10 ； CTD-2509F1 ； RP11-431C15 ； RP11-361O6 ； RP11-1066C16 ； CTD-2359H18 ； RP11-1066G14 ； RP11-1034P14 ； RP11-1034P22 ； CTD-3114P12 ； RP11-787A12 ； RP11-787C12 ； CTD-3149J12 ； RP11-195P12 ； CTD-2595P20 ； CTD-2168E8 ； RP11-621G7 ； CTD-3023M8 ； RP11-748B19 ； CTD-2064P19 ； RP11-461K16 ； RP11-630F5 ； CTD-3021E11 ； CTD-3028I7 ； RP11-1021K17 ； RP11-729G15 ； RP11-104I5 ； RP11-595D13 ； RP11-436O7 ； CTD-2646F10 ； RP11-104A15 ； CTD-2024F12 ； CTD-2169M24 ； RP1 1-140D22 ； RP11-848A7 ； CTD-2060D6 ； CTD-2298K5 ； CTD-3022J6 ； RP11-29P22 ； RP11-790O10 ； RP11-89P6 ； RP11-91I8 ； RP11-694N4 ； RP11-752I11 ； RP11-324G2 ； CTA-186D6 ； RP11-88C10 ； RP11-608N7 ； RP11-732L14 ； RP11-324G2 ； RP11-705O1 ； RP11-839O23 ； RP11-683J11 ； RP11-815L4 ； RP11-720L2 ； RP11-179K3 ； RP11-778P8 ； RP11-823F8 ； RP11-791M5 ； RP11-672L10 ； RP11-827M19 ；
     RP11-19J12 ； RP11-607C2 ； RP11-267C19 ； CTD-3214N24 ； RP11-1035E2 ； CTD-2004F18 ； CTD-3155L20 ； CTD-2281A22 ； CTD-3231L23 ； CTD-2014P18 ； RP11-1150C18 ； RP11-170J1 ； CTC-790I9 ； RP11-76H24 ； RP11-48I21 ； CTC-775A10 ； CTD-2034O18 ； RP11-431C11 ； RP11-50C2 ； CTD-2208G7 ； CTD-2345G8 ； RP11-797C9 ； RP11-133D9 ； RP11-655D4 ； RP11-14P20 ； RP11-103B23 ； RP11-806L2 ； RP11-145B19 ； CTD-2593J12 ； CTD-3215I7 ； RP11-381D10 ； RP11-769O8 ； RP11-95H4 ； RP11-552E8 ； RP11-914P23 ； RP11-904F1 ； RP11-164C14 ； CTD-3040A20 ； RP11-1152E8 ； CTD-3065D24 ； CTD-3243B17 ； CTD-3243D18 ； CTD-3243D19 ； CTD-3113H2 ； RP11-1120E20 ； CTD-3046I16 ； RP11-635J20 ； RP11-114M20 ； RP11-1018M4 ； CTA-344N3 ； RP11-137K7 ； RP11-689C9 ； RP11-1005B18 ； RP11-126M20 ； CTD-2134I3 ； RP11-701F4 ； CTD-3236J23 ； CTD-3047L19 ； CTD-3240G16 ； CTD-3148N6 ； RP11-22J24 ； RP11-1094D2 ； CTD-2182K19 ； RP11-107A13 ； RP11-134P22 ； RP11-636P15 ； RP11-78F17 ； CTD-2221P22 ； CTD-2011M14 ； RP11-626B11 ； 和 RP11-27K24。
     在其它实施方案中， 探针可结合在编码或不编码基因的染色体区内。例如， 探针 可与 5-FU 途径相关的染色体区结合， 所述途径包括胸苷酸合酶 (TYMS)、 二氢叶酸还原酶 (DHFR)、 胸苷磷酸化酶 (TP)、 二氢嘧啶脱氢酶 (DPD)、 亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR)、 胸苷 激酶 (TK) 和 5- 甲基四氢叶酸 - 同型半胱氨酸 - 甲基转移酶 ( 甲硫氨酸合酶， MTR)。
     在一个实施方案中， 分子探针检测先天性遗传疾病例如脆性 X 综合征。可被检 测的其它先天性遗传疾病包括例如唐氏综合征、 特纳氏综合征、 Wolf-Hirschhorn 综合征、 Jacobsen 综合征、 Charcot-Marie-Tooth 病 1A 型和罗伯逊易位。
     在一个实施方案中， 分子探针检测癌性病症， 例如实体瘤， 包括例如膀胱癌、 乳癌、 宫颈癌、 结直肠癌、 肝癌、 肺癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 皮肤癌或子宫癌。在一个实施方案中， 分 子探针检测造血系统恶性肿瘤， 例如急性淋巴性白血病、 慢性淋巴细胞性白血病、 淋巴瘤、 多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤 (Non-Hodgkin’ s lymphoma)。在一个实施方案中， 分子探 针检测 B 细胞恶性肿瘤或 T 细胞恶性肿瘤。
     在另一个实施方案中， 分子探针检测感染性病原体， 例如细菌、 病毒或真菌。例 如， 病原体可以是例如 EB 病毒、 人乳头瘤病毒或单纯疱疹病毒。在另一个实例中， 病原体 可以是例如大肠杆菌 (Escherichia coli)、 肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)、 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)、 荚膜组 织胞浆菌 (Histoplasma capsulatum)、 皮炎芽生菌 (Blastomyces dermatitidis)、 球孢 子 菌 (Coccidioides species)、 新 生 隐 球 菌 (Cryptococcus neoformans)、 格特隐球菌 (Cryptococcus gattii) 或单纯疱疹病毒。
     在一个实施方案中， 分子探针检测以下的畸变 ( 包括例如重排、 扩增或缺失 ) ： ALK、 BCL2、 BCL3、 BCL6、 BCL10、 BCL12、 BCR(22q11)、 CCND1、 cyclinD1(11q23)、 E2A(19p 13)、 EGFR(7p11.2)、 ETV6(TEL)(12p13)、 FIP1L1、 HER2(ERBB2)(17q21.1)、 IGH(14q32)、 IGK(2p11)、 IGL(22q11)、 MALT1、 MLL(ALL-1、 HTRX1、 HRX)(11q23)、 MYC(c-Myc)(8q24)、 PAX5、 PDGFRA、 PDGFRB、 SIL、 TCF3(E2A、 ITF1)、 TCL1A、 TCRAD、 TCRB、 TCRG、 端 粒、 TLX1、 TLX3(HOX11L2、 RNX) 或 TOP2A。例如， 探针可用于检测儿童癌症中的常见基因重排， 其特征 是 ETV6 和 AML1( 也称为 RUNX1 和 CBFA2) 的融合。
     在一个实施方案 ( 包括例如在造血系统恶性肿瘤的情况下 ) 中， 分子探针检测易位， 例如选自以下的易位 ： t(1 ； 14)(q34 ； q11)、 t(1 ； 19)(q23 ； p13)、 t(2 ； 5)、 t(2 ； 18)(q12 ； q21)、 t(2 ； 8)、 t(4 ； 11)、 t(4 ； 11)(q21 ； q23)、 t(6 ； 11)(q27 ； q23)、 t(7 ； 22)(p22 ； q12)、 t(8 ； 14)、 t(8 ； 22)、 t(9 ； 11)(p22 ； q23)、 t(9 ； 22)(q34 ； q11)、 t(10 ； 14)(q24 ； q11)、 t(11 ； 14)、 t(11 ； 14)(p13 ； q11)、 t(11 ； 19)(q23 ； p13)、 t(14 ； 18)(q23 ； q21)、 t(14 ； 18)、 t(18 ； 22) (q21 ； q11) 和 t(21 ； 22)(q22 ； q12)。 在另一个实施方案中， 分子探针检测缺失， 例如 TAL1 的 缺失。在又一个实施方案中， 分子探针检测基因扩增， 例如 EGFR、 MYC、 TOP2A 或 HER2 的扩 增。在这种情况下， 探针可与参考探针配对。例如， 检测 EGFR 的探针可与检测 CEN-7 的探 针配对， 检测 MYC 的探针可与检测 CEN-8 的探针配对， 而检测 HER2 的探针可与检测 CEN-17 的探针配对。
     对于可用于本发明组合物和方法以检测非血液病的探针， 示例性靶标包括例如 BASE、 BRCA1、 CCND1、 CCNE1、 DCD、 E2F3、 n-MYC/MYCN、 COX-2/PTGS2、 LRIG 1、 ER a、 hTERT、 MLN64/STARD3、 PGR、 SNAI1、 SRC、 TOP1、 TUBB1、 AIB1、 DLC-1、 EDD、 Pip4k2b/5k、 Sil、 TBX2、 c-Kit、 VEGF、 VCAM-1、 Tie-1、 Ts/TYMS、 PSMA、 PSA、 PAP、 P15、 P16、 BCL1、 BCL2、 MTOR、 TIMP1、 ESR1、 PTEN、 MDM2/CDK4、 MET、 C-MET、 ERB 1、 FGFR1、 IGF 1R、 NET、 FGFR3、 ABCB1、 TMPRSS2、 BRCA2、 TOP2B、 ERCC1、 AKT1、 AKT2、 AKT3、 HRAS、 NRAS、 RAF1、 HER3、 HER4、 ENT1、 RRM1、 RRM2、 RRM2B、 PIK3CA、 AURK4、 AURKB、 AURKC、 MAPT/tau、 TTBK1、 TUBB、 VEGFR、 CCND3、 CDK6、 CDK2、 CDC2、 HDAC、 ESR2、 SCUBE2、 BIRC5、 FASN、 DHFR、 TP/ECGF1、 TYMP、 DPYD、 TK1、 HMGIC、 ABCA2、 ABCB11、 ABCC1、 ABCC2、 ABCC3、 ABCC4、 ABCC5、 ABCG2、 MVP、 ATP7A、 ATP7B、 SLC29A1、 SLC28A1、 SLC19A1、 TUBB4、 TUBA、 MAP4、 MAP7、 STMN1、 KIF5B、 HSPA5、 PSMD14、 FPGS、 GSTP1、 GPX、 GCLC、 GGT2、 MT、 AKR1B1、 HMGB1、 HMGB2、 XPA、 XPD、 MSH2、 MLH1、 PMS2、 APEX1、 MGMT、 GLO1、 RB1、 GML、 CDKN1A、 CDKN2A、 CDKN1B、 ERBB2、 KRAS2、 ITGB1、 JUN、 FOS、 NFKB1、 TP53、 TP73、 BCL2L1、 MCL1、 BAX、 BIRC4、 TNFRSF6、 CASP3、 CASP8、 HSPB 1、 MALAT1(α)t(11 ； 19)(q11 ； q13.4)、 MHLB1t(11 ； 19)(q11 ； q13.4)、 COL1A1t(17 ； 22)(q22 ； q13)、 PDGFB t(17 ； 22)(q22 ； q13)、 FKHR t(2 ； 13)&t(1 ； 13)、 ETV6t(12 ； 15)(p13 ； q25)、 NTRK3t(12 ； 15)(p13 ； q25)、 TLS/FUSt(12 ； 16)(q13 ； p11)、 CHOP t(12 ； 16)(q13 ； p11)、 EWS t(12 ； 22)(q13 ； q12)、 EWS/ FLI1t(11 ； 22)(q24 ； q12) 和 FLI1t(11 ； 22)(q24 ； q12)。
     对 于 可 用 于 本 发 明 组 合 物 和 方 法 以 检 测 血 液 病 的 探 针， 示例性靶标包括例 如用于检测例如以下慢性骨髓增生性疾病的靶标的探针 ： ABL t(9 ； 22)(q34 ； q11)、 PRDM16del(1p36.32)、 del(21q22.12)、 RUNX1/AML1del(1p36.32)、 del(21q22.12)、 CEP8、 PDGFRB、 NUP98、 FGFR1 和 ASS ； 用于检测例如以下急性骨髓性白血病的靶标的探针 ： ETO t(8 ； 21)(q22 ； q22)、 AML1t(8 ； 21)(q22 ； q22)、 CBFbeta inv(16)(p13q22) 或 t(16 ； 16) (p13 ； q22)、 MYH11inv(16)(p13q22) 或 t(16 ； 16)(p13 ； q22)、 AF9t(9 ； 11)、 PML t(15 ； 17) (q22 ； q21)、 PLZF t(11 ； 17)(q23 ； q21)、 NuMAt(11 ； 17)(q13 ； q21)、 NPM t(5 ； 17)(q23 ； q12)、 RAR αt(15 ； 17)(q22 ； q21)t(11 ； 17)(q23 ； q21)t(11 ； 17)(q13 ； q21)t(5 ； 17)(q23 ； q21)、 EVI1t(3 ； v)(q26 ； v)、 GR6t(3 ； 3)(q21 ； q26)、 RPN1t(3 ； 3)(q21 ； q26)、 DEK t(6 ； 9)、 CAN t(6 ； 9)、 MLF1t(3 ； 5)(... ； q23)、 FUS t(16 ； 21)、 ERG t(16 ； 21)、 NUP98t(7 ； 11)、 HOX9A t(7 ； 11)、 MOZ/MYST3t(8 ； 16)(p11 ； p13)、 CBPt(8 ； 16)(p11 ； p13)、 p300t(8 ； 22)(p11 ； q13)、 TIF2/GRIP-1/NCoA-2inv(8)(p11q13) 和 MKL1 ； 用于检测例如以下前体 B 细胞和 T 细胞赘生 物的靶标的探针 ： PBX1t(1 ； 19)(q23 ； p13.3)+var.、 ABLt(9 ； 22)(q34 ； q11)、 AF4/AFF1t(4 ；11)(q21 ； q23)、 AML1/RUNX1t(12 ； 21)(p13 ； q22)、 IL3t(5 ； 14)(q31 ； q32)、 HLF t(17 ； 19)、 IKZF1del(7)(p12.2)、 CDKN2A/CDKN2B del(9)(p21.3)、 TAL11p32 畸 变、 LMO2t(11 ； 14) (p13 ； q11)+var.、 LMO1t(11 ； 14)(p15 ； q11)、 HOX11t(10 ； 14)(q24 ； q11)+var.、 TAL2t(7 ； 9) (q34 ； q32) 和 TAN1t(7 ； 9)(q34 ； q34) ； 用于检测例如以下成熟 B 细胞赘生物的靶标的探针 ： CEP12、 ATM、 D13S25、 D13S319、 TP53、 P53、 TNFAIP3del(6)(q23.3-q24.1)、 CDK6BCL1t(11 ； 14)(q13 ； q32)+var.、 IRF4t(6 ； 14)(p25 ； q32)、 C-MAFt(14 ； 16)(q32 ； q23)、 FGFR3t(4 ； 14) (p16 ； q32) 和 MUM2/3t(1 ； 14)(q21 ； q32) ； 和用于检测例如以下成熟 T 细胞和 NK 细胞赘生 物的靶标的探针 ： NPM t(2 ； 5)(p23 ； q35)、 ASS、 RB1 和 ATM。
     对于可用于本发明组合物和方法以检测着丝粒的探针， 示例性靶标包括例如 CEP1、 CEP2、 CEP3、 CEP4、 CEP5、 CEP6、 CEP7、 CEP8、 CEP9、 CEP10、 CEP11、 CEP12、 CEP13、 CEP14、 CEP15、 CEP16、 CEP17、 CEP18、 CEP19、 CEP20、 CEP21、 CEP22、 CEP23、 CEP X 和 CEP Y。
     对 于 可 用 于 本 发 明 组 合 物 和 方 法 的 探 针， 示例性靶标也包括例如 CEP 18(18p11.1-q11.1)、 CEP X (Xp11.1-q11.1)、 CEP Y(Yp11.1-q11.1)、 LSI 13(13q14)、 LSI 21(21q22.13-q22.2)、 CEP 3(3p11.1-q11.1)、 CEP 7(7p11.1-q11.1)、 LSI(p169p21) 、 CEP 17(17p11.1-q11.1) 、 CEP 1(D1Z5)1p11.1-q11.1 、 CEP 11q12 、 CEP 2(D2Z1)2p11.1-q11.1 、CEP 3(D3Z1)3p11.1-q11.1 、CEP 44p11-q11 、CEP 6(D6Z1)6p11.1-q11 、CEP 6(D6Z1)6p11.1-q11.1 、CEP 7(D7Z1)7p11.1-q11.1 、 C E P 8 ( D 8 Z 2 ) 8 p 1 1 . 1 - q 1 1 . 1 、C E P 9 9 p 1 1 - q 1 1 、C E P 1 0 1 0 p 1 1 . 1 - q 1 1 . 1 、 C E P 1 1 ( D 1 1 Z 1 ) 1 1 p 1 1 . 1 1 - q 1 1 . 1 1 、C E P 1 1 ( D 1 1 Z 1 ) 1 1 p 1 1 . 1 1 - q 1 1 、C E P 12(D12Z3)12p11.1-q11、 LSI 13(13q14)、 LSI 13(RB1)、 CEP 15(D15Z1)15p11.2、 CEP 15(D15Z4)15p11.1-q11.1、 CEP16(D16Z3)16q11.2、 CEP 17(D17Z1)17p11.1-q11.1、 CEP 18(D18Z1)18p11.1-q11.1、 CEP 20(D20Z1)20p11.1-q11.1、 LSI 21、 LSI 22(BCR)、 CEP X(DXZ1)Xp11.1-q11.1、 CEP X(DXZ1)/Y(DYZ1)*Xp11.1-q11.1Yq12、 CEP X(DXZ1)/Y(DYZ3) Xp11.1-q11.1Yp11.1-q11.1、 CEP Y(DYZ1)Yq12、 CEP Y(DYZ1)、 CEP Y(DYZ3)Yp11.1-q11.1、 LSI 1p36/LSI 1q25 和 LSI 19q13/19p13、 LSI 4q12、 LSI 9q34、 LSI 13(RB 1)13q14、 LSI 13(RB1)、 LSI(13q34)、 LSI 13(13q14)、 LSI 21、 LSI 22(BCR)、 LSI ALK、 LSI AML1/ETO、 LSI 雄 激 素 受 体 基 因 (Xq 12)、 LSIAPI2/MALT1t(11 ； 18)(q21 ； q21)、 LSI ATM(11q22.3)、 LSI ATM/CEP11、 LSI BCL2、 LSI BCR/ABL+9q34、 LSI BCR/ABL、 LSI CBFB、 LSI CCND1(11q13)、 LSI CHOP(12q13)、 LSI CSF1R(5q33-q34)/D5S23， D5S721、 LSI C-MYC(8q24.12-q24.13)、 LSI LSI Cyclin D1(11q13)/CEP 11、 LSI D13S25(13q14.3)、 LSI D13S319(13q14.3)、 D13S319(13q14.3)/LSI 13q34、 LSI D20S108(20q12)、 LSI D5S23/D5S721、 CEP9、 CEP15、 LSI D7S486(7q31)/CEP 7、 LSI D7S522(7q31)/CEP7、 LSI EGFR/CEP 7、 LSI EGR1(5q31)/ D5S23、 D5S721、 LSI ETV6(TEL)(12p13)、 LSI EWSR1(22q12)、 LSI FKHR(13q14)、 LSI FUS(16p11)、 LSI IGH、 LSI IGH/BCL2、 LSI IGH/CCND1、 LSI IGH/FGFR3、 LSI IGH/MAF、 LSI IGH/MALT1t(14 ； 18)(q32 ； q21)、 LSI IGH/MYC、 CEP 8、 LSI MALT1(18q21)、 LSIMLL、 LSI MYB(6q23)、 LSI MYC、 LSI N-MYC(2p24.1)、 LSI N-MYC(2p24)/CEP 2S、 LSI p16(9p21)/ CEP9、 LSI p53(17p13.1)、 LSI p53/LSI ATM 和 LSI D13S319/LSI 13q34/CEP 12、 LSI PML/RARA、 LSI PTEN(10q23)/CEP 10、 LSI RARA、 LSI SYT(18q11.2)、 LSI TEL/AML1、 LSI TCF3/PBX1、 LSI TCRα/delta、 LSI TOP2A、 LSI TP53/CEP 17、 LSI ZNF217(20q13.2)、LSIp58(1p36)LSI 1q25、 LSI D5S23、 D5S721、 LSI EGR1/LSI D5S23、 D5S721、 LSI N25/ARSA、 LSI TUPLE 1/LSI ARSA、 LSI TUPLE1(HIRA)/TelVysion 22q S、 LSI KAL/CEP X、 LSI LIS 1/LSI RARA、 LSID15S10/CEP 15(D15Z1)/PML、 LSI D15S11/CEP 15(D15Z1)、 LSIGABRB3/ CEP 15(D15Z1)、 LSI SNRPN/CEP 15(D15Z1)/LSI PML、 LSISMS Region/LSI RARA、 LSI NSD 1(5q35)、 LSI SRY/CEP X、 LSI SRY、 LSI STS/LSI CEP X、 LSI ELNe/LSI D7S486、 D7S522、 LSI WHS/CEP4、 CEB108/T71p、 VIJ2yRM2052(U32389)2p、 3PTEL25(D3S4559)3p、 4p022(D4S3359 、 6244599)4p 、C84c11/T75p 、 6PTEL486p 、VIJ2yRM2185(G31341)7p 、 AFM 197XG5(D8S504 、 199153)8p 、 305J7-T79p 、 10p006(Z96139)10p 、 VIJ2(D11S2071 、 U12896)11p、 VIJ3(sAVH27， U57865)12p、 STSG608831STSG60893816p、 282M16/SP617p、 VIJ2yRM2102(D18S552)18p、 129F16/SP619p、 20p18(D20S1157)20p、 DXYS129， DXYS153Xp/ Yp 、 VIJ2yRM21231QTEL10(D1S3738 、 9043912)1q 、 VIJ2yRM2112(D2S447)2QTEL472q 、 3QTEL05(D3S4560)3q 、 AFM A224XH1(D4S2930)4q 、 GS35o8/T75QTEL702(D5S2907)5q 、 V I J 2 y R M 2 1 5 8 6 q 、V I J 2 y R M 2 1 8 5 ( S T S 2 0 0 0 H 、G 3 1 3 4 1 ) 7 q 、V I J 2 y R M 2 0 5 3 8 q 、 VIJ2yRM2241(D9S325)9q、 10QTEL24(D10S2490、 6 2 4 4 6 3 1 ) 1 0 q 、D 1 1 S 1 0 3 7 1 1 q 、 VIJ2yRM219612q 、VIJ2yRM2002(D13S327)13q 、D14S142014q 、WI-5214(D15S396) (G04801)15q 、 16q013(Z96319)16q 、 D17S928Z2364617q 、 VIJ2yRM205018QTEL 11STSG 193AFM254VD5CU18-010L/CU18-010R STS-F04195TIGR-A008P37STSG5296318q、 D19S238E 19q、 20QTEL1420q、 VIJ2yRM202921q、 MS607(X58044)ACR 22q 和 EST Cdy 16c07( 对 于 SYBL1- 作图在粘粒 C8.2(Z43206)Xq/Yq 内 )。
     可用于本发明组合物和方法的示例性探针也包括例如结合在 HIV 亚型 A、 B、 C、 D、 AE、 F、 AG、 G 和 O 的 POL 基因的 IN 区内的探针 ； 结合在 HIV-1 的 PR 基因和 POL 基因的 RT 区 内的探针 ； 和用于检测沙眼衣原体 (Chlamydia trachomatis) 的隐蔽性质粒的探针 ； 用于 检测淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae) 的 Opa 基因的探针 ； 结合在染色体 1-12 和 16-20 的 p 和 q 亚端粒、 近端着丝粒染色体 13、 14、 15、 21 和 22 的 q 亚端粒、 以及 Xp/Yp 和 Xq/Yq 拟常染色体区 (pseudo-autosomal region) 亚端粒的探针 ； 结合在 HLA-A 的外显子 2 或 3 的探针 ； 结合在 HLA-B 外显子 2 或 3 的探针 ； 结合在 HLA-C 外显子 2 或 3 的探针 ； 结合 在 HLA-DRB1 外显子 2 的探针 ； 结合在 HLA-DPB1 外显子 2 的探针 ； 和结合在 HLA-DQB1 外显 子 2 的探针。
     B. 含水组合物
     (1) 溶剂选择
     可根据极性非质子溶剂的 Hansen 溶度参数， 选择用于本发明的合适的极性非质 子溶剂。实验测定和 / 或计算溶剂 HSP 的方法是本领域已知的， 已经报道了超过 1200 种化 学品的 HSP。
     例如， 可根据折射率， 以合理的准确度计算 D 参数， 或可在建立了临界温度和摩尔 体积之后， 通过与类似大小、 形状和组成的已知溶液进行比较， 从图表中得到 D 参数。可 从已知偶极距估计 P 参数 ( 参见例如 McClellan A.L.， Tables of Experimental Dipole Moments(W.H.Freeman 1963))， 使用公式 1 ：
     公式 1 ： δP ＝ 37.4( 偶极距 )/V1/2
     其中 V 是摩尔体积。对于计算 H 参数， 没有公式。相反， 通常根据基团贡献来确定H 参数。 HSP 表征可方便地用球形示意图来直观表示， 实验所测合适参考溶剂的 HSP 在球 心。球的半径 (R) 表示仍然能允许 “良” 相互作用发生的参考溶剂 HSP 的最大可容许变异。 良溶剂在球内， 而不良溶剂在外。用公式 2 可测定基于它们相应 HSP 值的两种溶剂间的距 离 Ra ：
     公式 2 ： (Ra)2 ＝ 4(δD1-δD2)2+(δP1-δP2)2(δH1-δH2)2 其中下标 1 表示参考样品， 下标 2 表示试验化学品， 所有值的单位都是 MPa1/2。良溶度需要 Ra 小于溶度球的实验所测 半径 Ro。两种溶剂间相对能量差， 即 RED 数， 可通过获取 Ra 与 Ro 之比而求得， 如公式 3 中所 示。
     公式 3 ： RED ＝ Ra/Ro
     RED 数小于 1.0， 表示高亲和性 ； RED 数等于或接近 1.0， 表示边界条件 ； RED 数逐渐 升高， 表示亲和性逐渐降低。
     在某些实施方案中， 本发明极性非质子溶剂的 D 参数介于 17.7-22.0MPa1/2 之间。 这种相对高的 D 参数通常与具有环状结构和 / 或具有硫或卤素结构的溶剂有关。线状化合 物可能不属于用于本发明的最合适溶剂， 但如果它们的 P 和 H 参数在下述范围内， 也可以考 虑。因为在公式 2 中 D 参数乘以 4， 所以限制是一半 Ro。另外， 应当注意， 在 21 上下或更高 的 D 值通常代表固体。
     在某些实施方案中， 本发明极性非质子溶剂的 P 参数介于 13-23MPa1/2 之间。这种 特别高的 P 参数通常与具有高偶极距并可能也具有相对低分子体积的溶剂有关。例如， 对 于接近 60cc/mole 的 V， 偶极距应介于 4.5-3.1 之间。对于接近 90cc/mole 的 V， 偶极距应 介于 5.6-3.9 之间。
     在某些实施方案中， 本发明极性非质子溶剂的 H 参数介于 3-13MPa1/2 之间。通常， 具有醇基的极性非质子溶剂不用于本发明的组合物和方法， 因为这类溶剂的 H 参数太高。
     极性非质子溶剂的摩尔体积也可能有关， 因为它进入到三个 Hansen 溶度参数的 评价中。随着摩尔体积变小， 液体倾向于快速蒸发。随着摩尔体积变大， 液体倾向于进入上 述 D 和 P 参数范围的固体区。因此， 本发明的极性非质子溶剂相当接近 HSP 空间的液体 / 固体分界线。
     在某些实施方案中， 本发明的极性非质子溶剂具有内酯、 砜、 腈、 亚硫酸和 / 或碳 酸官能团。这类化合物的特征是具有相当高的介电常数、 高偶极距和水溶性。具有内酯官 能团的示例性极性非质子溶剂是 γ- 丁内酯 (GBL)， 具有砜官能团的示例性极性非质子溶 剂是环丁砜 (SL ； 四氢噻吩 - 二氧化物 )， 具有腈官能团的示例性极性非质子溶剂是乙腈 (AN)， 具有亚硫酸官能团的示例性极性非质子溶剂是亚硫酸乙二醇酯 (GS)， 而具有碳酸官 能团的示例性极性非质子溶剂是碳酸亚乙酯 (EC)、 碳酸异丙二醇酯 (PC) 或三硫代碳酸亚 乙酯 (ETC)。这些示例性溶剂的结构提供如下， 它们的 Hansen 溶度参数、 RED 数和摩尔体积 见表 1。
     表1n/a ＝不适用。
     可用于本发明的其它合适极性非质子溶剂是环状化合物， 例如 ε- 己内酯和 N- 甲 基吡咯烷酮。 另外， 取代的吡咯烷酮 (pyrolidinone) 和氮在 5- 元或 6- 元环内的相关结构， 以及具有两个腈基、 或一个溴和一个腈基的环状结构， 也可适用于本发明。 其它合适的极性 非质子溶剂可含有环尿烷基 (NHCOO-)。 然而， 并非所有这种化合物都是合适的， 因为当用于 本发明的杂交组合物时 1， 3- 二甲基 -2- 咪唑烷酮不产生信号。本领域技术人员可按本文 所述筛选可用于本发明组合物和方法的化合物。适用于本发明的示例性的化学品见下表 2 和表 3。
     表2
     溶剂 乙酰苯胺 N- 乙酰基吡咯烷酮D 20.6 17.8P 13.3 13.1H 12.4 8.325102046808 A CN 102046812说20.4 21.2 20.6 18.7 18.3 18.0 19.7 20.4 18.5 17.4 19.2 19.0 18.6 17.7 19.0 18.4 20.6 20.0 21.1 20.6 20.0明书16.1 14.7 14.9 15.6 14.4 16.8 15.0 17.3 13.0 13.5 17.0 19.8 16.2 17.0 19.4 16.4 22.7 13.1 14.4 22.7 13.1 12.9 11.2 11.0 12.4 6.2 3.1 7.4 11.5 5.1 5.5 11.2 9.6 5.7 9.7 12.3 10.2 5.4 4.9 3.4 5.4 4.918/54 页4- 氨基吡啶 苯甲酰胺 苯并咪唑 1， 2， 3- 苯并三唑 二氧化丁二烯 碳酸 2， 3- 丁二醇酯 己内酯 (ε) 氯马来酸酐 2- 氯环己酮 氯硝甲烷 柠康酸酐 巴豆酸内酯 (crotonlactone) 环丙腈 硫酸二甲酯 二甲砜 二甲亚砜 1， 2- 二硝基苯 2， 4- 二硝基甲苯 二苯砜 1， 2- 二硝基苯 2， 4- 二硝基甲苯26102046808 A CN 102046812说21.1 19.4 17.7 18.6 18.4 18.8 20.2 17.7 19.4 19.6 19.7 19.4 19.0 20.0 19.4 19.6 21.2 19.7 20.3 20.6 18.4明书14.4 13.8 14.9 14.9 15.0 13.4 18.1 18.4 16.7 16.3 15.6 14.8 16.1 16.9 17.4 15.3 18.7 16.2 17.1 20.1 16.0 3.4 3.9 6.8 5.1 8.2 11.2 12.6 6.7 5.4 5.5 11.2 11.8 10.2 7.8 5.3 3.8 10.3 8.2 4.8 10.1 9.019/54 页二苯砜 ε- 己内酰胺 乙磺酰氯 糠醛 2- 呋喃甲腈 异噁唑 马来酸酐 丙二腈 4- 甲氧基苄腈 1- 甲氧基 -2- 硝基苯 1- 甲基咪唑 3- 甲基异噁唑 N- 甲基吗啉 -N- 氧化物 苯甲砜 甲基环丁砜 4- 甲苯磺酸甲酯 3- 硝基苯胺 2- 硝基噻吩 9， 10- 菲醌 邻苯二甲酸酐 1， 3- 丙磺酸内酯27102046808 A CN 102046812说19.7 19.4 21.0 17.9 20.0 20.3 19.5 20.5 17.7 17.7 17.8明书18.2 17.4 13.9 16.2 19.5 18.2 14.0 18.8 15.5 15.7 15.7 10.3 11.3 8.8 7.9 10.7 10.9 6.3 10.8 3.4 3.4 3.420/54 页β- 丙醇酸内酯 2- 吡咯烷酮 糖精 琥珀腈 对氨基苯磺酰胺 环丁砜 2， 2， 6， 6- 四氯环己酮 噻唑 3， 3， 3- 三氯丙烯 1， 1， 2- 三氯丙烯 1， 2， 3- 三氯丙烯
     表 2 根据它们的 Hansen 溶度参数， 给出用于本发明组合物和方法的潜在化学品的 示例性列表。其它化合物当然也满足这些要求。这些化学品中的某些已经用于现有技术的 杂交和 / 或 PCR 溶液 ( 例如二甲亚砜 (DMSO) 已经用于杂交和 PCR 溶液， 环丁砜 (SL) 已经 用于 PCR 溶液 )， 但大部分没有。然而， 现有技术并不认为这些化合物可有利地用于减少杂 交时间和 / 或降低温度， 正如本申请所公开的。
     表3
     并非所有列于表 2 和表 3 的化学品都适用于本发明的组合物和方法。例如， 尽管 DMSO 列于表 2， 因为其 Hansen 溶度参数 (HSP) 落入上述范围， 但是 DMSO 在本发明组合物和
     方法中不能起到减少杂交时间和 / 或降低温度的作用。因此， 在某些实施方案中， 含水组合 物不含 DMSO 作为极性非质子溶剂。然而， 用本文提供的指导来筛选合适化合物， 包括测试 实施例之一所提供的化合物， 在普通技术人员的技术范围之内。例如， 在某些实施方案中， 合适的极性非质子溶剂所具有的 HSP 应在上述范围之内， 其结构示于上式 1-9。
     (2) 组合物、 缓冲剂和溶液
     (a) 杂交溶液
     传统的杂交溶液是本领域已知的。这类溶液可包括例如缓冲剂、 促进剂、 螯合剂、 盐、 去垢剂和封闭剂。
     例如， 缓冲剂可包括 SSC、 HEPES、 SSPE、 PIPES、 TMAC、 TRIS、 SET、 磷酸钾、 柠檬酸、 焦 磷酸钠等。缓冲剂浓度可以是 0.5x 至 50x。通常， 缓冲剂浓度是 2x 至 10x。
     促进剂可包括聚合物 ( 例如 FICOLL、 PVP、 肝素、 硫酸葡聚糖、 蛋白质 ( 例如 BSA)、 二醇 ( 例如乙二醇、 甘油、 1， 3- 丙二醇甘油、 丙二醇或二甘醇 )、 其组合 ( 例如 Dernhardt 氏 溶液和 BLOTTO)、 以及有机溶剂 ( 例如甲酰胺、 二甲基甲酰胺、 DMSO 等 )。促进剂浓度可以 是 1％至 80％或 0.1x 至 10x。通常， 甲酰胺浓度是 25％至 75％， 而 DMSO、 硫酸葡聚糖和二 醇浓度是 5％至 10％。
     螯合剂可包括 EDTA、 EGTA 等。螯合剂浓度可以是 0.1mM 至 10mM。通常， 螯合剂浓 度是 0.5mM 至 5mM。
     盐可包括氯化钠、 磷酸钠、 磷酸镁等。盐浓度可以是 1mM 至 750mM。通常， 盐浓度是 10mM 至 500mM。
     去垢剂可包括吐温、 SDS、 Triton、 CHAPS、 去氧胆酸等。去垢剂浓度可以是 0.01％ 至 10％。通常， 去垢剂浓度是 0.1％至 1％。
     核酸封闭剂可包括酵母 tRNA、 均聚物 DNA、 变性的鲑鱼精子 DNA、 鲱鱼精子 DNA、 人 类总 DNA、 COT1DNA 等。封闭核酸浓度可以是 0.05mg/mL 至 100mg/mL。
     在文献中， 传统的杂交溶液有很大差异。例如， 传统的杂交溶液可包含 5x 或 6x SSC、 0.01M EDTA、 5x Dernhardt 氏溶液、 0.5％ SDS 和 100mg/mL 剪切变性的鲑鱼精子 DNA。 另一种传统的杂交溶液可包含 50mM HEPES、 0.5M NaCl 和 0.2mM EDTA。用于生物标本 RNA 检测的 FISH 的典型杂交溶液可包括例如 2x SSC、 10％硫酸葡聚糖、 2mM 氧钒基 - 核糖核苷复 合物、 50％甲酰胺、 0.02％无 RNA 酶的 BSA 和 1mg/mL 大肠杆菌 tRNA。用于生物标本 DNA 检 测的 FISH 的典型杂交溶液可包括例如 2x SSC、 10％硫酸葡聚糖、 50％甲酰胺和例如 0.3mg/ mL 鲑鱼精子 DNA 或 0.1mg/mL COT1DNA。 其它典型杂交溶液可包含 40％甲酰胺、 10％硫酸葡 聚糖、 30mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 封闭 PNA 或 COT-1DNA， 和在某些情况下 0.1μg/μl 人 类总 DNA(THD)。
     本发明的组合物可包含杂交溶液， 其含有上述传统杂交溶液的任何组分以及至少 一种极性非质子溶剂。传统组分的浓度可以是与传统杂交溶液中所用的相同浓度， 或者可 以是更高或更低浓度， 或者可完全省略不用。
     例如， 如果本发明的组合物包含 NaCl 和 / 或磷酸盐缓冲液时， 它们的浓度可以是 0-1200mM NaCl 和 / 或 0-200mM 磷酸盐缓冲液。 在某些实施方案中， 盐浓度可以是例如 300mM NaCl 和 5mM 磷酸盐缓冲液， 或 600mM NaCl 和 10mM 磷酸盐缓冲液。
     如果本发明的组合物包含促进剂例如硫酸葡聚糖、 二醇或 DMSO， 硫酸葡聚糖浓度可以是 5％至 40％， 二醇浓度可以是 0.1％至 10％， DMSO 可以是 0.1％至 10％。在某些实 施方案中， 硫酸葡聚糖的浓度可以是 10％或 20％， 乙二醇、 1， 3- 丙二醇或甘油的浓度可以 是 1％至 10％。在某些实施方案中， DMSO 的浓度可以是 1％。在某些实施方案中， 含水组合 物不包含 DMSO 作为促进剂。在某些实施方案中， 含水组合物不包含甲酰胺作为促进剂， 或 者包含甲酰胺， 条件是所述组合物含有小于 10％、 或小于 5％、 或小于 2％、 或小于 1％、 或小 于 0.5％、 或小于 0.1％、 或小于 0.05％、 或小于 0.01％。
     如果本发明的组合物包含柠檬酸， 其浓度范围可以是 1mM 至 50mM， pH 范围可以是 5.0 至 8.0。在某些实施方案中， 柠檬酸浓度可以是 10mM， pH 可以是 6.2。
     本发明的组合物可包含能减少与例如细胞膜的非特异性结合的试剂， 例如鲑鱼精 子或少量人类总 DNA， 或者例如， 它们可包含能封闭例如重复序列与靶标结合的封闭剂， 例 如大量人类总 DNA 或重复序列富集 DNA 或特定封闭剂例如 PNA 或 LNA 的片段和序列。这些 试剂的浓度可以是 0.01-100μg/μl 或 0.01-100μM。例如， 在某些实施方案中， 这些试剂 可以是 0.1μg/μl 人类总 DNA 或 0.1μg/μl 非人类 DNA， 例如鲱鱼精子、 鲑鱼精子或小牛 胸腺 DNA 或 5μM 封闭 PNA。
     本发明一方面是用于杂交的组合物或溶液。 用于本发明的组合物包含含有核酸序 列和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合物。 变性双 链核苷酸序列的有效量是能够杂交的量。例如， 用于测定极性非质子溶剂的量是否对杂交 有效的一个方式就是， 确定所述极性非质子溶剂， 当用于本文所述的杂交方法和组合物例 如实施例 1 时， 是否能产生可检测信号和 / 或扩增的核酸产物。
     极性非质子溶剂有效量的非限制性实例包括例如约 1％至约 95％ (v/v)。在某些 实施方案中， 极性非质子溶剂的浓度为 5％至 60％ (v/v)。在其它实施方案中， 极性非质子 溶剂的浓度为 10％至 60％ (v/v)。在再一些实施方案中， 极性非质子溶剂的浓度为 30％至 50％ (v/v)。1％至 5％、 5％至 10％、 10％、 10％至 20％、 20％至 30％、 30％至 40％、 40％至 50％、 或 50％至 60％ (v/v) 的浓度也是合适的。在某些实施方案中， 极性非质子溶剂的浓 度可以是 0.1％、 0.25％、 0.5％、 1％、 2％、 3％、 4％或 5％ (v/v)。在其它实施方案中， 极性 非质子溶剂的浓度可以是 7％、 7.5％、 8％、 8.5％、 9％、 9.5％、 10％、 10.5％、 11％、 11.5％、 12％、 12.5％、 13％、 13.5％、 14％、 14.5％、 15％、 15.5％、 16％、 16.5％、 17％、 17.5％、 18％、 18.5％、 19％、 19.5％或 20％ (v/v)。
     当一种或多种核酸探针存在于本发明的组合物时， 所述探针可用可检测化合物 ( 例如酶、 生色团、 荧光染料和半抗原 ) 直接或间接标记， 如上所述。DNA 探针浓度可以是 0.1-100ng/μL。例如， 在某些实施方案中， 探针浓度可以是 1-10ng/μL。PNA 探针浓度可 以是 0.5-5000nM。例如， 在某些实施方案中， 探针浓度可以是 5-1000nM。
     在一个实施方案中， 本发明的组合物包含 40％极性非质子溶剂 (v/v)( 例如碳酸 亚乙酯， “EC” )、 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液和 1-10ng/μL 探针的混合 物。 本发明的另一种示例性组合物包含 15％ EC、 20％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐 缓冲液和 0.1μg/μl 人类总 DNA 的混合物。又一种示例性组合物包含 15％ EC、 20％硫酸 葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 柠檬酸 pH 6.2 和 0.1μg/μl 非人类 DNA( 例如鲱鱼精子、 鲑鱼精 子或小牛胸腺 ) 或 0.5％甲酰胺或 1％二醇 ( 例如乙二醇、 1， 3 丙二醇或甘油 )。
     (b) 极性非质子溶剂不同的极性非质子溶剂可赋予本发明组合物不同特性。例如， 对极性非质子溶剂 的选择可促进组合物的稳定性， 因为某些极性非质子溶剂会随时间降解。 例如， 极性非质子 溶剂碳酸亚乙酯分解成乙二醇 ( 其是相当稳定的分子 ) 和二氧化碳 ( 其可与水反应形成碳 酸， 改变本发明组合物的酸度 )。不受理论的束缚， 据信在碳酸亚乙酯分解时 pH 的改变使 本发明组合物的杂交效果降低。然而， 可通过降低组合物的 pH， 通过添加柠檬酸作为缓冲 液 (pH 6.2)， 替代传统的磷酸盐缓冲液 ( 其通常在约 pH 7. 使用 4)， 和 / 或通过添加乙二 醇 ( 浓度例如介于 0.1％至 10％， 或介于 0.5％至 5％， 例如 1％、 2％、 3％等 )， 改善稳定性。 例如， 使用 10mM 柠檬酸缓冲液， 本发明组合物在 2-8℃可保持稳定大约 8 个月。 如果组合物 贮存在低温 ( 例如 -20℃ ) 时也可改善稳定性。
     另外， 在某些条件下， 某些极性非质子溶剂可使本发明组合物分离成多相体系。 对 于不同的极性非质子溶剂而言， 得到多相体系的条件可以不同。然而， 通常， 随着极性非质 子溶剂浓度增加， 相数增加。 例如， 包含低浓度碳酸亚乙酯 ( 即小于 20％ ) 的组合物可以单 相形式存在， 而包含更高浓度碳酸亚乙酯的组合物可分离成两相、 或甚至三相。举例来说， 包含 15％碳酸亚乙酯的组合物在室温下以单相存在， 而包含 40％碳酸亚乙酯的组合物在 室温下由粘稠的下相 ( 总体积的大约 25％ ) 和不太粘稠的上相 ( 总体积的大约 75％ ) 组 成。 另一方面， 某些极性非质子溶剂在室温下可以两相形式存在， 甚至在低浓度时。 例 如， 环丁砜、 γ- 丁内酯、 三硫代碳酸亚乙酯、 亚硫酸乙二醇酯和碳酸异丙二醇酯在浓度为 10、 15、 20 或 25％ (20％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 柠檬酸缓冲液 ) 时， 在室温下以两相 形式存在。
     也可通过调节本发明组合物的温度来改变相数。通常， 随着温度上升， 相数减少。 例如， 在 2-8℃， 包含 40％碳酸亚乙酯的组合物可分离成三相体系。
     也可通过调节组合物中硫酸葡聚糖和 / 或盐的浓度， 来改变相数。一般而言， 降低 硫酸葡聚糖浓度 ( 传统浓度为 10％ ) 和 / 或盐浓度， 可减少相数。然而， 根据组合物中特定 极性非质子溶剂及其浓度， 可甚至用更高浓度的盐和硫酸葡聚糖产生单相。 例如， 通过增加 硫酸葡聚糖和盐的浓度， 包含少量 EC( 例如 15％、 10％、 5％ ) 的组合物可工作良好， 同时仍 然保持单相体系。在一个具体的实施方案中， 包含 HER2 基因 DNA 探针、 CEN7PNA 探针、 15％ EC、 20％硫酸葡聚糖、 600mMNaCl 和 10mM 磷酸盐缓冲液的组合物甚至在 -20℃以单相形式存 在。在其它实施方案中， 组合物在 -20℃是液体。
     某些极性非质子溶剂在一相或另一相中可产生更强信号。例如， 40％亚硫酸乙二 醇酯在下相产生强烈信号， 而在上相无信号。 同样， 某些种类的探针在一相或另一相中可产 生更强烈的信号。例如， PNA 探针倾向于在下相、 而不是上相中显示出更强烈信号。
     因此， 本发明的多相体系可用于方便地检查样品的不同方面。 例如， 两相体系可用 于分离带有 PNA 探针标记的样品和带有 DNA 探针的样品。其它用途包括分离具有例如某些 杂交优势的特定相， 使得所分离的相可用作单相体系。 在分离特定相之前或之后， 可加入探 针和 / 或样品。
     可用本发明的单相组合物、 本发明多相组合物的单一相、 或本发明多相组合物的 任何一相或多相的混合物， 来进行杂交。例如， 在单相体系中， 可提取一定体积的样品用于 杂交。在多相体系中， 可从目标相 ( 例如上相、 下相或中相 ) 中提取一定体积的样品用于杂
     交。或者， 在提取一定体积的混合样品用于杂交之前， 可将多相体系中的各相混合。然而， 根据组合物的不同， 多相体系可产生强烈而不均匀的局部背景染色。 尽管， 加入少量甲酰胺 将会减低单相体系中的背景， 但它对具有高浓度 ( 例如 40％ ) 极性非质子溶剂的多相体系 却没什么效果。另外， 随着甲酰胺浓度的增加， 需要更高浓度的探针和 / 或更长的杂交时间 来保持强烈信号强度。
     (c) 对于具体应用的优化
     可以改变本发明的组合物， 以优化具体应用的结果。 例如， 可以改变极性非质子溶 剂、 盐、 促进剂、 封闭剂和氢离子 ( 即 pH) 的浓度， 以改善具体应用的结果。
     例如， 可改变极性非质子溶剂浓度， 以改善信号强度和背景染色。通常， 随着极性 非质子溶剂浓度增加， 信号强度增加且背景染色降低。例如， 与包含 5％ EC 的组合物相比， 包含 15％ EC 的组合物倾向于显示出更强的信号和更少的背景。然而， 对于具有低浓度极 性非质子溶剂 ( 例如 0％至 20％ ) 的组合物， 如果增加盐和 / 或硫酸葡聚糖的浓度， 则可 改善信号强度。例如， 用 5％至 10％ EC， 当盐浓度比传统盐浓度升高大约 8-16 倍 ( 即大约 1200mM NaCl、 20mM 磷酸盐缓冲液 ) 时， 可观察到强烈信号。 同样， 如果使用较低浓度的极性 非质子溶剂， 通常需要较高浓度的硫酸葡聚糖以保持良好信号和背景强度。 因此， 也可改变盐和硫酸葡聚糖的浓度， 以改善信号强度和背景染色。通常， 随着 盐和硫酸葡聚糖的浓度增加， 信号强度增加， 背景染色降低。例如， 传统盐浓度的大约 2-4 倍的盐浓度 ( 即 300mM NaCl5mM 磷酸盐缓冲液 ) 产生强烈信号和低背景。然而， 令人惊奇 的是， 使用甚至完全不含盐的本发明组合物时发生杂交。 在无盐条件下， 通过增加促进剂和 / 或极性非质子溶剂的浓度， 可改善信号强度。
     同样， 随着硫酸葡聚糖浓度从 0％增至 20％， 信号强度增加。然而， 甚至在硫酸葡 聚糖浓度为 0％时可观察到良好信号。 在低硫酸葡聚糖条件下， 通过增加极性非质子溶剂和 / 或盐的浓度， 可改善信号强度。
     另外， 可改变用于本发明组合物的探针类型， 以改善结果。例如， 在本发明某些方 面， 与 DNA/PNA 探针组合相比， 在本发明组合物中 DNA/DNA 探针组合可表现出低背景， 或反 之亦然。另一方面， 在低盐和 / 或低极性非质子溶剂浓度下， 与 DNA 探针相比， PNA 探针倾 向于显示更强烈信号。事实上， 在没有极性非质子溶剂时， PNA 探针也显示信号， 而在没有 极性非质子溶剂时， DNA 探针则显示微弱信号或无信号。
     II. 试剂盒
     本发明也提供包含本发明组合物的试剂盒。因此， 试剂盒可包含一种或多种分子 探针 ( 如上所述 ) 和含水组合物 ( 如上所述 )。在一个实施方案中， 探针不立即显示 ( 例如 因为它们没有荧光团或生色团标记 )， 试剂盒还包含显色剂， 例如抗体 ( 其可以是单克隆抗 体， 并且其可具有可检测标记 )、 酶的荧光或显色底物、 链霉抗生物素缀合物， 或技术人员已 知的任何其它合适的显色剂。
     在一个实施方案中， 试剂盒还包含可用于检测染色体畸变的其它试剂和 / 或组合 物。在一个实施方案中， 试剂盒还可包含蛋白酶， 例如胃蛋白酶或蛋白酶 K。在一个实施方 案中， 试剂盒还可包含一种或多种预处理溶液、 蛋白酶、 严格洗涤缓冲剂、 荧光封固剂、 洗涤 缓冲剂、 信号放大溶液和盖玻片密封剂。例如， 在一个实施方案中， 细胞学 FISH 试剂盒还可 包含一种或多种洗涤缓冲剂、 严格性缓冲剂、 荧光封固剂和盖玻片密封剂。 在一个实施方案
     中， 组织学 FISH 试剂盒还可包含一种或多种预处理溶液、 胃蛋白酶、 洗涤缓冲剂、 严格性缓 冲剂、 荧光封固剂和盖玻片密封剂。在一个实施方案中， CISH 试剂盒还可包含过氧化物酶 组件 (block)、 CISH 抗体混合物、 红色底物缓冲剂、 蓝色底物缓冲剂、 红色显色剂和蓝色显 色剂。在另一个实施方案中， 试剂盒还可包含使用说明书。
     III. 应用、 方法和使用
     本发明还提供使用上述组合物和试剂盒的方法， 所述方法用于检测染色体畸变、 诊断疾病、 监测治疗性治疗过程、 监测已经完成治疗的患者的疾病复发。一般而言， 这种方 法使用一种或多种上述杂交条件。
     例如， 本发明提供用本发明组合物检测染色体畸变的方法。 检测可涉及诊断、 选择 合适的治疗和 / 或监测患者的疾病复发。在一个实施方案中， 本发明提供确定核酸序列中 是否存在染色体畸变的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供检测染色体畸变的分子探针，
     - 提供所述核酸序列，
     - 提供包含 1％ (v/v) 至 95％ (v/v) 的至少一种极性非质子溶剂的含水组合物，
     - 将所述分子探针、 所述核酸序列和所述含水组合物混合在一起， 其时间至少足以 使所述分子探针与所述核酸序列杂交， 和
     - 确定所述分子探针是否已经与所述核酸序列杂交，
     从而确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。
     在另一个实施方案中， 本发明提供确定核酸序列中是否存在染色体畸变的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供所述核酸序列，
     - 将包含检测染色体畸变的分子探针和 1 ％ (v/v) 至 95 ％ (v/v) 的至少一种极 性非质子溶剂的含水组合物用于所述核酸， 其时间至少足以使所述分子探针与核酸序列杂 交， 和
     - 确定所述分子探针是否与所述核酸序列杂交，
     从而确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。
     在另一个实施方案中， 本发明提供确定核酸序列中是否存在染色体畸变的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供所述核酸序列，
     - 将包含至少一种极性非质子溶剂和检测染色体畸变的分子探针的本发明含水化 合物用于所述核酸序列， 其时间至少足以使所述分子探针与核酸序列杂交， 和
     - 确定所述分子探针是否与所述核酸序列杂交，
     从而确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。
     本发明还提供诊断染色体畸变相关的先天性遗传疾病、 癌症或感染的方法， 所述 方法包括 ：
     - 提供来自受试者的组织样品， 其中所述组织样品包含核酸序列，
     - 按照本发明方法， 确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中， 和
     - 如果染色体畸变存在于所述组织样品中， 则诊断所述先天性遗传疾病、 癌症或感 染。在一个实施方案中， 本发明的方法可用于确定患者是否能从特定治疗中受益。例 如， HER 已扩增 2 的乳癌患者可从 HerceptinTM( 曲妥单抗 ) 治疗中受益， 过量表达 EGFR 的 TM 结直肠癌患者可从 ( 西妥昔单抗 ) 或 Vectibix (panitumumab) 的治疗中受益。
     在一个实施方案中， 本发明的方法可用于监测疾病进程或缓解。在另一个实施方 案中， 本发明的方法可用于评价患者的预后。例如， 本发明的方法可与临床病理学数据一 起， 用于评价患者的预后。在一个实施方案中， 所述方法可用于确定 HER2 基因扩增的存在， 并使用该信息来提供 II 期、 结节阳性乳癌患者的预后。TOP2A 缺失或扩增的存在也可用于 评价乳癌患者的预后。
     A. 分析样品
     本发明的方法和组合物可全部或部分用于细胞学、 组织学或分子生物学领域的所 有类型的杂交应用。依据一个实施方案， 本发明方法中的第一或第二核酸序列存在于生物 样品中。这些样品的实例包括组织样品、 细胞制备物、 细胞碎片制备物、 以及分离或富集的 细胞组分制备物。样品可源自不同组织 ( 例如乳房、 肺、 结直肠、 前列腺、 肺、 头颈部、 胃、 胰 脏、 食道、 肝脏和膀胱或其它相关组织及其赘生物 )、 任何细胞悬液、 血液样品、 细针吸出物、 腹水、 痰、 腹膜洗液、 肺部洗液、 尿、 粪、 细胞刮取物、 细胞涂片、 细胞离心涂片或细胞涂片离 心 (cytoprep) 细胞。
     可用标准方案分离和处理样品。细胞碎片制备物可通过例如细胞匀浆、 冻融处理 或细胞破碎而获取。可根据获取样品的目的并根据其场所的常规方法的不同， 采用多种不 同方式处理分离的样品。通常用不同试剂处理样品， 以保藏组织， 用于随后的样品分析， 或 者可直接分析样品。广泛用于保藏样品的方法实例是经福尔马林固定， 然后石蜡包埋和冷 冻保藏。
     细胞学包括检查来自生物样品的单个细胞和 / 或染色体铺片。样品的细胞学检查 首先是获取细胞标本， 这通常是通过以下方式而达到 ： 通过刮取、 擦拭或刷取某区域 ( 例如 就宫颈标本而言 )、 或通过采集体液 ( 例如得自胸腔、 膀胱或脊柱的那些 )、 或通过细针吸出 或穿刺活检 ( 例如就内部肿瘤而言 )。 在常规手工细胞学制备中， 将样品移至液体悬浮材料 中， 再将液体中的细胞直接转移或通过基于离心的处理步骤， 转移到显微镜载玻片上， 进行 观察。 在典型的自动化细胞学制备中， 将过滤装置放入液体悬液中， 过滤装置同时可分散细 胞并将细胞捕获到滤膜上。再取出滤膜并贴放在显微镜载玻片上。将细胞固定在显微镜载 玻片上， 然后通过下述任何技术进行分析。
     对于中期铺片， 细胞培养物通常经秋水仙碱或其它合适的纺锤体极破坏剂处理， 以将细胞周期终止在中期。然后将细胞固定并印迹到 (spotted onto) 显微镜载玻片上， 用 甲醛处理， 洗涤并在乙醇中脱水。然后加入探针， 通过下述任何技术分析样品。
     在使用细胞学样品的传统杂交实验中， 将含有标本的玻片浸泡在甲醛缓冲液中， 洗涤， 然后在乙醇中脱水。再加入探针， 给标本盖上盖玻片。将玻片在足以变性标本中任何 核酸的温度下孵育 ( 例如 5 分钟， 在 82℃ )， 然后在足以允许杂交的温度下孵育 ( 例如在 45℃过夜 )。杂交之后， 除去盖玻片， 对标本进行高严格性洗涤 ( 例如在 65℃ 10 分钟 )， 接 着是一系列低严格性洗涤 ( 例如在室温下 2×3 分钟 )。 然后样品经脱水和封固， 用于分析。
     组织学包括检查组织薄片中的细胞。为了制备组织样品用于组织学检查， 将组织 片固定在合适固定剂 ( 通常是醛， 例如甲醛或戊二醛 ) 中， 然后包埋在融化石蜡中。再在切片机上对含有组织样品的蜡块进行切片， 得到含有组织的石蜡薄片， 通常厚度为 2-10 微 米。再将标本放在显微镜载玻片上， 风干并加热， 使标本粘附在载玻片上。再将残余石蜡溶 于合适溶剂 ( 通常是二甲苯、 甲苯或其它 ) 中。 这些所谓的脱蜡溶剂再用洗涤 - 脱水类试剂 除去， 然后通过下述任何技术来分析样品。或者， 可从冷冻标本制备切片， 快速固定在 10％ 福尔马林或其它合适的固定剂中， 再用脱水剂浸泡， 然后分析样品。
     在使用组织学样品的传统杂交实验中， 将经福尔马林固定、 石蜡包埋的组织标本 切成 2-6μm 的切片并收集在载玻片上。石蜡被融化 ( 例如 30-60 分钟， 在 60℃ ) 并通过用 二甲苯 ( 或二甲苯替代品 ) 洗涤例如 2×5 分钟而除去 ( 脱蜡 )。使样品复水， 洗涤和预处 理 ( 例如在 95-100℃ 10 分钟 )。载玻片经洗涤并用胃蛋白酶或其它合适的渗透剂在 37℃ 处理例如 3-15 分钟。载玻片经洗涤 ( 例如 2×3 分钟 )， 脱水并使用探针。给标本盖上盖 玻片， 并将玻片在足以变性标本中任何核酸的温度下孵育 ( 例如 5 分钟， 在 82℃ )， 然后在 足以允许杂交的温度下孵育 ( 例如在 45℃过夜 )。杂交之后， 除去盖玻片， 对标本进行高严 格性洗涤 ( 例如 10 分钟， 在 65℃ )， 接着是一系列低严格性洗涤 ( 例如 2×3 分钟， 在室温 下 )。然后样品经脱水和封固， 用于分析。
     B. 杂交技术
     本发明的组合物和方法可全部或部分用于本领域已知用于细胞学和组织学样品 的所有类型的核酸杂交技术。这种技术包括例如原位杂交 (ISH)、 荧光原位杂交 (FISH ； 包 括多色 FISH、 纤维 -FISH 等 )、 显色原位杂交 (CISH)、 银染原位杂交 (SISH)、 比较基因组杂 交 (CGH)、 染色体涂染和原位阵列。
     一般而言， 杂交技术例如 CGH、 FISH、 CISH 和 SISH 使用大的、 主要是非特异性核酸 探针， 所述探针以不同的严格性与细胞染色体中的基因或基因片段杂交。这类探针可衍生 自粘粒克隆 (cosmic clone)、 YAC 克隆或其它克隆的 DNA 片段。使用大探针使原位杂交技 术非常灵敏。然而， 在传统杂交测定中成功使用大基因组探针取决于封闭来自例如广泛存 在于基因组中的重复序列的不想要的背景染色。这种封闭步骤是耗时而昂贵的。如本文所 述， 本发明的方法和组合物有利地减少和 / 或消除对这种封闭步骤的需要。然而， 在一个实 施方案中， 按照本领域已知方法例如公开于 PCT/US02/30573 的方法， 重复序列可被抑制。
     可直接或间接使用荧光染料 ( 例如 FISH)、 有机显色剂 ( 例如 CISH)、 银颗粒 ( 例 如 SISH) 或其它金属颗粒 ( 例如金促进的荧光原位杂交， GOLDFISH)， 来检测细胞学和组织 学样品中的结合探针。 因此， 根据检测方法， 得自待检样品的细胞群体可通过荧光显微镜术 或常规明视野光学显微镜来观察。
     对细胞学和组织学样品的杂交测定是测定特定 DNA 序列的数目、 大小和 / 或位置 的重要工具。例如， 在 CGH 中， 将全基因组染色并与正常参考基因组比较， 用于检测具有异 常拷贝数的区域。通常， 来自受试者组织和正常对照组织的 DNA 用不同颜色的探针来标记。 将 DNA 混合物合并并加入到正常染色体的中期铺片 ( 或加入到微阵列芯片， 对于阵列 CGH 或基质 -CGH)。然后比较颜色比例， 识别具有异常拷贝数的区域。
     当需要多色图像和 / 或当方案要求定量信号时， 通常使用 FISH。该技术通常要求 制备细胞学样品， 标记探针， 变性靶染色体和探针， 将探针与靶序列杂交并检测信号。 通常， 杂交反应对靶序列进行荧光染色， 使它们的位置、 大小或数目可用荧光显微镜术、 流式细胞 术或其它合适仪器来测定。范围从全基因组到几千碱基对的 DNA 序列都可用 FISH 来研究。FISH 也可用于中期铺片和间期核。
     FISH 已经成功用于对中期染色体、 间期核、 染色质纤维和裸 DNA 分子的重复 DNA 序列和单拷贝 DNA 序列作图， 并通过大重复家族 (large repeated family)、 尤其是核糖体 DNA 和主要串联排列家族 (major tandem array family) 的定位而用于染色体识别和核型 分析。 FISH 的一个最重要应用就是在人和其它真核模型物种的特定疾病相关基因中检测单 拷贝 DNA 序列， 和检测感染因子。 FISH 可用于检测例如在出生前诊断、 造血系统癌症和实体 瘤中的染色体非整倍性 ； 检测基因异常例如癌基因扩增、 基因缺失或基因融合 ； 染色体结 构异常例如易位、 重复、 插入或倒位 ； 邻近基因综合征 (contiguous gene syndrome) 例如微 缺失综合征 (microdeletion syndrome) ； 各种治疗的遗传效应 ； 体细胞中的病毒核酸和染 色体中的病毒整合位点等。
     在多色 FISH 中， 每条染色体染上不同颜色， 使得可以确定正常染色体， 异常染色 体正是从中衍生出来的。这种技术包括多色 FISH(m-FISH ； Speicher 等， Nat.Genet.， 12 ： 368-75(1996))、 光谱核型分析 (SKY ； Schrock 等， Science， 273 ： 494-97(1996))、 组合二元 关系标记 (combined binary ration labeling)(COBRA ； Tanke 等， Eur.J.Hum.Genet.， 7： 2-11(1999))、 变色核型分析 (color-changing karyotyping)(Henegariu 等， Nat.Genet.， 23 ： 263-64(1999))、 多 色 显 带 分 析 (Muller 等， Hum.Genet.， 100 ： 271-78(1997))、 高分 辨率多色显带分析 (Chudoba 等， Cytogenet.Cell Genet.， 84 ： 156-60(1999))、 端粒多色 FISH(TM-FISH ； Henegariu 等， Lab.Invest.， 81 ： 483-91(2001))、 信号分离 FISH(ssFISH) 和 信号融合 FISH。CISH 和 SISH 可用于与 FISH 相同的许多应用， 并具有允许分析基础组织形 态学的额外优势， 例如用于组织病理学应用。
     本发明的组合物也可全部或部分用于涉及杂交的所有类型的分子生物学技术， 包 括印迹和探针 ( 例如 DNA 印迹、 RNA 印迹等 )、 阵列和扩增技术 ( 包括传统的 PCR、 RT-PCR、 突 变 PCR、 不对称 PCR、 热启动 PCR、 反向 PCR、 多重 PCR、 巢式 PCR、 定量 PCR 和原位 PCR)。原位 PCR 是在载玻片上的细胞 ( 例如上述细胞学和组织学样品 ) 内发生的聚合酶链式反应。通 常， 当样品粘附到载玻片上之后， 使细胞复水和渗透， 然后与包含聚合酶、 dNTP 和引物的合 适 PCR 试剂混合物混合。 PCR 可在专用仪器例如 GeneAmp 原位 PCR 系统 1000(Perkin Elmer Biosystems， Foster City， CA) 上进行， 并可用标记探针或通过在扩增期间掺入标记 dNTP 来检测扩增产物。本发明的组合物将会改善传统的和原位 PCR 分析的效率， 例如通过降低 变性和杂交的温度和 / 或减少进行扩增循环的所需时间。
     C. 杂交条件
     使用本发明组合物的杂交方法可包括将所述组合物用于包含靶核酸序列 ( 很可 能呈双链形式 ) 的样品。通常， 为了保证探针与靶序列杂交， 将样品和组合物加热， 以变性 靶核酸。变性期间， 极性非质子溶剂与序列相互作用并促进靶标的变性和探针重新退火到 靶标。与甲酰胺相比， 本发明所述的极性非质子溶剂显著地加速了该过程并降低了杂交条 件的苛刻性和毒性。
     可采用与使用传统溶液进行杂交同样的测定方法， 使用本发明组合物进行杂交。 然而， 本发明的组合物允许更短的杂交时间。 例如， 加热预处理、 消化、 变性、 杂交、 洗涤和封 固步骤可使用与传统溶液所用的体积、 温度、 试剂和孵育时间相同的条件。 大的变化存在于 本领域已知的传统杂交方案中。例如， 某些方案规定了没有探针存在时可能的双链核苷酸的单独变性步骤， 然后接着是杂交步骤。本发明的组合物可用于本领域已知的任何传统的 杂交方案。
     或者， 可以从传统方法来改变并优化使用本发明组合物的测定， 例如通过减少杂 交时间， 升高或降低变性和 / 或杂交的温度、 和 / 或增加或减少杂交体积。
     例如， 在某些实施方案中， 当变性温度是 60-100 ℃， 杂交温度是 20-60 ℃时， 本 发明的组合物将会产生强烈信号。在其它实施方案中， 当变性温度是 60-70 ℃、 70-80 ℃、 80-90℃或 90-100℃， 杂交温度是 20-30℃、 30-40℃、 40-50℃或 50-60℃时， 本发明的组合 物将会产生强烈信号。在其它实施方案中， 当变性温度是 72、 82 或 92℃， 杂交温度是 40、 45 或 50℃时， 本发明的组合物将会产生强烈信号。
     在其它实施方案中， 当变性时间是 0-10 分钟， 杂交时间是 0 分钟至 24 小时时， 本 发明的组合物将会产生强烈信号。在其它实施方案中， 当变性时间是 0-5 分钟， 杂交时间是 0 分钟至 8 小时时， 本发明的组合物将会产生强烈信号。在其它实施方案中， 当变性时间是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 分钟， 杂交时间是 0 分钟、 5 分钟、 15 分钟、 30 分钟、 60 分钟、 180 分钟或 240 分钟时， 本发明的组合物将会产生强烈信号。本领域技术人员将会理解， 在某些情况下， 例 如 RNA 检测时， 不需要变性步骤。 因此， 使用本发明组合物的杂交可以在不到 8 小时内完成。在其它实施方案中， 杂 交可以在不到 6 小时内完成。在再一些实施方案中， 杂交可以在 4 小时内完成。在其它实 施方案中， 杂交可以在 3 小时内完成。在又一些实施方案中， 杂交可以在 2 小时内完成。在 其它实施方案中， 杂交可以在 1 小时内完成。在再一些实施方案中， 杂交可以在 30 分钟内 完成。在其它实施方案中， 它们的杂交可发生在 15 分钟内。杂交甚至可发生在 10 分钟内 或不到 5 分钟内。图 1 和图 2 分别说明了在组织学和细胞学样品上进行的杂交的典型时间 进程， 其使用本发明组合物与使用传统溶液进行的杂交相比较。
     随着杂交时间的改变， 探针浓度也可不同， 以产生强烈信号和 / 或降低背景。例 如， 随着杂交时间减少， 探针量可增加， 以改善信号强度。另一方面， 随着杂交时间减少， 探 针量可以减少， 以改善背景染色。
     本发明的组合物令人惊奇地消除了杂交期间对封闭步骤的需求， 即通过封闭例如 重复序列与靶 DNA 的结合而改善信号和背景强度。因此， 不需要使用人类总 DNA、 封闭 PNA、 COT-1DNA 或来自任何其它来源的 DNA， 作为封闭剂。然而， 在使用本发明组合物时， 还可通 过向杂交反应中加入能减少非特异性结合 ( 例如与细胞膜结合 ) 的试剂， 进一步降低背景 水平， 所述试剂例如少量人类总 DNA 或非人类来源的 DNA( 例如鲑鱼精子 DNA)。
     本发明的含水组合物还提供了明显降低组合物所含的核酸序列浓度的可能性。 通 常， 与传统的探针浓度相比， 探针浓度可降低 2-8 倍。例如， 如果 HER2DNA 探针和 CEN17PNA 探针用于本发明的组合物， 它们的浓度可分别降低至其在传统杂交溶液中浓度的 1/4 和 1/2。 该特征， 以及不需要封闭用 DNA( 例如封闭 PNA 或 COT1)， 允许在自动化仪器系统中增加探针 体积， 与传统组合物系统所用的传统的 10μL 体积相比， 这减少了因蒸发而带来的损失， 详 细讨论如下。
     降低探针浓度也降低了背景。 然而， 降低探针浓度与杂交时间成负相关， 即浓度越 低， 所需杂交时间越长。然而， 甚至当极低浓度的探针与本发明含水组合物一起使用时， 杂 交时间仍然比用传统溶液更短。
     本发明的组合物通常允许比传统杂交溶液更好的信噪比。例如， 与在传统溶液中 杂交过夜相比， 使用某些探针， 使用本发明组合物的一小时杂交将会产生类似背景和更强 烈信号。当不加探针时没有观察到背景。
     当使用本发明组合物时， 也可改变和优化传统的测定方法， 这取决于系统是否是 手动、 半自动或自动化的。 例如， 半自动或自动化系统将会从使用本发明组合物而得到的短 杂交时间中受益。 短杂交时间可减少在这类系统中使用传统溶液所遇到的困难。 例如， 使用 半自动和自动化系统的一个问题就是， 杂交期间样品会发生明显蒸发， 因为这类系统需要 小的样品体积 ( 例如 10-150μL)、 升高的温度和延长的杂交时间 ( 例如 14 小时 )。因此， 在传统杂交溶液中的组分比例相当恒定。 然而， 因为本发明组合物允许更快的杂交， 所以减 少了蒸发， 允许在用于半自动和自动化系统的杂交组合物中组分比例的灵活性增加。
     例如， 两种自动化仪器用于使用本发明组合物来进行杂交。包含 40 ％碳酸亚乙 酯的组合物已经用于仪器， 其公开于 PCT 申请 DK2008/000430， 包含 15 ％碳酸亚乙酯的 组合物已经用于 HYBRIMASTER HS-300(Aloka CO.LTD， Japan)。当本发明的组合物用于 HYBRIMASTER HS-300 时， 该仪器可进行快速 FISH 杂交， 用水代替传统有毒的甲酰胺混合 物， 因而改善了安全性并减少了蒸发。 如果将水润湿的条带贴到 Aloka 仪器的反应单元 ( 杂 交室 ) 的内部盖子上， 如美国专利申请公布号 2005/0281711 所述， 甚至会进一步减少蒸发。
     自动化图像分析的另一个问题就是所需的图像数， 所需的大量存储空间和采集图 像所需的时间。 本发明的组合物通过产生与传统溶液相比非常强烈信号， 而解决了该问题。 因为本发明组合物产生非常强烈信号， 所以可以用比传统溶液所需的更低的放大倍数来作 图并且仍然可以对其进行检测和分析， 例如通过算法。因为放大倍数更低， 焦平面更宽， 所 以本发明组合物减少或消除了对采集样品连续切片的需要。结果是总体成像快得多， 因为 本发明组合物需要更少连续切片或不需要连续切片， 并且各图像覆盖大得多的面积。 另外， 总体分析时间更快， 因为总图像文件小得多。
     因此， 本发明的组合物和方法解决了传统的杂交溶液和方法相关的许多问题。
     通过以下非限制性实施例， 可以更清楚地理解本说明书， 所述实施例构成了本说 明书的组合物的优选实施方案。除非在实施例中或其它地方另有说明， 否则在本说明书和 权利要求书中所用的表达成分数量、 反应条件等的所有数字都可理解为在所有情况下被术 语 “约” 修饰。因此， 除非另有相反说明， 否则以下说明书和所附权利要求书中给出的数字 参数都是近似值， 其可根据意图在本文中获取的所需性质的不同而异。至少而并非试图将 等同方案原则的应用限制在权利要求书的范围之内， 每个数字参数应当视为按照有效数字 的数值和通常的四舍五入方式。
     尽管宽范围给出的数字范围和参数是近似值， 但是在具体实施例中给出的数值是 尽可能精确地报告的。然而， 任何数值必定具有来自其各自测试的标准差的某些误差。以 下实施例说明了本发明， 并且不应视为以任何方式限制本发明。 实施例
     对于本发明具体的实施方案， 将会详细给出参考。尽管参考这些实施方案描述了 本发明， 但可以理解， 它们不得视为将本发明限制至这些实施方案。相反， 本发明覆盖了替 代、 修改和等同方案， 其可按照所附权利要求书的定义而包括在本发明之内。以下实施例中所用的试剂来自 Dako 的组织学 FISH 辅助试剂盒 (K5599) 和细胞学 FISH 辅助试剂盒 (K5499)(Dako Denmark A/S， Glostrup Denmark)。试剂盒含有完成经福 尔马林固定、 石蜡包埋的组织切片标本的 FISH 程序所需的所有关键试剂， 除了探针之外。 按照制造商描述制备所有样品。Dako 杂交仪 (S2450， Dako) 用于消化、 变性和杂交步骤。
     在杂交后一周内， 使用装有 DAPI、 FITC、 德克萨斯红单滤色镜和 FITC/ 德克萨斯红 双滤色镜的 Leica DM6000B 荧光显微镜， 在 10x、 20x、 40x 物镜和 100x 油镜下， 对 FISH 载玻 片进行评价。
     使用 Olympus BX51 光学显微镜， 在 4x、 10x、 20x、 40x 和 60x 物镜下， 对 CISH 载玻 片进行评价。
     在以下实施例中， “硫酸葡聚糖” 是指分子量 Mw ＞ 500,000 的硫酸葡聚糖的钠盐 (D8906， Sigma)。所有浓度的极性非质子溶剂都以体积 (v/v) 百分比计。磷酸盐缓冲液是 指含有 NaH2PO4， · 2H2O( 磷酸二氢钠 - 二水合物 ) 和 Na2HPO4· H2O( 磷酸氢二钠 - 一水合物 ) 的磷酸缓冲溶液。柠檬酸缓冲液是指含有柠檬酸钠 (Na3C6H5O7， 2H2O ； 1.06448， Merck) 和柠 檬酸 - 一水合物 (C6H8O7， H2O ； 1.00244， Merck) 的柠檬酸缓冲溶液。
     通用组织学 FISH/CISH 程序 ( 实施例 1-20)
     将带有经福尔马林固定、 石蜡包埋 (FFPE) 的来自人 ( 扁桃体、 乳癌、 肾和结肠 ) 的 多组织阵列切片的载玻片在 60℃加热 30-60 分钟， 在二甲苯浴中脱蜡， 在乙醇浴中复水， 然 后移入洗涤缓冲液。 再将样品在预处理溶液中在至少 95℃预处理 10 分钟， 洗涤 2×3 分钟。 然后将样品用胃蛋白酶 RTU 在 37℃消化 3 分钟， 洗涤 2×3 分钟， 在一系列乙醇中脱水， 蒸发 并风干。按照所述， 在单独实验下， 将样品与 10μL FISH 探针一起孵育。将样品再通过严 格性洗涤， 在 65℃洗涤 10 分钟， 再洗涤 2×3 分钟， 然后在一系列乙醇中脱水， 蒸发并风干。 最终， 将载玻片用 15μL 抗褪色封固剂封固。完成染色之后， 观察人员连续评价染色载玻片 的信号强度、 形态学和背景， 进行评分。
     通用细胞学 FISH 程序 ( 实施例 21-22)
     将带有中期制备物的载玻片在 3.7％甲醛中固定 2 分钟， 洗涤 2×5 分钟， 在一系列 乙醇中脱水， 蒸发并风干。按照所述， 在单独实验下， 将样品与 10μL FISH 探针一起孵育。 将样品再通过严格性洗涤， 在 65℃洗涤 10 分钟， 再洗涤 2×3 分钟， 然后在一系列乙醇中脱 水， 蒸发并风干。 最终， 将载玻片用 15μL 抗褪色封固剂封固。 最终， 将载玻片用 15μL 抗褪 色封固剂封固。完成染色之后， 观察人员连续评价染色载玻片的信号强度、 形态学和背景， 按照组织切片评分指南所述， 进行评分。
     组织切片评分指南
     在 0-3 级量表上评价信号强度， 其中 0 表示无信号， 3 表示强烈信号。在 0-3 级量 表上评价细胞 / 组织结构， 其中 0 表示无结构和无核边界， 3 表示完整结构和清晰核边界。 介于 0 和 3 之间， 有额外的 0.5 级， 除非观察人员可评价信号强度、 组织结构和背景。
     根据 0-3 级量表上的分级系统， 对信号强度进行评分。
     0 无信号可见。
     1 信号强度微弱。
     2 信号强度中等。
     3 信号强度强烈。该评分系统允许使用 1/2 级。
     根据 0-3 级量表上的分级系统， 对组织和核结构进行评分。
     0 组织结构和核边界完全被破坏。
     1 组织结构和 / 或核边界差。该级别包括某些区域具有空核的情况。
     2 组织结构和 / 或核边界可见， 但核边界不清晰。该级别包括少量核是空的情况。
     3 组织结构和核边界完整而清晰。
     该评分系统允许使用 1/2 级。
     根据 0-3 级量表上的分级系统， 对背景进行评分。
     0 无或几乎无背景可见。
     1 有些背景。
     2 中等背景。
     3 高背景。
     该评分系统允许使用 1/2 级。
     实施例 1
     本实施例比较了经本发明组合物或传统杂交溶液处理的样品的信号强度和细胞 形态学， 作为变性温度的函数。
     FISH 探针组合物 I ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％甲酰胺 (15515-026， Invitrogen)、 5μM 封闭 PNA( 参见 Kirsten Vang Nielsen 等， PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation(FISH)Technique inPRINS and PNATechnologies in Chromosomal Investigation， 第 10 章 (Franck Pellestor 编 著 )(Nova Science Publishers， Inc.2006))、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针 (RP11-1143E20， 大小 192kb)。
     FISH 探针组合物 II ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸 亚乙酯 (03519， Fluka)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针 (RP11-1143E20， 大小 192kb)。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。按照指示， 将 FISH 探针变性 5 分钟并 在 45℃杂交 60 分钟。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。实施例 2
     本实施例比较了经本发明组合物或传统杂交溶液处理的样品的信号强度和背景 染色， 作为杂交时间的函数。
     FISH 探针组合物 I ： 10 ％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40 ％甲酰 胺、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     FISH 探针组合物 II ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸 亚乙酯、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后 在 45℃孵育 14 小时、 4 小时、 2 小时、 60 分钟、 30 分钟、 15 分钟、 0 分钟。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。
     实施例 3
     本实施例比较了经具有不同极性非质子溶剂的本发明组合物或传统杂交溶液处 理的样品的信号强度。
     FISH 探针组合物 I ： 10 ％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40 ％甲酰 胺、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     FISH 探针组合物 II ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸 亚乙酯 (EC)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     FISH 探针组合物 III ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸 异丙二醇酯 (PC)(540013， Aldrich)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基 因 DNA 探针。
     FISH 探针组合物 IV ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％环丁
     砜 (SL)(T22209， Aldrich)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探 针。
     FISH 探针组合物 V ： 10 ％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40 ％乙腈 (AN)(C02CIIX， Lab-Scan)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探 针。
     FISH 探针组合物 VI ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％ γ- 丁 内酯 (GBL)(B 103608， Aldrich)、 5μM 封闭 PNA、 7,5ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然 后在 45℃孵育 60 分钟。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。
     实施例 4
     本实施例比较了经具有不同浓度极性非质子溶剂的本发明组合物处理的样品的 信号强度。
     FISH 探针组合物 ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 10-60％碳酸 亚乙酯 ( 按照指示 )、 5μM 封闭 PNA、 7.5ng/μL 德克萨斯红标记的 IGK- 恒定区 DNA 基因探 针 ((CTD-3050E15、 RP11-1083E8 ； 大小 227kb) 和 7.5ng/μL FITC 标记的 IGK- 可变区基因 DNA 探针 (CTD-2575M21、 RP11-122B6、 RP11-316G9 ； 大小 350 和 429kb)。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后 在 45℃孵育 60 分钟。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。 实施例 5 本实施例比较了经有或没有 PNA 封闭的组合物处理的样品的信号强度和背景强度。FISH 探针组合物 ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸亚 乙酯、 7.5ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后 在 45℃孵育 60 分钟。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。
     实施例 6
     本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度， 作为探针浓度和杂交时 间的函数。
     FISH 探针组合物 ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸亚 乙酯、 和 10、 7.5、 5 或 2.5ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针 ( 按照指示 )。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后 在 45℃孵育 3 小时、 2 小时和 1 小时。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。
     实施例 7
     本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度， 作为盐、 磷酸盐和缓冲 液的浓度的函数。
     FISH 探针组合物 ： 10％硫酸葡聚糖、 ([NaCl]、 [ 磷酸盐缓冲液 ]、 [TRIS 缓冲液 ] 如结果所示 )、 40％碳酸亚乙酯、 7.5ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后 在 45℃孵育 60 分钟。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。 实施例 8 本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度， 作为硫酸葡聚糖浓度的函数。 FISH 探针组合 物 ： 0、 1、 2、 5 或 10 ％硫 酸葡聚 糖 ( 按 照指示 )、 300mM NaCl、 5mM 磷 酸 盐 缓 冲 液、 40 ％ 碳 酸 亚 乙 酯、 5ng/μL 德 克 萨 斯 红 标 记 的 SIL-TAL1 基 因 DNA 探 针 (RP1-278O13 ； 大小 67kb) 和 6ng/μL FITC SIL-TAL1(ICRFc112-112C1794、 RP11-184J23、 RP11-8J9、 CTD-2007B18、 133B9 ； 大小 560kb)。
     如果存在， 不同粘度的各相在使用前混合。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后 在 45℃孵育 60 分钟。不封闭。
     结果 ：
     注意 ： 本实验没有得到评分为 “3” 的结果， 因为 SIL-TAL1 德克萨斯红标记的探针 仅为 67kb 并且来自未优化制备物。实施例 9
     本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度， 作为硫酸葡聚糖、 盐、 磷 酸盐和极性非质子溶剂的浓度的函数。
     FISH 探针组合物 Ia ： 34 ％硫酸葡聚糖、 0mM NaCl、 0mM 磷酸盐缓冲液、 0 ％碳酸亚 乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 Ib ： 34％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 0％碳酸亚 乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 Ic ： 34％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐缓冲液、 0％碳酸 亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记 的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IIa ： 32％硫酸葡聚糖、 0mM NaCl、 0mM 磷酸盐缓冲液、 5％碳酸亚 乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IIb ： 32％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 5％碳酸 亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记 的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IIc ： 32％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐缓冲液、 5％碳酸 亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记 的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IIIa ： 30％硫酸葡聚糖、 0mM NaCl、 0mM 磷酸盐缓冲液、 10％碳酸 亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记 的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IIIb ： 30％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 10％碳 酸亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标 记的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IIIc ： 30％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐缓冲液、 10％碳 酸亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标 记的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IVa ： 28％硫酸葡聚糖、 0mM NaCl、 0mM 磷酸盐缓冲液、 15％碳酸亚 乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IVb ： 28％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 15％碳酸 亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标记 的 CEN-7PNA 探针。
     FISH 探针组合物 IVc ： 28％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐缓冲液、 15％碳 酸亚乙酯、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针 ( 大小 218kb) 和 50nM FITC 标 记的 CEN-7PNA 探针。FISH 探针参考 V ： 标准售卖的含有封闭 PNA 的 HER2PharmDx 探针混合物 (K5331， Dako) 的小管。杂交过夜 20 小时。
     所有组合物以单相存在。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 60 分 钟， 不封闭， 除了 FISH 探针参考 V 之外， 后者具有 PNA 封闭并杂交 20 小时。
     结果 ：
     注意 ： 组合物 Iva 给出强烈 DNA 信号， 其中无盐。这用标准 FISH 组合物 ( 其中 DNA 结合是盐依赖型的 ) 是不可能的。
     实施例 10
     本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度， 作为高盐 (4x 正常 ) 条 件下的极性非质子溶剂和硫酸葡聚糖的浓度的函数。
     FISH 探针组合物 I ： 0％碳酸亚乙酯、 29％硫酸葡聚糖、 1200mMNaCl、 20mM 磷酸盐缓 冲液、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探针。 组合物是单相。
     FISH 探针组合物 II ： 5％碳酸亚乙酯、 27％硫酸葡聚糖、 1200mMNaCl、 20mM 磷酸盐 缓冲液、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探 针。组合物是单相。
     FISH 探针组合物 III ： 10％碳酸亚乙酯、 25％硫酸葡聚糖、 1200mMNaCl、 20mM 磷酸 盐缓冲液、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA
     探针。组合物是单相。
     FISH 探针组合物 IV( 未测试 ) ： 20％碳酸亚乙酯、 21％硫酸葡聚糖、 1200mM NaCl、 20mM 磷酸盐缓冲液、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针和 50nM FITC 标记的 CEN-7PNA 探针。组合物具有两相。
     结果 ：
     注意 ： 组合物 II 仅用 5％ EC 就得到良好 DNA 信号， 用 10％ EC 就得到强烈 DNA 信号。 实施例 11
     本实施例比较了经本发明组合物的不同相处理的样品的信号强度和背景。
     FISH 探针组合物 ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％碳酸亚 乙酯、 8ng/μL 德克萨斯红标记的 HER2 基因 DNA 探针和 600nM FITC 标记的 CEN-17PNA 探 针。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 60 分钟。不封闭。
     结果 ：
     注意 ： 在这些实验中， 上相比下相具有更多背景。
     实施例 12
     本实施例类似于上一个实施例， 但使用不同 DNA 探针并用 GBL 替代 EC。
     FISH 探针组合物 ： 10 ％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40 ％ GBL、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针和 600nM FITC 标记的 CEN-17PNA 探针。
     将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 60 分钟。不封闭。
     结果 ：
     实施例 13
     本实施例检查了本发明组合物中的相数， 作为极性非质子溶剂和硫酸葡聚糖的浓 度的函数。
     FISH 探针组合物 ： 10％或 20％硫酸葡聚糖 ； 300mM NaCl ； 5mM 磷酸盐缓冲液 ； 0、 5、 10、 15、 20、 25、 30％ EC ； 10ng/μL 探针。
     结果 ：
     注意 ： 15％ EC、 20％硫酸葡聚糖得到以上单相溶液中的最好的高信号强度。两相 20％ EC 比 15％ . 甚至具有更高信号强度 ( 数据未显示 )。
     实施例 14
     本实施例比较了经本发明不同组合物处理的样品的信号强度和背景， 作为探针浓 度和杂交时间的函数。
     FISH 探针组合物 I ： 10ng/μL HER2TxRed 标记的 DNA 探针 ( 标准浓度 ) 和标准浓 度的 CEN7FITC 标记的 PNA 探针 (50nM) ； 15％ EC ； 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 磷酸 盐缓冲液。
     FISH 探针组合物 II ： 5ng/μLHER2TxRed 标记的 DNA 探针 (1/2 的标准浓度 ) 和标 准浓度 (50nM)FITC 标记的 CEN7PNA 探针 ； 15％ EC ； 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 磷 酸盐缓冲液。
     FISH 探针组合物 III ： 2.5ng/μL HER2TxRed 标记的 DNA 探针 (1/4 的标准浓度 ) 1 和 /2 标准浓度 (25nM) 的 CEN7PNA 探针 ； 15％ EC ； 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 磷酸 盐缓冲液。
     组合物 I-III 以单相形式存在。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵 育 3 小时、 2 小时和 1 小时。
     结果 ：
     信号评分为 “3” 分， 是在 20x 物镜下清晰可见。B.G. ： 背景 实施例 15 本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度和背景， 作为封闭剂的函数。 FISH 探针组合物 ： 15 ％ EC ； 20 ％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 磷酸盐缓冲液 ； 1 2.5ng/μL HER2TxRed 标记的 DNA 探针 (1/4 的标准浓度 ) 和 /2 的标准浓度 (300nM)FITC 标记的 CEN17PNA 探针。样品用以下试剂封闭 ： (a) 无 ； (b)0.1μg/μl COT1(15279-011， Invitrogen) ； (c)0.3μg/μl COT1 ； 或 (d)0.1μg/μl 人类总 DNA， 然后用本发明组合物杂 交。
     所有样品都以单相形式存在。将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 60 分钟。
     结果 ：
     注意 ： 无封闭的背景水平明显低于无封闭的标准 FISH 通常观察到的水平。 相比之 下， 如果标准 FISH 组合物不含封闭剂， 信号通常不能读出。
     实施例 16
     本实验比较了用本发明的组合物去除背景染色的不同方式。
     所有组合物都含有 15 ％ EC、 20 ％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐缓冲液、
     2.5ng/μL HER2DNA 探针 (1/4 的标准浓度 )、 300nM CEN17PNA 探针 (1/2 的标准浓度 ) 和一 种以下背景降低剂 ：
     A)5μM 封 闭 PNA( 参 见 Kirsten Vang Nielsen 等， PNASuppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH)Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation， 第 10 章 (Franck Pellestor 编著 ) (Nova Science Publishers， Inc.2006))
     B)0.1μg/μl COT-1DNA
     C)0.1μg/μl 人类总 DNA(THD)( 超声处理的未标记的 THD)
     D)0.1μg/μl 剪切鲑鱼精子 DNA(AM9680， Ambion)
     E)0.1μg/μl 小牛胸腺 DNA(D8661， Sigma)
     F)0.1μg/μl 鲱鱼精子 DNA(D7290， Sigma)
     G)0.5％甲酰胺
     H)2％甲酰胺
     I)1％乙二醇 (1.09621， Merck)
     J)1％甘油 (1.04095， Merck)
     K)1％ 1， 3- 丙二醇 (533734， Aldrich)
     L)1％ H2O( 对照 )
     所有样品都以单相形式存在。 将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃在 FFPE 组织切片上孵育 60 和 120 分钟。
     结果 ：
     注意 ： 所有背景降低剂， 除了封闭 PNA 以外， 都表现出降低背景的效果。 因此， 针对 重复 DNA 序列的特异性封闭是不需要的。
     实施例 17
     本实验比较了使用两种不同极性非质子溶剂的上相和下相的信号强度。
     FISH 探针组合物 I ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％三硫代 碳酸亚乙酯 (ET)(E27750， Aldrich)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基 因 DNA 探针。
     FISH 探针组合物 II ： 10％硫酸葡聚糖、 300mM NaCl、 5mM 磷酸盐缓冲液、 40％亚硫 酸乙二醇酯 (GS)(G7208， Aldrich)、 5μM 封闭 PNA、 10ng/μL 德克萨斯红标记的 CCND1 基因 DNA 探针。
     将 FISH 探针在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 60 分钟。
     结果 ：
     实施例 18.
     本实验检查了不同极性非质子溶剂形成单相体系的能力。
     所有组合物都含有 ： 20％硫酸葡聚糖、 600mM NaCl、 10mM 磷酸盐缓冲液、 以及 10、 15、 20 或 25％的以下极性非质子溶剂之一 ：
     环丁砜
     γ- 丁内酯
     三硫代碳酸亚乙酯
     亚硫酸乙二醇酯
     碳酸异丙二醇酯
     结果 ： 所检查的所有浓度的所有极性非质子溶剂在所用的组合物中都得到至少两 相体系。然而， 这并不排除这些化合物可在其它组合物条件下得到单相体系。
     实施例 19
     本实验检查了本发明组合物在多 FFPE 组织切片的显色原位杂交 (CISH) 分析中的 使用。
     FISH 探针组合物 I ： 4.5ng/μL TCRAD FITC 标记的基因 DNA 探针 (1/4 的标准浓 度 )(RP11-654A2、 RP11-246A2、 CTP-2355L21、 RP11-158G6、 RP11-780M2、 RP11-481C14 ； 大小 1018kb) ； 15％ EC ； 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0。
     FISH 探针组合物 II ： 4.5ng/μL TCRAD FITC 标记的基因 DNA 探针 (1/4 的标准浓 度 )( 大小 1018kb) ； 15 ％ EC ； 20 ％硫酸葡聚糖 ； 600mMNaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0 ； 0.1ug/uL 剪切鲑鱼精子 DNA。
     FISH 探针组合物 III ： 300nM 各种单独的 FITC 标记的 PNACEN17 探针 (1/2 的标准 浓度 ) ； 15％ EC ； 20％硫酸葡聚糖 ； 600mMNaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0。
     使用 Dako DuoCISH 方案 (SK108) 和用于分离探针的组合物分析所有样品， 除了严
     格性洗涤进行 20 分钟、 而不是 10 分钟， 而且不用 DuoCISH 红色显色剂步骤之外。
     结果 ：
     注意 ： 信号强度非常强烈。 因为高水平的背景， 所以无法判断将鲑鱼精子 DNA 加入 到组合物 II 中是否减低了背景。使用 10x 物镜观察例如扁桃体， 其通常具有较少背景， 信 号清晰可见。如果组织具有高背景， 使用 20x 物镜， 信号清晰可见。
     实施例 20
     本实施例比较了经具有两种 DNA 探针的本发明组合物处理的 FFPE 组织切片的信 号强度和背景。
     FISH 探 针 组 合 物 I ： 9ng/μL IGH FITC 标 记 的 基 因 DNA 探 针 (RP11-151B17、 RP11-112H5、 RP11-101G24、 RP11-12F16、 RP11-47P23、 CTP-3087C18 ； 大 小 612kb) ； 6.4ng/ μL MYC Tx Red 标记的 DNA 探针 (CTD-2106F24、 CTD-2151C21、 CTD-2267H22 ； 大小 418kb) ； 15％ EC ； 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0。
     FISH 探针组合物 II ： 9ng/μL IGH FITC 标记的基因 DNA 探针 ； 6.4ng MYC TxRed 标 记的 DNA 探针 ； 15％ EC、 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0 ； 0.1ug/ uL 剪切鲑鱼精子 DNA。
     注意 ： 高背景可能是因为使用标准探针浓度这一事实。
     实施例 21
     本实验检查了本发明组合物在细胞学样品中的使用。
     FISH 探针组合物 ： 15 ％ EC ； 20 ％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 磷酸盐缓冲液 ； 1 5ng/μL HER2TxRed 标记的 DNA 探针 (1/2 的标准浓度 ) 和 /2 标准浓度的 CEN7(25nM)。
     将 FISH 探针在中期染色体铺片上在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 30 分钟， 都不封闭。
     结果 ：
     用本发明组合物没有观察到染色体显带 (R 显带模式 )， 与传统 ISH 溶液相反， 后者 通常显示 R 显带。观察到间期核和中期染色体的低的均匀红色背景染色。
     实施例 22
     本实施例比较了有或无封闭时 DNA 探针对细胞学样品、 中期铺片的信号强度和背 景。
     FISH 探针组合物 I ： 6ng/μL TCRAD 德克萨斯红标记的基因 DNA 探针 ( 标准浓度 ) (CTP-31666K20、 CTP-2373N7 ； 大小 301kb) 和 4.5ng/μL FITC 标记的基因 DNA 探针 (1/4 的 标准浓度 ) ； 15％ EC、 20％硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0。
     FISH 探针组合物 II ： 6ng/μL TCRAD 德克萨斯红标记的基因 DNA 探针 ( 标准浓度 ) ( 大小 301kb) 和 4.5ng/μL FITC 标记的基因 DNA 探针 (1/4 的标准浓度 ) ； 15％ EC、 20％ 硫酸葡聚糖 ； 600mM NaCl ； 10mM 柠檬酸缓冲液， pH 6.0 ； 0.1ug/uL 剪切鲑鱼精子 DNA。
     将 FISH 探针在中期铺片上在 82℃孵育 5 分钟， 然后在 45℃孵育 60 分钟。 结果 ：用本发明组合物又没有观察到染色体显带 (R 显带模式 )。另外， 没有观察到间期 核或中期染色体的背景染色。
     更多的实施方案
     实施方案 1. 一种杂交组合物， 所述组合物包含 ：
     (a) 检测染色体畸变相关核苷酸序列的第一分子探针，
     (b) 足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂， 和
     (c) 杂交溶液，
     其中所述核苷酸序列是染色体畸变的标记， 而且其中所述极性非质子溶剂不是二 甲亚砜 (DMSO)。
     实施方案 2. 实施方案 1 的杂交组合物， 其中所述染色体畸变是非整倍性、 潜在断 点、 插入、 倒位、 缺失、 重复、 基因扩增、 重排或易位。
     实施方案 3. 实施方案 1-2 的杂交组合物， 其中所述染色体畸变与先天性遗传疾 病、 癌症或感染相关。
     实施方案 4. 实施方案 3 的杂交组合物， 其中所述染色体畸变与癌症相关。
     实施方案 5. 实施方案 4 的杂交组合物， 其中所述第一分子探针检测 ALK、 BCL2、
     BCL3、 BCL6、 BCL10、 BCL12、 BCR、 CCND1、 E2A、 EGFR、 ETV6、 FIP1L1、 HER2、 IGH、 IGK、 IGL、 MALT1、 MLL(ALL-1、 HTRX1、 HRX)、 MYC(c-Myc)、 PAX5、 PDGFRA、 PDGFRB、 SIL、 TCF3(E2A、 ITF1)、 TCL1A、 TCRAD、 TCRB、 TCRG， 端粒、 TLX1、 TLX3(HOX11L2、 RNX) 或 TOP2A。
     实施方案 6. 实施方案 1-4 中任一项的杂交组合物， 其中所述第一分子探针检测 选自以下的非血液病的靶标 ： BASE、 BRCA1、 CCND1、 CCNE1、 DCD、 E2F3、 n-MYC/MYCN、 COX-2/ PTGS2、 LRIG1、 ER a、 hTERT、 MLN64/STARD3、 PGR、 SNAI1、 SRC、 TOP1、 TUBB1、 AIB 1、 DLC-1、 EDD、 Pip4k2b/5k、 Sil、 TBX2、 c-Kit、 VEGF、 VCAM-1、 Tie-1、 Ts/TYMS、 PSMA、 PSA、 PAP、 P15、 P16、 BCL1、 BCL2、 MTOR、 TIMP1、 ESR1、 PTEN、 MDM2/CDK4、 MET、 C-MET、 ERB1、 FGFR1、 IGF1R、 NET、 FGFR3、 ABCB1、 TMPRSS2、 BRCA2、 TOP2B、 ERCC1、 AKT1、 AKT2、 AKT3、 HRAS、 NRAS、 RAF1、 HER3、 HER4、 ENT1、 RRM1、 RRM2、 RRM2B、 PIK3CA、 AURK4、 AURKB、 AURKC、 MAPT/tau、 TTBK1、 TUBB、 VEGFR、 CCND3、 CDK6、 CDK2、 CDC2、 HDAC、 ESR2、 SCUBE2、 BIRC5、 FASN、 DHFR、 TP/ECGF1、 TYMP、 DPYD、 TK1、 HMGIC、 ABCA2、 ABCB11、 ABCC1、 ABCC2、 ABCC3、 ABCC4、 ABCC5、 ABCG2、 MVP、 ATP7A、 ATP7B、 SLC29A1、 SLC28A1、 SLC19A1、 TUBB4、 TUBA、 MAP4、 MAP7、 STMN1、 KIF5B、 HSPA5、 PSMD14、 FPGS、 GSTP1、 GPX、 GCLC、 GGT2、 MT、 AKR1B1、 HMGB1、 HMGB2、 XPA、 XPD、 MSH2、 MLH1、 PMS2、 APEX1、 MGMT、 GLO1、 RB1、 GML、 CDKN1A、 CDKN2A、 CDKN1B、 ERBB2、 KRAS2、 ITGB1、 JUN、 FOS、 NFKB1、 TP53、 TP73、 BCL2L1、 MCL1、 BAX、 BIRC4、 TNFRSF6、 CASP3、 CASP8、 HSPB1、 MALAT1(α)t(11 ； 19)(q11 ； q13.4)、 MHLB1t(11 ； 19)(q11 ； q13.4)、 COL1A1t(17 ； 22)(q22 ； q13)、 PDGFB t(17 ； 22)(q22 ； q13)、 FKHR t(2 ； 13)&t(1 ； 13)、 ETV6t(12 ； 15)(p13 ； q25)、 NTRK3t(12 ； 15)(p13 ； q25)、 TLS/FUSt(12 ； 16)(q13 ； p11)、 CHOP t(12 ； 16)(q13 ； p11)、 EWS t(12 ； 22)(q13 ； q12)、 EWS/FLI1t(11 ； 22)(q24 ； q12) 和 FLI1t(11 ； 22)(q24 ； q12)。
     实施方案 7. 实施方案 1-4 中任一项的杂交组合物， 其中所述第一分子探针检测 选自以下的血液病的靶标 ： ABL t(9 ； 22)(q34 ； q11)、 PRDM16del(1p36.32)del(21q22.12)、 RUNX1/AML1del(1p36.32)del(21q22.12)、 CEP8、 PDGFRB、 NUP98、 FGFR1、 ASS、 ETOt(8 ； 21) (q22 ； q22)、 AML1t(8 ； 21)(q22 ； q22)、 CBFbeta inv(16)(p13q22)t(16 ； 16)(p13 ； q22)、 MYH11 inv(16)(p13q22)t(16 ； 16)(p13 ； q22)、 AF9t(9 ； 11)、 PML t(15 ； 17)(q22 ； q21)、 PLZF t(11 ； 17)(q23 ； q21)、 NuMAt(11 ； 17)(q13 ； q21)、 NPM t(5 ； 17)(q23 ； q12)、 RAR αt(15 ； 17)(q22 ； q21)t(11 ； 17)(q23 ； q21)t(11 ； 17)(q13 ； q21)t(5 ； 17)(q23 ； q21) 、 EVI1t(3 ； v)(q26 ； v)、 GR6t(3 ； 3)(q21 ； q26)、 RPN1t(3 ； 3)(q21 ； q26)、 DEK t(6 ； 9)、 CAN t(6 ； 9)、 MLF1t(3 ； 5)(... ； q23)、 FUS t(16 ； 21)、 ERG t(16 ； 21)、 NUP98t(7 ； 11)、 HOX9A t(7 ； 11)、 MOZ/MYST3t(8 ； 16)(p11 ； p13)、 CBPt(8 ； 16)(p11 ； p13)、 p300t(8 ； 22)(p11 ； q13)、 TIF2/ GRIP-1/NCoA-2inv(8)(p11q13)、 MKL1、 PBX1t(1 ； 19)(q23 ； p13.3)+var.、 ABLt(9 ； 22)(q34 ； q11)、 AF4/AFF1t(4 ； 11)(q21 ； q23)、 AML1/RUNX1t(12 ； 21)(p13 ； q22)、 IL3t(5 ； 14)(q31 ； q32)、 HLF t(17 ； 19)、 IKZF1del(7)(p12.2)、 CDKN2A/CDKN2B del(9)(p21.3)、 TAL11p32 畸 变、 LMO2t(11 ； 14)(p13 ； q11)+var.、 LMO1t(11 ； 14)(p15 ； q11)、 HOX11t(10 ； 14)(q24 ； q11)+var.、 TAL2t(7 ； 9)(q34 ； q32)、 TAN1t(7 ； 9)(q34 ； q34)、 CEP12、 ATM、 D13S25、 D13S319、 TP53、 P53、 TNFAIP3del(6)(q23.3-q24.1)、 CDK6BCL1t(11 ； 14)(q13 ； q32)+var.、 IRF4t(6 ； 14)(p25 ； q32)、 C-MAF t(14 ； 16)(q32 ； q23)、 FGFR3t(4 ； 14)(p16 ； q32)、 MUM2/3t(1 ； 14) (q21 ； q32)、 NPM t(2 ； 5)(p23 ； q35)、 ASS、 RB1 和 ATM。
     实施方案 8. 实施方案 1-4 中任一项的杂交组合物， 其中所述第一分子探针检测选自以下的着丝粒 ： CEP1、 CEP2、 CEP3、 CEP4、 CEP5、 CEP6、 CEP7、 CEP8、 CEP9、 CEP10、 CEP11、 CEP12、 CEP13、 CEP14、 CEP15、 CEP16、 CEP17、 CEP18、 CEP19、 CEP20、 CEP21、 CEP22、 CEP23、 CEP X 和 CEP Y。
     实施方案 9. 实施方案 4 的杂交组合物， 其中所述癌症是肾上腺皮质癌、 膀胱癌、 脑 癌、 烧伤癌 (burn cancer)、 乳癌、 宫颈癌、 结直肠癌、 结肠癌、 直肠癌、 子宫内膜癌、 食道癌、 肾癌、 白血病、 肝癌、 肺癌、 胃癌、 胶质瘤、 造血系统癌症、 头颈部癌、 黑素瘤、 淋巴瘤、 白血病、 非霍奇金淋巴瘤、 卵巢癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 成视网膜细胞瘤、 肉瘤、 皮肤癌 ( 非黑素瘤 )、 睾丸癌、 甲状腺癌或子宫癌。
     实施方案 10. 实施方案 9 的杂交组合物， 其中所述癌症是乳癌， 所述第一分子探针 检测 HER2。
     实施方案 11. 实施方案 9 的杂交组合物， 其中所述癌症是结直肠癌， 所述第一分子 探针检测 EGF2。
     实施方案 12. 实施方案 4 的杂交组合物， 其中所述癌症是造血系统恶性肿瘤。
     实施方案 13. 实施方案 12 的杂交组合物， 其中所述第一分子探针检测选自以下的 染色体畸变 ： t(1 ； 14)(q34 ； q11)、 t(1 ； 19)(q23 ； p13)、 t(2 ； 5)、 t(2 ； 18)(q12 ； q21)、 t(2 ； 8)、 t(4 ； 11)、 t(4 ； 11)(q21 ； q23)、 t(6 ； 11)(q27 ； q23)、 t(7 ； 22)(p22 ； q12)、 t(8 ； 14)、 t(8 ； 22)、 t(9 ； 11)(p22 ； q23)、 t(9 ； 22)(q34 ； q11)、 t(10 ； 14)(q24 ； q11)、 t(11 ； 14)、 t(11 ； 14) (p13 ； q11)、 t(11 ； 19)(q23 ； p13)、 t(14 ； 18)(q23 ； q21)、 t(14 ； 18)、 t(18 ； 22)(q21 ； q11)， 和 t(21 ； 22)(q22 ； q12)。
     实施方案 14. 实施方案 1-13 中任一项的杂交组合物， 所述组合物还包含第二分子 探针。
     实施方案 15. 实施方案 14 的杂交组合物， 其中所述第二分子探针检测参考序列。
     实施方案 16. 实施方案 15 的杂交组合物， 其中所述参考序列是着丝粒序列。
     实施方案 17. 实施方案 16 的杂交组合物， 其中所述分子探针在实施方案 8 中定 义。
     实施方案 18. 实施方案 14 的杂交组合物， 其中所述第一分子探针和所述第二分子 探针检测侧接一个或多个潜在断点的序列或在所述潜在断点内的序列。
     实施方案 19. 实施方案 14-18 中任一项的杂交组合物， 所述组合物还包含第三分 子探针。
     实施方案 20. 实施方案 1-19 中任一项的杂交组合物， 其中所述第一分子探针是 DNA 探针、 PNA 探针或 LNA 探针。
     实施方案 21. 实施方案 14-20 中任一项的杂交组合物， 其中所述第二分子探针是 DNA 探针、 PNA 探针或 LNA 探针。
     实施方案 22. 实施方案 19-21 中任一项的杂交组合物， 其中所述第三分子探针是 DNA 探针、 PNA 探针或 LNA 探针。
     实施方案 23. 实施方案 1-22 中任一项的杂交组合物， 其中所述分子探针还包含标 记。
     实施方案 24. 实施方案 23 的杂交组合物， 其中所述标记是生色团、 荧光团、 生物 素、 DIG、 抗体 - 半抗原、 染料或酶。实施方案 25. 实施方案 1-24 中任一项的杂交组合物， 其中所述杂交组合物中的极 性非质子溶剂浓度范围为 1％ (v/v) 至 95％ (v/v)。
     实施方案 26. 实施方案 1-25 中任一项的杂交组合物， 其中所述杂交组合物中的极 性非质子溶剂浓度范围为 5％ (v/v) 至 10％ (v/v)。
     实施方案 27. 实施方案 1-25 中任一项的杂交组合物， 其中所述杂交组合物中的极 性非质子溶剂浓度范围为 10％ (v/v) 至 20％ (v/v)。
     实施方案 28. 实施方案 1-25 中任一项的杂交组合物， 其中所述杂交组合物中的极 性非质子溶剂浓度范围为 20％ (v/v) 至 30％ (v/v)。
     实施方案 29. 实施方案 1-28 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂是 无毒的。
     实施方案 30. 实施方案 1-29 中任一项的杂交组合物， 前提条件是所述杂交组合物 不含甲酰胺。
     实施方案 31. 实施方案 1-30 中任一项的杂交组合物， 前提条件是所述杂交组合物 含有小于 10％甲酰胺。
     实施方案 32. 实施方案 1-31 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂具 有内酯、 砜、 亚硫酸、 腈和 / 或碳酸官能团。
     实施方案 33. 实施方案 1-32 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂的 1/2 1/2 分散溶度参数范围为 17.7MPa 至 22.0MPa ， 极性溶度参数范围为 13MPa1/2 至 23MPa1/2， 氢 1/2 1/2 键溶度参数范围为 3MPa 至 13MPa 。
     实施方案 34. 实施方案 1-33 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂具 有环状基本结构。
     实施方案 35. 实施方案 1-34 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂选 自：
     其中 X 为 O， R1 为烷基二基，
     其中 X 是任选的， 如果存在则选自 O 或 S， 其中 Z 是任选的， 如果存在则选自 O 或 S， 其中 A 和 B 独立地为 O 或 N 或 S 或烷基二基的一部分或伯胺， 其中 R 为烷基二基， 和 其中 Y 为 O 或 S 或 C。 实施方案 36. 实施方案 1-35 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂选自： 乙酰苯胺、 乙腈、 N- 乙酰基吡咯烷酮、 4- 氨基吡啶、 苯甲酰胺、 苯并咪唑、 1， 2， 3- 苯并三 唑、 二氧化丁二烯、 碳酸 2， 3- 丁二醇酯、 γ- 丁内酯、 己内酯 (ε)、 氯马来酸酐、 2- 氯环己酮、 碳酸氯代乙二醇酯、 氯硝甲烷、 柠康酸酐、 巴豆酸内酯、 5- 氰基 -2- 硫尿嘧啶、 环丙腈、 硫酸 二甲酯、 二甲砜、 1， 3- 二甲基 -5- 四唑、 1， 5- 二甲基四唑、 1， 2- 二硝基苯、 2， 4- 二硝基甲苯、 二苯砜、 1， 2- 二硝基苯、 2， 4- 二硝基甲苯、 二苯砜、 ε- 己内酰胺、 乙磺酰氯、 亚膦酸二乙酯、 N- 乙基四唑、 碳酸亚乙酯、 三硫代碳酸亚乙酯、 硫酸乙二醇酯、 亚硫酸乙二醇酯、 糠醛、 2- 呋 喃甲腈、 2- 咪唑、 靛红、 异噁唑、 丙二腈、 4- 甲氧基苄腈、 1- 甲氧基 -2- 硝基苯、 α 溴代特窗 酸甲酯、 1- 甲基咪唑、 N- 甲基咪唑、 3- 甲基异噁唑、 N- 甲基吗啉 -N- 氧化物、 苯甲砜、 N- 甲基 吡咯烷酮、 甲基环丁砜、 4- 甲苯磺酸甲酯、 3- 硝基苯胺、 硝基苯并咪唑、 2- 硝基呋喃、 1- 亚硝 基 -2- 吡咯烷酮、 2- 硝基噻吩、 2- 噁唑烷酮、 9， 10- 菲醌、 N- 苯基悉尼酮、 邻苯二甲酸酐、 皮 考啉腈 (2- 氰基吡啶 )、 1， 3- 丙磺酸内酯、 β- 丙醇酸内酯、 碳酸异丙二醇酯、 4H- 吡喃 -4- 硫 酮、 4H- 吡喃 -4- 酮 (γ- 吡喃酮 )、 哒嗪、 2- 吡咯烷酮、 糖精、 琥珀腈、 对氨基苯磺酰胺、 环丁 砜、 2， 2， 6， 6- 四氯环己酮、 四氢噻喃氧化物、 四氢噻吩砜 ( 环丁砜 )、 噻唑、 2- 硫尿嘧啶、 3， 3， 3- 三氯丙烯、 1， 1， 2- 三氯丙烯、 1， 2， 3- 三氯丙烯、 硫杂环丁烷 - 二氧化物和硫杂环丁烷。
     实施方案 37. 实施方案 1-35 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂选 自：
     实施方案 38. 实施方案 1-35 中任一项的杂交组合物， 其中所述极性非质子溶剂是：
     实施方案 39. 实施方案 1-38 中任一项的杂交组合物， 所述组合物还包含至少一种 选自以下的额外组分 ： 缓冲剂、 盐、 促进剂、 螯合剂、 去垢剂和封闭剂。实施方案 40. 实施方案 39 的杂交组合物， 其中所述促进剂是硫酸葡聚糖， 所述盐 是氯化钠和 / 或磷酸钠。
     实施方案 41. 实施方案 40 的杂交组合物， 其中硫酸葡聚糖浓度是 5％至 40％， 氯 化钠浓度是 0mM 至 1200mM， 和 / 或磷酸钠浓度是 0mM 至 50mM。
     实施方案 42. 实施方案 41 的杂交组合物， 其中硫酸葡聚糖浓度是 10％至 30％， 氯 化钠浓度是 300mM 至 1200mM， 和 / 或磷酸钠浓度是 5mM 至 20mM。
     实施方案 43. 实施方案 39 的杂交组合物， 其中所述促进剂选自 ： 甲酰胺、 甘油、 丙 二醇、 1， 2- 丙二醇、 二甘醇、 乙二醇、 二醇和 1， 3- 丙二醇， 所述缓冲剂是柠檬酸缓冲剂。
     实施方案 44. 实施方案 43 的杂交组合物， 其中甲酰胺浓度为 0.1-5％， 甘油、 丙二醇、 1， 2- 丙二醇、 二甘醇、 乙二醇、 二醇和 1， 3- 丙二醇的浓度为 0.1％至 10％， 柠檬酸缓冲剂 浓度为 1mM 至 50mM。
     实施方案 45. 实施方案 39 的杂交组合物， 其中所述封闭剂选自 ： 人类总 DNA、 鲱鱼 精子 DNA、 鲑鱼精子 DNA 和小牛胸腺 DNA。
     实施方案 46. 实施方案 45 的杂交组合物， 其中所述人类总 DNA、 鲱鱼精子 DNA、 鲑 鱼精子 DNA 和小牛胸腺 DNA 的浓度是 0.01-10μg/μl。
     实施方案 47. 实施方案 1-46 中任一项的杂交组合物， 所述组合物包含 40％的至少 一种极性非质子溶剂、 10％硫酸葡聚糖、 300mM 氯化钠和 5mM 磷酸钠。
     实施方案 48. 实施方案 1-46 中任一项的杂交组合物， 所述组合物包含 15％的至 少一种极性非质子溶剂、 20％硫酸葡聚糖、 600mM 氯化钠、 10mM 磷酸钠和 0.1μg/μl 人类总 DNA。
     实施方案 49. 实施方案 1-46 中任一项的杂交组合物， 所述组合物包含 15 ％的 至少一种极性非质子溶剂、 20％硫酸葡聚糖、 600mM 氯化钠、 10mM 柠檬酸缓冲剂 pH 6.2 和 0.1μg/μl 鲱鱼精子 DNA、 或鲑鱼精子 DNA、 或小牛胸腺 DNA、 或 0.5 ％甲酰胺、 或 1 ％乙二 醇、 或 1％ 1， 3- 丙二醇、 或 1％甘油。
     实施方案 50. 实施方案 1-49 中任一项的杂交组合物， 其中所述含水组合物在室温 下包含不止一相。
     实施方案 51. 一种包含实施方案 1-41 中任一项的组合物的试剂盒。
     实施方案 52. 一种试剂盒， 所述试剂盒包含 ：
     (a) 检测染色体畸变相关核苷酸序列的第一分子探针， 和
     (b) 包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交组 合物，
     其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)。
     实施方案 53. 实施方案 51 和 52 的试剂盒， 所述试剂盒还包含显色剂。
     实施方案 54. 实施方案 51 和 52 的试剂盒， 其中所述试剂盒经设计用于细胞学。
     实施方案 55. 实施方案 51 和 52 的试剂盒， 其中所述试剂盒经设计用于组织学。
     实施方案 56. 实施方案 52 的试剂盒， 其中所述极性非质子溶剂按照实施方案 25-38 中任一项的定义。
     实施方案 57. 实施方案 51-56 中任一项的试剂盒， 其中所述试剂盒经设计用于 FISH 或 CISH 实验。
     实施方案 58. 一种检测染色体 DNA 中的靶标的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供与染色体 DNA 中的靶标杂交的至少一种分子探针，
     - 提供染色体 DNA，
     - 提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交 组合物， 其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)，
     - 将所述分子探针、 所述染色体 DNA 和所述杂交组合物混合在一起， 其时间至少足 以使所述分子探针与所述靶标杂交， 和
     - 检测所述靶标。
     实施方案 59. 确定核酸序列中染色体畸变存在的方法， 所述方法包括 ：- 提供至少一种分子探针，
     - 提供所述核酸序列，
     - 提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交 组合物， 其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)，
     - 将所述分子探针和所述核酸序列和所述杂交组合物混合在一起， 其时间至少足 以使所述分子探针与所述核酸序列杂交， 和
     - 检测所述至少一种分子探针，
     - 并确定染色体畸变的存在。
     实施方案 60. 确定核酸序列中染色体畸变存在的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供所述核酸序列，
     - 提供包含至少一种分子探针和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极 性非质子溶剂的杂交组合物，
     - 将所述杂交组合物用于所述核酸， 其时间至少足以使所述分子探针与核酸序列 杂交， 和
     - 检测所述至少一种分子探针，
     - 并确定染色体畸变的存在，
     其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜 (DMSO)。
     实施方案 61. 实施方案 58-60 中任一项的方法， 其中所述极性非质子溶剂按照实 施方案 25-38 中任一项的定义。
     实施方案 62. 确定核酸序列中染色体畸变存在的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供所述核酸序列，
     - 将实施方案 1-50 中任一项的组合物用于所述核酸序列， 其时间至少足以使所述 分子探针与核酸序列杂交， 和
     - 确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。
     实施方案 63. 实施方案 58-62 中任一项的方法， 其中提供足够量的能量使所述第 一和第二核酸杂交。
     实施方案 64. 实施方案 63 的方法， 其中通过加热所述杂交组合物和核酸序列而提 供能量。
     实施方案 65. 实施方案 64 的方法， 其中通过使用微波、 热浴、 加热板、 加热线、 珀耳 帖元件、 感应加热或加热灯来进行所述加热步骤。
     实施方案 66. 实施方案 58-65 中任一项的方法， 其中所述核酸序列是双链的并且 所述分子探针是单链的， 所述核酸序列是双链的并且所述分子探针是双链的， 所述核酸序 列是单链的并且所述分子探针是单链的， 或者所述核酸序列是单链的并且所述分子探针是 双链的。
     实施方案 67. 实施方案 58-66 中任一项的方法， 其中所述变性和杂交步骤单独发 生。
     实施方案 68. 实施方案 58-67 中任一项的方法， 其中所述杂交步骤包括所述杂交 组合物、 分子探针和核酸序列的加热和冷却步骤。
     实施方案 69. 实施方案 58-68 中任一项的方法， 其中所述杂交步骤需要不到 8 小时。
     实施方案 70. 实施方案 69 的方法， 其中所述杂交步骤需要不到 1 小时。 实施方案 71. 实施方案 58-70 中任一项的方法， 其中所述冷却步骤需要不到 1 小 实施方案 72. 实施方案 71 的方法， 其中所述冷却步骤需要不到 30 分钟。 实施方案 73. 实施方案 58-72 中任一项的方法， 其中所述核酸序列是在生物样品时。
     内。 实施方案 74. 实施方案 73 的方法， 其中所述生物样品是组织样品。
     实施方案 75. 实施方案 58-74 中任一项的方法， 其中所述含水组合物在室温下包 含一相。
     实施方案 76. 实施方案 58-74 中任一项的方法， 其中所述含水组合物在室温下包 含多相。
     实施方案 77. 实施方案 76 的方法， 其中所述含水组合物的各层混合在一起。
     实施方案 78. 实施方案 58-77 中任一项的方法， 所述方法还包括封闭步骤。
     实施方案 79. 一种诊断染色体畸变相关的先天性遗传疾病、 癌症或感染的方法， 所述方法包括 ：
     - 提供来自受试者的组织样品， 其中所述组织样品包含核酸序列，
     - 按照实施方案 58-78 中任一项的方法， 确定染色体畸变是否存在于所述核酸序 列中， 和
     - 如果染色体畸变存在于所述组织样品中， 则诊断所述先天性遗传疾病、 癌症或感 染。
     实施方案 80. 组合物在杂交测定中的用途， 所述杂交测定用于检测染色体畸变相 关的核苷酸序列， 所述组合物包含检测染色体畸变相关核苷酸序列的分子探针和杂交组合 物， 所述杂交组合物包含 1％ (v/v) 至 95％ (v/v) 的至少一种极性非质子溶剂。
     实施方案 81. 实施方案 1-50 中任一项的组合物在实施方案 80 中的用途。