一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用，以Laceyella sacchari 基因组为基础，克隆出其亮氨酸脱氢酶基因LeuDH，编码亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了编码该亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了与目前已知的亮氨酸脱氢酶来源不同的一种新型脱氢酶。该亮氨酸脱氢酶其耐热性质较好，pH适应范围较广，在工业生产中能够有效延长半衰期，降低生产成本。

1.  一种亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.  一种表达载体，它包含权利要求2所述的亮氨酸脱氢酶基因。

4.  一种重组菌，其是通过利用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞获得的。

5.  亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，在营养培养基中培养权利要求4所述的重组菌，收集具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽。

6.  根据权利要求5所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述的重组菌的构建方法为：将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET22b上，得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET22b-LeuDH，然后将重组质粒pET22b-LeuDH转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组菌E.coli BL21-pET22b-LeuDH。

7.  根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：将重组菌E.coli BL21-pET22b-LeuDH在含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养10小时；按1% (v/v)的接种量吸取培养液转接到含100μg/mL氨苄青霉素的自诱导液体培养基中30℃进行培养；待OD_600nm达到1.0后25℃低温培养6~12小时，离心收集菌液，弃上清培养基，用pH=8的PBS缓冲等体积洗涤三次，加入PBS缓冲使得重悬菌液OD_600nm达到20，混匀；用超声破碎仪破碎，10000rpm离心10min取上清粗酶液；粗酶液用0.22μm膜过滤除去杂质，再采用亲和的介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化，得到亮氨酸脱氢酶。

8.  根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：制备得到的亮氨酸脱氢酶，在25℃，pH10条件下比酶活为182.62U/mg；在60℃，pH10条件下比酶活为326.63U/mg。

9.  根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述自诱导培养基配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖2 g/L，乳糖3 g/L。

10.   权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶在制备L型氨基酸中的应用。

一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用
技术领域
  本发明涉及基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用。
背景技术
 亮氨酸脱氢酶（Leucine Dehydrogenase, LeuDH, EC1.4.1.9）是一种以NADH以及其氧化态为辅酶因子的氧化还原酶。该酶可催化L-亮氨酸及其他支链L型氨基酸的氧化，并有能力还原其对应酮酸成L型氨基酸。该酶最先由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中筛选而来，后来逐渐被发现存在于杆菌属、芽孢八叠球菌属、棒状杆菌属以及高温放线菌属等。目前的高活性亮氨酸脱氢酶菌株已被筛选出来，并被应用于工业生产，例如：球形赖安酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）以及西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）等。
由于嗜热酶在工业应用上具有较高的热稳定性，可为分离纯化和工业上的连续反应过程提供便利，大大降低由于酶用量过高而产生的成本，嗜热酶便成为研究的热点。高温放线糖莱斯菌（Laceyella sacchari）是兼性厌氧微生物，具有抗逆性強，易储存以及耐热性好等独特性质，是一种近年来受到广泛关注的潜在淀粉高效利用工业价值。该菌可催化断开淀粉中α-1,4糖苷键，并具有淀粉的液化和糖化能力。至此由该菌被广泛应用与纺织品的脱浆工艺和烘焙工业等，且发酵过程易于控制、最适发酵温度高（55~65℃）。到目前为止，还没有关于高温放线糖莱斯菌亮氨酸脱氢酶基因的报道，鉴于亮氨酸脱氢酶在催化制备L-亮氨酸、叔亮氨酸等方面的优势，选择高活性亮氨酸脱氢酶菌株对于工业化生产具有重要意义。
发明内容
   本发明的目的是提供一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用，首次以高温放线糖莱斯菌基因组为模板，扩增出亮氨酸脱氢酶基因，提供了一种与目前已知的亮氨酸脱氢酶来源不同的新型亮氨酸脱氢酶，该亮氨酸脱氢酶在60℃，pH10.0条件下，纯酶液的酶活为35.93IU，比酶活为326.63U/mg，在催化合成L-氨基酸中具备明显的优势。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种表达载体，它包含所述的亮氨酸脱氢酶基因SEQ ID NO.2。
 一种重组菌，其是通过利用所述的表达载体转化宿主细胞获得的。
亮氨酸脱氢酶的制备方法，在营养培养基中培养所述的重组菌，收集具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽。
所述的重组菌的构建方法为：将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET22b上，得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET22b-LeuDH，然后将重组质粒pET22b-LeuDH转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组菌E.coli BL21-pET22b-LeuDH。
将重组菌E.coli BL21-pET22b-LeuDH在含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养10小时；按1% (v/v)的接种量吸取培养液转接到含100μg/mL氨苄青霉素的自诱导液体培养基中30℃进行培养；待OD_600nm达到1.0后25℃低温培养6~12小时，离心收集菌液，弃上清培养基，用pH=8的PBS缓冲等体积洗涤三次，加入PBS缓冲使得重悬菌液OD_600nm达到20，混匀；用超声破碎仪破碎，10000rpm离心10min取上清粗酶液；粗酶液用0.22μm膜过滤除去杂质，再采用亲和的介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化，得到亮氨酸脱氢酶。
制备得到的亮氨酸脱氢酶，在25℃，pH10条件下比酶活为182.62U/mg；在60℃，pH10条件下比酶活为326.63U/mg。
所述自诱导培养基配方为：蛋白胨15g/L，酵母粉25 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖2 g/L，乳糖3 g/L。
所述的亮氨酸脱氢酶在制备L型氨基酸中的应用。
  本发明是以高温放线糖莱斯菌（Laceyella sacchari）基因组为模板，设计特异性引物，扩增出亮氨酸脱氢酶基因，其氨基酸序列加序列表SEQ ID NO.1所示。其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用DNA重组技术将本发明得到的亮氨酸脱氢酶基因在原核细胞中进行诱导表达，获得的重组亮氨酸脱氢酶共364个氨基酸，分子量为40～42kDa。
   通过Blast软件在线比较分析，发现来自于高温放线糖莱斯菌的亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列与其它微生物的己知亮氨酸脱氢酶基因的同源性差异较大，与Thermoactinomyces intermedius、Bacillus cereus strain、Bacillus sphaericus的一致性分别为81%、74%、71%。
   本发明中，术语“亮氨酸脱氢酶基因”还包括能编码具有与亮氨酸脱氢酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.2的突变形式，所述突变类型包括：确实、无义、插入、错义。本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。
本领域技术人员可以根据遗传密码表，基于SEQ ID NO ：1所示的氨基酸序列，设计多种多核苷酸，进而获得氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示、具有亮氨酸脱氢酶活性的蛋白质。
    本发明实例中，所述的基因全长1092bp。将该基因连接在表达载体pET22b上，构建重组质粒pET22b -LeuDH，随后将该重组质粒转化到感受态细胞E．coli BL21 (DE3)中，将含有重组质粒pET22b - LeuDH的大肠杆菌绌胞转接到含有氨苄青霉素的自诱导液体培养基上进行培养。待OD600nm为1.0时，进行低温诱导目的基因的表达，诱导结束后采用超声波破碎细胞，获得具有活性的亮氨酸脱氢酶。用紫外分光光度计分别测定了粗酶液和空白对照含有质粒pET22b大肠杆菌表达产物的酶活力。2mL反应体系下：pH10.0的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，含10mM L-亮氨酸，3.5mM NAD⁺加入50μL的酶液于25℃下检测到340nm处吸光值的降低，而空白对照检测不到酶活力。证明诱导表达出的亮氨酸脱氢酶具有活性。
   粗酶液经镍柱亲和层析时，加入酶液后在37℃摇床65rpm下15min充分结合，再用Wash Buffer洗去杂蛋白后，再用Elution Buffer将目的蛋白分批次洗脱下来，洗脱之前每批次在37℃摇床65rpm下15min充分后洗脱。用紫外分光光度计分别测定了己纯化的酶液，在60℃，pH10.0条件下，纯酶液的酶活为35.93IU，比酶活为326.63U/mg。
   有益效果：亮氨酸脱氢酶在催化制备氨基酸方面有非常大的优势。本发明提供一种来自于Laceyella sacchari的亮氨酸脱氢酶，运用基因工程实现其高效表达，提高了亮氨酸脱氢酶的生产效率，该亮氨酸脱氢酶在70℃水浴1.6小时后，该酶酶活降至原活性的50%；而在65℃水浴2.4小时后，该酶酶活降至原活性的50%；在60℃下，该酶半衰期达到8小时。该酶pH耐受范围较广，储存在pH 6至11的缓冲中，室温条件下，酶活几乎不发生衰减。由于其耐热性质较好，pH适应范围较广，在工业生产中能够有效延长半衰期，降低生产成本。
本发明实验实例中对该亮氨酸脱氢酶酶学性质的工作有利于进一步研究亮氨酸脱氢酶的结构和功能之间的联系。
附图说明
    图1是含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET22b- LeuDH结构图。
   图2是含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET22b- LeuDH的pcr验证电泳绪果。其中， marker：Marker DL2000；1，2:来自不同菌落的pET22b- LeuDH的pcr鉴定。
    图3是诱导表达后粗酶液和纯酶液的SDS-PAGE电泳结果图。其中M:Protein Marker；1:洗脱缓冲液洗脱得到的纯酶；2:重组菌的诱导表达的粗酶经过热处理后的样品；3: 重组菌诱导表达的粗酶。
图4 是纯酶的最适反应温度实验结果图；
图5是纯酶的最适反应pH实验结果图；
图6是纯酶的热稳定性实验结果图；
图7是纯酶的pH稳定性实验结果图。
具体实施方式
   本发明提供了编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是从Laceyella saccharis中分离得到的，具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列，它编码364个氨基酸的多肽，推测分子量为40～42kDa。
本发明还涉及一种重组载体，该载体包含本发明的核苷酸序列SEQ ID NO.2，以及包含重组质粒的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组质粒和宿主细胞的方法，以及用重组工程生产亮氨酸脱氢酶的方法。
   本发明进一步地提供了一种亮氨酸脱氢酶，具有SEQ ID NO.1氨基酸序列。
在本发明中，“亮氨酸脱氢酶”是指具有亮氨酸脱氢酶活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括SEQ ID NO.1序列的变异体，包括（但不限于）若干个氨基酸的缺失，插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一个或数个氨基酸，也可以使不影响序列的修饰形式上的差异。
    本发明的亮氨酸脱氢酶酶基因全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法，重组法，或人工合成法获得。
本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。
重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括：氯化钙热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。
本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆菌，乳酸乳球菌等。常用的真核细胞如酵母细胞，或各种动植物细胞。
本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
  下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如《分子克隆实验指南》，或者制造厂商所建议的条件。
   实施例l：含有亮氨酸脱氢酶基因序列的重组质粒pET22b-LeuDH的构建
    利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库，分析、筛选、发现Laceyella sacchari中有一段序列与亮氨酸脱氢酶基因序列相似度较高，很有可能是编码亮氨酸脱氢酶的基因序列，对此序列进行筛选、优化（优化包括部分位点的突变、插入等），得到具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
Ls-LeuDH基因由金斯瑞公司按照SEQ ID NO.2 核苷酸序列进行人工合成。在序列两端分别添加Nde I（CAT） 与 Xho I(CTCGAG)，连接至pET22b质粒载体上的Nde I 与 Xho I酶切位点之间。得到重组质粒pET22b-LeuDH，转入50微升大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），在冰中缓慢混匀，静置冰浴30分钟，迅速转入42摄氏度水浴热击60秒，再在冰上放置3分钟，加入1毫升LB培养基（1%氯化钠，1%蛋白胨，0.5%酵母粉），37摄氏度下摇床培养2小时，转速180转。之后在还有终浓度100mg/mL氨苄的LB固体平板上划线，37摄氏度静置过夜培养，20小时后对单菌落进行pcr鉴定，上游引物设计为： 5’ >CATATGAAAATCTTTGAATAC< 3’。下游引物设计为：5’ >CTCGAGGCGGTGGGA< 3’。
重组质粒pET22b- LeuDH的pcr鉴定电泳验证电泳结果（图2）表明，单克隆菌落含有目的基因片段，可用于后续的亮氨酸脱氢酶蛋白的诱导表达。
    实施例2：重组亮氨酸脱氢酶的表达和纯化
    挑取单菌落的工程菌E．coli BL21-pET22b- LeuDH，于10ml含100μg/mL氨苄亲霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养10小时；按1v/v%的接种量吸取培养液转接到含100μg/mL氨苄青霉素的自诱导液体培养基中30℃进行培养（自诱导培养基配方为（每100毫升）：蛋白胨1.5克，酵母粉2.5克，氯化钠1克，葡萄糖0.2克，乳糖0.3克。），待OD_600nm达到1.0后25℃低温培养20小时，离心收集菌液，弃上清培养基，用pH=8的PBS缓冲等体积洗涤三次，加入PBS缓冲使得重悬菌液OD_600nm达到20，混匀；用超声破碎仪破碎，超声工作条件：工作时间设为15min，每次工作3s，休息3s，功率设定220w，破碎后10000rpm离心10min取上清粗酶液；粗酶液用0.22μm膜过滤除去杂质。将收集到的蛋白(50μL)与l×SDS-PAGE样品缓冲液，按1:1体积比于沸水中煮沸5min失活，12000rpm离心1min，上清加入12%SDS-PAGE胶中进行电泳验证。用含有质粒pET22b的E．coli BL21 (DE3)诱导表达出的蛋白作为空白对照，验证结果如图3所示。对获得的含有亮氨酸脱氢酶的粗酶液用0. 22 μm膜过滤除去杂质，采用亲和介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化，粗酶液经镍柱亲和层析时，加入酶液后在37℃摇床65rpm下15min充分结合，再用Wash Buffer洗去杂蛋白后，再用Elution Buffer将目的蛋白分批次洗脱下来，洗脱之前每批次在37℃摇床65rpm下15min充分后洗脱。以8mL为单位分管收集合并。目的蛋白保存于4℃，并进行SDS-PAGE电泳检测纯化效果。在40～42kDa处的蛋白质条带即为亮氨酸脱氢酶，如图3所示。
   实施例3：亮氨酸脱氢酶酶活测定。
按照表l中所示的反应体系加入各组分，对照采用含有质粒pET22b大肠杆菌表达产物。基本原理是鉴于NADH在340nm处有最大吸收峰，通过光吸收峰值的改变定量测定酶的含量。比色皿中依次加入
反应液1.95ml：pH10.0的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，含10mM L-亮氨酸，3.5mM NAD⁺。置于分光光度计样品槽中，检测原始NADH吸光值，待读数稳定后马上加入50μL的稀释适当倍数酶液，开始光度计读数，每1s测定一次吸光值，共30s，反应结束后得到△A_340nm/min值。酶的活力单位采用国际单位IU，即每分钟氧化1μmol的NADH所用的酶量为1个酶活力单位。
   表1亮氨酸脱氢酶活性检测