技术领域
本发明涉及一种细胞检测领域，特别涉及一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒及方法。
背景技术
肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞被称之为肿瘤干细胞，其被认为是造成恶性肿瘤复发的主要原因，因此肿瘤干细胞的研究是当今肿瘤领域的热点。现有的肿瘤干细胞检测手段复杂、效率低，有的甚至对细胞有毒性。如：传统的细胞表面标志分子如CD133,CD44，CD24等可用来分离鉴定某些肿瘤的肿瘤干细胞，但是这类标志分子常常需要将几种标志分子组合在一起使用，并且这类标志分子不是肿瘤干细胞通用的标志分子。Hoechst 33342也可以用来分离疑似肿瘤干细胞的侧群细胞，但Hoechst 33342染色对细胞具有毒性，且某些肿瘤中的侧群细胞并不能代表肿瘤干细胞本身。
干细胞、祖细胞和肿瘤干细胞均表达较高的乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，缩写ALDH)活性，高ALDH活性被认为几乎是所有肿瘤干细胞的通用标志。因此找到一种细胞内ALDH活性的检测方法，对肿瘤干细胞检测领域的研究有推动作用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒和方法，使用该试剂盒和方法进行检测对细胞无伤害，且使得检测中流式细胞仪的背景荧光强度更低、便于使用者辨认且灵敏度更高，能够用于干细胞、祖细胞和肿瘤干细胞的研究中。
在本发明提供的技术方案中BAAA-DA是BODIPY-aminoacetaldehyde diethyl acetal(即：BODIPY-氨基乙醛缩二乙醇)的缩写；BAAA是BODIPY-aminoacetaldehyde(即：BODIPY-氨基乙醛)的缩写；BAA是BODIPY-aminoacate；DEAB是Diethylaminobenzaldehyde(即：二乙氨基苯甲醛)的缩写；其中BODIPY是氟硼二吡咯类荧光染料。
本发明提供了一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒，包括以下组分：BAAA-DA溶液，DEAB溶液和试验缓冲液；所述BAAA-DA溶液中BAAA-DA的浓度为0.6-1.2g/L；所述DEAB溶液中DEAB的浓度为1.2-1.8mM；所述试验缓冲液是含有ABC transportor抑制剂和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中ABC transportor抑制剂的浓度为45-55μM，牛血清白蛋白的浓度为0.8-1.2％。
上述试剂盒在另一种可能的实现方式中，还包含HCl。
本发明还提供了一种检测细胞内ALDH活性的方法，包括以下步骤：
1)用试验缓冲液将样品细胞稀释成细胞浓度为(0.8-2)×106个/ml的单细胞悬液，优选为1×106个/ml的单细胞悬液；
2)为每个待检测的样品细胞取出两个流式检测管，其中一个流式检测管作为检测管，另一个流式检测管作为对照管，试剂的加入方式为：
A、在检测管中加入1ml步骤1)所得单细胞悬液；之后向检测管中加入5μL活化稀释好的BAAA-DA溶液，混匀；
向对照管中加入5μL DEAB溶液；
B、将0.5ml步骤A所得混合液立即转移至已加入DEAB的对照管中混匀；
3)将检测管和对照管在37℃孵育30-60分钟；
4)将检测管和对照管离心，除去上清，将细胞沉淀重悬于0.5ml试验缓冲液中，冰上或者4℃存放；
5)对经过上述处理的样品细胞进行流式细胞仪检测；
其中：所述BAAA-DA溶液中BAAA-DA的浓度为0.6-1.2g/L；所述DEAB溶液中DEAB的浓度为1.2-1.8mM；所述试验缓冲液是含有ABC transportor抑制剂和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中ABC transportor抑制剂的浓度为45-55μM，牛血清白蛋白的浓度为0.8-1.2％；所述活化稀释好的BAAA-DA溶液是指在浓度为0.6-1.2g/L的BAAA-DA溶液中加等体积的盐酸混匀并室温静置12-18分钟进行活化，优选15分钟，再加入6-6.5倍体积的试验缓冲液进行稀释并混匀所得，优选6.2倍体积。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述BAAA-DA溶液中BAAA-DA的浓度为1g/L，BAAA-DA溶液所用溶剂为醋酸甲酯。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述DEAB溶液中DEAB的浓度为1.5mM，DEAB溶液所用溶剂为95％乙醇。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述磷酸盐缓冲液中ABC transportor抑制剂的浓度为50μM；可选的，牛血清白蛋白的浓度为1％。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述ABC transportor抑制剂为Verapamil盐酸盐。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0-7.5，优选为pH7.4；所述盐酸为浓度2mol/L的盐酸水溶液。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述BAAA-DA溶液的包装体积为50μL；所述DEAB溶液的包装体积为1mL；所述试验缓冲液为4瓶，每瓶的包装体积为25mL；所述HCl的包装体积为1.5mL。
上述试剂盒或上述方法在另外一种可能的实现方式中，所述细胞来源于人脐带间充质干细胞、人外周血单个核细胞、人肺癌细胞A549细胞系、人卵巢癌细胞SKOV3细胞系、人乳腺癌细胞SKBR-3或人卵巢癌细胞OVCAR-3。
本申请中牛血清白蛋白(即：BSA)的浓度是质量体积百分数，即100ml试验缓冲液中溶有1g BSA；Verapamil盐酸盐即盐酸维拉帕米。
检测细胞内ALDH活性试剂盒的工作原理如图1所示，具体为：活化的BAAA-DA(即BAAA)是一个无毒性的ALDH底物，它可以自由扩散至完整的活细胞内；在细胞内存在ALDH的情况下，BAAA被转化成荧光产物BAA，在底物BAAA足量的情况下，荧光产物BAA的量与ALDH活性呈正相关，细胞内的荧光产物BAA可以通过流式细胞仪绿色荧光通道(520-540nm)被检出。虽然BAA能通过ATP-binding cassette(ABC)转运系统主动外泄出细胞外，但优化过的试验缓冲液具有抑制该外泄的功能。Diethylaminobenzaldehyde(DEAB)是ALDH的特异性抑制剂，将DEAB加入对照管抑制ALDH作用于BAAA，用来控制背景荧光。细胞内ALDH活性检测试剂盒结合流式细胞仪可以用于正常干祖细胞、正常祖细胞或者肿瘤干细胞的研究中。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明检测试剂盒的各种组分的浓度和配比经过精心的优化，实验操作步骤简单易行，利用流式细胞仪可简单、快速的检测细胞内ALDH活性，检测时对照管细胞的荧光显示区域更集中，使得样品管细胞的荧光显示不容易被对照管细胞的荧光显示所覆盖，试验操作者更容易观察到样品管细胞的荧光显示，使该检测更为灵敏；同时使用该检测试剂盒对细胞无毒、无伤害，将检测过的细胞从试验缓冲液中分离后，BAAA和ALDH产生的荧光物质BAA可以通过ABC转运系统排出细胞外，因此经过分离的细胞可直接用于体内外实验；并且试验缓冲液中1％BSA还具有保护细胞的功能。
附图说明
图1是本发明试剂盒的工作原理示意图；
图2是本发明试剂盒使用时的实验流程图；
图3是本发明试剂盒进行检测时对照管R1门创建的参考图，该样品细胞为人脐带间充质干细胞；
图4是本发明试剂盒进行检测时检测管R2门创建的参考图，该样品细胞为人脐带间充质干细胞；
图5是本发明中人肺癌细胞A549细胞系进行ALDH活性检测时R2门创建的参考图；
图6是采用本发明试剂盒与对照试剂盒分别对人脐带间充质干细胞进行检测所得对比图；
图7是采用本发明试剂盒与对照试剂盒分别对人肺癌细胞A549进行检测所得对比图；
图8是采用本发明试剂盒与对照试剂盒分别对人卵巢肿瘤细胞SKOV3进行检测所得对比图；
图9是采用本发明试剂盒与对照试剂盒分别对人乳腺肿瘤细胞SKBR-3进行检测所得对比图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
一、实施例主要试验材料
1、主要细胞
人卵巢癌细胞SKOV3购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞SKBR-3购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；人脐带间充质干细胞由本公司提供。
2、主要试剂
人卵巢癌细胞SKOV3和人肺癌细胞A549的培养基由McCoy’s 5A培养基和10％胎牛血清组成；人乳腺癌细胞SKBR-3的培养基由RPMI 1640培养基和10％胎牛血清组成；人脐带间充质干细胞的培养基由DMEM培养基和10％胎牛血清组成。
DMEM培养基，McCoy’s 5A培养基，RPMI 1640培养基，PBS以及胎牛血清均购自美国Gibco公司。
对照试剂盒为市售ALDEFLUORTM Kit；4-Diethylaminobenzaldehyde(DEAB)和DMSO购自Sigma公司；BODIPY-aminoacetaldehyde-diethyl acetal(BAAA-DA)购自Cayman Chemical公司,Item Number 9002056)；Verapamil盐酸盐购自Shanghai Sphchem Co.Ltd(CAS:52-53-9)；BSA购自MP Biomedicals；浓盐酸由北京北化精细化学品有限责任公司生产。
3、主要仪器
BDS200倒置相差显微镜购自中国重庆奥特光学仪器有限责任公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。
二、试剂的准备
1、用MiliQ水配制2mol/L盐酸，混匀，室温保存；
2、用MiliQ水配制95％乙醇，混匀，室温保存；
3、1.5mM DEAB乙醇溶液的配制：称量4-Diethylaminobenzaldehyde(Sigma，cat#D86256-100G)，溶于95％乙醇中，避光，4℃保存；
活化BODIPY-aminoacetaldehyde-diethyl acetal(BAAA-DA,Cayman Chemical公司)的准备：取出50μL的BAAA-DA(浓度为1g/L，共相当于50μg)，直接加50μL 2mol/L盐酸混匀并室温静置15分钟进行活化，再加310μL试验缓冲液进行稀释，混匀，分装，-20℃避光保存，使用过程中将BAAA-DA保持在2-8℃，避免反复冻融；
4、100mM Verapamil盐酸盐的配制：称量Verapamil盐酸盐,溶于MiliQ水，混匀，过滤，避光，-20℃保存。
5、含50μM Verapamil盐酸盐以及1％BSA磷酸盐缓冲液的配制：将100mM Verapamil盐酸盐用PBS稀释2000倍，并添加BSA使BSA在磷酸缓冲液中的浓度为1％，用0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。
实施例1检测细胞内ALDH活性的方法
1、用试验缓冲液将样品细胞稀释成细胞浓度为1×106个/ml的单细胞悬液；但要注意：当样品细胞的来源为血液样本时，若红细胞和白细胞的细胞数量比例大于2：1，要在样品细胞中加入不含表面活性剂和固定剂的红细胞裂解液裂解红细胞至红细胞和白细胞的细胞数量比例不大于2：1，然后250g离心5分钟，去除上清，再用试验缓冲液稀释沉淀物，使细胞浓度为1×106个/ml；
2、为每个待检测的样品细胞取出两个流式检测管，其中一个流式检测管作为检测管，另一个流式检测管作为对照管，试剂的加入方式可以参考图2进行，具体为：
A、在检测管中加入1ml步骤1所得细胞悬液；之后向检测管中加入5μL活化稀释好的BAAA-DA溶液(参见“试剂的准备”部分步骤3)，混匀；
B、向对照管中加入5μL 1.5mM DEAB乙醇溶液，立即盖上对照管的盖子和盛放DEAB乙醇溶液的容器盖子，防止DEAB随着乙醇挥发；
C、将0.5ml步骤A所得混合液立即转移至已加入DEAB的对照管中混匀；由于步骤A中底物BAAA-DA一旦加入到细胞悬液，ALDH酶反应便立即开始，所以0.5ml步骤A所得混合液要迅速的加入到含有DEAB的对照管中；
在对照体系和反应体系的构建中，还可以是先添加其他组分，最后再向检测管和对照管中加入底物BAAA-DA，但要保证对照体系和反应体系各组分的添加量与步骤A-C中描述的相同；
3、将检测管和对照管在37℃孵育30-60分钟；
4、将检测管和对照管在250g的条件下离心5分钟，取出上清，将细胞沉淀重悬于0.5ml试验缓冲液中，冰上或者4℃存放；
额外的，如果要检测细胞的免疫表型，则需要在步骤4后孵育抗体，为了防止反应底物BAAA-DA的流出，抗体的孵育要在分析缓冲液中进行。
额外的，步骤4后可以选择性的进行细胞活力的检测，如果活细胞少于90％，建议使用DNA染料，如propidium或者7-actinoaminomycin-D进行细胞染色；
5、对经过上述处理的样品细胞进行流式细胞仪检测，具体步骤如下：
1)创建一个横坐标为前向角散射(FSC)、纵坐标为侧向角散射(SSC)的点图，称之为FSC vs SSC点图；
2)在设定模式，先检测对照管：调整FSC及SSC的电压使有核细胞聚集到FSC vs SSC点图中央，并在FSC vs SSC点图创建一个R1门使有核细胞落入其中并将细胞碎片划到区域外，R1门的创建可参考图3中封闭区域；
3)在R1区域的设门基础上，创建一个横坐标为荧光通道1信号(FL1)、纵坐标为侧向角散射(SSC)的点图，称之为FL1vs SSC点图；
4)在FL1vs SSC点图上，调整FL1光电倍增管电压使得对照管的点群右边界位于FL1荧光强度的横坐标中间位置附近，该调整可以参见图4A；
5)之后换上与对照管对应的检测管，创建一个R2门，使R2门包含所有的ALDH阳性(ALDHbr)细胞群，如图4B所示，换对照管；
6)进行数据收集：在设置中移除自动分析，在对照管和检测管的R1门中均收集100000个细胞。
不同种类的样品细胞有不同的SSC，因此划门也要依照上述原则进行调整，如图4和图5所示，R2门划分所得区域不同。ALDH阳性细胞的比例以及背景荧光强度都取决于样品细胞的类型，为每一个样本添加独立的对照来确保分析的准确性。
实施例2细胞内ALDH活性检测试剂盒
本发明细胞内ALDH活性的检测试剂盒，包括以下组分：
1.BAAA-DA溶液50μL；BAAA-DA溶液中BAAA-DA的浓度为1g/L，BAAA-DA溶液所用溶剂为醋酸甲酯；
2.DEAB溶液1mL；DEAB溶液中DEAB的浓度为1.5mM，DEAB溶液所用溶剂为95％乙醇；
3.试验缓冲液，4瓶×25mL，所述试验缓冲液是含有Verapamil盐酸盐和BSA的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中Verapamil盐酸盐的浓度为50μM，BSA的浓度为1％，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
4.浓度为2mol/L的HCl，1.5mL。
上述检测试剂盒的保存条件：
试验缓冲液应保持无菌状态；
BAAA-DA应存于-20℃，可保存至少二年；
用2mol/L HCl活化的BAAA-DA(即BAAA)应该分装保存于-20℃，可保存一年，避免反复冻融；
试剂盒的其余组分应存放于4-8℃。
实施例3细胞内ALDH活性检测试剂盒的使用
采用本申请实施例1中的检测方法和实施例2中的检测试剂盒对多种类型的样品细胞进行检测，并针对完全相同的检测样品与用对照试剂盒的检测结果进行对比。
人脐带间充质干细胞的检测结果对比如图6所示；
人肺癌细胞A549的检测结果对比如图7所示；
人卵巢癌细胞SKOV3的检测结果对比如图8所示；
人乳腺癌细胞SKBR-3的检测结果对比如图9所示。
从图6-9可以看出，本发明试剂盒的各种组分的浓度和配比经过精心的优化后，在使用时针对多种样品，都能使对照管中的对照荧光范围分布更集中，即背景荧光强度干扰小，便于试验操作者观察。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。