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本申请要求在2012年11月9日提交的第61/724,458号美国临时 申请的权益，其通过引用的方式全文并入本申请中。
背景技术
本发明公开了一种从玉米(maize)中获得油的方法，包括将玉米 颗粒粉碎形成粉，向粉中加水形成浆体，以及在温度为约75℃至约120℃和 pH为约3至约7条件下，用α-淀粉酶培育该浆体约10分钟至约180分钟形 成糊状物(mash)，将糊状物冷却至约15℃至约40℃，并加入氮源、葡糖淀 粉酶、酵母、酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶(cell-wall polysaccharide-degrading enzymes)形成含有乙醇和油的啤酒，其中，啤酒 的pH为约3至约7，并从啤酒中回收油。
目前进行的玉米(corn)处理方法主要有两种：干磨处理和湿磨 处理。湿磨处理用于玉米是有效的，因为其可产生许多高价值的玉米产品， 例如玉米油、淀粉、玉米面筋粉、玉米蛋白饲料和玉米浆。然而，湿磨处理 需要在机械装置上高资本投资。使用干磨乙醇处理生产乙醇和动物饲料。动 物饲料的价值远远低于玉米油和玉米蛋白，它们被留在由干磨处理生产的动 物饲料中。
过去几年中，通过离心分离浓缩的酒精废液流(thin stillage stream)(浆)来回收后发酵玉米油(经常被称作后期油回收)已经有显著 增加。美国环境保护局(EPA)预测，至2013年将会有60％以上的干磨乙醇 生产者采用该技术(环境保护局，2011，燃料和燃料添加剂的管理：2012可 再生燃料标准，联邦公报76:38844-38890)(EPA,2011,Regulation of fuels and fuel additives:2012renewable fuel standards,Federal Register 76:38844-38890)。这种工业上的快速实施是由于良好的经济回报，以及对 现有乙醇处理的最小影响。采用该技术回收的油品质相对较低，由于高游离 脂肪酸水平，这使得回收的油不适合精制成食品级油(Winkler-Moser,J.K. 和L.Breyer，工业原料作物与制品，33:572-578(2011)；Moreau,R.A.等， 美国石油化学家协会杂志，87:895-902(2010))(Winkler-Moser,J.K.,and L. Breyer,Industrial Crops and Products,33:572-578(2011)；Moreau,R.A.,et al.,Journal of the American Oil Chemists′Society,87:895-902(2010))。目前 它被用作生物柴油产品的原料和作为动物饲料成分。
当该技术在工业中达到快速成功时，其也存在着许多重大的技术 问题。主要问题是回收率低。虽然一些设施报道达到了较好的产率，但大多 数也只是每蒲式耳玉米(25.4kg)回收约0.25kg。这表明约25％的油存在于 原料玉米(incoming corn)中，通常是干基重约4％的油(Johnston,D.B.等， 美国石油化学家协会杂志，82:603-608(2005)；Moreau,R.A.等，美国石油 化学家协会杂志，86:469-474(2009))(Johnston,D.B.,et al.,Journal of the American Oil Chemists′Society,82:603-608(2005)；Moreau,R.A.,et al., Journal of the American Oil Chemists′Society,86:469-474(2009))。已经发 现，使用破乳剂以及机械和热处理对提高一些设施的产率方面是有益的，然 而，回收仍然通常低于30％，而且这些添加剂增加了操作成本。
我们发现，在发酵期间加入酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶(例 如纤维素酶和半纤维素酶)，可增加后发酵油回收，其它加工因素(例如玉 米粉粒径)影响干磨玉米乙醇工艺的油回收率。
发明概述
本发明公开了一种从玉米中获得油的方法，包括将玉米颗粒研磨 形成粉，向粉中加水形成浆液，以及在温度为约75℃至约120℃和pH为约 3至约7条件下，用α-淀粉酶培育该浆体约10分钟至180分钟形成糊状物， 将糊状物冷却至约15℃至约40℃，并加入氮源、葡糖淀粉酶、酵母、酸性 蛋白酶和细胞壁多糖降解酶形成含有乙醇和油的啤酒，其中，啤酒的pH为 约3至约7，并从啤酒中回收油。
本发明提供了一个概述以引出简化形式中概念的选择，并在下面 的详细说明书进一步描述。该概述不是为了确定所要求保护的主题的主要特 征或基本特征，也不是为了作为辅助以确定所要求保护的主题的范围。
附图说明
本专利或申请文件包括至少一个彩色附图。本专利或申请具有彩 色附图的公开副本，在请求和支付必要的费用时由专利局(Office)提供。
如下所述，图1显示酶筛选研究结果，其显示五种酶制剂和对照 (没有添加酶)的游离油回收率。酶的加入量为10kg酶/MT干玉米。
如下所述，图2显示使用CP的游离油回收率。误 差线代表重复平均值±一个标准差。插入的样品代表使用所示剂量的 CP从每400g糊状物中回收游离油的实际量。
图3显示使用GC 220(方形)和FERMGENTM(圆形)的游离油 回收率。如下所述，误差线代表重复平均值±一个标准差。
如下所述，图4显示用于研究对油回收率影响的玉米粉的粒径分 布。显示的结果是重复测量的平均值。
如下所述，图5显示玉米粉中游离油的回收率，制备玉米粉以研 究粒径对游离油回收率的影响。脱胚机研磨(D)、粗研磨(C)、中研磨(M)、 细研磨(F)、宝创研磨(Polytron Ground)(P)以及添加(+)10kg酶/MT 干玉米的GC 220。
如下所述，图6显示固定总酶量为7kg酶/MT干玉米中，不同 比例的GC 220和FERMGENTM的游离油的回收率。误差线代表重复平均值 ±一个标准差。
如下所述，图7显示1.0kg酶/MT干玉米的FERMGENTM和2.5kg 酶/MT干玉米的GC 220的游离油的回收率，和相同水平的FERMGENTM和 GC 220混合物的游离油的回收率。
如下所述，图8显示单独使用GC 220和FERMGENTM的游离油 的回收率，以及使用相对于酶的量为2.5:1的GC 220和FERMGENTM混合 物的游离油的回收率。
如下所述，图9显示平均酶量为2kg/MT时，使用不同比例的GC 220和FERMGENTM的游离油回收率。
如下所述，图10显示玉米干磨乙醇工艺的一般处理模式。
如下所述，图11显示发酵后油回收的一般流程图。虚线框代表完 成油回收的工艺中两个不同的位置。
发明详述
本发明公开了一种从玉米中获得油的方法，包括将玉米颗粒研磨 形成粉，向粉中加水形成浆体，以及在温度为约75℃至约120℃和pH为约3 至约7条件下，用α-淀粉酶培育该浆体约10分钟至180分钟形成糊状物，将 糊状物冷却至约15℃至约40℃，并加入氮源、葡糖淀粉酶、酵母、酸性蛋白 酶和细胞壁多糖降解酶形成含有乙醇和油的啤酒，其中，啤酒的pH为约3 至约7，并从啤酒中回收油。
玉米可以是，例如整个颗粒或压片玉米。进料的含水量可以是约 0至约14％重量(例如0-14％重量)。虽然事实上任何种类和品质的谷物均 可用于生成乙醇，但这些工艺的进料通常是“2号普通黄玉米”。“2号”是 指如国家粮食检验协会(National Grain Inspection Association)和美国农业 部粮食检验，包装和牲畜饲养场管理局(USDA Grain Inspection,Packers and Stockyards Administration)所定义的，具有本领域已知的某些特征的高质量 玉米。“普通黄玉米”是指本领域已知的一种特定种类的玉米。
干磨条件一般与玉米干磨乙醇工业使用的条件一样。将干燥后的 整个玉米颗粒输入干磨处理步骤，以将颗粒研磨成粉(玉米粉(meal))。 通常用于商业玉米中乙醇设施的玉米粒径数据如Rausch,K.D.等，粉碎玉米 的粒径分布和干磨工艺得到的玉米酒糟及可溶物，ASAE会刊，2005,48(1): 273-277(Rausch,K.D.,et al.,Particle Size Distributions of Ground Corn and DDGS from Dry Grind Processing,Transactions of the ASAE,48(1):273-277 (2005))给出的。玉米被研磨以使85％以上可通过2.0mm筛(Rausch等) (Rausch et al.)。但是，我们发现，玉米研磨得越细(特别是胚芽)，从玉 米中回收的油越多；优选地，粉包含约2至约0.25mm的粒径(例如2-0.25mm)， 优选地约1.5至0.25mm(例如1.5-0.25mm)，更优选地约0.6至约0.25mm (例如0.6-0.25mm)。研磨后的玉米粉或粉与水混合得到浆体，加入被称为 α-淀粉酶的商品酶。然后将浆体加热至约75℃至约120℃(例如，75℃至约 120℃)，优选地约85℃至约115℃(例如85℃至约110℃)，更优选地约 90℃至110℃(例如，90℃至约110℃)，进行或不进行喷射蒸煮(jet cooking)， 在pH为约3至约7(例如，3-7)，优选地约4至约7(例如，4-7)，更优 选地约5至约6.5(例如，5-6.5)下进行约10至约180分钟(例如，10-180 分钟)，优选地约20至约100分钟(例如，20-100分钟)，更优选地约30 至约90分钟(例如，30-90分钟)，以使α-淀粉酶水解胶状淀粉为麦芽糊精 和寡糖(葡萄糖分子链)，得到液化糊状物或浆体，其含有约15％至约50％ 重量(例如，15％至50％重量)的总固形物含量，优选地约20％至约40％重 量(20％-40％重量)的总固形物含量，更优选地约25％至约35％重量(例如， 25％-35％重量)的总固形物含量，最优选地约32％至约33％重量(例如， 32％-33％重量)的总固形物含量。随后进行单独的糖化步骤和发酵步骤，尽 管在大多数商业干磨乙醇工艺中，糖化和发酵同时进行(该步骤在工业中被 称为“同步糖化和发酵”(SSF))。在糖化过程中，液化糊状物冷却至约 15℃至约45℃(例如，15℃-45℃)，优选地约25℃至约40℃(例如，25℃ -40℃)，更优选地约30℃至约35℃(例如，30℃-45℃)，并且，将pH降 至约3至约7(例如，3-7)，优选地约3至约5(例如，约3-5)，更优选地 约3.5至约4.5，之后，加入被称作葡糖淀粉酶的商品酶(例如，杜邦生物科 技公司的SSF)。在我们的工艺中，我们也加入了至少一种 酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶(例如，纤维素酶和半纤维素酶，因为纤维 素酶实际上不纯，含有一些半纤维素酶)以提高油回收率；理想地，当发酵 罐被填满时加入酶。通常在发酵过程中也加入例如尿素的氮源，以提供给酵 母补充原料。氮源通常在液化前加入，但可在过程中随后补充。葡糖淀粉酶 将麦芽糊精和短链寡糖水解为单一葡萄糖分子，得到液化的糊状物，当进行 SSF时其也是一种“发酵原料”。在发酵过程中，加入普通的酵母菌株(酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))使葡萄糖代谢为乙醇和CO2。糖化过 程和SSF可进行长达约30至约90小时(例如，30-90小时)，优选地约40 至约80小时(例如，40-80小时)，更优选地约50至约75小时(例如，50-75 小时)，但可进行更长或更短的时间。一旦完成，发酵液(“啤酒”)将含 有约17％至约18％的乙醇(体积/体积基准)(例如，17-18％)，以及所有剩 余的谷物成分产生的可溶或不溶的固体。最终的乙醇含量是基于淀粉的起始 浓度和酶的转化效率，以及酵母，并可能会较高或较低。
然后处理啤酒以除去啤酒中的乙醇，该乙醇在一系列蒸馏塔中被 进一步纯化。整个釜馏物(stillage)是从啤酒中去除乙醇后产生的流。将整 个釜馏物流用卧螺离心机分离以分离固体(湿颗粒)部分和液体(酒精废液) 部分。通过蒸发收集酒精废液流得到浆液(浓缩的酒糟可溶物(condensed distillers soluble(CDS))。目前油的回收方法通常是在将酒精废液流浓缩 得到浆液或浓缩的酒糟可溶物之后开始的。然后将浆液用热处理法和/或化学 处理法进行处理，以促进释放流中的乳化油。这些额外的处理后，浆液被再 次离心以回收游离油。化学处理通常是针对被设计以释放乳化油的专有的化 合物，并且可以从几个不同的供应商获得。通过离心分离从浆液中去除油后， 浆液可以与湿颗粒混合，干燥为低脂肪的干酒糟及其可溶物(distiller’s dried grains with solubles，DDGS)。
另一种从酒精废液流中回收油的替代方法，是在滗析器 (decanter)之前使用附加的离心机，以有效地冲洗整个釜馏物流，有助于回 收被截留于整个釜馏物固体部分中的油。然后将该酒精废液蒸发至浆液，并 进行如上所述的处理，以去除油。
油的回收在本领域是公知的，参见，例如，Moreau,R.A.等，干磨 乙醇工艺中发酵后玉米油的水提取，绿色油处理，Farr,W.和A.Proctor主编， AOCS出版，乌尔班纳，伊利诺伊，2012：53-70(Moreau,R.A.,et al.,Aqueous extraction of corn oil after fermentation in the dry grind ethanol process,In:Green Oil Processing,Farr,W.,and A.Proctor,editors,AOCS Press,Urbana,IL,pages 53-70(2012))。
当前技术工艺中，油的回收率通常只有原料玉米中油含量的25％。 酒精废液流不进行热和机械处理时，将很少或没有可回收的游离油。
我们研发的方法利用附加酶(例如，酸性蛋白酶和诸如纤维素酶 和半纤维素酶的细胞壁多糖降解酶)，其只在发酵前或发酵期间加入。发酵 过程后，从啤酒中去除乙醇得到改良的整个釜馏物流。该流的性质随发酵过 程中酶处理而改变。然后将整个釜馏物流进行如上所述的处理：首先使用滗 析器分离湿颗粒和酒精废液，接着将酒精废液浓缩为浆液，然后用化学处理 法和/或热处理法进行处理，然后通过离心回收玉米油。该新方法使得通过离 心分离的油的回收率增加。酶处理的回收率显著大于常规方法报道的25％， 为约40％或更高(例如，40％或更高)，优选地约40％至约55％(例如， 40％-55％)。
如上面提到的，我们的方法中也加入了酸性蛋白酶和细胞壁多糖 降解酶(例如，纤维素酶和半纤维素酶)以提高油的回收。所述酸性蛋白酶 可为本领域已知的任何酸性蛋白酶，例如杜邦生物科技公司(DuPont Industrial Biosciences)的FERMGENTM。所述纤维素酶可为本领域已知的 任何纤维素酶，例如杜邦生物科技公司的GC 220。酸性蛋白酶和纤维素酶 混合物(例如GC 220和FERMGENTM)中的至少一个组分可占组合物的约 80％重量(例如80％)，优选地约60％重量(例如60％)，更优选地按重量 计约等份。酶的浓度(酸性蛋白酶和/或纤维素酶)将是从少至约0.25kg至约 15kg/公吨玉米(基于干重)(例如，0.25至约15kg/公吨)，优选地约0.5至 约10kg/公吨(例如，0.5至约10kg/公吨)，更优选地约0.5至约5kg/公吨(例 如，0.5至约5kg/公吨)。
具体添加量是基于所需的油回收率增加的量。使用增加量的酶可 以潜在地减少反应时间。目前，α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的使用量是约1kg/MT， 以使玉米颗粒中的淀粉转换为葡萄糖，从而酵母将其转换为乙醇。
优化酶的量在本领域技术人员的技术范围内。可以增加培育时间 从而使用更少的酶。
确定哪些酶可以被成功地使用也在本领域技术人员的技术范围 内。可用于本方法的其它酶的选择将需要考虑在具体使用条件下的活性和稳 定性。这类酶需要具有破坏油体的能力，以使油从油体中释放以及从与油体 膜可能的关联中释放。破坏油体膜的酶可以是其它的蛋白酶，所述蛋白酶可 降解能够稳定油体膜的油体蛋白(结构蛋白)，破坏油体膜的酶也可以是磷 脂酶，所述磷脂酶可破坏包围油的油体膜中磷脂单层膜。这类酶也需要具有 从细胞壁基质内的障碍释放出油的能力。取决于细胞壁的具体结构，这种释 放可能需要不同的单独酶或酶的组合，并且可能需要细胞壁多糖降解酶(细 胞壁降解酶)的混合物，所述细胞壁多糖降解酶诸如是纤维素酶、半纤维素 酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶。这类酶也可以防止乳剂的稳定化，一 旦油从油体中释放即可形成乳剂。诸如玉米纤维胶(一种阿拉伯糖基木糖) 或玉米蛋白(一种疏水蛋白质)的颗粒的组分可与释放的油相互作用，形成 稳定的乳剂。水解这些乳剂稳定组分的酶可释放乳化油或防止其乳化。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语都与本 发明所属领域的普通技术人员的普遍理解具有相同意义。术语“约”定义为 加或减百分之十；例如，约100°F意思是90°F-110°F。虽然类似或等同于 本文描述的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试，但现在描述优 选的方法和材料。
以下实施例仅是为了进一步说明本发明，并不是为了限制由权利 要求书定义的本发明的范围。
实施例
材料和方法。酶：所用酶由杜邦生物技术公司提供。如下所述， 使用Fred(热稳定的α-淀粉酶)和L-400(葡糖淀 粉酶)制备玉米糊状物。CP(纤维素酶)、GC220(纤维素 酶)、FERMGENTM(酸性蛋白酶)、木聚糖酶(木聚糖酶 /纤维素酶)、1500(纤维素酶/半纤维素酶)和 XY(木聚糖酶)用于如下所述的油回收试验。
油含量：如前所述，用于发酵的玉米的油含量使用己烷提取和戴 安ASE系统(Dionex ASE system)测定((Johnston等，美国石油化学家协 会杂志，82:6030608(2005)；Moreau,R.A.等，农业与食品化学杂志， 44:2149-2154(1996))((Johnston et al.,Journal of the American Oil Chemists Society 82:6030608(2005)；Moreau,R.A.,et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,44:2149-2154(1996))。
磨粉和分析：将普通黄玉米在轧板机(G2型号，巴恩，斯普林菲 尔德，伊利诺伊州)(model G2,Bunn,Springfield,IL)中研磨，以使产生 的粉可通过2mm筛。在评价研磨粒度的实验中改变板间隙。使用具有7种筛 (SSBC 14、20、24、34、44、54和74)和一个盘的摇筛机(大西部生产 制造，莱文沃斯，KS)评价研磨的玉米粒径。粒径范围通过使用的筛的尺寸 确定，并报告为100g样品保留在筛上的百分数：分别为1.6mm或更大 (1.6mm)，1.0-1.6mm(1.0mm)，0.87-1.0mm(0.87mm)，0.58-0.87mm (0.58mm)，0.44-0.58mm(0.44mm)，0.37-0.44mm(0.37mm)，0.25-0.37mm (0.25mm)，以及小于0.25mm。在进行如Rausch等(Rausch,K.D.等，美 国农业工程师学会会刊)(Rausch,K.D.,et al.,Transactions of the ASAE, 48:273-277(2005))所述的过筛之前，先将研磨后的玉米在55℃下干燥过夜 以减少凝集。玉米粉的含水量使用AOAC官方方法930.15(AOAC官方方法 930.15，AOAC国际官方分析方法，第18版，AOAC国际，盖瑟斯堡，马里 兰州(2005)(AOAC Official Method 930.15,Official Methods of Analysis of AOAC International,18th ed,AOAC International,Gaithersburg,Md(2005)) 测定。
糊状物的制备：向烧杯中加入适当量的玉米粉(调整含水量)和 水制得30％总固体含量的溶液，测量总质量以稍后增加用于补偿蒸发的水。 使用机械搅拌机，用1M HCl调节pH为5.8。按照0.5ml/kg糊状物(2kg/MT 干玉米)的剂量加入α-淀粉酶(FRED，杜邦生物技术公司)， 将浆体加热至95℃，用热板(hot plate)保持60分钟。然后将糊状物冷却至 30℃，并加入尿素(400ppm氮)。然后用1M HCl调节pH为4.5，葡糖淀 粉酶(L-400，杜邦生物技术公司)的加入量是0.4ml/kg糊状物 (1.6kg/MT干玉米)。必要时补充水以补偿蒸发损失的水，加入活性酵母 (1.1g/kg糊状物)开始发酵(红星红色乙醇，富酶泰斯)(Red Star Ethanol Red， Fermentis)。
油回收：如前所述，制备30％固体玉米糊状物。已经含有酵母的 400g糊状物，被分配到每一个预称重的500ml锥形瓶中，锥形瓶配有橡皮塞 和释放发酵过程中产生的CO2的21号针(21gauge needles)。向每个烧瓶 中加入合适量的酶，称量最终烧瓶的重量。将烧瓶在200rpm和30℃下振动 培养72小时，定期称重以确定由于产生CO2而造成的损失。
发酵过程后，称量最终烧瓶的质量，取一个小的(1ml)子样品 用于HPLC分析。然后将整个内容物转移到600ml的烧杯中，搅拌加热至 90℃。将样品从初始体积350ml浓缩至约250ml，以近似去除发酵后啤酒中 的乙醇。然后将烧杯中的内容物转移至已称重的250ml的离心瓶中，并冷却 至室温。将瓶在吊桶转子(swinging bucket rotor)中以2000xg离心10分钟。 将表面的油和乳剂层用移液管转移至250ml烧杯中，以最大限度地减少由倾 析产生的损失。将油和乳剂层转移后，将液体(约相当于称为酒精废液的部 分)倾析到相同的烧杯中。称量含有剩余颗粒的瓶的重量。然后将酒精废液 (约150ml)加热至90℃并浓缩为45ml，以得到相等的浆液(也是业界已知 的浓缩的酒糟可溶物(CDS))。将浆液转移至50ml的离心管中。将离心管 冷却至室温并以2400xg离心20分钟。
将油和乳剂层用移液管再次去除并转移至15ml离心管中。增加 该最后的离心步骤进一步浓缩游离油，以使其可被定量测定。将额外的液体 从50mL管中转移至15ml管中，使每个15ml管中液体的最终体积约12ml。 然后将这些管以4000xg离心20分钟。对这些管进行目测比较，以确定游离 油和其正下方的乳剂层的体积。然后将游离油用移液管小心移至称量过的小 玻璃管中，称量回收的油的重量。
HPLC分析：将从摇瓶中分离的小的子样品离心(艾本德5415D (Eppendorf 5415D)，16000xg)，并将上清液用0.2μm的过滤膜过滤。然 后，使用配有示差折光检测器和离子排斥柱(型号为Aminex HPX-87H，R&B， 赫拉克勒斯市，加利福尼亚)(Aminex HPX-87H,Bio-Rad,Hercules,CA) 的安捷伦1200HPLC(Agilent 1200HPLC)(圣克拉拉，加利福尼亚)(Santa Clara,CA)对样品进行分析。将柱保持在65℃，用5mM的硫酸以0.6ml/min 的速度洗脱。使用麦芽糊精(DP4+)、麦芽三糖(DP3)、麦芽糖、葡萄糖、 果糖、琥珀酸、乳酸、乙酸、丙三醇、甲醇和乙醇分析标准物对柱进行校准。 将样品用0.22μm的针头式过滤器(型号为Acrodisc，颇尔生命科学公司，密 歇根州)(Acrodisc,PALL Life Sciences,MI)过滤并注射。结果采用安捷伦 化学工作站软件(Agilent ChemStation software)进行分析。报告的结果是 重复注射的平均值。
结果和讨论。油回收方法的研发：以上研发和描述的方法，目的 是在实验室规模上模拟用于可回收后发酵油的乙醇设备的一般方法。该方法 中没有使用有机溶剂(例如己烷或二氯甲烷)，因为这些有机溶剂会人为增 加油回收率。玉米颗粒的初始油含量小，正常处理方法中的释放量少，以及 玻璃器皿转移和操作时不可避免的损失使得方法研发困难。我们使用100g糊 状物规模的初步实验没有成功地实现油产量的重复增加。我们断定，更大量 (400g糊状物)的发酵对准确地测量油回收将是足够量的，并且还可进行乙 醇去除、固体分离和液体浓缩步骤。测试这个规模以确定再现性，令人惊讶 地发现，该规模得到具有可重复结果的可接受的表现。通过称量游离油而不 是估计油体积最终实现了改进的重复性。
需要注意的是，实验室规模的处理方法得到的游离油回收率相对 低于商业加工设备中报道的油产量，报道中总油的25％被回收。摆脱理论约 束，相信该差异部分是由于实验室规模回收过程中使用的较温和的处理条件 (例如，较低温度下的离心和低剪切转移(low shear transfers))；油产量 降低可能是由于转移过程中的损失或因为实验室的处理方法只回收了清澈游 离油。
酶的筛选：筛选了几种具有增加油回收能力的商品酶制剂。基于 与发酵条件相容的pH选择酶。选择细胞壁降解制剂(纤维素酶、半纤维素 酶和木聚糖酶)和蛋白酶。不使用酶的对照实验也与每一批被测试的酶同时 进行。相对于由己烷提取确定的发酵中使用的玉米的总油含量，评估游离油 回收量。结果被报告为通过己烷提取玉米粉所确定的糊状物中总油的百分数。
使用相当于10kg/MT干玉米的酶剂量的筛选结果显示于图1中。 在最初的筛选实验中，在非常低的水平(相当于约1.0kg/MT)下筛选酶，但 相对于对照没有显示出明显的增加(结果未显示)。只有在使用较高的酶剂 量时，相对于图1所示的对照，所有测试的制剂在游离油回收量上表现出可 测量的改进。SPEZYME CP和GC220令人惊奇地给出了相对于对照最显著的 增加，并且被用于进一步的研究；遗憾的是，我们没有时间用也可在该处理 方法中使用的型号为Accellerase 1500的酶进行更多的实验。
酶浓度的影响：使用筛选研究中的前两个酶制剂：GC 220和 CP进行酶剂量实验。这两种制剂均具有显著的纤维素酶活性， 并且令人惊奇地发现，可对游离油产生相对于对照的明显增加。使用增加剂 量的CP和GC 220的实验中油回收率分别显示于图2和图3中(图 3中也显示了FERMGENTM剂量的响应，将在下面讨论)。结果表明，增加 剂量可增加油回收率直至一个点，达到该点后，再增加酶会使油回收率增加 很少或不再增加。使用各种酶的游离油的最终回收率为40％以上。然而，大 于50％的油仍然存在于离心过程分离的固体中，或在游离油下方的颗粒/乳剂 层中。相对于一般乙醇厂的回收率，较高的酶浓度出奇地产生增加的游离油 回收率。然而，较低的酶水平导致游离油产量低于一般商业设备中报道的值。 如前所述，并不清楚较低的油产量是否是由于较温和的处理条件或在小的实 验室规模的模型系统中(粘)清澈游离油回收过程中不可避免地发生的转移 损失。清楚的是，大量的油仍然存在于第一次离心分离时分离的固体部分中。
初始粒径的影响：我们测试了减小粒径是否是乙醇生产中提高油 释放的一种可能方法。测试初始玉米粒径的减小以确定是否会进一步增加油 回收率。使用盘式磨粉机将玉米研磨至三种不同的粒径分布(粗、中和细(图 4)：粗粒一般为约1.5mm或更小，中粒一般为1.0mm或更小，细粒一般为 约0.5mm或更小；完整的胚芽颗粒一般大于1.6mm)，第四种样品使用脱胚 机(de-germination mill)研磨(粒径分布如图4所示)。脱胚机可使胚芽(大 于85％的玉米油的所在地)完整，因此显著限制了油泡的可及性；当用这种 方法研磨时，胚乳也相对粗糙，导致这些样品中最终乙醇产量下降(数据未 显示)。四种不同玉米粉的粒径分布如图4所示。此外，在玉米经过液化过 程和冷却后，使用均质机进一步降低一种样品的粒径。与使用细磨玉米粉得 到的1500ml糊状物制剂一起，使用20mm标准的均质发生器在高速下均质 10分钟。相对于任何其它的糊状物制剂，由此所得的糊状物具有更均衡的一 致性。该制备中没有进行粒径分析。
不同研磨粉的后发酵油回收率，添加或未添加GC 220，如图5所 示。没有添加酶的游离油的回收率显示增加油和减小粒径之间的相关性；然 而，总游离油产量相对低，粗或完整的胚芽粉中没有可回收的游离油。用酶 处理的样品中也观察到增加油回收和减小粒径之间同样令人惊奇的趋势。使 人惊奇的是，用酶处理的总回收率显著高于未处理的粉，完整的胚芽粉除外。 使用完整或粗糙的胚芽而不是细磨的胚芽显然可使游离油回收率降低；这种 降低强有力地表明，粒径减小(尤其是胚芽)对从玉米固体中释放油的令人 惊讶的重要性，可有益地辅助发酵后游离油的回收。
蛋白酶添加的影响：利用酶混合物试图提高总油回收率的初步研 究，收效甚微。大多数情况中，相对于单个制剂，这些结果没有产生更多的 油(结果未显示)。然而，我们发现，将酸性蛋白酶(例如FERMGENTM) 和细胞壁降解制剂(例如，像GC 220的纤维素酶)进行混合可惊人地产生协 同作用。这些结果如图6所示。这些实验中，向每个烧瓶中加入固定量(7 kg/MT干玉米)的酶，但FERMGENTM和GC 220的比例不同。结果清楚地表 明，当GC 220的比例占优势时，加入FERMGENTM时油产量显著增加，高于 单独使用GC 220的水平。令人惊讶的是，当混合物中FERMGENTM的比例占 优势时，添加GC 220也产生相同的情况；然而，回收率有所降低。当 FERMGENTM比例增加(GC 220减少)时，产量下降，但仍大于单独使用 FERMGENTM时的产量。
为了确定使用的FERMGENTM的水平并不处于饱和点(其中，减 少酶时不会产生油回收率的相应降低)，也建立了FERMGENTM的剂量响应 曲线(图3)，相对于其它测试的酶，其令人惊讶地表现出显著的区别。单 独使用GC220(以及Spezyme CP)，出乎意料地，获得的最大量的游离油 略高于40％的玉米总油量；然而，仅使用FERMGENTM时，最大量却只有约 20％。这是意料不到的，表明混合实验中使用的水平太高而不能确定我们观 察的是两种酶的协同作用。然而，结果确实暗示了酶使用不同的机制释放油 的可能性。摆脱理论约束，如果它们使用了相同的机制，则蛋白酶将会最有 可能会随剂量增加而继续提高产量，直至它达到与GC 220和Spezyme CP相 同的产量。
使用远低于各酶的饱和点的水平，进行第二个实验以确定协同观 测。使用1kg/MT FERMGENTM、2.5kg/MT GC 220和相同水平的上述两种的 混合物，由相同的糊状物准备一式三份的烧瓶。游离油结果如图7所示，惊 奇并清楚地显示，具有统计学意义，酶混合物具有协同作用。当与单独加入 所用两种酶相比时，令人惊讶地观察到对于酶混合物而言，游离油增加了稍 高于10％(图7中标记为“计算出的”)。
乙醇生产：重量损失和由HPLC测量的最终乙醇值决定发酵速率， 测量所有对照和加酶实验的发酵速率。惊奇地发现，随着GC 220和 FERMGENTM水平的增加，乙醇产量值的平均值增加，相较于对照，这个增 加在最高酶加入水平具有统计学意义(结果未显示)。加入FERMGENTM竟 然没有显示最后乙醇产量的显著增加，但相对于对照显示了发酵速率的显著 增加。这表明，葡萄糖向乙醇和二氧化碳的转化增加不是产生更多可利用葡 萄糖的结果，而是酵母对可利用养分的利用提高的结果。在72小时发酵过程 的最后测量乙醇水平，以确定加入酶没有产生抑制。如果在较早的时间点测 量乙醇水平，由于发酵速率增加，结果将会明显不同。在较早的时间点，分 析FERMGENTM处理的更快发酵将会使乙醇浓度增加，相对于未处理的样品。 随着葡萄糖浓度耗尽，转换减慢，使更慢的、非FERMGENTM处理的样品有 时间赶上并达到相当的乙醇浓度。
图7所示的协同效应显示了单个酶剂量比值2.5:1(GC220: FERMGENTM)的结果。为了看出这种混合酶怎样与单个制剂进行比较，在 酶载量(enzyme loadings)范围内测试相同的混合物。图8显示了结果，包 括如前所示的单个制剂的数据。可以很容易地看出，当使用相同载量时，相 对于单个制剂，GC 220和FERMGENTM一起的混合物惊人地产生更明显的较 多的游离油回收。
为了进一步检测GC 220和FERMGENTM混合物对油回收的影响， 我们用不同比例的每种酶制备了酶混合物。发酵过程中将这些混合物等量 (2kg/MT)加入。选择2kg/MT的水平以使油回收的增加或减少可容易地被 检测。这些实验的目的是确定是否特定的酶混合物可以提高或降低油回收率。 图9显示了这些实验的结果。方形数据点代表单独使用2kg/MT的GC 220或 FERMGENTM的预期产量。这些数据清楚地表明，混合物中只有百分之几的 其它酶却惊人地提高了游离油的回收率。最高产量的增长却出现在或接近每 一个酶的等份混合处；然而，相对于纯的酶制剂，仅仅加入2％体积的其它酶 却惊人地表现出增加。加入5-10％体积，游离油回收被惊人地和显著地改善。
结论：以上表明，只有特定的酶，当在玉米向乙醇发酵的实验室 规模中添加足够水平时，可出乎意料地提高发酵后可以回收(例如，通过离 心分离或浮式离心)的游离油的量。惊人地发现，发酵前玉米的粒径减小可 提高添加酶的游离油的回收率，惊人地发现，胚芽粒径减小是特别重要的。 用酸性蛋白酶/纤维素酶混合物得到的游离油回收，所得的油回收率竟高于乙 醇生产设施回收油通常报道的值，乙醇生产设施回收油在发酵过程中没有添 加这些酶。惊人地发现，使用酸性蛋白酶(FERMGENTM)和纤维素酶(GC 220) 的特定混合物相对于游离油回收显示了协同作用。这种令人惊讶的作用可使 所需酶总量减少，并可能有助于提高酶辅助油回收方法的经济性。据我们所 知，这是第一份报告，该报告显示在发酵过程中添加的酸性蛋白酶和纤维素 酶可用于改善下游的油回收方法。
本文引用的所有参考文献，包括美国专利，通过引用的方式全文 并入本文。通过引用全文并入本文的还有以下参考文献：Moreau,R.A.等， 水酶法油提取：一种从玉米胚芽和其它富油植物材料中获得油的“绿色”生物 工艺，101-120页，ACS研讨会系列，G.Eggleston和J.R.Vercellotti，2007 版(Moreau,R.A.,et al.,Aqueous enzymatic oil extraction:A"Green"bioprocess to obtain oil from corn germ and other oil-rich plant materials,pages 101-120,in: ACS Symposium Series,G.Eggleston and J.R.Vercellotti,eds(2007))；Moreau, R.A.等，美国石油化学家协会杂志，2004(81):1071-1075(Moreau,R.A.,et al., Journal of the American Oil Chemists′Society,81:1071-1075(2004))；Yadav M.P. 等，农业与食品化学杂志，2007，55(15):6366-6371)。通过引用全文并入本 文的还有以下美国专利：8,168,037，8,008,517，8,008,516，7,601,858， 7.608.729，7,148,366和7,101,691。
因此，鉴于上述情况，进行以下描述(部分地)：
一种从玉米中获得油的方法，包括(或基本由……组成或由…… 组成)将玉米颗粒研磨成粉，向所述粉中加水形成浆体，以及在温度为约75℃ 至约120℃和pH为约3至约7条件下，用α-淀粉酶培育所述浆体约10分钟 至180分钟形成糊状物，将所述糊状物冷却至约15℃至约40℃，并加入氮源、 葡糖淀粉酶、酵母、酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶(cell-wall polysaccharide-degrading enzymes)以形成含有乙醇和油的啤酒，其中，所 述啤酒的pH为约3至约7，并从所述啤酒中回收油。
上述的方法，其中所述细胞壁多糖降解酶为纤维素酶和半纤维素 酶。
上述的方法，其中所述酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶的浓度为 约0.25kg/公吨玉米干基至约15kg/公吨玉米干基。上述的方法，其中所述酸 性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶的浓度为约0.5kg/公吨玉米至约10kg/公吨玉 米。上述的方法，其中所述酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶的浓度为约0.5kg 至约5kg/公吨玉米。
上述的方法，其中所述粉的粒径为约2至约0.25mm。上述的方 法，其中所述粉的粒径为约1.5至约0.25mm。上述的方法，其中所述粉的粒 径为约0.6至约0.25mm。
一种从玉米中获得油的方法，包括(或基本由……组成或由…… 组成)将玉米颗粒研磨成粉，向所述粉中加水形成浆体，以及在温度为约75℃ 至约120℃和pH为约3至约7条件下，用α-淀粉酶培育所述浆体约10分钟 至180分钟形成糊状物，将所述糊状物冷却至约15℃至约40℃，并加入氮源、 葡糖淀粉酶、酵母、酸性蛋白酶和细胞壁多糖降解酶形成含有乙醇和油的啤 酒，其中，所述啤酒的pH为约3至约7，并从所述啤酒中去除乙醇得到整个 釜馏物，分离所述整个釜馏物得到湿颗粒和酒精废液，蒸发所述酒精废液得 到浆液，并从所述浆液中回收油。
从该说明书和本文公开的本发明实践考虑，本发明的其它具体实 施方式对本领域技术人员来说将是显而易见的。其目的是，说明书和实施例 仅被视为示例，本发明真实的范围由所附的权利要求书显示。