技术领域
本发明涉及一种高谷胱甘肽含量酿酒酵母的制备方法，特别涉及一种利用农副资源制备高谷胱甘肽含量酿酒酵母的方法。
技术背景
谷胱甘肽（GSH）具有清除自由基、解毒、抑制衰老、预防糖尿病和癌症、抑制艾滋病毒、提高人体免疫力等重要生理功能；最近发现谷胱甘肽在提高动物的免疫能力，降低抗生素的用量方面具有重要的左右。因此，高谷胱甘肽含量的酿酒酵母在医学、食品、化妆品及动物保护等领域具有广泛的市场前景。
谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中发酵法是最具潜力的方法。但目前国内谷胱甘肽的发酵生产存在以下几个方面的问题：1、产谷胱甘肽的微生物谷胱甘肽合成产率低；2、谷胱甘肽合成过程中的代谢调控不完善；3、谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，导致在谷胱甘肽提取过程中损失大。由于这些因素的制约，使谷胱甘肽的生产受到很大的影响。
谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，因此微生物细胞合成的谷胱甘肽一般存在于细胞中。酵母是谷胱甘肽合成最具潜力的微生物，且酵母富含蛋白质，在食品和医药工业中具有广泛的用途，生产谷胱甘肽含量高的酵母既能作为食品和医药工业的原料，同时也可以提供丰富的功能性成分谷胱甘肽，对改善人体机能具有非常重要的作用。
谷胱甘肽的发酵生产已有一些报道，如：专利CN1203185C，以产朊假丝酵母WSH02-08为菌株，在发酵过程中一次性添加L-半胱氨酸，在7L发酵罐中发酵，细胞干重14-16g/L，干细胞谷胱甘肽含量3.5-4.0%，其生物量和谷胱甘肽含量均较低。专利CN101024818A以酿酒酵母YA03083为菌株，采用补料分批发酵，虽生物量可达到60g/L，但谷胱甘肽的含量只有15mg/g。本申请人曾经申报的专利CN102653722A公开了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532发酵生产富含谷胱甘肽的酵母，其在摇瓶发酵中，添加谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、ATP，发酵周期为56小时，细胞干重：12.5g/L，干细胞中谷胱甘肽含量：40mg/g；在30L发酵罐中，采用流加补料分批发酵，一次性添加前体氨基酸和ATP，发酵47小时，细胞干重：46g/L，干细胞中谷胱甘肽含量：35-40mg/g；发酵液中谷胱甘肽产量：1.814g/L。然而，由于发酵工艺的技术参数没有得到优化，因此其谷胱甘肽产率较低。
发明内容
本发明人在前期研究的基础上，再次优化工艺参数，从而提供一种高谷胱甘肽含量酿酒酵母的制备方法。该方法可使酿酒酵母的谷胱甘肽胞内含量提高5倍以上，从而进一步解决微生物谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的问题。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复研究工艺及技术参数，并终于获得了如下生产方法：
一种高谷胱甘肽含量酿酒酵母的制备方法，该方法包括将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532经活化培养、种子培养、发酵、分离、洗涤和干燥步骤，所述的发酵步骤为摇瓶发酵，发酵前和发酵过程中均不添加谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和ATP。
对上述摇瓶发酵制备高谷胱甘肽含量酿酒酵母的方法作进一步的优选，其中的发酵步骤为摇瓶发酵，培养基组成为葡萄糖60g/L，酵母粉13g/L，硫酸铵6g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁0.3g/L，pH5.5-6.0；发酵工艺条件为：摇床转速180-200rmp/min，发酵温度28-32℃，发酵时间32-48小时。
一种高谷胱甘肽含量酿酒酵母的制备方法，该方法包括将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532经活化培养、种子培养、发酵、分离、洗涤和干燥步骤，所述的发酵步骤为发酵罐发酵，将种子培养后的菌种接入装有底水的发酵罐中，采用多级变速流加发酵的方式，在30L发酵罐中发酵32-48h，发酵温度28-32℃；
流加碳源为350g/L葡萄糖溶液；发酵0-4小时，碳源的流加速度为80mL/h～120mL/h，溶氧量控制在2-4%；发酵4-20小时，碳源的流加速度为120mL/h～180mL/h，溶氧量控制在10-20%；
流加氮、磷源的配方为尿素80g/L、硫酸铵35g/L和磷酸二氢钾60g/L；发酵0-20小时，氮、磷源的流加速度为60mL/h～90mL/h；
发酵到18-20小时，生物量干重达到30-50g/L，开始流加谷氨酸8-12mmol/L、半胱氨酸8-12mmol/L和甘氨酸5-7mol/L，控制流加速度，在8-12小时内流加完毕，开始流加氨基酸的同时，控制碳源的流加速度为50mL/h～90mL/h继续发酵6-16小时；
整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%（W/V）。
对上述发酵罐发酵制备高谷胱甘肽含量酿酒酵母的方法作进一步的优选，其中的底水含有：水9L，酵母粉270g，22.5g氯化钙，67.5g五水硫酸镁，0.072g硫酸锌，45g氯化钾，0.45g维生素B1，0.45g维生素B2，13.5g维生素B6，0.45g烟酸，0.45g泛酸钙，自然pH。
对上述发酵罐发酵制备高谷胱甘肽含量酿酒酵母的方法再作进一步的优选，其中的分离步骤采用真空转鼓分离，真空度0.08-0.1Mpa，转鼓转速每分钟50-80rpm。
与现有技术相比，本发明涉及的方法可制备高谷胱甘肽含量的酿酒酵母，体现如下：
（1）在摇瓶发酵中，发明人意外地发现加入氨基酸和ATP会抑制酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532的谷胱甘肽转化产率，因此选择不添加谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸及ATP，在发酵32-48小时时酵母细胞干重达到16-24g/L，干酵母细胞中谷胱甘肽的含量达到80-100 mg/g；
（2）在30L发酵罐中，采用变速流加碳源、氮源及磷源，在不同时间内变速流加一定配比的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸，不添加ATP，在发酵32-48小时时酵母细胞干重达到40-60g/L，干酵母细胞中谷胱甘肽含量高达180-220mg/g。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例一:摇瓶中发酵培养制备高谷胱甘肽酿酒酵母
（1）菌株：
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532，湖北工业大学生物工程209实验室保藏。
（2）培养基：
每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母膏 5g，琼脂20g，所述斜面培养基pH5.8-6.2；
每1L所述种子培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母膏 5g，所述种子培养基pH5.8-6.2；
每1L所述摇瓶水平上发酵培养基含有：葡萄糖60g，酵母粉13g，硫酸铵6g，磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁0.3g，pH5.5-6.0；
（3）种子扩大培养：
斜面种子活化12-16小时后接入装入种子培养基的三角瓶中培养，装液量25-30mL，12-18小时即得一级种子；
（4）药瓶发酵培养：
将种子接入25mL/250mL培养基组成为：葡萄糖60g/L，酵母粉13g/L，硫酸铵6g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁0.3g/L，pH5.5-6.0的摇瓶中，在28-32℃，摇床转速为180-200rmp/min，不添加谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、ATP，发酵32-48小时。
（5）细胞干重的测定
一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105℃烘干至恒重。
（6）谷胱甘肽含量的测定
采用碘量法。
（7） 结果：
发酵时间：48小时；细胞干重：20g/L；干酵母细胞中谷胱甘肽含量：90mg/g。
实施例二30L发酵罐上采用流加发酵培养制备高谷胱甘肽含量酿酒酵母
（1）菌株
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532，湖北工业大学生物工程209实验室保藏。
（2）培养基
每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母膏 5g，琼脂20g，所述斜面培养基pH5.8-6.2；
每1L所述种子培养基含有：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母膏 5g，所述种子培养基pH5.8-6.2；
所述发酵罐水平上发酵中底水含有：水9L，酵母粉270g，22.5g氯化钙，67.5g五水硫酸镁，0.072g硫酸锌，45g氯化钾。自然pH。加4ml的消泡剂。另外：加 0.45g维生素B1，0.45g维生素B2，13.5g维生素B6，0.45g烟酸，0.45g泛酸钙，一起溶解在500ml水中，115℃灭菌20分钟，加入到灭菌后的底水中。
流加碳源：流加碳源的体积为9.0L ，葡萄糖浓度350g/L，自来水溶解液，108℃灭菌20分钟。
流加氮源、磷源：流加氮、磷源的体积为3L，配方为：尿素80g/L、硫酸铵35g/L、磷酸二氢钾60 g/L。
流加前体氨基酸：流加前体氨基酸的体积为1.8L，配方为：谷氨酸8-12mmol/L、半胱氨酸8-12mmol/L、甘氨酸5-7mol/L。
（3）种子培养
斜面种子活化14小时后，接入装入25mL种子培养基的250mL三角瓶中培养12-18小时即得一级种子；之后再按10%（V/V）的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-18小时制备二级种子，培养温度28-32℃，恒温培养振荡器，转速200rpm；
（4）发酵培养
多级流加发酵：将准备好的二级种子按10%的接种量接入装有9L底水的全自动发酵罐中，发酵温度28-32℃，发酵周期32-48h。发酵前期0-4小时，碳源的流加速度为：80mL/h～120mL/h，溶氧量控制在2-4%，发酵中期4-20小时，碳源的流加速度为：120mL/h～180mL/h，溶氧量控制在10-20%。发酵0-20小时，氮、磷源的流加速度为60mL/h～90mL/h。发酵到18-20小时，生物量干重达到30-50g/L，开始流加谷氨酸8-12mmol/L、半胱氨酸8-12mmol/L、甘氨酸5-7mol/L，控制流加速度，在8-12小时内流加完毕，开始流加氨基酸的同时，控制碳源的流加速度为50mL/h～90mL/h继续发酵6-16小时。整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%（W/V）。
（5）细胞干重的测定
一定的发酵液离心后用蒸馏水洗涤2次，得到的新鲜细胞在105℃烘干至恒重。
（6）谷胱甘肽含量的测定
采用碘量法。
（7）结果：
发酵时间：48小时；细胞干重：50g/L；胞内谷胱甘肽含量：180-220mg/g；发酵液中谷胱甘肽的产量为：9-11g/L。
实施例三:高谷胱甘肽含量酿酒酵母的分离、洗涤及干燥
（1）高谷胱甘肽含量酿酒酵母的分离
将发酵液泵入真空度为0.08-0.1Mpa真空转鼓分离，转鼓转速每分钟50-80rpm，连续分离酵母细胞，待转鼓形成滤饼后，将滤出液第二次泵入转鼓，回收滤出液中流失的细胞；
（2）高谷胱甘肽含量酿酒酵母的洗涤
其中所述的洗涤是在储罐中加入2-4倍分离所得的酵母细胞体积温度为常温的自来水分散酵母细胞，再在前述相同的条件下采用真空转鼓分离分离，如此重复洗涤2-3次。
（3）高谷胱甘肽含量酿酒酵母的干燥
将洗涤分离后收集的酵母细胞分散于常温的自来水中，使细胞浓度达到220-260g/L，所得的酵母分散液采用喷雾干燥塔干燥，控制喷雾干燥塔的进风温度为130-150℃进行干燥。
（4）结果
酵母细胞的收率95-98%；
干酵母细胞的水分为10-12%（W/W）；
酵母细胞中谷胱甘肽的损失率为0.4-0.6%。