技术领域
本发明属于发酵工程和天然产物的生物合成领域。更具体的，本发明涉及一种发酵制备 喷司他丁的方法。
背景技术
喷司他丁（pentostatin），又名喷司他汀、喷妥司汀、脱氧助间型霉素，其化学名为： (8R)-3-(2-脱氧-β-D-赤-戊呋喃糖基)-3,6,7,8-四氢咪唑[4,5-d][1,3]二氮杂卓-8-醇 （(8R)-3-(2-deoxy-β -D-ribofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol），化学式为： C11H16N4O4，结构式如式（I）。1974年Warner Lambert公司的Peter W.K.Woo等人首次从 Streptomyces antiboticus发酵液中分离得到。喷司他丁是一种高效的腺苷脱氨酶（ADA） 抑制剂，能够与ADA紧密结合并抑制其活性，进而使肿瘤细胞内大量积累脱氧腺苷三磷酸 （dATP）和脱氧腺苷，从而使DNA或RNA的合成受到抑制，最终导致肿瘤细胞死亡。1998年 2月美国FDA正式批准了注射用喷司他丁（商品名）上市，主要用于干细胞白血病 （Hairy cell leukemia,HCL）、慢性淋巴细胞白血病（ChroniclympH=ocytic leukemia,CLL）、 移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）及蕈样霉菌病（Mycosis fungoides） 的治疗。
目前，制备喷司他丁主要有化学合成法和生物合成法。由于喷司他丁特殊的七元杂环结 构及七元杂环上的手性醇结构，使得喷司他丁的化学合成较为困难。目前文献中报道的化学 合成方法路线繁杂，过程中需要提供强酸、强碱、高温、低温环境和使用有毒的有机溶剂， 且需对中间产物进行多次提纯，工艺复杂、成本较高，收率较低，故化学合成不是制备喷司 他丁的理想途径。生物合成法主要是指液体深层发酵，在适宜的条件下，通过微生物的生长 与代谢将廉价原料转化为喷司他丁，整个生产过程条件温和，没有强酸、强碱、有毒试剂的 使用，生产成本低于化学合成法，因而成为喷司他丁合成的主流方法。
文献报道最优方法为2011年上海工业医药研究所发明专利（CN102234673A）实施例中 提供，该方法利用抗生链霉菌NRRL3238发酵制备喷司他丁，其培养基配方为：葡萄糖40.0 g/L，细豆粕30.0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5.0g/L，NaCl5.0g/L，泡敌0.05g/L， 温度30℃，pH=6.5，溶氧40%，通气量0.5vvm，24h开始流加葡萄糖1-10‰L/h，发酵 周期72h，喷司他丁产量达55mg/L。
目前，制约喷司他丁生物合成产业化的主要因素是发酵工艺不成熟，发酵液中喷司他丁 浓度较低。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种用于发酵制备喷司他丁的发酵培养基。
本发明的第二个目的是提供一种发酵制备喷司他丁的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于发酵制备喷司他丁的发酵培养基，包括下述组份：碳源3～10g，氮源21～60g， (NH4)2SO40～0.5g，加水至1L。
优选的是：碳源为3～7g，氮源为35～50g，(NH4)2SO4为0～0.3g。
优选的是：碳源为4～5g，氮源为42～45g(NH4)2SO4为0～0.1g。
碳源优选为：葡萄糖、糊精、麦芽糖醇、可溶性淀粉、山梨醇、木糖醇或大米粉。
氮源优选为：酵母浸粉、麦芽浸粉、高温豆粕粉、棉籽粉、脱脂豆粉、麸皮和秘鲁鱼粉 至少一种。
一种发酵制备喷司他丁的方法，包括如下步骤：
（1）将链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到摇瓶种子培养基中，在200～350r/min， 28～34℃摇床中，培养36～72h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为3%～20%的比例接种到发酵培养基中，在150～300r/min， 28～34℃摇床中，培养200～400h，收集发酵液；
或将种子液按体积接种量为6%～10%的比例接种到发酵培养基中，装液量为5L/7L发酵 罐，温度为30～32℃，通风量为0.5～3vvm，搅拌转速为100～500r/min，溶氧与通风量和搅拌 转速偶联为30%～50%，控制pH=7.3～7.9，培养167～389h，收集发酵液；
或将种子液按体积接种量为6%～10%的比例接种到发酵培养基中，装液量为5L/7L发酵 罐，0～24h温度为32～34℃，24h～312h温度为31～33℃，312～403h温度为33～35℃，搅 拌转速为100～500r/min，通风量为0.5～2vvm,溶氧与通风量和搅拌转速偶联为30%～50%，控 制pH=7.3～7.9，培养167～389h，收集发酵液。
步骤（1）优选为：将链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到摇瓶种子培养基中，在 250～300r/min，32～34℃摇床中，培养48～60h，得到种子液。
步骤（2）优选为：将种子液按体积接种量为4%～15%的比例接种到发酵培养基中，在 200～300r/min，30～32℃摇床中，培养272～389h，收集发酵液；
或将种子液按体积接种量为6%～10%的比例接种到发酵培养基中，装液量为5L/7L发酵 罐，温度为30～32℃，通风量为0.5～3vvm，搅拌转速为100～500r/min，溶氧与通风量和搅拌 转速偶联为35%～40%，控制pH=7.6～7.9，培养256～356h，收集发酵液；
或将种子液按体积接种量为6%～10%的比例接种到发酵培养基中，装液量为5L/7L发酵 罐，0～24h温度为33℃，24h～312h温度为32℃，312～403h温度为35℃，搅拌转速为 100～500r/min，通风量为0.5～2vvm,溶氧与通风量和搅拌转速偶联为35%～40%，控制pH= 7.6～7.9，培养256～356h，收集发酵液。
发酵培养基包括下述组份：碳源3～10g，氮源21～60g，(NH4)4SO40～0.5g，加水至1L。
优选的是：碳源为3～7g，氮源为35～50g，(NH4)4SO4为0～0.3g。
优选的是：碳源为4～5g，氮源为42～45g(NH4)4SO4为0～0.1g。
碳源优选为：葡萄糖、糊精、麦芽糖醇、可溶性淀粉、山梨醇、木糖醇或大米粉。
氮源优选为：酵母浸粉、麦芽浸粉、高温豆粕粉、棉籽粉、脱脂豆粉、麸皮和秘鲁鱼粉 至少一种。
用本发明的发酵培养基和本发明的方法，可以使发酵制备喷司他丁其喷司他丁产量较高， 发酵能力稳定，适于进行大规模工业化生产。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步说明本发明，但本发明不受其限制。下述实施例中所使用的 实验方法若无特殊说明，均为常规方法。下述实施例用所涉及到的原料、试剂等，若无特殊 说明，均可以通过商业途径获得。
实施例1-13一种用于发酵制备喷司他丁的发酵培养基组成见表1
表1
表1中各实施例中的组份加水至1L，配成发酵培养基。
实施例14
种子培养基（g/L）：葡萄糖4，酵母浸粉4，麦芽浸粉10，(NH4)3PO42，pH=7.0～7.4。
实施例15
将链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365（购于美国典型培养物保藏中心American type culture collection），接种到高氏一号培养基斜面上，在28℃恒温培养箱中培养7-10d，待 斜面长满孢子。
实施例16
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 200r/min，28℃摇床中，培养72h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为3%的比例接种到发酵培养基（实施例2制备）中，在150 r/min，34℃摇床中，培养400h，收集发酵液。喷司他丁产量为57mg/L。
实施例17
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 250r/min，32℃摇床中，培养60h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为4%的比例接种到发酵培养基（实施例2制备）中，在300 r/min，32℃摇床中，培养389h，收集发酵液。喷司他丁产量为76mg/L。
实施例18
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 300r/min，32℃摇床中，培养48h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为15%的比例接种到发酵培养基（实施例4制备）中，在 200r/min，30℃摇床中，培养272h，收集发酵液。喷司他丁产量为56mg/L。
实施例19
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 350r/min，34℃摇床中，培养36h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为20%的比例接种到发酵培养基（实施例5制备）中，在 200r/min，28℃摇床中，培养200h，收集发酵液。喷司他丁产量为59mg/L。
实施例20
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 200r/min，28℃摇床中，培养72h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为6%的比例接种到发酵培养基（实施例8制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，温度为30℃，通风量为0.5～3vvm，搅拌转速为100～500r/min，溶氧与 通风量和搅拌转速偶联为30%，控制pH=7.6，培养167h，收集发酵液。喷司他丁产量为75 mg/L。
实施例21
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 250r/min，32℃摇床中，培养60h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为10%的比例接种到发酵培养基（实施例2制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，温度为30℃，通风量为0.5～3vvm，搅拌转速为100～500r/min，溶氧与 通风量和搅拌转速偶联为40%，控制pH=7.3，培养256h，收集发酵液。喷司他丁产量为84 mg/L。
实施例22
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 300r/min，32℃摇床中，培养48h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为10%的比例接种到发酵培养基（实施例9制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，温度为32℃，通风量为0.5～3vvm，搅拌转速为100～500r/min，溶氧与 通风量和搅拌转速偶联为50%，控制pH=7.9，培养356h，收集发酵液。喷司他丁产量为80 mg/L。
实施例23
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 350r/min，34℃摇床中，培养36h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为10%的比例接种到发酵培养基（实施例2制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，温度为32℃，通风量为0.5～3vvm，搅拌转速为100～500r/min，溶氧与 通风量和搅拌转速偶联为35%，控制pH==7.6，培养389h，收集发酵液。喷司他丁产量为 85mg/L。
实施例24
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 200r/min，28℃摇床中，培养72h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为6%的比例接种到发酵培养基（实施例10制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，0～24h温度为32℃，24h～312h温度为31℃，312～403h温度为33℃， 搅拌转速为100～500r/min，通风量为0.5～2vvm,溶氧与通风量和搅拌转速偶联为30%，控制 pH=7.3，培养256h，收集发酵液。喷司他丁产量为75mg/L。
实施例25
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 250r/min，32℃摇床中，培养60h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为10%的比例接种到发酵培养基（实施例2制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，0～24h温度为33℃，24h～312h温度为32℃，312～403h温度为34℃， 搅拌转速为100～500r/min，通风量为0.5～2vvm,溶氧与通风量和搅拌转速偶联为35%，控制 pH=7.6，培养356h，收集发酵液。喷司他丁产量为100mg/L。
本实施例中的发酵培养基，用实施例1、3、7、11、12制备的发酵培养基替代，其它同 本实施例，所获得的喷司他丁产量为依次为60mg/L、65mg/L、80mg/L、75mg/L、76mg/L、
实施例26
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 300r/min，32℃摇床中，培养48h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为10%的比例接种到发酵培养基（实施例13制备）中，装 液量为5L/7L发酵罐，0～24h温度为34℃，24h～312h温度为33℃，312～403h温度为35℃， 搅拌转速为100～500r/min，通风量为0.5～2vvm,溶氧与通风量和搅拌转速偶联为40%，控制 pH=7.9，培养389h，收集发酵液。喷司他丁产量为92mg/L。
实施例27
一种发酵制备喷司他丁的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将实施例15获得的链霉菌Streptomyces sp.ATCC39365接种到种子培养基中，在 350r/min，34℃摇床中，培养36h，得到种子液；
（2）将种子液按体积接种量为10%的比例接种到发酵培养基（实施例6制备）中，装液 量为5L/7L发酵罐，0～24h温度为33℃，24h～312h温度为32℃，312～403h温度为34℃， 搅拌转速为100～500r/min，通风量为0.5～2vvm,溶氧与通风量和搅拌转速偶联为50%，控制 pH=7.6，培养167h，收集发酵液。喷司他丁产量为62mg/L。