技术领域
本发明涉及一种检测猪细小病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯 片以及检测方法。
背景技术
随着我国养猪业向集约化和规模化方向发展，规模化猪场疫病多发、多 种病原混合感染较普遍存在，给养猪业造成了一定损失。其中猪细小病毒 (PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪繁殖障碍的两种重要疫病病原。 这两种病临诊症状相似，需要进行鉴别诊断。
目前，对这两种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需 时间较长，也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别 两种病毒的方法。因此，有必要建立能同时进行两种疫病快速检测的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检 测猪细小病毒和/或猪圆环病毒2型的可视化基因芯片和试剂盒。
基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝 胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集 成化、平行化和高通量。
本发明检测猪细小病毒和/或猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载 体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1、2所示基因 片段，用于分别检测猪细小病毒和/或猪圆环病毒2型。
优选地，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了一种检测猪细小病毒和/或猪圆环病毒2型的试剂盒，其 特征在于：它包括前述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8所示引物对，用于分别扩增猪细小病毒和/ 或猪圆环病毒2型的基因。
优选地，它还包括质控探针的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO： 9～10和/或SEQ ID NO：11～12所示。
优选地，所述SEQ ID NO：5、7、9、11所示上游引物标记有生物素。
本发明还提供了SEQ ID NO：1、2所示基因片段在制备检测猪细小病毒 和/或猪圆环病毒2型的基因芯片的用途。
优选地，所述基因芯片还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO： 3和/或SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8所示引物对以及 SEQ ID NO：1、2所示基因片段在制备检测猪细小病毒和/或猪圆环病毒2 型中的用途；其中，两对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO：1、2所示基因片 段为检测探针。
优选地，所述试剂盒还包括质控探针和质控探针的扩增引物，质控探针 的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示，质控探针的扩增 引物，分别如EQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12所示。
本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪细小病毒和猪圆环病毒2型病 原，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测 结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，临 床应用前景良好。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的 详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。 凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：阵列排布示意图；
图2：点阵设置图示；
图3：样品设置图示；
图4：芯片预杂交的组装图示
图5：芯片特异性检测结果A:PRV检测结果；B:PPV检测结果；C:PCV2检测结果；D:PRV+PPV 检测结果；E:PRV+PPV检测结果；F:PRV+PCV2检测结果。
图6：NS1探针基因芯片灵敏性检测结果
图7：ORF2探针基因芯片灵敏性检测结果
图8：稳定性检测结果
具体实施方式
实施例1 本发明检测方法
一、探针基因的设计以及包含探针的质粒菌的构建
1材料
1.1种毒
PRV Fa株，由卫生部成都生物制品研究所惠赠；
PCV2由本实验室赵春容从四川资阳病料中分离；
猪细小病毒灭活疫苗购自北京中海科技动物保健科技公司。
1.2探针基因重组质粒菌
T/GAPDH由英骏生物公司合成。
1.3主要实验仪器
电子天平：Sartorius BP 310S；
超纯水仪：Milli Qplus，法国产；
超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；
恒温摇床：真空机：SinBo，香港；
恒温水浴锅；Thermo Savant冷冻干燥仪；
核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010；
高速冷冻离心机3K18型：德国产；
Mini-SUB凝胶电泳装置，电泳仪:POWER Pac300，凝胶电泳图像分析系统2000型：意大利产；
梯度PCR仪：P×2，Thermo hybaid；分子杂交仪：Thermo，美国产；
SmartArrayerTM48(微阵列芯片点样系统)，LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪：
Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司；
高纯氮气瓶：四川冠峰气体有限公司生产。
1.4主要试剂
Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均购自Omega(美国)生物技术有限公司；
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、50bp DNA Ladder、100bp DNA Ladder、2×Taq PCR MasterMix、DH5a感受态细胞-化学转化，Amp均购自北京天根生化科技有限公司；
PUC18Cloning Vector，pMD19-T Simple克隆试剂盒，均购自宝生物(大连)科技有限公司；
LB液体培养基(含100mg/ml Amp)；LB平板(含100mg/ml Amp)等。
Western Blot膜封闭液，购自天根生物科技有限生司；
Streptavidin-HRP，DAB Kit(Brown)购自英骏生物科技有限公司；
点样缓冲液，购自上海百傲生物工程有限公司；
预杂交缓冲液：甲酰胺50ml、20×SSC 25ml、100×denhartd’s 5ml、脱脂奶粉5g、0.2M Na3PO410 ml，超纯水定容至100ml；
杂交缓冲液，甲酰胺45ml、20×SSC 25ml、100×denhartd’s 1ml、脱脂奶粉2g、20m M Na3PO4(pH 6.5)10ml，超纯水定容至100ml；
尼龙膜，购自GE Healthcare；硝酸纤维素膜，购自Millipore.
0.2M PBS缓冲液：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.27g，定容至1L；
洗液Ⅰ：1×SSC 0.1％SDS；洗液Ⅱ：0.2×SSC 0.1％SDS；洗液Ⅲ：0.2×SSC；超纯水。
2实验方法
2.1探针设计
2.1.1PPV探针
PPV-NS1基因(SEQ ID NO：1)：
TTCATGGGCCAGCATCAACAGGAAAAAGTATAATTGCTCAACACATTGCAAACTTAGTTGGTAAT GTTGGTTGCTACAATGCAGCCAATGTGAACTTTCC
2.1.2PCV2探针
PCV2-ORF2基因(SEQ ID NO：2)：
GGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGG TTAGGGCATTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCA
2.1.3质控1：PUC18基因(SEQ ID NO：3)：
GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAG TCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGA GCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCT CACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC
2.1.4质控2：GAPDH基因(SEQ ID NO：4)：
CCCCTTCATCACCACGGACTACATGACCTACATGTTCAAGTACGACACCGTCCACGGCCACTGGA AGCACAGCGACATCACACTCAAGGACTCCAAGACCCTTCTCTTCGGTGACAAGCCGGTCACCGT CTTTGGCATCAGGAACCCTGAGGAAATCCCGTGGGGTGAGGCTGGCGCTGAGTATGTCGTGGAG TCCACCGGCGTCTTCACTGACAAGGACAAGGCTGCTGCACATCTCAAGGGTGGTGCCAAGAAGG
2.1.5重组质粒及其重组菌的制备
2.1.5.1探针基因的连接
采用pMD19-T Simple克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进行。连接体系 如下：
4℃连接过夜，连接产物用于转化DH5α感受态细胞。
2.1.5.2探针基因的转化
取9ul连接产物，向其中加入1ul SolutionⅢ(可增强转化效率)，混匀。将连接产物加入50ul 感受细胞中，混匀，冰浴30min；42℃水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min；立即加入600ul 37℃ 预热的LB液体培养基(不含Amp)，37℃，180r/min振荡培养1h，使受体菌恢复正常生长状态； 4000r/min离心5min，弃上清510ul，重悬菌液后取150ul培养物均匀涂布于LB平板(含100mg/ml Amp)，晾干，于37℃培养箱中培养约12h。
即得T/NS1和T/ORF22个检测探针以及T/PUC18和T/GAPDH 2个定位探针基因重组质粒菌。
2.2可视芯片的制备
2.2.1阵列的设计排布
每张芯片分为2个重复阵列，每个阵列为7排不同的探针基因，每排探针基因重复喷样4次。每 个阵列探针基因排布为：第一排为空白对照(超纯水)，第二排为空白对照(超纯水)，第三排为PPV-NS1 基因，第四排为PCV2-ORF2基因，第五排为空白对照(超纯水)，第六排为PUC18基因，第七排为 GAPDH基因。阵列排布示意图如图1。
2.2.2喷样
本试验采用北京博奥生物有限公司的SmartArrayer 48系统喷样。在喷样前，先将384孔板 与粘在基片上的硝酸纤维素膜安装到点样仪的指定区域，然后对点样仪的各项位置参数进行标定，并 按2.2.1的阵列排布设置点阵。针阵点矩为3000μm，阵间间隔为7mm.点阵及样品参数设置如图2 和图3.
将纯化好的探针基因浓度调整到200ng/ul，加入等体积的点样缓冲液后混匀。混合液在PCR仪中 95℃变性10min后，立即冰浴冷却5min，将探针基因轻轻加至384孔板相应的孔中。以上均设置完 成后，打开氮气瓶，调整压力为0.4～0.5M Pa，即可开始喷样。
2.2.3探针基因固定、密封与保存
喷样完成后将硝酸纤维素膜置于80℃的烘箱中烘焙2h，真空机抽干密封、4℃冰箱保存。
2.3靶基因的PCR扩增标记
分别提取PPV和PCV2DNA，与对应的引物进行PCR扩增标记。
2.3.1DNA提取方法如下：基因组DNA抽提采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，具 体操作步骤如下：
(1)处理病料：取疑似患猪圆环病、猪细小病毒病的肝、肺脏(纤维素性渗出及出血处)、脾(梗 死、出血处)、淋巴结(肿大、出血处)25～50mg剪碎、研磨；
(2)加入20ul 20mg/ml的Protease K溶液，吹打混匀，56℃水浴锅放置1h，顺离30s后进 行下一步骤；
(3)加200ul缓冲液GB，上下颠倒混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，溶液应变的清亮， 顺离30s；
(4)加200ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时溶液中可能会出现絮状的沉淀物，顺离30s；
(5)将上一步所得液体都加入一个带有收集管的吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，倒废 液，将吸附柱重新放入收集管中；
(6)向吸附柱中加入500ul去蛋白液GD，12,000rpm顺离30s，倒废液，再将吸附柱重新放 入收集管中；
(7)向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12,000rpm顺离30s，倒废液，将吸附柱重新放入收 集管中；
(8)向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12,000rpm顺离30s，倒废液；
(9)将吸附柱放入废液收集管中，12,000rpm离心2min.室温开盖放置数分钟；
(10)将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空加入100ul经预热过的TE缓 冲液，室温放置3min后，12,000rpm离心30s；
(11)再次将离心得到的溶液加入吸附柱中，室温放置3min，12,000rpm离心3min。
2.3.2引物如下
2.3.2.1PPV(SEQ ID NO：5～6)
F：TTCATGGGCCAGCATCAA
R：TGAAAGTTCACATTGGCTGC
2.3.2.2PCV2(SEQ ID NO：7～8)
F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
R：TGGGCTCCACTGCTGTTATT
2.3.2.3质控1(SEQ ID NO：9～10)
F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
R：TGGGCTCCACTGCTGTTATT
2.3.2.4质控2(SEQ ID NO：11～12)
F：CCCCTTCATCACCACGGACTA
R：CCTTCTTGGCACCACCCT
2.3.3PCR反应体系如下：
反应程序为：94℃、4min；94℃、40s，58℃、30s，72℃、30s，共30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。取6ul用3.0％的琼脂糖凝胶电泳分析。
2.4可视化基因芯片检测操作程序
2.4.1预杂交
将制备好的芯片放于塑料盒中(如图4)，加入10ml预杂交缓冲液(加入量盖住芯片即可)，然 后将塑料盒放入湿盒内44℃预杂交1.5h.
2.4.2杂交
吸除预杂交液，将制备好的靶基因在PCR仪中95℃变性10min后立即冰浴冷却5min，然后加 入10ml杂交缓冲液中，44℃杂交一定时间。杂交结束后，将芯片固定在洗片夹上，然后于室温下， 依次用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ中各洗涤5min，1000r/min，离心5min干燥。
2.4.3封闭
吸除杂交液，加入10ml封闭液，37℃封闭40min.
2.4.4酶联
将streptavidin-HRP在避光条件下用0.2M PBS buffer按1：1000倍稀释，37℃酶联30min.然后 于室温下，依次用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和洗涤液Ⅲ中各洗涤5min，1000r/min，离心5min干燥。
2.4.5显色
加入DAB底物显色液(现用现配)，显色5～10min，肉眼观察结果。
2.5性能检测
2.5.1可视化基因芯片特异性检测评价
分别以PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记，将 标记产物与基因芯片杂交后，观察其特异性杂交结果。
2.5.2可视化基因芯片灵敏性检测评价
提取各探针基因重组质粒菌的质粒DNA，经PCR扩增标记后，分别作10×倍比稀释作为靶基因， 将各靶基因混合后与基因芯片进行杂交检测，以评价芯片与PCR的灵敏性。
2.5.3可视化基因芯片的保存期检测评价
以PCV2检测基因芯片为例，分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一张，将 各质粒DNA进行经PCR扩增标记后进行杂交检测，以评价其保存期。
3实验结果
3.1可视化基因芯片特异性检测评价结果
分别以PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记，将 标记产物与基因芯片杂交后，观察其特异性杂交结果(如图5)。结果表明芯片特异性好，PPV、PCV2 分别在相应位置出现杂交斑点，而其余位置均未出现杂交斑点。
3.2可视化基因芯片灵敏性检测评价结果
3.2.1基因芯片灵敏性检测结果
NS1探针基因芯片灵敏性检测结果
对NS1质粒DNA进行PCR扩增标记，10×系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度可达11.7pg/ul， 检测结果见图6.
ORF2探针基因芯片灵敏性检测结果
对ORF2质粒DNA进行PCR扩增标记，10×系列稀释后与芯片杂交，最低检测浓度可达13.2 pg/ul，检测结果见图7
3.3可视化基因芯片保存期检测评价结果
如图8所示，分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一张，将各质粒DNA进 行经PCR扩增标记后混合，与芯片经预杂交、杂交、封闭、酶联、显色等一系列操作后观察结果，结 果表明芯片在保存120天后仍可进行有效检测。
研究结果表明，芯片与CSFV、PRRSV、JEV、PRV检测结果均为阴性，PPV、PCV2各靶基因 之间也无交叉反应；PPV-NS1和PCV2-ORF2探针基因的灵敏性分别为：11.7pg/ul和13.2pu/ul，均 较PCR灵敏性高10倍；芯片在保存120天后仍可进行有效检测。
实施例2 采用本发明可视化基因芯片和试剂盒对实际样品进行检测
1、临床样本：采自四川成都、广安、乐山、德阳、安岳、攀枝花等地疑似猪繁殖障碍性疾病病猪 的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织。
2、检测方法
采集四川、重庆、福建、贵州、甘肃等地103份临床样本的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结的 病变部位，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取病毒基因组，按照实施例1的方法进 行检测。
3、检测结果
结果如下表所示：
表1：临床样本检测结果
PPV、PCV2的阳性率分别为8.7％、78.6％，PPV+PCV2为8.7％。
实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测能联合共检PPV和PCV2等病原。
综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测PPV和PCV2，具有特异性好、灵敏性高和保存期 长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，具有良好的应用前景。