技术领域
本发明涉及一种利用融合表达提高酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。
背景技术
葡萄糖二酸及其衍生物是自然界存在的一种无毒成分，在一些植物及哺乳动物中均有发 现，特别是在一些十字花科蔬菜、苹果和柑橘类水果中含量丰富。葡萄糖二酸具有重要的生 理功能，广泛的应用于食品、化工、医药等领域，被美国能源部确定为“最有价值的生物炼制 产品”。它可以降低胆固醇、用于糖尿病的治疗，预防及辅助治疗癌症，同时其钙盐也是一种 食品添加剂。葡萄糖二酸又是羟基化尼龙、聚酰胺类聚合物的基本聚合单位，可用于合成环 保型的可降解聚合物，用于洗涤剂中替代磷酸盐的使用等。葡萄糖二酸其结构与单糖结构相 似，可以通过糖转运系统进入细胞内部，能够在病灶部位聚集，并少量被缺血组织快速吸收， 因此可以作为显像剂应用于心肌梗死和肿瘤的研究中。
目前葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法，如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物 (TEMPO)及其衍生物为催化剂的共催化氧化及光催化氧化等。硝酸氧化法主要是以葡萄糖 为原料，通过硝酸氧化为葡萄糖二酸及其小分子物质。此种方法生成的产物较多，副产物复 杂，同时产生大量气体，其反应废液对环境产生污染，因此逐渐被新方法取代。TEMPO氧化 体系对糖类伯羟基的氧化选择性高、反应条件温和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水溶液 易形成葡萄糖1，4-内酯及葡萄糖6,3-内酯，所以在制备过程中以制得单钾盐为最终产物。此 方法所用TEMPO可回收利用，产物纯化容易，便于操作，是目前常用的一种方法。但是由 于反应过程中的反应温度及pH不易控制，因此仍然需要改进。
由于化学法所存在的局限较多，通过生物法来制备葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。 葡萄糖二酸是存在于哺乳动物的代谢途径中，它与抗坏血酸是葡萄糖醛酸代谢途径的终产物。 然而，从D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。Prather等通过重组大肠 杆菌，分别从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和小鼠体内获取肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1) 和肌醇氧化酶(MIOX)，从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)获得醛酸脱氢酶基因，克 隆到大肠杆菌中，实现了葡萄糖二酸的生物合成。发明人之前通过构建重组酵母菌株，表达 肌醇氧化酶(MIOX)及醛酸脱氢酶(Udh)成功实现了葡萄糖二酸的生成。但是葡萄糖二酸 还有待提高。
本发明采用融合酶的分子设计策略，将醛酸脱氢酶(Udh)融合在肌醇氧化酶(MIOX) 的N端，采用的构建方式为直接融合及通过添加连接肽进行融合。本发明中构建的新型重组 工程菌进一步提高了葡萄糖二酸的产量，为高产葡萄糖二酸提供了新的思路。
发明内容
本发明通过将肌醇加氧酶基因(miox)及醛酸脱氢酶基因(udh)通过融合，克隆表达至 酵母菌株中，构建重组酵母，该重组酵母菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡 萄糖二酸。
本发明的第一个目的是提供一种重组酵母菌，该重组酵母菌融合表达肌醇加氧酶MIOX 和醛酸脱氢酶Udh。
所述肌醇加氧酶基因miox，在本发明的一种实施方式中，来源于以下任意一种：小鼠 (mouse)、毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、白假丝酵母(Candida albicans)。
所述醛酸脱氢酶基因udh，在本发明的一种实施方式中，来源于恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)。
所述肌醇加氧酶和醛酸脱氢酶，在本发明的一种实施方式中，醛酸脱氢酶是NCBI上登 录号为BK006380的酶；肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
所述肌醇加氧酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，是将醛酸脱氢酶基因udh融合在肌醇加氧 酶基因miox的N端。
所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，是直接融合表达或者使用连接肽进行融合 表达，即将两个酶的编码基因首尾相连(去掉第一个酶的终止密码子)直接融合，或者通过 连接肽将两个酶的编码基因融合。
所述连接肽，在本发明的一种实施方式中，为GGGGS，GGGGSGGGGS， GGGGSGGGGSGGGGS，EAAAK,EAAAKEAAAK，EAAAKEAAAKEAAAK，PTPTP， PTPTPTPTP，PTPTPTPTPTPTPTP及SSSNNNNNNNNNN。优选GGGGS、 EAAAKEAAAKEAAAK。
所述连接肽，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2 所示的序列。
所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，融合基因前有毕赤酵母组成型启动子GAP。
所述重组酵母菌，在本发明的一种实施方式中，其出发宿主菌为以下任意一种：酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。 优选毕赤酵母。
所述肌醇加氧酶基因miox和醛酸脱氢酶基因udh，在本发明的一种实施方式中，为游离 表达或者整合表达。优选整合表达。
本发明的第二个目的是提供一种所述重组毕赤酵母菌的构建方法，是将GAP启动子、udh 基因及miox基因按照顺序融合，然后连接到表达载体上，再转化到毕赤酵母、酿酒酵母或解 脂假丝酵母中得到的。
所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，还包括在udh基因和miox基因之间添加不 同的连接肽。
所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是(1)或(2)中的任意一种：
(1)：以恶臭假单胞菌(P.putida)的基因组为模板扩增udh基因，以pGAPZB质粒为 模板扩增GAP启动子，以pUC57-MIOX质粒为模板扩增miox基因，将GAP启动子、udh 基因及miox基因按照顺序融合(去除udh的终止密码子)，并在融合片段上下游分别引入了 酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒， 命名为pPIC9KGAP-Udh-MIOX，将重组质粒转化到宿主P.pastoris GS115中即得到P.pastoris GS115-(Udh-MIOX)；
(2)按照(1)中方法扩增GAP启动子、udh基因及miox基因，设计引物时在Udh的 下游引物，及MIOX的上游引物中引入不同的连接肽的核苷酸序列，将GAP启动子、udh基 因及miox基因按照顺序融合，并在udh基因及miox基因之间引入不同的连接肽，在融合片 段上下游分别引入了酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选 获得正确的重组质粒，将重组质粒转化到宿主P.pastoris GS115中即得到重组酵母菌。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，所述方法 是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是采用摇瓶发酵培养或者发酵罐发酵培养。
所述摇瓶发酵培养，在本发明的一种实施方式中，是将重组酵母菌种子液以5％-10％的 接种量接种到发酵培养基中，25℃-30℃，180-220rpm培养24-96h。
所述发酵罐发酵培养，在本发明的一种实施方式中，是将重组酵母菌种子液以5％-10％ 的接种量接种到发酵培养基中，25℃-30℃，600rpm-1000rpm，通气量1-4vvm，控制pH 5-6， 培养24h—144h。
所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，其碳源为葡萄糖和/或肌醇。
所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，为含有10g/L肌醇的YPD培养基。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是，摇瓶发酵培养时，将种子培养液按10％ 接种量接种到发酵培养基中，温度为30℃，搅拌转速为220rpm，发酵培养96h。3L罐发酵 培养时，将种子培养液按10％接种量接种到含有发酵培养基的3L发酵罐中，温度为30℃， 控制搅拌转速为800-1000rpm，通气量3vvm，用50％(v/v)的氨水控制pH 5.5，发酵培养 132小时。
本发明的第四个目的是提供一种提高重组酵母菌发酵生产葡萄糖二酸的方法，所述方法 是在酵母中融合表达肌醇加氧酶MIOX和醛酸脱氢酶Udh。
所述融合表达是将醛酸脱氢酶基因udh融合在肌醇加氧酶基因miox的N端；所述融合 表达是直接融合表达或者使用连接肽进行融合表达。所述连接肽为GGGGS或 EAAAKEAAAKEAAAK。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过融合表达的方法，将醛酸脱氢酶基因udh融合在肌醇加氧酶基因miox 的N端，得到了一系列葡萄糖二酸产量提高的重组酵母菌。本发明所用融合酶的设计策略可 以使多个蛋白酶集成于一体，在顺序催化反应中可以强化中间产物在两个酶或多酶之间的传 递过程，减少中间产物的其他副反应的竞争，减少中间体不稳定性导致的降解，更重要的是 增加中间产物在催化活性中心附近的局部浓度，从而加速整个顺序催化过程。通过在两个酶 之间引入连接肽，可以将两个酶的结构域适当的隔开，从而避免了不同结构域在折叠、催化 等过程中的干扰。
(2)重组菌株P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX、P.pastoris GS115-(Udh-MIOX)、P. pastoris GS115-Udh-(EAK)3-MIOX产葡萄糖二酸的量分别为944.67mg/L、921.30mg/L及 930.63mg/L，相比为融合表达的对照菌株(777.13mg/L)，分别提高了21.6％、18.6％、19.8％。 同时P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX在含有肌醇的培养基的发酵罐中培养时，葡萄糖二酸 产量可达6.02g/L。
附图说明
图1：采用不同融合方式重组毕赤酵母摇瓶发酵产葡萄糖二酸；Control为对照未融合菌株P. pastoris GS115-Udh-MIOX；B为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-(Udh-MIOX)；C为重 组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX；D为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)2-MIOX；E为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)3-MIOX；F为重组 毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-EAK-MIOX；G为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(EAK)2-MIOX；H为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(EAK)3-MIOX；I为 重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(PT)2P-MIOX；J为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(PT)4P-MIOX；K为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(PT)7P-MIOX；L为重 组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-S3N10-MIOX；
图2：重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX在3L发酵罐上发酵产葡萄糖二酸结 果(培养基中不添加肌醇)；
图3：重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX在3L发酵罐上发酵产葡萄糖二酸结 果(培养基中添加肌醇)。
具体实施方式
实施例1重组毕赤酵母P.pastoris GS115-(Udh-MIOX)的构建
以pGAPZB质粒为模板，以G-U-1-F，G-U-1-R为引物扩增GAP启动子，以恶臭假单胞 菌(PseudomonasputidaKT2440)基因组为模板，以G-U-2-F、U-M-1R为引物扩增udh基因， 同时以pUC57-MIOX质粒为模板，以U-M-2F、U-M-2R为引物扩增miox基因。使用融合 PCR方法，将GAP启动子、udh基因、miox基因融合，通过引物在融合片段上下游分别引入 酶切位点SacI和NotI。通过对融合片段双酶切，连接至具有相应切口的表达载体pPIC9K上， 转化至E.coli JM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPIC9KGAP- (Udh-MIOX)，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SacI线性化后电转入表达宿 主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确，命名为P.pastoris GS115-(Udh-MIOX)， 即为直接融合表达udh基因、miox基因的重组酵母菌。
实施例2含有不同连接肽的融合重组毕赤酵母的构建
以pGAPZB质粒为模板，以G-U-1-F，G-U-1-R为引物扩增GAP启动子，以恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putidaKT2440)基因组为模板，以G-U-2-F为正向引物，分别以U-G1-M-1 R、U-G2-M-1R、U-G3-M-1R、U-E1-M-1R、U-E2-M-1R、U-E3-M-1R、U-P2-M-1R、U-P4-M-1 R、U-P7-M-1R、U-G2-M-1R为反向引物扩增udh基因，同时以pUC57-MIOX质粒为模板， 分别以U-G1-M-2F、U-G2-M-2F、U-G3-M-2F、U-E1-M-2F、U-E2-M-2F、U-E3-M-2F、 U-P2-M-2F、U-P4-M-2F、U-P7-M-2F、U-S3N10-M-2F为正向引物，以U-M-2R为反向引 物，扩增miox基因。通过设计Udh的下游引物，及MIOX的上游引物，引入不同的连接肽。 使用融合PCR方法，将GAP启动子、udh基因、miox基因融合，通过引物在融合片段上下 游分别引入酶切位点SacI和NotI。通过对融合片段双酶切，连接至具有相应切口的表达载体 pPIC9K上，转化至E.coli JM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒，经 DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SacI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115 中，重组克隆子经PCR验证正确，得到相应的重组菌株。
表1为实施例1、2中用到的引物。
表1引物
实施例3不同融合方式重组毕赤酵母摇瓶发酵生产葡萄糖二酸
将不同的重组菌进行摇瓶发酵培养。单克隆接种于25ml的YPD培养基(酵母提取物10g/L, 蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24h。按10％接种量接种至50ml(摇瓶容 量为500ml)发酵培养基YPD-MI培养基(YPD培养基中加入10g/L肌醇)中发酵，培养96 小时。培养结束后，取1ml发酵液在8000rpm下离心5min，取上清经Affi-Gel凝胶处理后， 将发酵液中的大部分杂质都去除，将处理后的样品经0.22um滤膜过滤，通过HPLC检测产物。 图1为采用不同融合方式重组毕赤酵母生产葡萄糖二酸的情况，其中对照菌株为游离表达Udh 及MIOX的菌株。由图可以看出，相比对照菌株(777.13mg/L)，重组菌株P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX产量最高，为944.67mg/L，重组菌株P.pastoris GS115-(Udh-MIOX) 及P.pastoris GS115-Udh-(EAK)3-MIOX产量也有所提高，分别为921.30mg/L及930.63mg/L。
实施例4重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX在3L发酵罐上生成葡萄糖二酸 的情况
接种单菌落于500ml(装液量50ml)的YPD培养基中，30℃，220rpm培养24-30h， 将种子培养基以10％的接种量接种到含有1L发酵培养基的3L发酵罐中，同时进行两个发酵 罐的操作，以葡萄糖作为碳源，在其中一个发酵罐中添加肌醇，另一个发酵罐则不添加肌醇。 温度为30℃，控制搅拌转速为800-1000rpm，通气量3vvm，用50％(v/v)的氨水控制pH 5.5， 发酵培养132小时。图2、图3为重组毕赤酵母P.pastoris GS115-Udh-(GS)1-MIOX在3L发 酵罐上生成葡萄糖二酸的情况，其中图2为在不添加肌醇的培养基中生成葡萄糖二酸的情况， 由图2可见，在不添加肌醇时，葡萄糖二酸产量较低，发酵132h后，葡萄糖二酸产量为107.02 mg/L。图3为在添加肌醇的培养基中，葡萄糖二酸产量较高，发酵132h后，葡萄糖二酸产 量为6.02g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。