技术领域
本发明属于干细胞领域，尤其涉及一种铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法及其用途。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，被称为“万用细胞”。衰老是一个复杂的生物学过程，除受基因的调控、疾病、不良生活习惯及社会心理负荷的影响外，还受环境因素的影响。目前，对皮肤不良作用的环境因素主要有日光中的紫外线和红外线、香烟烟雾和空气污染等，其中紫外线的影响尤为显著，可以加速生理衰老的过程。近年来，瑞士科学家发现了一种苹果干细胞具有激活休眠细胞、修复受损细胞和促进细胞再生的功能，从而达到延缓皮肤衰老的效果，为植物干细胞在延缓衰老的研究领域中奠定了基础。
铁皮石斛是兰科石斛属植物，为兰科多年生附生草本植物。铁皮石斛干细胞含有较多的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等高活性酶；因此，铁皮石斛干细胞具有较强的抗氧化的作用，是一种纯天然、环保、无污染的抗衰老植物干细胞。
然而，由于植物细胞培养技术在培养期间无法维持稳定的，较快的细胞增殖与高的代谢产物的问题，限制了铁皮石斛抗衰老植物干细胞的应用。为了解决该问题，中国专利申请201410486185.1公开了一种铁皮石斛干细胞及其分离培养方法，该方法是从铁皮石斛根尖静止中心的细胞系开始培养，获得稳定遗传的植物干细胞进行培养，该培养方法解决了铁皮石斛离体材料易褐化的问题，由于其干细胞系的细胞尚未分化，具有细胞活性强的优点；但是，静止中心的干细胞具有较长的细胞周期，细胞培养需要较长的时间，不能维持稳定的，较快的细胞增殖，无法满足植物细胞培养技术的产业化生产。因此，研究一种细胞培养周期短，细胞增殖速度快的铁皮石斛细胞培养技术推动植物干细胞的应用是亟需解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术铁皮石斛植物细胞培养技术细胞培养周期长，细胞增殖速度慢的缺陷，本发明的目的是提供一种铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法及其用途，以解决以上缺陷。
本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.取切除根冠的铁皮石斛根尖，清洗，消毒；
S2.将步骤S1得到的铁皮石斛根尖切成5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌、柠檬酸、甘氨酸、α-萘乙酸、蔗糖、活性炭和琼脂的固体培养基上，培养温度为25-29℃，pH值为6-6.5，培养20-30天，得形成层来源的铁皮石斛干细胞；
S3.将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至含有硫酸锌、柠檬酸、甘氨酸、α-萘乙酸、蔗糖、麦饭石颗粒和硒矿石颗粒的液态培养基中培养；
S4.将步骤S3培养收集的形成层来源的铁皮石斛干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤S3的液态培养液，在常温下不断搅拌，培养至第10天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水；
S5.将步骤S4的气升式生物反应器内的培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-75~-85℃超低温冷冻2-3h，取出解冻30-40min，重复3-5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，得到铁皮石斛干细胞提取物；
S6.往步骤S5中的铁皮石斛干细胞提取物加水调节蛋白质的终浓度为50±0.5μg/ml，加入铁皮石斛干细胞提取物总质量的4-6%的甘露醇，灭菌，在温度为-20～-35℃，真空度为50～200Pa中冻干，制得铁皮石斛干细胞冻干粉。
其中，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述步骤S2中固体培养基成的分含量为硫酸锌2-3 mg/L、柠檬酸77-83mg/L、甘氨酸79-84mg/L、α-萘乙酸2-2.8 mg/L、蔗糖10.5-11.5mg/L、活性炭460-540mg/L和琼脂2.8-3.5mg/L。
进一步的，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述的步骤S3中液体培养基成分的含量为硫酸镁181-183mg/L、柠檬酸77-82 mg/L、甘氨酸76-84mg/L、α-萘乙酸3.3-4.5mg/L、蔗糖32-34 mg/L、麦饭石颗粒65-75 mg/L和硒矿石颗粒65-75 mg/L。
进一步的，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述步骤S4中蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水混合液是气升式生物反应器内培养液的体积比为0.8-1:1。
更进一步的，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，所述步骤S5中过滤器的滤芯孔径是1-3μm。
本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法在培养过程中无细胞变异，分离培养的铁皮石斛干细胞纯度高，可以达到95%以上，有利于该铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法的推广和应用。
另外，本发明制得的铁皮石斛干细胞冻干粉在制备抗衰老护肤品中的用途。
其中，所述的抗衰老护肤品可以制成精华素、乳液、爽肤水、面霜、眼霜和面膜；本发明制得的铁皮石斛干细胞冻干粉制备的抗衰老护肤品优选制成眼霜。
本发明提供的一种抗衰老眼霜，所述眼霜包括以下组分：
A相：丙二醇1-4g、丙三醇2-6g、丁二醇1-5g、卡波0.1-0.6g和水50-70g；
B相：二甲基硅氧烷0.5-2g、辛酸癸酸三甘油酯1-4g、棕榈酸异丙酯1-4g、合成角鲨烷1-3g、鲸蜡硬酯醇醚2-6g；
C相：如权利要求1所述的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法制得的铁皮石斛干细胞冻干粉8-15ng、聚合杏仁蛋白1-3g、富醚斯金0.5-2g、防腐剂0.1-0.5g和水10-20g；
D相：三乙醇胺0.2-0.4g。
优选地，本发明提供的抗衰老眼霜包括以下组分：
A相：丙二醇2g、丙三醇4g、丁二醇3g、卡波0.35g和水60g；
B相：二甲基硅氧烷1g、辛酸癸酸三甘油酯3g、棕榈酸异丙酯3g、合成角鲨烷2g、鲸蜡硬酯醇醚3.5g；
C相：如权利要求1所述的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法制得的铁皮石斛干细胞冻干粉10ng、聚合杏仁蛋白2g、富醚斯金1g、防腐剂0.2g和水10g；
D相：三乙醇胺0.35g。
进一步地，本发明提供的抗衰老眼霜，所述的卡波为卡波940。
进一步地，本发明提供的抗衰老眼霜，所述的鲸蜡硬酯醇醚由鲸蜡硬酯醇醚-2和鲸蜡硬酯醇醚-21按质量比为1-2.5:1-3混合组成。其中鲸蜡硬酯醇醚-2和鲸蜡硬酯醇醚-21购于巴斯夫股份公司（BASF SE），鲸蜡硬酯醇醚-2的型号是BRIJ721，鲸蜡硬酯醇醚-21的型号是BRIJ721。
进一步地，本发明提供的抗衰老眼霜，所述的防腐剂为Euxyl K100。其中Euxyl K100购于德国舒美有限公司，Euxyl K100的成分为苯甲醇、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮；该Euxyl K100防腐剂对细菌，酵母菌和霉菌具有广谱均衡的抑制功效，可以有效延长产品的保质期。
另外，本发明还提供了一种抗衰老眼霜的制备方法，包括以下步骤：
将A相组分和B相组分分别加入锅中，加热至70-80℃，搅拌至完全溶解，并将A相加入B相中混合，放入均质机中均质3~5min，冷却至50-30℃；将C相组分混合搅拌至完全溶解；将C相和D相加入A相和B相的混合液中，均质即得。
相对于现有技术，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法，具有以下优点：
（1）本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法具有细胞培养周期短，细胞增殖速度快的优点；
（2）本发明制得的铁皮石斛干细胞冻干粉具有激活休眠细胞、修复受损细胞和促进细胞再生的作用，对人体皮肤具有抗老化及延长细胞寿命的效果；
（3）本发明制得的抗衰老眼霜对眼部的鱼尾纹、眼袋、皮肤松弛具有显著的改善作用。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
实施例1、铁皮石斛干细胞冻干粉的制备
S1.取切除根冠的铁皮石斛根尖，用水清洗2h后用浓度为70%酒精表面消毒10s，无菌水冲洗3次；再用浓度0.1%升贡溶液消毒10min，无菌水冲洗3次，备用；
S2.将步骤S1消毒后的铁皮石斛根尖切成5mm*5mm大小，每瓶1块，接种至含有 2mg/L硫酸锌、77 mg/L柠檬酸、79mg/L甘氨酸、2mg/L α-萘乙酸、10.5mg/L蔗糖、460 mg/L活性炭和2.8 mg/L琼脂的固体培养基上，培养温度为25℃，pH值为6，培养20天，得形成层来源的铁皮石斛干细胞；
S3.将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至含有 181mg/L硫酸镁、 77mg/L柠檬酸、76 mg/L甘氨酸、3.3 mg/Lα-萘乙酸、32 mg/L蔗糖、65 mg/L麦饭石颗粒和 65mg/L硒矿石颗粒的液态培养基中培养；
S4.将步骤S3培养收集的铁皮石斛干细胞移入10L气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤S3的液态培养基，在25℃不间断搅拌，在培养至第10天，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，该混合液的添加量与气升式生物反应器内培养液体积比为0.8:1
S5.将步骤S4气升式生物反应器内的培养液通过1μm过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-75℃超低温冷冻2h，取出解冻30min，重复3次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，得铁皮石斛干细胞提取物；
S6.往步骤S5中的铁皮石斛干细胞提取物加入水，调节至蛋白终浓度为50.5μg/ml，加入铁皮石斛干细胞提取物总质量的4%的甘露醇，除菌、在温度为-20℃，真空度为50Pa中冻干48小时，即得。
实施例2、铁皮石斛干细胞冻干粉的制备
S1.取切除根冠的铁皮石斛根尖，用水清洗3h后用浓度为75%酒精表面消毒15s，无菌水冲洗4次；再用浓度0.1%升贡溶液消毒10min，无菌水冲洗4次，备用；
S2.将步骤S1消毒后的铁皮石斛根尖切成5mm*5mm大小，每瓶1块，接种至含有2.5mg/L硫酸锌、80mg/L柠檬酸、82mg/L甘氨酸、2.5mg/L α-萘乙酸、11mg/L蔗糖、500mg/L活性炭和3mg/L琼脂的固体培养基上，培养温度为27℃，pH值为6.5，培养25天，得到形成层来源的铁皮石斛干细胞；
S3.将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至含有182mg/L硫酸镁、80mg/L柠檬酸、80mg/L甘氨酸、4mg/Lα-萘乙酸、33mg/L蔗糖、70mg/L麦饭石颗粒和70mg/L硒矿石颗粒的液态培养基中培养；
S4.将步骤S3培养收集的铁皮石斛干细胞移入10L气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤S3的液态培养基，在25℃不间断搅拌，在培养至第10天，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，该混合液的添加量与气升式生物反应器内培养液体积比为0.9:1；
S5.将步骤S4气升式生物反应器内的培养液通过1μm过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃超低温冷冻2h，取出解冻35min，重复4次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，得铁皮石斛干细胞提取物；
S6.往步骤S5中的铁皮石斛干细胞提取物加入水，调节至蛋白终浓度为50μg/ml，加入铁皮石斛干细胞提取物总质量的5%的甘露醇，除菌、在温度为-25℃，真空度为100Pa中冻干48小时，即得。
实施例3、铁皮石斛干细胞冻干粉的制备
S1.取切除根冠的铁皮石斛根尖，用水清洗4h后用浓度为75%酒精表面消毒10s，无菌水冲洗5次；再用浓度0.1%升贡溶液消毒10min，无菌水冲洗5次，备用；
S2.将步骤S1消毒后的铁皮石斛根尖切成5mm*5mm大小，每瓶1块，接种至含有3mg/L硫酸锌、83mg/L柠檬酸、84mg/L甘氨酸、2.8mg/L α-萘乙酸、11.5mg/L蔗糖、540mg/L活性炭和3.5mg/L琼脂的固体培养基上，培养温度为29℃，pH值为6.5，培养30天，得到形成层来源的铁皮石斛干细胞；
S3.将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至含有183mg/L硫酸镁、82mg/L柠檬酸、84mg/L甘氨酸、4.5mg/Lα-萘乙酸、34mg/L蔗糖、75mg/L麦饭石颗粒和75mg/L硒矿石颗粒的液态培养基中培养；
S4.将步骤S3培养收集的铁皮石斛干细胞移入10L气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤S3的液态培养基，在25℃不间断搅拌，在培养至第10天，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，该混合液的添加量与气升式生物反应器内培养液体积比为0.9:1；
S5.将步骤S4的气升式生物反应器内的培养液通过1μm过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-85℃超低温冷冻3h，取出解冻40min重复5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，将滤液浓缩，得铁皮石斛干细胞提取物；
S6.往步骤S5中的铁皮石斛干细胞提取物加入水，调节至蛋白终浓度为50.5μg/ml，加入铁皮石斛干细胞提取物总质量的6%的甘露醇，除菌、在温度为-35℃，真空度为200Pa中冻干48小时，即得。
实施例4-6、本发明提供的一种抗衰老眼霜
实施例4、实施例5和实施例6一种抗衰老眼霜包括以下组分及其重量份：
其中，C相中的铁皮石斛干细胞冻干粉是根据权利要求1所述的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法制得的。
抗衰老眼霜的制备方法，包括以下步骤：
将A相组分和B相组分分别加入锅中，加热至70-80℃，搅拌至完全溶解，并将A相加入B相中混合，放入均质机中均质3~5min，冷却至50-30℃；将C相组分混合搅拌至完全溶解；将C相和D相加入A相和B相的混合液中，均质即得。
试验例一、铁皮石斛干细胞冻干粉的纯度测定试验：
1、试验材料：本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的铁皮石斛干细胞冻干粉。
2、试验方法：采用高效液相色谱法，色谱柱采用C18，以A相：三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀，B相：三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀为流动相，在室温条件下，采用0-70%B相溶液进行梯度洗脱，上样量为10ug,在波长280nm处检测，按面积归一化法计算。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1 铁皮石斛干细胞冻干粉的纯度测定数据 实施例1实施例2实施例3铁皮石斛干细胞冻干粉纯度（%）95.8%99.2%96.6%
由上述表1可知，本发明提供的铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法在培养过程中无细胞变异，分离培养的铁皮石斛干细胞纯度高，可以达到95%以上，有利于该铁皮石斛干细胞冻干粉的制备方法的推广和应用。
试验例二、铁皮石斛干细胞冻干粉体外抗光老化试验
1、试验对象：紫外损伤人真皮成纤维细胞（HDF细胞）。
2、试验材料：实施例2制备的铁皮石斛干细胞冻干粉。
3、试验方法：
（1）分组：将标有对照组、模型组、阳性对照组、试验1组、试验2组的5个细胞培养瓶中接种人真皮成纤维细胞进行培养，当人真皮成纤维细胞生长至80%融合时，其中对照组用锡纸包住细胞培养瓶，其余4组不做任何处理，将这5个细胞培养瓶用UVA紫外线照射HDF细胞，每天照射2h，照射4天。在显微镜下观察HDF细胞的形态，发现HDF细胞开始出现皱缩，个别细胞漂浮在培养基中；第五天，试验1组加入铁皮石斛干细胞冻干粉使蛋白终浓度分别为10μg/ml，试验2组加入铁皮石斛干细胞冻干粉使蛋白终浓度分别为20μg/ml，阳性对照组加入20μg/ml的维生素C，继续培养48h，收集HDF细胞；
（2）测试铁皮石斛干细胞冻干粉对HDF细胞内SOD酶活性的影响：胰酶消化后，细胞在1500g、4℃条件下离心10min。细胞沉淀悬浮在遇冷的50mM的Tris–HCl、5 mM EDTA和1 mM DTT缓冲液中进行超声，裂解液在10000g、4℃条件下离心10min，上清利用SOD检测试剂盒根据其说明方法进行分析。
4、试验结果：
试验结果如表2所示。
表2 铁皮石斛干细胞冻干粉体HDF细胞内SOD酶活性的影响
其中与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
试验例三、铁皮石斛干细胞冻干粉对紫外线引起小鼠皮肤光老化的影响试验
1、试验对象：选取50只SPF级雌性昆明小鼠，体重为22±2g。
2、试验材料：实施例2制备的铁皮石斛干细胞冻干粉。
3、试验方法：
3.1 动物饲养：将龄SPF级雌性昆明小鼠适应性饲养一周后，剔除小鼠背部毛，裸露的皮肤约2cm2，进行试验，试验过程中正常给水和饲料。
3.2 试验分组：将SPF级雌性昆明小鼠随机分为五组，分别为对照组、模型组、阳性对照组、试验1组、试验2组，每组10只，各组分别进行如下操作：
对照组：小鼠裸露的皮肤不作任何处理，正常饲养；
模型组：小鼠裸露的皮肤紫外照射，正常饲养；
阳性对照组：小鼠裸露的皮肤涂抹用生理盐水配置维生素C的浓度为20μg/ml，涂抹量为lml/只，1次/天，进行紫外照射，正常饲养；
试验1组：小鼠裸露的皮肤涂抹用生理盐水溶解配置实施例2制备的的铁皮石斛干细胞冻干粉的浓度为10μg/ml，涂抹量为lml/只，1次/天，进行紫外照射，正常饲养；
试验2组：小鼠裸露的皮肤涂抹用生理盐水溶解配置实施例2制备的的铁皮石斛干细胞冻干粉的浓度为20μg/ml，涂抹量为lml/只，1次/天，进行紫外照射，正常饲养。
紫外线照射的具体操作是对小鼠给药1h后进行照射，第一周每天照射1h，第二周每天照射2h，第三周每天照射3h，从第4周开始每天照射4h，总共照射42天；紫外线的强度为：UVA：0.25mJ/cm2/s，UVB：02mJ/cm2/s；待照射完成后，将小鼠处死，进行各项指标的检测；对小鼠进行放血，血清在2500g、4℃条件下离心4min，取上清进行各项指标的检测。
3.3 检测项目：
对小鼠进行放血，在2500g、4℃条件下离心4min，收集上清，检测小鼠血浆中SOD酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）及丙二醛（MDA）含量；其中，SOD的活性，GPx的活性以及MDA的含量利用南京建成生物工程研究所购买的诊断试剂盒测定分析。
4、试验结果：
试验结果如表3所示。
表3 铁皮石斛干细胞冻干粉对紫外线引起小鼠皮肤光老化的影响数据
其中与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
试验例四、抗衰老眼霜的产品安全性评价（人体皮肤斑贴试验）
1.1试验品
实施例5制备的抗衰老眼霜
1.2受试人群
数目：50人
年龄：18-48岁之间
性别：女
健康状况：受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。
1.3斑贴方法：
选用合格的斑贴器，以封闭式斑贴试验方法，将试验品约0.20-0.25mL滴于斑贴器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，24小时后去除试验品，分别去除后0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。
1.4试验结果
本试验50名受试者通过本发明实施例5制备的抗衰老眼霜的斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，其中0例出现皮肤不良反应，说明本发明抗衰老眼霜使用安全。
试验例五、抗衰老眼霜的抗衰老效果
1.1试验品：
实施例5制备的抗衰老眼霜
1.2受试人群
数目：50人
年龄：18-48岁之间
性别：女
健康状况：受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。
1.3测试方法：
受试者脸部清洁后，将实施例5制备的抗衰老眼霜涂覆到眼部周围，观察和感受使用效果。
1.4测试评估结果如下：
表4 实施例5制备的抗衰老眼霜的试用（8周）反馈总结表
测试者均表示，实施例5制备的抗衰老眼霜，使用后不粘腻，吸收快，皮肤迅速饱满水润。长期使用后，可以有效提高肌肤含水量，增强肌肤保湿力和皮肤弹性；同时具有淡化眼部鱼尾纹、黑眼圈和消除眼袋的效果。而且使用者均为出现过敏现象，是一种安全、刺激性低的抗衰老眼霜。