技术领域
本发明涉及基因芯片领域的一种耳聋基因筛查芯片。
背景技术
耳聋是最常见的感觉神经性疾病，它不仅是造成听力残疾、影响人类身心健康的疾病，而且给患者的 生活、家庭、工作和学习中的交流带来极大的不便。与此同时，耳聋也给社会带来了沉重的负担。据报道， 全球有2.5亿人患有中度以上听力损失。在5岁之前，感音神经性耳聋患病率为2.7，到青春期时增加 至3.5，每500个新生儿中有一个新生儿具有双侧永久性感音神经性听力损失在40dBHL以上。中国每年 约有3万先天性聋儿出生。据2006年第二次全国残疾人抽样调查显示，我国现有听力残疾人约2004万， 占残疾人总数的24.16％，为残疾类疾病之首。其中，约有超过800万的聋哑患者。
耳聋的临床表现为听觉下降或完全听不到声音，伴或不伴有哑症。可分为感音神经性聋和传导性聋， 两者均可以表现为先天性和后天性，但先天性聋和遗传性聋无必然联系。根据是否合并其他系统疾病，可 将耳聋分为综合征型耳聋与非综合征型耳聋。目前已证实的与听力损失相关的综合征约有400多种.其中 较为常见且致病基因比较明确的综合征包括Pendred综合征(SLC26A4)、USHER综合征(MYO7A、USH2A等 基因)、Waardenburg综合征(PX3、MITF、SOXIO等基因)、BOR综合征(EYAl、SIXI等基因)等。耳聋的致 病因素可分为环境因素和遗传因素，也可两者共同作用。环境因素致聋如外伤性聋、噪声性聋、药物中毒 性聋、医疗因素致聋等，遗传因素是指耳聋可能由单一基因的一个突变或不同基因的多个突变所致，据统 计50％先天性聋与遗传因素有关。
现阶段耳聋遗传学研究表明，人类23对染色体中的22对都分布有耳聋遗传位点，线粒体基因也与耳 聋相关。约有半数的先天性耳聋与遗传因素有一定联系。据估计，遗传性聋中77％为常染色体隐性遗传，2 2％为常染色体显性遗传，1％为性染色体相关，少于1％的遗传性聋与线粒体基因母系遗传相关。虽然，佩戴 助听器、植入人工耳蜗等多种手段可以帮助部分患者提高或恢复听力功能，但这些手段并未从根本上解决 耳聋的病因及预防相同表型后代的出现。多项调查显示，患者本身及家属迫切希望可以找到致聋根本病因、 并针对病因进行治疗，从而达到恢复听力的效果，而且希望通过恰当的产前诊断方式避免耳聋后代的产生。 然而，减少耳聋的发生重在早期的预防与干预，对于环境因素导致的耳聋，可以通过预防感染、加强孕期 围产期保健、避免应用耳毒性药物等措旌有效地预防；但对于遗传性耳聋的预防，明确耳聋病因是关键。 因此，耳聋的基因诊断对于家庭和国家、社会均具有重大的意义。基因序列的发展及新技术的涌现为遗传 性耳聋患者带来了希望的曙光。但是，通往遗传性耳聋的基因诊断的道路依旧充满艰辛，原因如下：第一， 遗传因素筛选范围广。迄今为止，已成功定位的非综合征型耳聋(Non-syndromic hearing loss，NSHL) 基因位点(locus)共133个，包括：常染色体显性聋(Non-syndromic dominant heredity deafness，DFNA) 54个、常染色体隐性聋(Non-syndromic dominant heredity deafness，DFNB)71个、X-连锁聋(Non-synd romic X-linked deafness，DFN)5个、修饰基因(Non-syndromic modified heredity deafness，DFNM)2 个和Y-连锁聋(Non-syndromic Y-linked deafness，DFNY)1个；克隆致病核基因62个，其中DFNA相关 基因27个，DFNB相关基因40个，DFN相关基因3个，部分基因同时为DFNA与DFNB。另外发现2个线粒 体基因与NSHL相关(http：//hereditaryhearingloss.org/)。但仍然有部分耳聋基因尚未明确，遗传学 家推测存在100余个基因与非综合征型耳聋相关。第二，遗传性耳聋具有高度的遗传异质性。表型一致的 个体可能具有完全不同的致病基因型，反之亦然。随着单基因病的深入研究，科学家们逐渐发现：简单疾 病和复杂疾病之间的界限并不明显，具有高度遗传异质性的疾病的表型和基因型并未表现为一对一的 关系，部分单基因疾病也并未按照孟德尔遗传定律的显/隐性遗传。第三，遗传性耳聋的临床表型复杂。 耳聋及其他临床症状的始发年龄(语前聋、语后聋)、主要病情特征(综合征型、非综合征型)、病程进展 (突发型、缓慢进展型)、预后情况(不同基因型导致的耳聋患者人工耳蜗效果不同)及复发风险等具有 差异，甚至还可区分为其他不同亚型，无法根据临床表型判断疾病病因。第四，现有的基因诊断手段有限。 目前，传统基因诊断方法包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、核酸限制性片段长 度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、扩增片段多态性连锁分析(Ampli fied fragment length polymorphism，AFLP)、等位基因特异寡核苷酸(Allele specific oligonucleot ide，ASO)探针诊断、直接测序法等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更 重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。因此有必要建立一种高通量、高效率的 基因突变检测方法，以实现临床快速检测或大规模人群筛查。由于以上种种原因，过去的20年中，耳聋 遗传学研究主要集中在家系搜集和新基因定位克隆，可广泛应用于临床诊断的耳聋基因诊断方法尚处于研 究阶段，并未取得实质性的进展。
综上所述，遗传性耳聋多属感音神经性耳聋，无法根据临床表现作出病因诊断，且治疗手段有限，开 展早期基因诊断、产前诊断及植入前诊断有望明确分子病因和阻断疾病的传递。但当前对遗传性耳聋的基 因诊断主要是选择某个或几个基因进行RFLP、直接测序法等检测，由于基因数量多、突变谱广、花费高、 耗时，且现有技术不能覆盖所有致病基因，也难以为患者提供全面的诊断。因此，建立覆盖中国地区所有 已知耳聋致病基因及相关疾病位点的高通量、标准化基因诊断、产前诊断技术平台，建立从临床诊断到基 因诊断、产前诊断及植入前诊断的遗传性耳聋技术规范，对实现其早期诊断、早期治疗以及降低发病率具 有重要意义。
一、与本发明相关的现有技术一
1、现有技术一的技术方案
目前国内主要用于耳聋筛查的微阵列突变分析基因芯片是由北京博奥生物有限公司推出的晶芯耳聋 基因芯片，原理是将多重等位基因特异性引物延伸PCR(allele-specific PCR)与通用芯片(universal ar ray)相结合。其原理可简述为：针对不同突变位点设计两种带有不同标签的上游探针和一个下游带Cy3荧 光标记的公共引物，先在液相中进行多重等位基因特异性引物延伸PCR，PCR扩增产物在带上一段标签序 列(Tag序列)的同时，被单色荧光所标记，然后将产物变形后，与固定有标签互补寡核苷酸序列的通用芯 片杂交，通过激光扫描仪及相应的软件对芯片进行扫描和数据分析就可以得到所检测的突变位点的检测结 果。图1是基于等位基因特异性PCR通用微阵列基因芯片(allele-specific PCR based universal array， ASPUA)的原理示意图。检测过程分三个步骤：(1)多重不对称等位基因特异性PCR。以待测样品DNA为模板， 使用所有待检测突变位点对应的等位基因特异性引物组，在热启动DNA聚合酶的作用下进行扩增。对于每 一个位点，设计两条5端带有不同Tag序列(25bp)的等位基因特异性引物和一条共有引物(20bp左右)， 该Tag序列与芯片上固定的Tag探针序列相同，由于使用的DNA聚合酶不具有3-5外切活性，所以当 等位基因特异性引物3末端碱基与模板不匹配时，扩增效率会大大下降，只有当引物3末端碱基与模 板完全匹配时，才能得到有效的扩增；所有待检测突变位点的共用引物5端都带有一段通用引物，该序 列与人类基因同源性低，与扩增体系中单独加入的通用引物序列相同，用于提高扩增产物中单链DNA的产 量。对于每个突变位点来说，由于在PCR反应体系中两条等位基因特异性引物都存在，杂合样品应该两个 等位基因都有检测信号，纯合样品应该一个等位基因有检测信号，所以不需要再另外设置PCR的阳性质控。 (2)扩增产物跟通用芯片杂交。通过多重不对称扩增后产生带有互补Tag序列的PCR产物，将其跟通用芯 片杂交。(3)芯片结果的扫描和判读。根据杂交结果中Tag探针的位置和信号强度确定是何种突变。参照 图1基于ASPUA平台的遗传性耳聋基因芯片原理示意图(检测过程分为三个步骤：1、多重不对称等位基 因特异性PCR；2、扩增产物与芯片上的探针杂交；3、芯片结果的扫描和判读)。
该芯片可同时检测4个耳聋相关基因的10个突变位点，即GJB2(35delG、176del16bp、235delC、299- 300delAT)，GJB3(538C>T、547G>A)，SLC26A4(IVS7_2A>G、2168A>G)和线粒体DNA12S rRNA(A1555G、C14 94T)。其操作流程分为以下几步：1、DNA提取。2、多重等位基因特异性PCR；3、杂交与清洗；4、扫描与 结果判定。基于该芯片与直接测序法所建立的基因诊断平台，其耳聋基因诊断流程为：受检者的外周血提 取DNA后，经晶芯耳聋基因芯片检测后若存在线粒体DNA12S rRNA(A1555G、C1494T)位点突变，需经直接测 序法验证后出具检测报告；若GJB2基因位点存在阳性，或所有芯片位点均为阴性且为非前庭导水管扩大综 合征，或SLC26A4基因位点检测阳性且为非前庭导水管扩大综合征，则进一步进行GJB2全序列测定，然后 出具检测报告；若SLC26A4基因位点检测阳性且为前庭导水管扩大综合征，或有芯片位点均为阴性且为前 庭导水管扩大综合征，则进一步进行SLC26A4全序列测序，然后出具检测报告。最终进行遗传咨询。(如图 2)参照图2晶芯耳聋基因芯片与直接测序法联合应用的耳聋基因诊断流程图(受检者的外周血提取DNA后， 经晶芯耳聋基因芯片检测后若存在线粒体DNA12S rRNA(A1555G、C1494T)位点突变，需经直接测序法验证 后出具检测报告；若GJB2基因位点存在阳性，或所有芯片位点均为阴性且为非前庭导水管扩大综合征，或 SLC26A4基因位点检测阳性且为非前庭导水管扩大综合征，则进一步进行GJB2全序列测定，然后出具检测 报告；若SLC26A4基因位点检测阳性且为前庭导水管扩大综合征，或有芯片位点均为阴性且为前庭导水管 扩大综合征，则进一步进行SLC26A4全序列测序，然后出具检测报告。最终进行遗传咨询。)
2、现有技术一的缺点
(1)低通量：仅包含已知的4个耳聋致病基因的9个位点检测。
(2)筛查覆盖面小：检测范围窄，不能满足中国人群遗传性耳聋的全面筛查。
(3)作用局限：该芯片仅能对被检测者个体进行独立的结果分析，无法实现家系的连锁分析。
(4)操作流程复杂：为防止某些引物间的相互作用，多重等位基因特异性PCR分两管进行。其中，四 个位点GJB2(35delG)，GJB3(547G>A)，SLC26A4(2168A>G和IVS7_2A>G)在同一管扩增，其它的六个位点在 另一管扩增。使操作时间增倍，耗时耗力。
(5)结果判别需改进：结果需要肉眼和软件相结合进行判断。另外，实践中存在1％～5％的检测结果难 以判别，其中最为常见问题是难以区分纯合突变和杂合突变，这主要是因为非特异性PCR扩增或杂交所致， 需要反复对DNA模板量、PCR反应体系、杂交体系、引物和探针序列进行调整。
(6)进一步改进存在局限性：该芯片目前所使用的荧光标记方法和非对称性等位基因特异性PCR技 术限制了芯片的进一步发展。荧光标记技术是目前生物芯片中最为常用的标记技术，由于荧光标记试剂及 检测设备昂贵，点阵的密度低，敏感性差，并且杂交后的芯片不能长期保存等原因，限制了该技术在临床 筛查检测或者现场或远程检测的广泛应用。另外，如果增加位点数量，则芯片所应用的非对称等位基因特 异性PCR技术导致的非特异性扩增及杂交的几率将呈几何级数增大，极大限制了芯片位点的增加。
二、与本发明相关的现有技术二
1、现有技术二的技术方案
美国斯坦福大学医学院的Juan Rodriguez-Paris等研发的一种新型耳聋筛查基因芯片包含6个耳聋核 基因(即GJB2，GJB6，GJB3，GJA1，SLC26A4and SLC26A5)与2个线粒体基因(即MTRNR1和MTTS1)的1 98个位点。改芯片的基本原理为特异引物延伸法(Arrayed Primer Extension)。
2、现有技术二的缺点
(1)筛查覆盖面小：虽然该芯片可检测198个突变位点，但仅包含已知的8个耳聋致病基因。
(2)使用人群不明确：不符合中国人群突变谱，不能作为中国人群遗传性耳聋的全面筛查。
(3)作用局限：该芯片仅能对被检测者个体进行独立的结果分析，无法实现家系的连锁分析。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种耳聋基因筛查芯片。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种耳聋基因筛查芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于，所述寡 核苷酸探针为SEQ ID NO.1～1152所示的核苷酸序列。
所述的耳聋基因筛查芯片在耳聋基因筛查中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)适合中国人群：耳聋突变检测位点绝大部分为中国人群中曾报道的耳聋突变位点，而且包含中 国人群最常见的8个热点突变，如下：GJB2_1_BP_DEL_35delG、GJB2_1_BP_DEL_235C、GJB2_2_BP_DEL_29 9_300at、GJB3_Arg180Term[C/T]、SLC26A4_Asn392Tyr[A/T]、SLC26A4_IVS7_2[A/G]、SLC26A4_His723Ar g[A/G]、线粒体12rsRNA1555[A/G]。
(2)高通量：芯片共包含384个检测位点。
(3)覆盖面广：涵盖了线粒体及46个位于常染色体上的不同耳聋基因，包含240个耳聋突变位点， 以及144个SNP位点。耳聋突变位点中包括200个非综合症耳聋位点，及40个常见综合征耳聋位点。
(4)高敏感性及特异性：经直接测序法验证，GJB2_1_BP_DEL_235C检测位点的敏感性为96.3％，特 异性为100％。
(5)简便快速：整个芯片检测过程只需2.5天，且芯片结果判读简单，检测位点命名规则如下：基 因名称_氨基酸转换[碱基变化]_耳聋类型。如CDH23_Asp124Gly[A/G]_NSR，CDH23代表基因名称，Asp124 Gly代表编码的第124个氨基酸由天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly)，[A/G]代表该位置由碱基A突变为 G，NSR(non-syndrome-recessive)代表非综合征型常染色体隐性遗传。由此，解决了多位点检测时繁冗 的结果判定过程。
(6)适用领域广泛：健康携带者筛查、产前诊断的研究、婴幼儿耳聋疾病早期筛查的研究、耳聋大 家系初筛及初步连锁分析。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内 容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例 及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及 其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为基于ASPUA平台的遗传性耳聋基因芯片原理示意图；
图2为晶芯耳聋基因芯片与直接测序法联合应用的耳聋基因诊断流程图；
图3为Illumina Goldengate耳聋芯片技术原理与工作流程；
图4为PCR程序示意图；
图5为微珠扫描时芯片某一区域的荧光示意图；
图6为芯片中某一SNP(rs9899531)的点状分析图；
图7为湖南张家界常染色体显性遗传耳聋家系图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
一、IlluminaGoldenGate芯片技术原理
IlluminaGoldenGate芯片技术原理(图3)是根据SNP两侧已知DNA序列设计上下游引物，检测每个 SNP需要3条寡核苷酸引物：两条上游引物，P1′和P2′，覆盖同一位点，分别代表二态SNP中的一种等 位基因型；一条下游引物，P3′。这3条寡核苷酸都包括与基因组DNA互补的区域和与通用PCR引物配对 的序列。下游探针还包含一段特异性 标志 序列，能与BeadArray中特定类型珠子上的探针互补结合。 当3条寡核苷酸引物与少量的基因组DNA样品杂交时，上游引物P1′和P2′的3′末端碱基与SNP位置 上碱基互补后，随即被DNA聚合酶有效地延伸到与下游引物P3′的5′磷酸基团毗邻，然后通过连接反 应与之连接起来。这样产生的全长拷贝即成为下一步PCR循环扩增的模板。在第二步的PCR扩增中，Cy 3和Cy5-标记通用上游引物P1和P2，生物素标记通用下游引物P3。PCR扩增之后，产物中由P3延伸的 链被带有抗生物素蛋白的磁珠吸附从而去除，留下荧光标记的单链。然后荧光标记的单链与微阵列杂交， 通过特异性 标志 序列与BeadArray中特定类型珠子上的探针互补结合。GoldenGate技术具有高度灵 活的特点，它根据实验者的需要在一个样品里同时检测96，384，768或1536个位点。我们选取了384个 检测点的芯片(参照图3中DAY2)进行高通量耳聋基因筛查芯片的设计。
二、Illumina Goldengate耳聋芯片位点设计
芯片位点设计包括以下几方面的内容：
1.非综合征型耳聋相关基因突变位点统计
我们查阅了Hereditary Hearing loss Homepage(http：//webh01.ua.ac.be/hhh/)网站、人类基因 突变数据库(Human genes mutation databases，HGMD)(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php) 以及Pubmed、CNKI、万方数据库近年所发表的中英文文献，并进行相应的统计。已克隆的非综合征耳聋遗 传基因有63个，在HGMD数据库上分别查询每个基因的基本信息(基因全名、染色体位置、标准序列编号)。 然后统计每个基因已报道的各种类型致病突变的数目，并归纳这些突变的具体突变碱基位置、氨基酸改变、 致病类型及首次文献报道。根据基因的标准序列编号在UCSC Genome Browser(http：//genome.ucsc.edu /)中查询该基因的标准序列，并将所有已报道的突变位点在序列中标记出来后，查询国内外文献，统计 每个位点在国内外报道的次数。
2.线粒体耳聋基因突变位点的统计
在人类线粒体基因组数据库(human mi tochondrial genome database，MITOMAP)(http：//www.mi tomap.org/MITOMAP)中查询迄今为止的所有的线粒体耳聋相关突变位点，并通过Pubmed、CNKI、万方数据 库近年所发表的中英文文献，并进行相应位点报道次数的统计。
3.综合征型耳聋基因突变位点的统计
四种最常见的综合征型耳聋，即Waardenburg综合征(Waardenburg Syndrome，WS)、前庭导水管扩 大综合征(Enlarged Vestibular Aqueduct Syndrome，EVAS)、Pendred综合征、USHER综合征的致病基 因的位点统计与非综合征步骤相同，统计各基因的基本信息、序列及突变位点的序列位置、国内外报道次 数。
4.耳聋突变检测位点的筛选
将以上查询的所有位点前后60bp进行探针评分，初步判断探针的合理性。考虑到芯片需结合临床应 用，故首要原则为：世界范围内突变位点报道次数大于2次，以中国人群报道次数较多的位点为主。在满 足第一原则的基础上，其他芯片设计原则为：(1)选择位点时应使相邻两个位点至少间隔60碱基以上， 避免探针的重复，造成探针相互影响；(2)芯片位点选择原则上应该尽量选择探针评分大于0.6的位点， 热点突变位点探针评分在0.5-0.6之间也将纳入芯片；(3)在其他条件相同的情况下，点突变优先于长 缺失及插入突变。
5.耳聋基因突变位点的命名
命名规则如下：基因名称_氨基酸转换[碱基变化]_常见耳聋类型。如CDH23_Asp124Gly[A/G]_NSR，C DH23代表基因名称，Asp124Gly代表编码的第124个氨基酸由天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly)，[A/G] 代表该位置由碱基A突变为G，NSR(non-syndrome-recessive)代表非综合征型常染色体隐性遗传。另外 其他的缩写字母分别为NSD(non-syndrome-dominant)代表非综合征型常染色体显性遗传，WS(Waardenb urg syndrome)代表Waardenburg综合征，EVA(Enlarged Vestibular Aqueduct)代表前庭导水管扩大，P S(Pendred syndrome)代表Pendred综合征，US(Usher syndrome)代表Usher综合征。
6.SNP位点选择
同时，在此芯片上添加了一些SNP位点，利用SNP位点可对非综合征型耳聋家系进行连锁分析。SNP 位点选取原则：①对于已克隆耳聋基因，我们查阅了Hapmap网站(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) 以及使用了Haploview4.2软件，为了能有效的进行连锁，我们根据每个基因大小，每个基因选取5-10 个SNP点，且保证每个基因中每个Block有1-2个以上的tag SNP点，同时所选的SNP点在中国人群中最 小等位基因频率是大于0.1的。(个别基因较小，被列入Hapmap计划的tag SNP不够5个或在中国人群 中最小等位基因频率大于0.1的不够5个，我们则随机选择了Hapmap计划以外的没有明确等位基因频率 的SNP。)一共在21个亚洲人群中有报道的已克隆耳聋基因中，选取了144个SNP位点。
7.Illumina Goldengate耳聋芯片位点汇总(见表1、表2)
表1芯片中240个耳聋突变位点的统计
表2芯片中144个SNP位点的统计
三、Illumina Goldengate耳聋芯片位点的特点
(1)芯片384个位点涵盖了线粒体及46个位于常染色体上的不同耳聋基因，包含240个耳聋突变位点， 以及144个SNP位点；
(2)耳聋突变位点中包含中国人群最常见的8个热点突变，如下：GJB2_1_BP_DEL_35delG、GJB2_1_BP _DEL_235C、GJB2_2_BP_DEL_299_300at、GJB3_Arg180Term[C/T]、SLC26A4_Asn392Tyr[A/T]、SLC26A4_I VS7_2[A/G]、SLC26A4_His723Arg[A/G]、线粒体12rsRNA1555[A/G]；
(3)耳聋突变位点中包括200个非综合症耳聋位点，其中隐性和显性突变位点分别为149个和51个。
(4)包含4个综合征(Waardenburg综合征、前庭导水管扩大综合征、Pendred综合征、USHER综合征) 的40个常见综合征耳聋位点。
四、Illumina Goldengate耳聋芯片操作流程
第一天：
1)在0.2ml的96孔SUD板中每孔加入5μl MS1缓冲液，再加5μ150ng/1DNA。
2)盖上SUD板板盖，250xg室温(22℃)离心1分钟。在水平震荡仪上2300rpm振荡20秒，250xg 室温(22℃)离心1分钟。
3)将SUD板放入加热仪(Heat Block)95℃，30分钟。
4)取出SUD板，250xg室温(22℃)离心1分钟。
5)轻轻地去掉热盖，每孔加5ul PS1至SUD板，盖好透明膜。
6)250xg室温(22℃)离心1分钟，在水平震荡仪上2300转/分振荡20秒。
7)去掉透明膜，加15ul异丙醇至每孔(沉淀DNA)
8)盖好透明膜，1600rpm震荡20秒。
9)离心SUD板3000xg，20分钟。
10)去掉透明膜，倒掉上清液，倒置在吸水纸上。
11)离心SUD板10xg，1分钟。
12)将SUD板正置，室温下干燥15分钟。
13)盖上透明膜，将SUD板置于-20℃。
14)从-20℃取出SUD板，去掉透明膜。
15)于SUD板每孔加入10ulRS1，溶解DNA沉淀。
16)盖上透明膜，250xg离心1分钟。
17)2300rpm震荡1分钟，至所有沉淀完全被溶解。
18)将SUD板离心250xg离心1分钟。
19)每孔加入OPA10ul和OB130ul至新的96孔裙边板ASE板。
20)去掉SUD板的透明膜，从SUD板中取出10ul加入至ASE板。
21)ASE板盖热盖5秒，离心250xg1分钟。
22)震荡ASE板1600rpm，1分钟至所有的磁珠完全重悬。
23)将ASE板放入70℃的加热仪中
第二天：
1)从加热仪中取出ASE板，250xg室温(22℃)离心1分钟，将管壁上的样本离心至管底。
2)将ASE板放在磁板上2分钟，磁珠会忘两边靠。
3)用枪去上清50ul。
4)加50μl AM1至每孔，盖透明膜。
5)1600rpm震荡20秒，至磁珠完全震起来。
6)将ASE板放在磁板上2分钟，至磁珠完全靠在两边为止。
7)去上清50ul。
8)加50ul AM1至每孔，盖透明膜。
9)1600rpm震荡20秒，至磁珠完全震起来。
10)将ASE板放在磁板上2分钟，至磁珠完全靠在两边为止。
11)加UB1 50ul至每孔，盖透明膜。
12)1600rpm震荡20秒，可多震数次直至磁珠全部震起来为止。
13)将ASE板放在磁板上2分钟，至磁珠完全靠在两边为止，去上清50ul。
14)加UB1 50ul至每孔，盖透明膜。
15)1600rpm震荡20秒，可多震数次直至磁珠全部震起来为止。
16)将ASE板放在磁板上2分钟，至磁珠完全靠在两边为止，去上清50ul。
17)在ASE板中加MEL37ul，盖透明膜。
18)1600rpm震荡1分钟，至磁珠完全震匀。
19)将ASE板放在45℃加热仪中，15分钟。
准备：准备0.2ml96孔裙边板(PCR板)，将64ul Titanium Taq酶与50ul UDG混合后加30ul混合 液至新的PCR板中。
20)从加热仪中取出ASE板，放在磁珠上，去掉透明膜。
21)去上清液。
22)把ASE板从磁板上取下，加50ul UB1至每孔。
23)把ASE放在磁板上2分钟，去上清50ul。
24)每孔加35ul 1P1至ASE板。
25)盖上透明膜，1800rpm震荡，1分钟。
26)置ASE板于95℃加热仪内，1分钟。
27)取出ASE板，将之放在磁板上2分钟。
28)从ASE板内各取30ul模板放入PCR板(已准备的含30ul混合液的PCR板)中。
29)盖好盖子，置之于PCR仪上做PCR。总体积60ul。
29)PCR程序，参照图4所示。
30)从PCR仪上取下PCR板，250xg离心1分钟。
31)取20ulMPB至每孔，调枪至85ul，将buffer与模板混匀，上下打匀。
32)每孔各取70ul加入至过滤板中，过滤板下面套一个96孔板。
33)避光，室温温育60分钟。
34)25℃下，1000xg离心5分钟。
35)在96孔过滤板中每孔加50ulUB2，盖好盖子。
36)1000xg离心5分钟，25℃，96孔过滤板下换一个新的96孔板。
37)在新的96孔板中每孔各加30ul MH1。
38)在96孔过滤板中每孔各加30ul 0.1N NaOH，洗脱DNA。
39)25℃1000xg离心5分钟。
40)将离心后过滤下来的液体，前后、左右平行轻摇混匀。
41)丢弃96孔过滤板。
42)将96孔板过滤下来的样品每个取15ul加入芯片。
43)上好样的芯片放入杂交盒中，至60℃杂交炉(OVEN)中30分钟。30分钟后调节杂交炉(OVEN) 温度值45℃，在45℃中至少放置16小时，不能超过18小时。
第三天：
1)从45℃的杂交炉中取出杂交盒，取出芯片，撕去芯片表面的透明膜，放入芯片架上，再放入已加 200ml PB1的玻璃清洗槽中，上下提动芯片架共10次，将芯片放入另一加有200ml PB1的玻璃清洗槽中， 浸泡5分钟，洗去芯片上未杂交的和非特异结合的DNA。
2)取出芯片再放入已加200ml XC4的玻璃清洗槽中，上下提动芯片架共10次，将芯片放入另一加有 200ml XC4的玻璃清洗槽中，浸泡5分钟。
3)将芯片放在0.68bar的真空干燥仪中干燥50-55分钟使芯片完全干燥。
4)从真空干燥仪中取出芯片，用无尘软布沾无水乙醇轻轻擦干净芯片的两边的胶，至到能清楚看到 芯片两边的点，用于芯片扫描时激光共聚焦微珠芯片扫描仪能准确定位芯片。
5)通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪用Illumina BeadScan软件进行芯片扫描。
6)通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪扫描后得到的芯片结果，用GenomeStudio软件分析。参照图5所 示(该区域的荧光点分布均匀，各颜色点随机分布，提示该区域的芯片检测效果好)。参照图6所示，芯 片中某一SNP(rs9899531)的点状分析图(465个DNA样本即有465个点，蓝色荧点表示纯合的GG，紫色 点表示杂合AG，红色点的表示纯合的AA。从上图可以很清楚的看到该SNP三种状态的分布情况)。
五、Illumina Goldengate耳聋芯片初步应用结果
目前，该芯片已应用于192个耳聋患者检测。芯片总call rate98.86％。
以下为检测出突变的位点(按突变检测率排序)。
注：call rate为芯片结果检出率
通过直接测序法对芯片结果进行验证，结果如下：
GJB2_1_BP_DEL_235C_NSR敏感度为96.3％(26/27)，假阳性率为3.7％(1/27，验证的27个样本中， 其中一个芯片结果为杂合缺失，测序结果为无缺失)。特异度为100％。
参照图7所示(图中，□为健康男性○为健康女性●为女性患者■为男性患者)我们应用该芯片 的144个SNP位点对论文第二章收集的一个来自湖南张家界地区非综合征型显性遗传耳聋家系进行了SNP 点的连锁分析进行排除定位。以验证Illumina GoldenGate384K芯片SNP位点排除定位连锁分析结果。 该家系为一4代人的常染色体显性遗传非综合征型耳聋家系，家系中一共有41人，其临床特征表现为： 语后聋，30岁左右发病，发病初期表现为耳鸣及高频听力下降，40岁左右进行性发展为双耳重至极重度 聋(图5)。由于家系发病年龄在30岁左右，故将未到达发病年龄的家系成员排除在研究中。我们对家系 中14名30岁以上成员(其中包括7名患者和7名正常人)进行了临床诊断分析、芯片排除定位研究。在 排除定位中我们在rs755931位点(1p34.3)得到最高两点LOD值1.9，该SNP位点(rs755931)是GJB4 (Cx30.3)基因的排查位点。其余排查基因位点LOD值均<1。因此，根据芯片结果我们可以初步将该家系 的致病位点锁定在1p34.3周围。而我们对此家系采用传统的微卫星定位扫描的方法对此家系进行了精细 定位。传统方法中我们将此家系的致病位点定位在1p34.2-p34.3，在此区间得到了最高多点LOD值3.2。 据此，我们认为该芯片能较准确的进行耳聋相关基因的排除定位连锁分析。
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