一种改进的反向斑点杂交方法及应用 技术领域 本发明涉及一种改进的反向斑点杂交方法， 并涉及改进的反向斑点杂交方法在产 品上的应用。
背景技术 1989 年 由 Saiki 等 (Saiki RK， et al.Proc Natl Acad Sci USA.1989， 86(16) ： 6230-4) 提 出 了 反 向 斑 点 杂 交 (reverse dot blot， RDB) 技 术， 该技术是在 PCR-ASO(Polymerase chain reaction&allelespecific oligonucleotide) 技术的基础上 进行了一个实用性的改进。Henry Erlich， Randall Saiki 及其同事在检测 HLA 时提出了 一个有效的改进， 该方法是将靶基因在 PCR 过程用放射性元素标记， 然后与尼龙膜杂交， 从 而检测靶基因的突变情况。 这一方法可将多个靶基因在同一条件下进行检测从而大大提高 了检测的效率。 随后， 其它科学家证实了该方法可以区分单个碱基的突变， 利用共价键的探 针固定方法代替紫外交联以及使用非放射性的生物素标记引物的方法， RDB 技术的稳定性 有了明显的提高。目前 Inogenetics 的 LiPA 系列产品 ( 通过 CE 认证 ) 均是基于上述的原 理。
从技术原理来说， RDB 在本质上也是 DNA 芯片 ( 一般是中密度芯片 ) 的一种， 但它 不同于一般所说的玻璃 DNA 芯片， 其信号特异性强， 简便易行， 技术要求低， 仪器设备投入 小， 检测结果用肉眼就可直接判断， 而无需购买昂贵的激光扫描仪， 更符合中国目前的国情 也更利于在基层医院推广。然而， 目前 RDB 技术整个杂交过程的操作步骤比较多， 操作时间 也相对较长， 成为大规模推广应用的阻力。 基于此需求， 虽然已经有相应的自动化杂交仪出 现， 但自动化杂交仪的价格昂贵， 并非普通的基层医院可接受。 而且， 繁多的操作步骤， 也对 自动化仪器运行的稳定性提出了挑战。
因此， 需要对现有的 RDB 技术进行改进以更适合在临床检测中使用， 目前国内外 尚无与本发明相关的技术报道。
发明内容 本发明目的是提供了一种改进的反向斑点杂交方法。
常规的反向斑点杂交方法可以一次并行检测多个位点， 而且通过固定在基底的探 针可以检测不同的样品， 一般分为四个步骤 ：
第一步 ： 将带标记的 PCR 产物与固定好探针的膜条和杂交液 I 在杂交温度下杂交。
该步骤目的是将靶核酸与探针结合， 为非选择性结合。
第二步 ： 弃杂交液 I， 加入预热到洗脱温度的杂交液 II 在洗脱温度下洗脱。
该步骤目的是将非特异结合的核酸从探针上洗脱下来， 为选择性洗脱。
第三步 ： 弃杂交液 II， 加入一定浓度的能与标记物结合的酶结合 5 ～ 30min。
该步骤目的是将酶与靶核酸交联 ；
第四步 ： 加入显色底物和显色液， 室温显色 5 ～ 30min。
该步骤目的是酶与底物显色。 第一步中 PCR 产物的标记常用的包括生物素标记， 地高辛标记， 也可采用其它标记。 第一步中膜条可使用硝酸纤维素、 尼龙或醋酸纤维素作为固相支持材料。
第一步和第二步中杂交液 I 的组成为 1×SSC ～ 6×SSC， 0.1％～ 1％ SDS， 优选的 方案是 2×SSC， 0.5％ SDS。
第三步中杂交液 II 的组成为 0.1×SSC ～ 1×SSC， 0.1％～ 1％ SDS， 其中优选的方 案是 0.5×SSC， 0.5％ SDS。
第三步中标记物结合的酶要根据 PCR 产物的标记使用相应的酶， 如与生物素标记 物结合的酶包括辣根过氧化物酶 (POD)、 碱性磷酸酶 (AP)。
第四步中应根据酶使用相应的显色底物和显色液， 如使用辣根过氧化物酶， 则 显色底物可以是 3， 3 ′， 5， 5 ′ -Tetramethylbenzidine( 简称 TMB)， 相应的显色液优选 的方案为 0.1M 柠檬酸钠 (pH4.9)， 0.42mM TMB， 0.004 ％ H2O2(v/v) ； 显色底物也可以是 1， 2-phenylenediamine( 简称 OPD)， 相应的显色液优选的方案为 50mM 磷酸钠， 20mM 柠檬酸 钠 (pH5.0)， 4mM OPD， 0.004％ H2O2(v/v) ； 但显色底物不仅局限于 TMB 和 OPD， 其他与辣根过 氧化物酶结合的底物均可使用。如使用碱性磷酸酶， 则显色底物可以选择氮蓝四唑 (NBT/ BCIP)， 相应的显色液优选的方案为 0.1M Tris 缓冲液 (pH9.5)， 50mM MgSO4， 0.4mg/ml NBT， 0.19mg/ml BCIP。
以上步骤中提及的杂交温度和洗脱温度可根据融解温度 (Tm 值 ) 结合具体实验来确定。 本发明的方法是将常规的反向斑点杂交方法的第二步和第三步合并成一步， 具体 来说弃杂交液 I， 加入预热到洗脱温度的杂交液 II 和酶在洗脱温度下洗脱。
该步骤可以使用在 25℃～ 56℃均能保持酶活性的酶， 优选使用辣根过氧化物酶 或碱性磷酸酶。
该步骤中杂交液 II 的组成为 0.1×SSC ～ 1×SSC， 0.1％～ 1％ SDS， 其中优选的方 案是 0.5×SSC， 0.5％ SDS。
本发明的反向斑点杂交方法正是通过对常规的反向斑点杂交方法在步骤上的优 化， 减少了反向斑点杂交实验操作的步骤和时间， 而两者方法在检测效果上无差异。 通过本 发明的反向斑点杂交方法的实施有利于反向斑点杂交产品在临床检测领域得到更广泛的 应用， 尤其是普通的基层医院。
附图说明 图 1 利用传统的方法与本发明方法 ( 包括方法 A 和方法 B) 检测 β 地中海贫血结 果比较， 编号 1 ～ 3 为传统的方法， 对应的结果分别为 CD41/42 杂合子 ( 编号 1)， IVS2-654 杂合子 ( 编号 2)， β 珠蛋白正常 ( 编号 3) ； 编号 4 ～ 6 为本发明方法 A， 对应的结果分别为 CD41/42 杂合子 ( 编号 4)， IVS2-654 杂合子 ( 编号 5)， β 珠蛋白正常 ( 编号 6)， 编号 7 ～ 9 为本发明方法 B， 对应的结果分别为 CD41/42 杂合子 ( 编号 7)， IVS2-654 杂合子 ( 编号 8)， β 珠蛋白正常 ( 编号 9)。
图 2 本发明方法检测 HCV 基因分型的实验结果， 编号 1 ～ 3 对应的结果分别为 HCV
3b 型， HCV 1b 型， HCV 3a 型。
图 3HCV 1b 型标本测序结果， 结果显示该例标本为 HCV 1b 型。
图 4HCV 2a 型标本测序结果， 结果显示该例标本为 HCV 2a 型。
图 5HCV 3b 型标本测序结果， 结果显示该例标本为 HCV 3b 型。 具体实施方式
本发明实施方式的描述， 旨在通过举例说明更好地理解本发明的本质， 而不是限 制本发明。
本发明实施方式所用的实验材料， 如没有特别说明， 均为市售产品。
实施例 1 传统的方法与本发明方法在地中海贫血检测中的比较
利用已上市试剂盒中山大学达安基因股份有限公司生产的 β 地中海贫血检测试 剂盒， 来对比本发明方法与试剂盒方法 ( 即传统的方法 ) 的检测结果。
其中方法 A 使用的酶是辣根过氧化物酶， 方法 B 使用的酶是碱性磷酸酶。选取 3 例临床样本， 分别是 CD41/42 杂合子、 IVS2-654 杂合子、 β 珠蛋白正常， 从实验结果看， 方法 A、 方法 B 与试剂盒方法均能正确检测相应的结果， 三者实施效果没有差异 ( 参见附图 1， 编 号 1 ～ 3 为传统方法， 4 ～ 6 为本发明方法 A， 7 ～ 9 为本发明方法 B)， 而本发明方法的操作 步骤比试剂盒方法减少三个步骤， 操作时间至少节约 30min。 实验流程简化有利于质量控制 和临床推广。
实施例 2 本发明方法在 HCV 基因分型检测中的应用
1、 试剂盒使用的引物和探针序列如下 ：
丙型肝炎病毒 (HCV) 核酸 (RNA) 逆转录引物序列为 ：
逆转录 (RT) 引物 ： 5′ -GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′ (SEQ ID NO ： 1)
聚合酶链反应扩增体系中使用的上游和下游引物序列分别为 ：
PCR 上游引物 ： 5′ -TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′ (SEQ ID NO ： 2)
PCR 下游引物 ： 5′ -CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′ (SEQ ID NO ： 3)
杂交反应中使用的寡核苷酸探针均为 5′端标记氨基标记， 其中探针 IC 5′端标 记氨基， 3′端标记生物素， 序列分别是 ：
探针 1 ： 5′ -CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′ (SEQ ID NO ： 4)
探针 1b-1 ： 5′ -CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′ (SEQ ID NO ： 5)
探针 1b-2 ： 5′ -GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′ (SEQ ID NO ： 6)
探针 2-1 ： 5′ -AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3`(SEQ ID NO ： 7)
探针 2-2 ： 5′ -GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′ (SEQ ID NO ： 8)
探针 2a-1 ： 5′ -GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′ (SEQ ID NO ： 9)
探针 2a-2 ： 5′ -CCCACTCTATGCCCGGCCA-3′ (SEQ ID NO ： 10)
探针 3-1 ： 5′ -CCCGCGAGATCACTAGCCG-3′ (SEQ ID NO ： 11) 探针 3-2 ： 5′ -AATCGCTGGGGTGACCGGG-3′ (SEQ ID NO ： 12)
探针 3b ： 5′ -CGCGCTCAATGCCCGGAAAT-3′ {SEQ ID NO ： 13)
探针 PC 1 ： 5′ -ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′ (SEQ ID NO ： 14)
探针 PC2 ： 5′ -CGGAACCGGTGAGTACACC-3′ (SEQ ID NO ： 15)
探针 IC ： 5′ -GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′ (SEQ ID NO ： 16)
2、 试剂盒使用的杂交载体的制备
用作杂交载体的膜条由尼龙膜作为固相支持材料制成。合成的探针用 TE 溶液稀 释后参照下表所示的阵列以适当方式固定在膜条的适当位置。 其中两条通用探针稀释成一 管， 其中 PC1 浓度为 10pmol/μl， PC2 浓度为 20pmol/ul， 将合并成一管后将探针点至膜条 11# 位置， 形成通用探针点 (PC 点 ) ； 其它探针浓度均为 10pmol/μl， 将稀释好探针点样至 膜条相应位置并晾凉后用 0.2mol/L NaOH 溶液处理膜条并用蒸馏水充分洗涤， 然后保存于 4℃备用。
将 探 针 通 过 紫 外 线 交 联， 以 及 用 氨 基 标 记 的 探 针 交 联 40 ％ (g/v)EDC(N- 乙 基 -N′ -[ 二四基氨丙基 ]- 碳二亚胺 ) 处理过的尼龙膜。
探针的点样阵列如下表所示 ：
3、 核酸的提取 采用 Qiagen RNA 提取试剂盒提取样品中的丙型肝炎病毒 RNA。 4、 RNA 的逆转录体系25μl 体系中使用 Ambion 的 RETROscriptTM 试剂盒 ( 按说明书要求操作 )， 加入 1μl10mM 逆转录 (RT) 引物， 5μl RNA， 逆转录反应条件为 44℃ 60 分钟， 92℃ 10 分钟。
5、 核酸扩增体系
50μl 核酸扩增体系包括 10mM Tris-HCl(pH8.30)， 50mM KCl， 3mM MgCl2， 100μM PCR 上游引物， 100μM PCR 下游引物， 200μM dNTPs， 2U TaqE(Promega) 及 2μl 逆转录产 物， 扩增反应条件为 ： 94℃ 5 分钟， 94℃ 30 秒， 55℃ 30 秒， 72℃ 45 秒， 运行 40 个循环， 最后 72℃ 7 分钟。
6、 反向斑点杂交
实验步骤如下 ：
Step1 ： 准备 5ml 的塑料管， 编号。镊取 RDB 膜条并编号， 对应将膜条放入塑料管 中。
Step2 ： PCR 产物在 PCR 仪上 98℃变性 5min， 放置冰上。
Step3 ： 往塑料管中加入 4ml 杂交液 I(2×SSC， 0.5％ SDS)， 再加入变性的 PCR 扩增 产物， 10min 后置于 50℃水浴 1h。
Step4 ： 将膜条转入装有 40ml 杂交液 B(0.5×SSC， 0.5％ SDS， 1％ Tween20) 的塑料 管中， 加入 2U Streptavidin-POD， 50℃振荡 15min。 Step5 ： 配制显色液 (20ml 0.1M 柠檬酸钠 +1ml 5mg/ml 四甲基联苯胺 +10.0μl 3％ H2O2)， 20 ～ 30℃将膜条浸泡于显色液中避光显色 3 ～ 10min。
Step6 ： 采集电子图像。
结果判读如下表所示 ：
显色情况 11#， 12# 探针显色， 其余无显色 11#， 12# 探针显色， 且 1# 探针显色， 其余无显色 11#， 12# 探针显色， 且 2#， 3# 探针同时或者其中之一显色， 其余无显色 11#， 12# 探针显色， 且 4#， 5# 探针同时或者其中之一显色， 其余无显色 11#， 12# 探针显色， 且 6#， 7# 探针同时或者其中之一显色， 其余无显色 11#， 12# 探针显色， 且 8#， 9# 探针同时或者其中之一显色， 其余无显色 11#， 12# 探针显色， 且 10# 探针显色， 其余无显色
基因型 HCV 感染 1 型感染 1b 型感染 2 型感染 2a 型感染 3 型感染 3b 型感染选取金标准方法测序确认分别为 HCV 1b 型、 2a 型和 3b 型的三例标本， 使用本发明 方法进行检测， 结果与测序结果完全相符， 具体参见附图 2 ～ 5。
序列表<110> 中山大学达安基因股份有限公司 <120> 一种改进的反向斑点杂交方法及应用 <140> <141> <160>16 <210>1 <211>27 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作逆转录引物。 <400>1 gctcatggtgcacggtctacgagacct <210>2 <211>26 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作 PCR 引物。 <400>2 tctagccatggcgttagtatgagtgt <210>3 <211>26 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作 PCR 引物。 <400>3 cactcgcaagcaccctatcaggcagt <210>4 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>4 caatgcctggagatttgggcg <210>5 <211>18<212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>5 ccgcgagactgctagccg <210>6 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>6 gcgagaccgctagccgagt <210>7 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>7 agtagcgttgggttgcgaaag <210>8 <211>22 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>8 gtcctttcttggataaacccac <210>9 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>9 gccgggaagactgggtcct <210>10<211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>10 cccactctatgcccggcca <210>11 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>11 cccgcgagatcactagccg <210>12 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>12 aatcgctggggtgaccggg <210>13 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>13 gccgggaagactgggtcct <210>14 <211>18 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>14 atttgggcgtgcccccgc<210>15 <211>19 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>15 cggaaccggtgagtacacc <210>16 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 根据特定核苷酸序列设计， 以用作芯片杂交反应探针。 <400>16 gccgtaaccgtcacaatccgt