技术领域：
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种调控培养温度及培养基配方以提高 灵芝液体发酵多糖产量的液体培养方法。
背景技术
多糖是存在于自然界中的醛糖和酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，是 一切有生命的有机体不可缺少的成分。多糖在海藻、真菌和高等植物中甚为丰 富。多糖作为生物效应调节剂，不仅是一种非特异性免疫增强剂，还具有降血 糖、降血压、降胆固醇等多种功能。
灵芝，别名赤芝、木灵芝、灵芝草，古称“瑞草”。在真菌分类上属担子菌 纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属。灵芝研究最多的是灵芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide)。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，其种类很多，有 葡聚糖、杂聚糖、半乳糖聚糖、甘露糖聚糖、甘露岩藻半乳聚糖、阿拉伯糖、 阿拉伯木质葡聚糖等。灵芝多糖的主要生物活性有：(1)调节免疫功能。(2) 抗肿瘤作用。(3)刺激胰岛素分泌，促进葡萄糖在外周组织的利用，降低血糖。 (4)促进核酸、蛋白质的代谢。(5)消炎。(6)抗放射与促进骨髓造血机能。 (7)抗氧自由基作用。(8)对心血管系统的调节作用。(9)保肝解毒作用。
灵芝的液体发酵培养又叫做液体深层发酵培养，就是将灵芝菌种接种在液 体培养基中，给予充足的无菌空气，保持一定的温度使之生长，液体发酵菌丝 生长快，完成一个生产周期只要18-23天左右，发酵罐周期只要4-6天。发酵 产物有菌丝体和发酵液，发酵液中有大量的灵芝菌丝分泌物，菌丝体和发酵液 两者都有药用价值。
一般认为灵芝深层发酵的适宜温度为25-30℃，发酵时候必须给予适当的温 度条件，高于30℃时菌丝生长快，但是菌丝得率低，且容易自溶，发酵液颜色 深，高于36℃，灵芝菌丝停止生长，40℃以上，菌丝很快死亡。发酵温度会对 发酵产物积累发生影响，温度高，菌丝呼吸强度高，营养物质消耗多，发酵产 物积累少，温度低，菌丝生长慢，营养物质消耗少，发酵代谢产物多，但是温 度低，发酵周期就会延长，成本就会提高，所以发酵时，前期以菌丝生长为主 要阶段，温度一般控制在27-28℃，以后当代谢物积累阶段，培养温度一般降到 20℃为宜。
中国发明专利CN101880700A涉及了一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方 法。该方法是利用灵芝细胞的液体培养，通过在培养基中添加稀土元素镨、钕 或镧，提高灵芝多糖的产量。所产灵芝多糖可用于免疫力调节、抗肿瘤、降血 糖等药物的制备。
中国发明专利CN101235393公开了一种促进灵芝酸或灵芝多糖生物合成的 发酵方法。本发明对灵芝细胞生长阶段和产物合成阶段所需要的条件进行了考 察，依据灵芝细胞生长和产物合成阶段所需环境条件的不一致性，分别考察了 pH两阶段、溶氧两阶段的控制策略对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响，在此 基础上，结合中间补料策略，又分别考察了pH两阶段、溶氧两阶段控制策略或 补料策略相互协同在一起后对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响。试验结果说 明，无论是分别采用pH值两阶段控制策略、溶氧浓度两阶段控制策略或是将pH 两阶段控制策略、溶氧浓度两阶段控制策略与补料策略协同在一起，均显著促 进灵芝细胞生长，大幅度提高灵芝酸或灵芝多糖的含量或产量。
发明内容：
本发明针在现有技术基础上，通过调控各个发酵过程中的旋转速度、培养 温度及培养基组分，改变灵芝菌丝体生长发育状态，提高灵芝多糖产量。
为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高灵芝多糖产量的控温液体培养方法，包括以下步骤：
(1)液体种子培养：将斜面灵芝菌种接种到液体种子培养基中，培养过程 一：旋转速度：200r/min、培养温度：29-30℃、培养时间：3天；培养过程二： 旋转速度：50-60r/min、培养温度：3-5℃、培养时间：1天；培养过程三：旋 转速度：150-160r/min、培养温度：28-29℃、培养时间：2天；
(2)摇瓶培养：将液体种子按照12-14％体积百分数接种到摇瓶培养基中， 培养过程一：旋转速度：120-130r/min、培养温度：28-29℃、培养时间：4天； 培养过程二：旋转速度：0-10r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过 程三：旋转速度：160-180r/min、培养温度：30℃、培养时间：3天。
优选的，所述灵芝菌种为赤灵芝(Ganoderma lucidum)、紫灵芝(Ganoderma japoncium)或者薄盖灵芝(Ganoderma applanatum)中的一种。
优选的，所述第(1)步骤中液体种子培养，培养过程一：旋转速度：200r/min、 培养温度：29℃、培养时间：3天；培养过程二：旋转速度：60r/min、培养温 度：5℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：150r/min、培养温度：28 ℃、培养时间：2天。
优选的，所述第(2)步骤中摇瓶培养：将液体种子按照13％体积百分数接 种到摇瓶培养基中，培养过程一：旋转速度：120r/min、培养温度：29℃、培 养时间：4天；培养过程二：旋转速度：0-5r/min、培养温度：4℃、培养时间： 1天；培养过程三：旋转速度：170-180r/min、培养温度：30℃、培养时间：3 天。
优选的，所述第(1)步骤中液体种子培养基配方为：蛋白胨1.7％，葡萄糖 2.2％，KH2P040.15％，MgS040.07％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/L。
优选的，所述第(2)步骤中摇瓶培养基配方为：蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％， KH2P040.12％，MgS040.05％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/。
优选的，所述第(1)步骤中液体种子培养基的pH为7.8-7.9。
优选的，所述第(2)步骤中摇瓶培养基的pH为7.9-8.0。
本发明的有益效果：
1.本发明通过调控各个发酵过程中的旋转速度、培养温度及培养基组分， 调节灵芝菌丝体生长状态，改变了人们以往对灵芝液体发酵温度需要控制在20 ℃以上的观点，通过高低温穿插，提高灵芝液体发酵菌丝体中多糖含量。
2.本发明方法简单，重复性好，经济效益高，具有较高的工业化应用前景。
具体实施方式：
下面对本发明的实施例做详细的说明，本实施例在以发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但是本发明的保护范 围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规 条件或者制造商所建议的条件实施。
实施例一：
实验菌种：泰山赤灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实验过程：菌种→斜面培养→种子培养→摇瓶培养→收获。
种子培养的培养基配方为：蛋白胨1.7％，葡萄糖2.2％，KH2P040.15％，MgS04 0.07％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/L，培养基pH为7.8-7.9。
摇瓶培养的培养基配方为：蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％，KH2P040.12％，MgS04 0.05％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/，培养基的pH为7.9-8.0。
其中种子培养过程及药瓶培养过程为：
一种提高灵芝多糖产量的控温液体培养方法，包括以下步骤：
液体种子培养：将斜面灵芝菌种接种到液体种子培养基中，培养过程一： 旋转速度：200r/min、培养温度：29℃、培养时间：3天；培养过程二：旋转速 度：60r/min、培养温度：3℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：160r/min、 培养温度：28℃、培养时间：2天；
摇瓶培养：将液体种子按照14％(v/v)接种到摇瓶培养基中，培养过程一： 旋转速度：130r/min、培养温度：28℃、培养时间：4天；培养过程二：旋转速 度：10r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：180r/min、 培养温度：30℃、培养时间：3天。
实施例二：
实验菌种：长白山紫灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实验过程：菌种→斜面培养→种子培养→摇瓶培养→收获。
种子培养的培养基配方为：蛋白胨1.7％，葡萄糖2.2％，KH2P040.15％，MgS04 0.07％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/L，培养基pH为7.8-7.9。
摇瓶培养的培养基配方为：蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％，KH2P040.12％，MgS04 0.05％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/，培养基的pH为7.9-8.0。
其中种子培养过程及药瓶培养过程为：
一种提高灵芝多糖产量的控温液体培养方法，包括以下步骤：
液体种子培养：将斜面灵芝菌种接种到液体种子培养基中，培养过程一： 旋转速度：200r/min、培养温度：29℃、培养时间：3天；培养过程二：旋转速 度：60r/min、培养温度：5℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：150r/min、 培养温度：28℃、培养时间：2天。
摇瓶培养：将液体种子按照13％(v/v)接种到摇瓶培养基中，培养过程一： 旋转速度：120r/min、培养温度：29℃、培养时间：4天；培养过程二：旋转速 度：0r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：170r/min、 培养温度：30℃、培养时间：3天。
实施例三：
实验菌种：海南吊罗山薄盖灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实验过程：菌种→斜面培养→种子培养→摇瓶培养→收获。
种子培养的培养基配方为：蛋白胨1.7％，葡萄糖2.2％，KH2P040.15％，MgS04 0.07％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/L，培养基pH为7.8-7.9。
摇瓶培养的培养基配方为：蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％，KH2P040.12％，MgS04 0.05％，ZnSO40.01％，稀土元素铽(Tb)0.01μmol/，培养基的pH为7.9-8.0。
其中种子培养过程及药瓶培养过程为：
一种提高灵芝多糖产量的控温液体培养方法，包括以下步骤：
液体种子培养：将斜面灵芝菌种接种到液体种子培养基中，培养过程一： 旋转速度：200r/min、培养温度：30℃、培养时间：3天；培养过程二：旋转速 度：50r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：160r/min、 培养温度：29℃、培养时间：2天；
摇瓶培养：将液体种子按照12％(v/v)接种到摇瓶培养基中，培养过程一： 旋转速度：130r/min、培养温度：28℃、培养时间：4天；培养过程二：旋转速 度：0r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：180r/min、 培养温度：30℃、培养时间：3天。
将上述实施例一、二、三收获得到的菌体采用干重法测定：
取发酵液1000毫升，在离心机中离心处理(6000rpm/min，20min)，将分 离得到的沉底与100目尼龙网中用蒸馏水洗涤多次，然后置于80℃条件下干燥 至恒重。
统计上述实施例一、二、三收获得到的菌体的粗多糖含量，测定方法如下：
取发酵液50毫升，加50毫升的水，在沸水中提取1小时，冷却至室温， 在离心机中离心处理(6000rpm/min，20min)，取上清液，加入5倍95％质量的 酒精沉淀1小时，再在离心机中离心处理(3000rpm/min，15min)，用无水乙醚 洗涤沉淀，将沉淀60℃下干燥至恒重，即为粗多糖。
结果分析：
表一：菌体干重及粗多糖含量
菌丝体干重(g/L) 粗多糖(g/L) 实施例一 9.36±0.52 1.725±0.241 实施例二 8.86±0.39 1.841±0.165 实施例三 9.12±0.57 1.936±0.047
上述结果均以平均数±方差的方式表达。本发明实施例菌丝体干重及粗多 糖含量较普通液体培养灵芝菌丝体干重及粗多糖含量均有极大的提高。
以上内容仅为本发明的较佳实施方式，对于本领域的普通技术人员，依据 本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容 不应理解为对本发明的限制。