一种发酵生产环孢菌素A的方法.pdf

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种发酵生产环孢菌素A的方法。该方法以多孔木霉(Tolypocladium?inflatum?csp3)为出发菌株，主要涉及种子培养基、发酵培养基的新配方及良好的发酵控制工艺等步骤。通过本发明所述的方法，环孢菌素A在前期对数生长期内(90小时)能迅速地获得菌体，后期能充分延长目的产物的分泌时间，最终环孢菌素A的浓度可达5.0g/L，极大的提高了环孢菌素的发酵效价。整个发酵过程操作简单，中间易于控制，通用性强，适合工业化生产。

1.  一种利用多孔木霉(Tolypocladium inflatum csp3)发酵生产环孢菌素A的方法，其特征在于，包括种子培养基和发酵培养基的制备以及利用该菌株进行的发酵培养，其工艺如下：
(1)摇瓶种子液培养：
将4℃冰箱保存的新鲜斜面用无菌水充分洗刷，而后将斜面孢子液接种至摇瓶培养基，进行培养；
培养基成分和含量为果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L；
(2)种子培养：
按体积百分比，将(1)中生长好的种子按接种量1-2％的比例接种种子罐进行培养；
培养基成分和含量为果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L，消泡剂1-4g/L；
所说的菌种为多孔木霉(Tolypocladium inflatum csp3)；
(3)发酵培养：
按体积百分比，将(2)中培养好的种子按接种量5-15％的比例移种至发酵罐培养；
培养基成分和含量为葡萄糖50-200g/L，磷酸氢二铵3-10g/L，L-Valine 1-10g/L，NaNO₃ 1-5g/L，KCl 0.1-0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，ZnSO₄·7H₂O0.0001-0.0005g/L，MnCl₂·4H₂O 0.00005-0.0001g/L，消泡剂5-10g/L；
90小时前pH控制在4.0-6.0，之后放弃pH的调控，在目的产物进行分泌阶段，进行补料控制，于200-260小时下罐；
(4)采用常规方法，从发酵培养产物中收集环孢菌素A。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，斜面培养时pH 4.0-6.0，搅拌转速250rpm，温度25-30℃，湿度40％-60％条件下振荡培养30-50小时。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养时pH 4.0-6.0，温度25-30℃，搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa，培养30-50小时。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时pH 4.0-6.0，温度25-30℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中90小时之前，发酵液的pH通过流加氨水的方式进行调控。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中补料控制所流加的营养物质为葡萄糖和磷酸氢二铵溶液。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中在目的产物分泌阶段(120小时之后)，发酵液中葡萄糖浓度维持在10-20g/L，氨基氮浓度维持在300-1000mg/L，若低于此浓度，则进行补料控制。

8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中补料的葡萄糖溶液浓度在0.5-1.2g/L，磷酸氢二铵溶液浓度在400-450mg/L。

一种发酵生产环孢菌素A的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种发酵生产环孢菌素A的新方法。
背景技术
环孢菌素是一种主要用于器官移植领域的免疫抑制剂，它是一种由真菌产生的环状寡肽，其结构式如下：

环孢菌素除了有环孢菌素A外还有B、C、D、U、L等20多种化合物，可以用字母A-Z来表示。在瑞士专利CH589716和CH603790中最早报道了环孢菌素的发酵生产。在所有的环孢菌素当中，环孢菌素A是首先从真菌培养物中分离出来的，后来发现其具有很强的免疫抑制活性。
环孢菌素A首先由瑞士山道士公司于1970年从微生物代谢产物中分离获得，1978年首次用于临床肾移植试验，美国FDA于1983年批准其可以用于临床器官的移植，它是第一个具有真正选择性的免疫抑制剂，开辟了脏器移植的新纪元。其详细的资料在ProcessBiochemistry 1991，26：157～166文献中已经有公开的报道。
目前在器官移植领域，环孢菌素仍然是最基本的免疫抑制用药。除肝脏移植治疗可以用FK506替代外，其他领域都很难被替代，作为一种免疫抑制剂，环孢菌素A的主要特点是抑制作用选择性，即主要抑制T细胞的增殖与分化。环孢菌素A抑制T细胞的活化，抑制Th产生白细胞介素-2和白细胞介素-3，以及β干扰素等各种淋巴因子和白细胞介素-2受体的表达，从而抑制了细胞毒T细胞的产生。在药理剂量下，环孢菌素A对抑制性T细胞的产生没有抑制作用，这一点对抑制耐受性的形成很有意义。环孢菌素A对B细胞和巨噬细胞的增殖和功能没有直接的抑制作用。这些特点是以前任何免疫抑制剂所没有的。从而使免疫抑制剂的研究和应用进入了一个新的被称之为环孢菌素时代。
环孢菌素A除了用于器官移植领域外，还可以用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、再生障碍性贫血、皮肤肌炎以及肾综合症的治疗等。
目前国内外实现了环孢菌素的工业化生产，主要是通过微生物菌种发酵产生，工业应用比较多的微生物有光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)、多孔木霉(Tolypocladium inflatumcsp3)、镰刀孢霉等，但是发酵水平普遍不高，CN1570130A专利中提到的新工艺其发酵效价只有2.023g/L，导致后续提取成本升高，势必增加患者的用药负担。因此提供一种新的制备环孢菌素A的方法是非常需要的。
发明内容
本发明提供了一种发酵生产环孢菌素A的新的培养基及其发酵控制工艺，克服了现有生产技术的不足，提高了环孢菌素A的产量，从而为工业化生产提供了一种新的生产工艺。
本发明共涉及三方面的内容，即摇瓶种子液的制备、种子罐的培养和发酵培养。
(1)摇瓶种子培养：
将4℃冰箱保存的新鲜斜面用无菌水充分洗刷，而后将斜面孢子接种摇瓶培养基，于250rpm、温度25-30℃、湿度40％-60％条件下振荡培养30-50小时；
培养基成分和含量：果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L，pH 4.0-6.0；
(2)种子培养：
将(1)中生长好的菌种按接种量1-2％的比例接种种子罐(体积百分比)进行培养，培养条件：温度25-30℃，搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa，培养30-50小时；
培养基成分和含量：果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L，；pH 4.0-6.0；
所说的菌种为多孔木霉(Tolypocladium inflatum csp3)，
(3)发酵培养：
将(2)中培养好的种子按接种量5-15％的比例移种发酵罐，在温度25-30℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养，90小时前pH控在4.0-6.0，之后放弃调控，中间进行补料控制，于200-260小时下罐；
培养基成分和含量：葡萄糖50-200g/L，磷酸氢二铵3-10g/L，L-Valine 1-10g/L，NaNO₃1-5g/L，KCl 0.1-0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，ZnSO₄·7H₂O0.0001-0.0005g/L，MnCl₂·4H₂O 0.00005-0.0001g/L，pH 4.0-6.0，消泡剂5-10g/L；
(4)采用常规方法，从发酵培养产物中收集环孢菌素A。
进一步，在发酵前期，菌丝体生长阶段(90小时内)，通过流加氨水调控发酵液的pH值，使其维持在4.0-6.0，在发酵中后期(120小时)，目的产物开始大量持续分泌，这时不再控制pH，只是维持发酵液中的糖和氨基氮在一定的水平，其中糖浓度保持在10-20g/L，氮浓度在300-1000mg/L，如果发酵液中的糖和氮低于此浓度则进行补料，补料所用的葡萄糖和磷酸氢二铵浓度分别为0.5-1.2g/L，氮浓度为400-450g/L。整个发酵过程依据溶氧保持在20％以上的原则进行通气量和搅拌转速的调节。
本发明通过新的发酵培养基配方和良好的中间控制工艺，使环孢菌素A的发酵水平大大提高，同时90小时之后，发酵液的pH迅速下降到3.0以下，其它杂菌很难生长，为中间补料创造了较好的条件，整个发酵过程可控性强，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。
实施例1
摇瓶种子液培养：将4℃冰箱保存的斜面用无菌水充分洗刷，而后用斜面孢子接种摇瓶培养基，培养基成分为：果糖5g/L，葡萄糖20g/L，豆粉15g/L，玉米浆粉2g/L，pH 5.2，摇瓶装液量为100mL/500mL，接种量为2mL，于250rpm、温度27℃、湿度40％-60％条件下振荡培养50小时获得成熟的种子。
10L种子罐培养：将摇瓶种子液按1％的体积比接种于灭菌完毕、温度27℃的10L种子罐内进行培养。种子罐培养基成分：果糖5g/L，葡萄糖20g/L，豆粉15g/L，玉米浆粉2g/L，pH 5.4，采用的装料量为7L，在搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下，培养45小时。
30L发酵罐培养：发酵培养采用30L的发酵罐，接种量10％，罐体装量18L。培养基成分为：葡萄糖150g/L，磷酸氢二铵5g/L，L-Valine 5g/L，NaNO₃ 1.5g/L，KCl 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，ZnSO4·7H₂O 0.0001g/L，MnCl₂·4H₂O 0.0001g/L，pH 6.0，消泡剂6g/L。在温度27℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养，70小时前pH控在5.0之上，90小时前pH控在4.0之上，之后放弃调控，此时开始测定发酵液中糖和氨基氮的浓度，当糖浓度低于20g/L时，开始流加糖，当氨基氮浓度低于300mg/L时，开始流加磷酸氢二铵溶液，整个培养过程溶氧不低于20％，培养240小时下罐，发酵效价为4.2g/L。
实施例2
摇瓶种子液培养：将4℃冰箱保存的斜面用无菌水充分洗刷，而后用斜面孢子接种摇瓶培养基，培养基成分为：果糖8g/L，葡萄糖20g/L，豆粉20g/L，玉米浆粉3g/L，pH 5.5，摇瓶装液量为100mL/500mL，接种量为2mL，于250rpm、温度27℃、湿度40％-60％条件下振荡培养48小时获得成熟的种子。
10L种子罐培养：将摇瓶种子液按1％的体积比接种于灭菌完毕、温度27℃的10L种子罐内进行培养。种子罐培养基成分：果糖8g/L，葡萄糖20g/L，豆粉20g/L，玉米浆粉3g/L，pH 5.4，采用的装料量为7L，在搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下，培养44小时。
30L发酵罐培养：发酵培养采用30L的发酵罐，接种量15％，罐体装量18L。培养基成分为：葡萄糖130g/L，磷酸氢二铵7g/L，L-Valine 6g/L，NaNO₃ 1.7g/L，KCl 0.15g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KH₂PO₄ 2.5g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0002g/L，MnCl2·4H₂O 0.0001g/L，pH 5.8，消泡剂7g/L。在温度27℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养，70小时前pH控在5.2之上，90小时前pH控在4.5之上，之后放弃调控，此时开始测定发酵液中糖和氨基氮的浓度，当糖浓度低于20g/L时，开始流加糖，当氨基氮浓度低于300mg/L时，开始流加磷酸氢二铵溶液，整个培养过程溶氧不低于20％，培养250小时下罐，发酵效价为5.0g/L。
实施例3
摇瓶种子液培养：将4℃冰箱保存的斜面用无菌水充分洗刷，而后用斜面孢子接种摇瓶培养基，培养基成分为：果糖2.5g/L，葡萄糖25g/L，豆粉20g/L，玉米浆粉3g/L，pH 4.5，摇瓶装液量为100mL/500mL，接种量为2mL，于250rpm、温度27℃、湿度40％-60％条件下振荡培养50小时获得成熟的种子。
10L种子罐培养：将摇瓶种子液按1％的体积比接种于灭菌完毕、温度27℃的10L种子罐内进行培养。种子罐培养基成分：果糖2.5g/L，葡萄糖25g/L，豆粉20g/L，玉米浆粉3g/L，pH 5.4，采用的装料量为7L，在搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下，培养46小时。
30L发酵罐培养：发酵培养采用30L的发酵罐，接种量7％，罐体装量18L。培养基成分为：葡萄糖170g/L，磷酸氢二铵5g/L，L-Valine 6.5g/L，NaNO₃ 1.6g/L，KCl 0.20g/L，MgSO₄.7H₂O 0.18g/L，KH₂PO₄ 2.6g/L，ZnSO₄.7H₂O 0.00015g/L，MnCl₂.4H₂O 0.0001g/L，pH5.9，消泡剂5g/L。在温度27℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养，70小时前pH控在5.5之上，90小时前pH控在4.5之上，之后放弃调控，此时开始测定发酵液中糖和氨基氮的浓度，当糖浓度低于20g/L时，开始流加糖，当氨基氮浓度低于300mg/L时，开始流加磷酸氢二铵溶液，整个培养过程溶氧不低于20％，培养200小时下罐，发酵效价为4.0g/L。
实施例4
摇瓶种子液培养：将4℃冰箱保存的斜面用无菌水充分洗刷，而后用斜面孢子接种摇瓶培养基，培养基成分为：果糖7g/L，葡萄糖22g/L，豆粉20g/L，玉米浆粉4g/L，pH 5.4，摇瓶装液量为100mL/500mL，接种量为2mL，于250rpm、温度27℃、湿度40％-60％条件下振荡培养48小时获得成熟的种子。
10L种子罐培养：将摇瓶种子液按1％的体积比接种于灭菌完毕、温度27℃的10L种子罐内进行培养。种子罐培养基成分：果糖7g/L，葡萄糖22g/L，豆粉20g/L，玉米浆粉4g/L，pH 5.2，采用的装料量为7L，在搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下，培养43小时。
30L发酵罐培养：发酵培养采用30L的发酵罐，接种量15％，罐体装量18L。培养基成分为：葡萄糖150g/L，磷酸氢二铵10g/L，L-Valine 5g/L，NaNO₃ 1.5g/L，KCl 0.20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，KH₂PO4 2.5g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0001g/L，MnCl₂·4H₂O 0.0001g/L，pH 5.5，消泡剂8g/L。在温度27℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养，70小时前pH控在5.6之上，90小时pH控在4.0之上，之后放弃调控，此时开始测定发酵液中糖和氨基氮的浓度，当糖浓度低于20g/L时，开始流加糖，当氨基氮浓度低于300mg/L时，开始流加磷酸氢二铵溶液，整个培养过程溶氧不低于20％，培养240小时下罐，发酵效价为4.5g/L。