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1、(10)申请公布号 CN 102206261 A (43)申请公布日 2011.10.05 CN 102206261 A *CN102206261A* (21)申请号 201110087617.8 (22)申请日 2011.04.08 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/00(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请。
2、人 中国科学院植物研究所 地址 100093 北京市海淀区香山南辛村 20 号 (72)发明人 贺超英 公丕昌 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 一种与植物育性相关的蛋白及其编码基因与 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种与植物育性相关的蛋白质 及其编码基因与应用。该蛋白质， 是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组 成的蛋白质 ； (b)将序列1的氨基酸序列经过一个 或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且与植物育性相关的由序列 1 衍生的蛋白质。实 验证明， 降低。
3、本发明的 OsY14 的表达量， 可以降低 植物的育性， 说明 OsY14 是与植物育性相关的蛋 白质。 本发明所得到的育性降低的转基因植物， 可 作为筛选可提高植物育性基因的模型。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 1 页 CN 102206264 A1/1 页 2 1. 一种蛋白质， 是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且与植物育性相关。
4、的由序列 1 衍生的蛋白质。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白质的基因。 3. 根据权利要求 2 所述的基因， 其特征在于 ： 所述基因为如下 1) 或 2) 或 3) 的 DNA 分 子 ： 1) 序列表中序列 2 自 5 端第 1 至 408 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 2) 在严格条件下与 1) 限定的 DNA 序列杂交且编码植物育性相关蛋白的 DNA 分子 ； 3) 与 1) 限定的 DNA 序列具有 90以上同源性， 且编码植物育性相关蛋白的 DNA 分子 ； 含有所述基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒。 4. 一种培育转基因植物的方法， 是降低目的植。
5、物中权利要求 1 所述蛋白质的编码基因 的表达， 得到育性低于所述目的植物的转基因植物。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述育性降低体现为结实率降低。 6. 如权利要求 4 或 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述降低目的植物中权利要求 1 所述 蛋白质的编码基因的表达是通过将如下式 I 所示的 DNA 片段导入目的植物中实现的 ： SEQ正向-X-SEQ反向 (I) 所述 SEQ正向是序列表中序列 2 中包括第 87-408 位核苷酸段 ； 所述 SEQ反向的序列与所述 SEQ正向的序列反向互补 ； 所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列， 在序列上， 。
6、所述X与所述SEQ正向及 所述 SEQ反向均不互补。 7. 如权利要求 4 或 5 或 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 SEQ正向的核苷酸序列是序列 2 中第 87-408 位核苷酸。 8. 如权利要求 4-7 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述式 I 所示的 DNA 片段的核苷 酸序列为序列表中的序列 3。 9. 如权利要求 4-8 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述降低目的植物中权利要求 1 所述蛋白质的编码基因的表达是通过将如下重组表达载体 pTCK303-OsY14i 导入目的植 物中实现的 ： 将序列 2 中第 87-408 位核苷酸所示 DNA 沿着从 SpeI。
7、 至 SacI 的方向插在载 体 pTCK303 的 SpeI 和 SacI 位点间， 得到的重组载体记作中间重组载体 ； 将序列 2 中第 87-408 位核苷酸的反向互补序列所示的 DNA 的沿着从 KpnI 至 BamHI 的方向插在所述中间 重组载体的 KpnI 和 BamHI 位点间， 得到的重组载体 pTCK303-OsY14i。 10. 如权利要求 4-9 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物为单子叶植物或双子叶 植物， 所述单子叶植物具体可为水稻。 权 利 要 求 书 CN 102206261 A CN 102206264 A1/5 页 3 一种与植物育性相关的蛋白及其。
8、编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种与植物育性相关的蛋白质及其编码基因与应用。 背景技术 0002 植物育性是与作物产量直接相关的因子之一。育性决定遗传基础的研究， 对粮食 安全具有重要意义。 转基因水稻植株的成功和水稻基因组测序工作的完成为研究发现新的 水稻育性相关基因提供了有利条件。通过 RNAi 等分子生物学手段， 对水稻中一些参与育性 决定的基因进行功能研究， 对提高水稻产量具有重要意义。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种与植物育性相关的蛋白质及其编码基因与应用。 0004 本发明所提供的与植物育性相关的蛋白质， 来源于水稻， 名称为 OsY14， 是如下 (a。
9、) 或 (b) ： 0005 (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0006 (b) 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且与植物育性相关的由序列 1 衍生的蛋白质。 0007 序列表中的序列 1 由 135 个氨基酸残基组成。 0008 编码权利要求 1 所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。 0009 所述基因具体可为如下 1) 或 2) 或 3) 的 DNA 分子 ： 0010 1) 序列表中序列 2 自 5 端第 1 至 408 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0011 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂。
10、交且编码植物育性相关蛋白的DNA分子 ； 0012 3) 与 1) 限定的 DNA 序列具有 90以上同源性， 且编码植物育性相关蛋白的 DNA 分子。 0013 所述严格条件可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)、 0.1 SDS 的溶液中， 65条件下 杂交并洗膜。 0014 序列表中的序列 2 由 408 个核苷酸组成。 0015 含有上述基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒， 也属于本 发明的保护范围。 0016 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。 所述植物表达载体还可。
11、包含外源基 因的 3 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA 前体的 3 端， 如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti) 质粒基因 ( 如胭脂合成酶 Nos 基因 )、 植物基因 ( 如大豆贮存蛋白基因 )3 端转录的 非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸 前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子， 如花椰菜花叶病毒 (CAMV)35S 启动子、 玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 说 明 书 CN。
12、 102206261 A CN 102206264 A2/5 页 4 使用本发明的基因构建植物表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅 读框相同， 以保证整个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了 便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行加工， 如加入 可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (GUS 基因、 萤光素酶基 因等 )、 具有。
13、抗性的抗生素标记物 ( 庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等 ) 或是抗化学试剂 标记基因 ( 如抗除莠剂基因 ) 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基 因， 直接以逆境筛选转化植株。 0017 本发明所提供的应用是利用上述蛋白质的编码基因培育转基因植物。 0018 本发明所提供的培育转基因植物的方法， 是降低目的植物中所述蛋白质的编码基 因的表达， 得到育性低于所述目的植物的转基因植物。 0019 所述育性降低具体可体现为结实率降低。 0020 所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达是通过将如下式 I 所示的 DNA 片段导入目的植物中实现的 ： 0021 SEQ正向-。
14、X-SEQ反向 0022 (I) 0023 所述 SEQ正向是序列表中序列 2 中包括第 87-408 位核苷酸的任何一段 ； 0024 所述 SEQ反向的序列与所述 SEQ正向的序列反向互补 ； 0025 所述 X 是所述 SEQ正向与所述 SEQ反向之间的间隔序列， 在序列上， 所述 X 与所述 SEQ 正向及所述 SEQ反向均不互补。 0026 所述 SEQ正向的核苷酸序列具体可为序列 2 中第 87-408 位核苷酸。 0027 所述式 I 所示的 DNA 片段具体可为用 BamHI 和 SacI 从重组载体 pTCK303-OsY14i 中切下的小片段。其核苷酸序列可为序列表中的序列。
15、 3。 0028 所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量可通过将如下重组表达载 体 pTCK303-OsY14i 导入目的植物中实现的 ： 将序列 2 中第 87-408 所示 DNA 沿着从 SpeI 至 SacI的方向插在载体pTCK303的SpeI和SacI位点间， 得到的重组载体记作中间重组载体 ； 将序列 2 中第 87-408 位核苷酸的反向互补序列所示的 DNA 沿着从 KpnI 至 BamHI 的方向插 在所述中间重组载体的 KpnI 和 BamHI 位点间， 得到的重组载体 pTCK303-OsY14i。 0029 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物， 所述单子叶植物。
16、具体可为水稻。 0030 实验证明， 降低本发明的 OsY14 的表达量， 可以降低植物的育性， 说明 OsY14 是与 植物育性相关的蛋白质。本发明所得到的育性降低的转基因植物， 可作为筛选可提高植物 育性基因的模型， 理解育性决定的分子机理。 附图说明 0031 图 1 为 OsY14 的 PCR 电泳图。 0032 左侧泳道为 Marker DL2000， 右侧泳道为 OsY14 基因的 PCR 产物 0033 图 2 为 OsY14-RNAi 的 PCR 电泳图。 0034 左侧泳道为 Marker DL2000， 右侧泳道为 OsY14-RNAi 的 PCR 产物 说 明 书 CN 。
17、102206261 A CN 102206264 A3/5 页 5 0035 图 3 为 pTCK303-OsY14i 相关片段的结构示意图。 0036 图 4 为野生型与转基因植株结实率的比较。 具体实施方式 0037 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0038 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0039 实施例 1、 OsY14 的制备 0040 用如下引物从水稻中扩增 OsY14 的编码基因 ： OsY14F(ATGGCTGCGGTGACCAACG) 和 OsY14R(CTCAGTATCTTCTCCTCGGTG)。 取水稻。
18、叶片提取总RNA， 反转录为cDNA并以其为模板进 行扩增， 得到长度约为 400bp 的 DNA 片段 ( 图 1)。扩增产物连接到 pGEM-T Easy 载体上， 得到重组载体 pGEM-T-OsY14。经克隆测序， 获得 408bp 的 cDNA 片段 ( 其核苷酸序列如序 列2)， 它含有完整的开放阅读框， 共编码含有136个氨基酸的蛋白质(其氨基酸序列如序列 1)， 将其命名为 OsY14。 0041 实施例 2、 培育育性降低的转基因水稻 0042 1、 OsY14-RNAi 载体构建 0043 由于基因组扫描， 发现 OsY14 为单拷贝基因， 因此根据已获得的 OsY14 的。
19、 cDNA 片 段设计特异引物， 构建 RNAi 载体以达到特异性敲除 OsY14 的转录表达。首先用如下引物从 pGEM-T-OsY14 中 PCR 扩增 OsY14-RNAi ： OsY14RNAiF 0044 (TAGGTACCACTAGTTGAAGGATGGATTGTGCTAG) 和 OsY14RNAiR 0045 (ATGGATCCGAGCTCAGTATCTTCTCCTCGGTG)。PCR 扩增得到 322bp 的片段 ( 图 2)。 回收该长度为 322bp 的片段， 然后通过两步酶切和链接， 即一半回收产物经限制性内切酶 SpeI 和 SacI 酶切后， 连到用限制性内切酶 Sp。
20、eI 和 SacI 酶切回收的 pTCK303 载体 (Zhen Wang， Changbin Chen， Yunyuan Xu， Rongxi Jiang， Ye Han， Zhihong Xu， Kang Chong(2004)A practical vector for efficient knockdownof gene expression in rice(Oryza sativa L.).Plant Molecular BiologyReporter 22 ： 409-417 ； 公众可从中国科学院植物研究所获 得 ) 上， 转化大肠杆菌 DH5， 克隆、 测序并提取质粒， 获得中。
21、间重组载体 ； 再用外酶 KpnI 和 BamHI 分别对另一半回收产物和中间重组载体进行双酶切， 分别纯化后进行连接反应， 并转 化至大肠杆菌 DH5 克隆测序， 得到 pTCK303-OsY14i( 图 3)。pTCK303-OsY14i 含有位于 Rice Intron一侧的序列2中第87-408位核苷酸所示的OsY14-RNAi及位于RiceIntron另 一侧的 OsY14-RNAi 的反向互补片段。pTCK303-OsY14i 含有序列 3 所示的 DNA 片段。 0046 将 pTCK303-OsY14i 通过根癌农杆菌 EHA105 的介导转化水稻品种中花 10 号。具 体的方。
22、法如下 ： 取水稻品种中花 10 号 ( 以下简称野生型水稻， 以 WT 表示 ) 种子， 70乙醇 水溶液消毒 1 分钟， 无菌水冲洗 2-3 遍 ； 再用 0.1的升汞溶液振荡消毒 10 分钟以上， 无 菌水冲洗 4-5 遍， 然后在无菌条件下分离出幼胚， 接在 NB 培养基 (N6盐分和维生素， 500mg/ L 谷氨酰胺， 500mg/L 脯氨酸， 300mg/L 水解酪蛋白， 30g/L 蔗糖， 2mg/L2， 4-D， 7g/L 琼脂， pH 5.8) 上， 于 25暗培养 2 周， 得到水稻 WT 幼胚的愈伤组织。将愈伤组织切成小块， 在 NB0.5(NB 培养基， 0.5mg/。
23、L 2， 4-D) 培养基上培养 2-3 周。农杆菌经划线活化后， 挑取单菌 落， 摇至对数期， 再按 1 100 的比例摇菌至 OD600 0.5， 6000rpm 离心 10 分钟， 收集菌体 重悬于AAM-AS(AAM盐分和氨基酸， 500mg/L水解酪蛋白， 0.5mg/L 2， 4-D， 100uM/L乙酰丁香 说 明 书 CN 102206261 A CN 102206264 A4/5 页 6 酮， pH 5.2) 培养基中， 将培养好的成熟胚愈伤组织剪成小块收集到一个培养皿中， 倒于农 杆菌的 AAM-AS 中侵染 20 分钟， 倒出菌液， 用滤纸吸干， 然后倒入 NB2C(NB。
24、 培养基， 10g/L 葡 萄糖， 100uM/L 乙酰丁香酮， pH 5.2) 中， 25共培养 3 天。共培养后的愈伤组织用头孢霉 素300mg/L的无菌水中冲洗3-4遍， 滤纸吸干， 转入筛选培养基I(NB0.5培养基， 25mg/L潮霉 素， 600mg/L头孢霉素)上， 25共培养2周。 后转入筛选培养基II(NB0.5培养基， 50mg/L潮 霉素， 300mg/L 头孢霉素 ) 上， 继续筛选 2 代， 2 周 / 代。将筛选得到的抗性愈伤组织放入带 有无菌滤纸的培养皿中干燥1天， 接种到分化培养基RE1(MS培养基， 1mg/L 6BA， 0.5mg/L激 动素， 0.2mg/。
25、L 玉米素， 0.25mg/LNAA， 50mg/L 潮霉素 ) 上暗培养 1 周， 再转到光下培养 1 周。 然后转到分化培养基 RE2(MS 培养基， 1mg/L 6BA， 0.5mg/L 激动素， 0.2mg/L 玉米素， 0.5mg/ LNAA， 50mg/L潮霉素)上光下培养2周。 待小苗张到2cm左右高时将小苗转移入生根培养基 (1/2MS 培养基， 0.2mg/LNAA)。待小苗长至 10cm 左右时打开容器封口膜， 炼苗 2-3 天， 将阳 性小苗移至人工气候室栽培， 共得到了 7 株阳性 T0 代转基因水稻， 分别命名为 1-4a、 3-1c、 4-2a、 5-1a、 6-1。
26、b、 7-8b 和 8-1a。同时设转入 pTCK303 的稻品种中花 10 号作为对照。 0047 根据载体上带有的潮霉素序列设计引物对所有组培苗进行了基因组 DNA 的 PCR 检测， 结果显示它们全部为阳性的转基因植株。进一步通过 Real-Time RT-PCR 分 析 ( 所 用 引 物 对 的 序 列 为 Y14RNAiExF ： 5 -GAAGGATGGATTGTGCTAGTC-3 ； Y14RNAiExR ： 5 -GCATTCTAAAGCACCATCATCAC-3 )， 精确地定量了 OsY14 在这些转基因株系中的表达情 况， 结果表明在不同的 RNAi 株系中 OsY14。
27、 基因的表达量下降的幅度不同， 在 60 -90 之间变动 ( 表 1)。转基因植物与其受体水稻在株型和营养生长等方面没有明显的差异， 但是在生殖生长发育中却有不同， 主要表现为转基因植株的结实率普遍下降， 其幅度为 20-70(图4)， 具体结实率结果如表2。 其中， 结实率按照如下方法测定 ： 选取每一转基 因植株上三个小穗， 分别统计每一小穗上的饱满和干瘪籽粒数目并计算饱满籽粒的比率， 结实率饱满籽粒数 / 总籽粒数， 每株三个小穗结实率的平均数代表该株结实率， 并以转 入 pTCK303 的稻品种中花 10 号结实率作为对照。 0048 表 1 转基因水稻实时定量表达检测 0049 植。
28、株 表达量 标准差 1-4a 0.01 0.00 3-1c 0.38 0.03 4-2a 0.39 0.06 5-1a 0.29 0.02 6-1b 0.57 0.06 7-8a 0.14 0.01 8-1a 0.54 0.07 说 明 书 CN 102206261 A CN 102206264 A5/5 页 7 WT 1.00 0.10 pTCK303 0.99 0.18 0050 表 2 转基因水稻结实率的变化 0051 植株 结实率 标准差 1-4a 36.22 1.97 3-1c 33.39 4.80 4-2a 56.59 2.24 5-1a 21.95 2.14 6-1b 40.70。
29、 2.94 7-8b 31.55 0.63 8-1a 79.95 4.98 WT 93.27 0.50 pTCK303 92.09 3.16 0052 表 1 中的结果为 3 次重复的平均值和标准差。表 1 和表 2 中， pTCK303 为转入 pTCK303 的稻品种中花 10 号的对照。 说 明 书 CN 102206261 A CN 102206264 A1/4 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102206261 A CN 102206264 A2/4 页 9 0003 序 列 表 CN 102206261 A CN 102206264 A3/4 页 10 0004 序 列 表 CN 102206261 A CN 102206264 A4/4 页 11 序 列 表 CN 102206261 A CN 102206264 A1/1 页 12 图 1图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102206261 A 。