通过融合至 M13 噬菌体的 pIX 而实现的用于设计和生成人 非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的工程化杂交噬菌体载体 【技术领域】
本发明涉及使用源自 M13 噬菌体的 pIX 的工程化杂交噬菌体载体来生成 pIX 噬菌 体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。背景技术
噬菌体展示是基于亲和力的多肽选择的一种成熟工具。( 在典型的噬菌体展示选 择中， 多肽文库经基因工程融合至丝状噬菌体 M13 外壳蛋白之一的末端。噬菌体颗粒提供 所述文库的每个多肽成员与其编码基因之间的物理关联。 接着可针对与所需靶分子结合的 文库成员， 对噬菌体文库进行亲和选择即淘选。 将文库与靶分子混合， 洗掉未结合的噬菌体 颗粒， 洗脱剩下的噬菌体并通过在大肠杆菌细胞中培养而扩增。
尽管已经用 M13 的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示， 然而 pIII 和 pVIII 仍 是目前最常用的融合伙伴。pIII 是 42kD 的次要外壳蛋白， 其负责噬菌体感染进入大肠杆 菌。 每个噬菌体颗粒在其表面含有最多五个拷贝的 pIII 蛋白， 聚集在噬菌体的一端。 PVIII 是噬菌体的主要外壳蛋白 ； 数千个拷贝到 pVIII( 分子量为 5kD) 的拷贝在单链病毒基因组 周围以有序的方式排列而构成噬菌体衣壳。除了 pIII， M13 还有三种其他次要外壳蛋白 ： pVI(12kD 的蛋白 ) 以及 pVII 和 pIX， 其中 pVII 和 pIX 是涉及装配起始和稳定性维持的短 蛋白质 ( 分别具有 33 和 32 个氨基酸 )。五个拷贝的 pVI 蛋白位于噬菌体的与 pIII 相同的 一端， 而五个拷贝的 pVII 和 pIX 的每一者均位于噬菌体的相对两端。
虽然已证实在许多情况下可产生与 pIII 和 pVIII 融合的噬菌体文库展示融合物， 但由噬菌体展示的多肽却受到某些生物学约束。例如， 大多数长度为八个或更多个氨基酸 的肽不能很好地展示为与 pVIII 的融合物。此外， 与噬菌体蛋白自身相互作用或以其他方 式影响 pIII 或 pVIII 的表达、 结合或活性的多肽将不能在文库中充分表达， 因为展示它们 的噬菌体生长不良。最后， 因为 pIII 是相当大的蛋白， pIII 展示的多肽到某些靶位点的通 路 ( 例如， 蛋白表面的深而窄的缝隙 ) 或以多聚体形式存在时功能最佳的多肽的正确装配 将在空间上受到阻碍。因此， 根据利用其他外壳蛋白 ( 其具有不同结构和生物学功能， 因此 可预计会对所展示的多肽施加不同的约束 ) 的噬菌体文库选择将有助于确保搜寻最大量 的序列多样性。在概念验证实验中， 已证实 pVII 和 pIX 可用于展示抗体片段和肽。这些结 果是特别值得注意的， 因为早期研究表明将多肽融合至 pVII 和 pIX 的 N 末端使得这些外壳 蛋白失去功能。
可通过使用噬菌体、 噬菌粒或杂交载体实现在噬菌体上展示外源多肽。使用噬菌 体载体， 通过使用噬菌体载体， 所关注的基因可被引入噬菌体基因组中作为与天然外壳蛋 白基因的框内融合物。这些载体作为全功能噬菌体独立地繁殖并展示多拷贝的外源多肽。 相反， 噬菌粒载体是除细菌复制起点之外还含有噬菌体复制起点和包装信号的质粒。噬菌 粒带有融合到外壳蛋白基因的重组拷贝中的所关注的基因， 并且一旦用辅助噬菌体救援， 噬菌粒即被包装进子代病毒中， 其中展示的多肽整合在噬菌体外壳中。对辅助噬菌体的需要导致噬菌粒载体比噬菌体载体具有更大的工作强度， 并且使定量任何指定样品中所存在 噬菌体数量的工作复杂化。此外， 由于噬菌体颗粒可同时利用野生型外壳蛋白和融合外壳 蛋白进行装配， 因此所得噬菌体的某些部分将不展示所关注的多肽序列， 从而导致较低的 展示效率。杂交载体类似于噬菌体载体， 因为噬菌体基因组中携带有融合蛋白并且不需要 辅助噬菌体， 杂交载体还类似于噬菌粒系统， 因为基因组也携带有融合蛋白的野生型拷贝。 关于 pIX 噬菌体展示的先前报道描述了在噬菌粒载体环境中的融合 ； 关于在来自杂交载体 或噬菌体载体的 pIX 上展示多肽尚未见报道。 最近已报道了多肽在来自噬菌体载体的 pVII 上的展示。
需要提供合成的非抗体肽或蛋白质文库， 和同时提供人治疗性肽和蛋白质的高亲 和力和活性、 高产率、 良好的溶解性质以及在人中施用时低免疫反应倾向这些关键要素的 方法。 相对于现行方法， 还需要提高从合成文库中分离非抗体肽或蛋白质的效率， 以减少发 现非抗体肽或蛋白质的资源耗费以及加速提供非抗体肽或蛋白质用于生物学评价。 通过将 综合设计、 装配技术以及噬菌体 pIX 肽或蛋白质展示加以结合， 本发明的文库和方法满足 了这些需求。 发明内容 本发明提供可与 pVII 和 pIX 噬菌体展示一起使用的工程化 pIX 噬菌体载体， 用于 利用 M13 噬菌体的 pIX 生成肽或蛋白质文库， 如使用诱变或其他多样性产生技术， 可选地 使用同步成熟法 (in line maturation)， 从而为肽或蛋白质以及非抗体肽或蛋白质片段的 生成及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明， 提供了杂交噬 菌体载体， 其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组 pIX 编码 区。
本发明提供将肽和蛋白质展示为与 pIX 或 pVII 噬菌体蛋白的融合物的噬菌体载 体， 以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库， 所述文库用于例如 ( 但不限于 ) 筛 选、 选择、 工程改造、 成熟或其他用途， 例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。 因为天 然基因 IX 的调控区和编码区与 pVII 和 pVIII 的调控区和编码区重叠， 简单融合至该基因 的末端可能造成噬菌体失活 (Hill 和 Petersen， J.of Virol.44 ： 32-46， 1982)。作为替代， 已将 M13mp19 衍生物改造成含有连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组 pIX 编码 区。该载体 ( 而不是噬菌粒 ) 的使用不需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养 噬菌体所花费的时间和工作量。此外， 携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬菌粒的生 长噬菌体的数量更容易确定。
因此本发明提供了新型载体构建体， 其用于以 pIX 噬菌体展示形式表达肽或蛋白 质， 以构建多肽阵列。具体地讲， 本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组 pIX 编码序列 的工程化 pIX 噬菌体载体， 其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白的氨 基末端的外源多肽。优选地， 所述噬菌体颗粒在其表面包含表达的融合蛋白。
在一方面， 本发明提供了工程化的重组核酸噬菌体载体， 其用于表达结合至所选 生物活性配体上的噬菌体展示融合肽或蛋白质， 该载体包含 (a) 重组噬菌体前导编码核酸 序列 ； 可操作地连接至 ： (b) 编码重组标签、 启动子或选择序列的核酸序列 ； 可操作地连接 至： (c) 重组 pIX 或 pVII 编码核酸序列 ； 可操作地连接至 ： (d) 重组限制性位点 ； 可操作地
连接至 ： (e) 编码肽接头的核酸序列 ； 可操作地连接至 ： (f) 选择性地结合到生物活性配体 上的第一外源肽或蛋白质编码序列 ； (g)pVII 编码核酸序列 ； (h) 天然 pIX 编码核酸序列 ； (i)pIII 编码核酸序列 ； 以及 (j)pVI 编码核酸序列。
这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述噬菌体前导编码序列为 pelB 序 列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列为 FLAG 标签序列。这 种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列选自 SEQ ID NO ： 3、 4、 5 或 6。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述 FLAG 标签序列包含 SEQ ID NO ： 2。这种工 程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述启动子为诱导型启动子。 这种工程化的核酸噬菌体 载体可包括其中所述诱导型启动子为 lac 启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其 中所述肽接头选自 SEQ ID NO ： 7 和 8。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述第一 外源肽或蛋白质是推定的生物活性肽或蛋白质。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中 所述生物活性配体至少介导一种生物体内活性。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中 所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳蛋白上的第二外源肽或蛋白质。
本发明还包括包含工程化的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞。 该宿主细胞可表达 生物活性融合蛋白。 本发明还涉及由根据本发明的细菌宿主细胞表达的生物活性融合蛋白。 本发明还 涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白质。
本发明还涉及包含复数种根据本发明的工程化核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞 的噬菌体文库。所述噬菌体文库包括其中所述第一外源肽或蛋白质的变体得以表达。
本发明还提供针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文 库进行筛选的方法， 所述方法包括 ； (a) 由噬菌体文库表达外源肽或蛋白质， 以及 (b) 选择 表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。 本发明还提供了根据此方法得 到的外源肽或蛋白质编码核酸。
在一个实施例中， 噬菌体载体还编码第二融合多肽， 其中第二融合多肽包含融合 至 pIX 或 pVII 蛋白的氨基末端的第二外源多肽， 并且第一融合多肽中的第一外源多肽融合 至 pIX 或 pVII 蛋白的氨基末端。在一个实施例中， 第一和第二融合多肽可联合形成异型二 聚体蛋白质复合物， 例如靶标蛋白质、 受体、 核酸结合蛋白或酶。
在另一个实施例中， 本发明描述了用于在丝状噬菌体表面表达融合蛋白的载体， 所述载体具有用于表达所述融合蛋白的表达盒。该表达盒包含上游和下游可翻译 DNA 序 列， 该 DNA 序列通过适于插入 DNA 定向连接的核苷酸序列 ( 即多位点接头 ) 可操作地连接， 其中上游序列编码原核分泌信号， 下游序列编码 pVII 或 pIX 丝状噬菌体蛋白。 该可翻译 DNA 序列可操作地连接至一组 DNA 表达信号上， 以将该可翻译 DNA 序列表达为融合多肽的一些 部分。 在一个优选的变型中， 载体任选地还包含第二表达盒， 用于在丝状噬菌体表面上表达 第二融合蛋白， 其中第二表达盒具有第一表达盒的结构， 前提条件是第一融合蛋白表达盒 编码 pIX 或 pVII 蛋白和 / 或第二融合蛋白表达盒编码 pIX 或 pVII 蛋白。该载体被用作噬 菌体基因组来在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白质复合物， 其中该异型二聚体的两 种外源多肽通过融合至第一和第二噬菌体蛋白 (pVII 和 / 或 pIX) 而锚定在噬菌体颗粒上。
在另一个实施例中， 基于所述工程化的 pIX 噬菌体载体， 本发明设想了根据本发 明的噬菌体颗粒文库 ( 即组合文库 )， 其中该文库中的代表性颗粒各自展示不同的融合蛋
白。当颗粒展示异型二聚体蛋白复合物时， 该文库包含异型二聚体的组合文库， 如 Fv 分子 3 4 5 6 7 8 文库形式的非抗体肽或蛋白质。优选的文库具有至少 10 、 10 、 10 、 10 、 10 、 10 、 109、 1010、 1011、 1012、 1013( 或其中任何范围或数值 ) 种融合肽或蛋白的组合多样性。
一个相关的实施例描述了包含由本发明的工程化 pIX 噬菌体载体表达的第一和 第二多肽的融合蛋白， 其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋 白， 其中外源蛋白融合至丝状噬菌体蛋白的氨基末端上。
另外， 本发明还设想了多种从本发明的工程化 pIX 噬菌体载体表达蛋白质或肽的 方法， 用于产生噬菌体的组合文库， 包括将编码外源多肽的基因克隆到本发明的载体中、 通 过诱变来修饰文库中外源多肽的结构、 随机组合第一和第二融合蛋白文库的群体、 通过靶 向及亲和筛选 (“淘选” ) 来改变文库的多样性等等。
设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、 工业、 环境以及基 础研究应用的重要目标。在用工程化 pIX 噬菌体载体开发非抗体肽或蛋白质组合文库后， 强有力的下一步骤是朝着人造非抗体肽或蛋白质构建体以及其他蛋白质基序推进， 所述人 造抗体构建体以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。
本发明通过将工程化的 pIX 噬菌体载体用于构建多肽组合阵列而提供噬菌体展 示形式来应对这些挑战， 所述多肽组合阵列中 pVII 和 / 或 pIX 用来展示表达单体或二聚体 的肽或蛋白质种类的融合蛋白。 该技术的范围和能力所固有的是能够展示可参与单体或二聚相互作用的各种蛋 白质。这些蛋白质不仅包括非抗体肽或蛋白质， 还包括某些酶、 激素和激素受体以及 DNA 结 合蛋白。本文所述的展示技术可用于非抗体肽或蛋白质框架区的组合改变， 以及改组并微 型化非抗体肽或蛋白质结构， 或将 DNA 结合蛋白 ( 例如阻遏蛋白 ) 展示为异型二聚体文库， 供选择具有临床和治疗价值的特定 DNA 序列。
因此， 本技术提供了肽或蛋白质文库以及其中成员由单体、 同型二聚体或异型二 聚体阵列组成的组合文库的展示和选择。
应当理解， 以上一般性的描述和以下详细的描述都仅出于示例性和说明性目的， 不应限制受权利要求书保护的本发明。
附图说明
图 1.M13-99 载体中的用于表达重组 FLAG 标签 -pIX 融合蛋白的合成 DNA 插入序 图 2.M13-99 的图谱， 示出了天然噬菌体外壳蛋白基因以及插入的重组 pIX 基因的列。
位置。 图 3. 示出了抗 FLAG 标签抗体对展示在 M13-99 和 M13-99L 噬菌体上的 FLAG-pIX 融合蛋白的特异性结合的 ELISA。
图 4.ELISA 检测到的展示在 pIX 上的肽表位。
图 5.ELISA 检测到的展示在 pIX 上的 EGF。通过添加 IPTG(0.01mM-1mM) 来诱导 EGF-pIX 从杂交载体表达。[IPTG] 浓度＞ 0.05mM 时， 与 EGFR-MMB 的特异性结合明显。
图 6. 展示在 pIX 上的 EGF 的 FACS 分析。 噬菌粒 ： 展示在噬菌粒系统中的 EGF-pIX ； NT ： 含有 pIX-EGF 融合的杂交体， 生长时无 IPTG 诱导 ； 0.01mM 和 1mM:EGF-pIX 杂交体， 分别
由 0.01mM 和 1mM IPTG 诱导。 具体实施方式
本发明提供可与 pVII 和 pIX 噬菌体展示一起使用的工程化 pIX 噬菌体载体， 用于 利用 M13 噬菌体的 pIX 生成肽或蛋白质文库， 如使用诱变或其他多样性产生技术， 可选地使 用同步成熟法， 从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以及治疗性非抗体肽或 蛋白质的选择提供有效快速的平台。 根据本发明， 提供了杂交噬菌体载体， 其已经工程改造 而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组 pIX 编码区。
本发明提供将肽和蛋白质展示为与 pIX 或 pVII 噬菌体蛋白质的融合物的杂交载 体， 以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库， 所述文库用于例如 ( 但不限于 ) 筛 选、 选择、 工程改造、 成熟或其他用途， 例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。 因为天 然基因 IX 的调控区和编码区与 pVII 和 pVIII 的调控区和编码区重叠， 简单融合至该基因 的末端可能造成噬菌体失活 (Hill 和 Petersen， J.of Virol.44 ： 32-46， 1982)(8)。作为替 代， 已将 M13mp19 的衍生物进行工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二 重组 pIX 编码区。该载体的使用不同于噬菌粒， 其不需辅助噬菌体并显著减少在选择和分 析期间培养噬菌体所花费的时间和精力。此外， 携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬 菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。 因此本发明提供了新型载体构建体， 其用于以 pIX 噬菌体展示形式表达肽或蛋白 质， 以构建多肽阵列。具体地讲， 本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组 pIX 编码序列 的工程化 pIX 噬菌体载体， 其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白的氨 基末端的外源多肽。优选地， 噬菌体颗粒包含在其表面上表达的融合蛋白。
利用本文所述的这种工程化 pIX 噬菌体载体生成的人肽或蛋白质从头文库与现 有的非抗体肽或蛋白质文库技术现状不同之处在于它通过 M13 噬菌体的 pIX 基因来展示。
丝状噬菌体
本发明设想将本文所述的工程化 pIX 噬菌体载体与编码至少一种重组融合肽或 蛋白质的 pIX 或 pVII 噬菌体一起使用。该融合蛋白包含融合至丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋 白的氨基末端上的外源多肽部分。
所谓 “外源” 意指融合至噬菌体蛋白的多肽通常不与丝状噬菌体的野生型种类中 的噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白相缔合， 而是对于正常噬菌体蛋白来说是外来的。
在一个优选实施例中， 丝状噬菌体封装有编码第一和 / 或第二融合蛋白的基因 组， 其中第一融合蛋白包含融合至 pVII 或 pIX 的第一外源多肽， 第二融合蛋白包含融合至 pIX 或 pIX 的第二外源多肽。
如本文所述， 丝状噬菌体还包含展示于噬菌体颗粒表面上的一种或多种融合蛋 白。因此， 如果存在至少第一和第二融合蛋白， 则噬菌体可以功能性方式展示这些蛋白质， 使得第一和第二外源多肽可相互作用成为异型二聚体， 从而在噬菌体表面上形成功能性双 链蛋白质复合物。
在存在于本发明噬菌体上的融合蛋白中， 外源多肽与丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白 之间的 “融合” 可包含典型的酰胺键， 或可如实例中所述包含连接多肽 ( 即 “接头” )。可使 用多种接头中的任何一种， 所述接头通常为一段长度为 5 至 50 个氨基酸的序列。尤其优选
的接头可在连接点处给融合蛋白提供高度的活动性。
文库设计 ： 以前的合成文库并入了以下内容的一部分， 但没有一个全面地包含以 下全部内容。
序列多样性的位置和性质。序列多样性是如何内源提供具有高亲和力、 选择性结 合实体的人蛋白质的标志。这种序列多样性的产生和积累不是随机的。基因组序列的核苷 酸突变位点和类型因 DNA 序列和机理而具有偏向性， 但是只有提供结合和功能优势的突变 才被选择和存储， 并且通常还伴有中性置换。 虽然不易从机理预测， 但已知的人肽或蛋白质 序列和结构功能分析的数据库能鉴定在大多数情况下与所需靶标或抗原的识别 ( 包括蛋 白质、 肽和小分子抗原之间的区分 ) 相关的位置和氨基置换。本发明的文库通过利用设计 的简并寡核苷酸来在推定的结合区及功能区整合进置换， 从而提供这种天然的人多样性。
表达、 生物化学和生物物理特性。优选的人类非抗体肽或蛋白质不仅具有所需生 物活性和结合活性， 而且可由多种宿主有效生产， 并且具有稳定性和良好的溶解特性。 高频 率种系基因用法 (1d) 也表明其在哺乳动物系统中具有良好的表达。此外， 通过选择或筛选 的细菌噬菌体展示方法来从文库回收的非抗体肽或蛋白质应在细菌宿主中良好表达。 本发 明的文库是基于人种系衍生的模板， 所述模板是从标准的重组哺乳动物宿主 ( 如 HEK293 和 CHO 细胞 ) 以及细菌宿主良好表达和纯化的， 并且具有高稳定性和良好的溶解特性。
文库组装技术。一些优选的从头非抗体肽或蛋白质文库均具有高的多样性 ( ＞ 10 10 )， 易于改变， 容易组装， 并且不需要的序列的背景低。这些背景序列包括亲代模板和低 靶向多样性。 结合以下方法可加速文库组装并产生低的背景 ： (a) 基于 Kunkle 的单链诱变 ； (b) 具有限制性位点的回文环 ； (c) 大引物。
pIX 肽或蛋白质噬菌体展示。所有以前的丝状噬菌体从头人非抗体肽或蛋白质文 库均利用 pIII 或 pVIII 噬菌体外壳蛋白来进行展示。 pIX 与所选的肽或蛋白质模板的组合 是用于回收非抗体肽或蛋白质的更有效的选择系统， 所回收的非抗体肽或蛋白质在转化为 单克隆抗体及其他相关分子时保留它们的选定特性。
肽或蛋白质展示。肽或蛋白质是人非抗体肽或蛋白质的天然片段， 当它们通过基 因工程引入至完全非抗体肽或蛋白质中时可更好地重演它们的活性。 肽或蛋白质的有效丝 状噬菌体展示除了要求在细菌宿主中良好表达这个性质之外还要去其他特性。 本发明的文 库中所用的肽序列被选择用于通过 pIX 在丝状噬菌体上有效展示。
噬菌粒展示。相对于噬菌体 pIX 外壳蛋白而言肽或蛋白质分子可能较大， 因此如 果连接至在细菌细胞中产生的所有 pIX 蛋白的话， 则可能干扰重组噬菌体颗粒的装配。规 避此干扰的一种方法为利用 pIX 噬菌粒系统， 凭此野生型 pIX 蛋白和肽或蛋白质连接的 pIX 蛋白都可整合进重组噬菌体颗粒中。在一个优选应用中， 本发明的文库是通过 pIX 在噬菌 粒系统中展示。
用于展示的噬菌体外壳蛋白 pIX。类似于 pIII， pIX 以较低的拷贝数存在于噬菌 体上， 并适合于对所展示的肽或蛋白质进行亲和选择。然而， pIII 蛋白参与侵染过程并起 着关键作用， 展示在该 pIII 蛋白上的蛋白质可能会干扰侵染效率。此外， 重链 Fd 片段或轻 链片段均可与 pIX 融合以进行展示。预计展示在 pIX 蛋白上的本发明文库可被有效复制并 递呈， 以进行选择和 / 或筛选。
肽或蛋白质 -pIX 表达。筛选从噬菌体文库中回收的肽或蛋白质的一种方法是去除连接至用来展示的肽或蛋白质分子上的噬菌体外壳蛋白。pIX 蛋白的小尺寸提供了不需 此步骤而直接筛选肽或蛋白质的生产选择。
噬菌体构造。合适的 M13 或相似类型的噬菌体载体可用作根据本发明的工程化载 体。可根据已知技术对具有合适调节、 选择、 限性制酶切以及其他所需位点和序列 ( 如启动 子、 信号序列、 前导序列 ( 如 pelB)、 核糖体结合位点 ( 如 Shine-Delgano)、 标签 ( 如 FLAG 标签 )、 转录终止子 ( 如 trpA)、 选择序列 ( 如 LACZ)、 限制性位点 ( 如 HindIII、 EcoRI)、 肽 接头等等 ) 的编码 pIX 或 pVII 融合蛋白的这种载体进行修饰， 使其还包含连接至上游信号 肽编码序列和诱导型启动子 ( 如 LacZa) 的第二 pIX 和 / 或 pVII 编码序列。这消除了对辅 助噬菌体的需要， 并且还显著减少了在选择和 / 或分析步骤期间培养噬菌体所需的时间和 精力。另外， 与使用其他载体相比， 可更容易地确定需要培养的噬菌体数量。
举个非限制性的例子， 源自 M13mp19 的 M13KE 是已知的可通过插入重组 pIX 基因 来提供本发明的工程化 pIX 噬菌体载体的噬菌体载体。可将重组区插入 ( 例如 )M13mp19 的 lacZα 区， 位于噬菌体基因组的基因间区域中， 因此 lac 启动子可驱动重组基因 IX 融合 的转录。插入序列 ( 图 1) 可包含 Shine-Delgarno 序列 ( 核糖体结合位点 )、 来自果胶裂解 酶 B 的信号序列 (pelB)、 用于后续克隆的双 BbsI 限制性酶识别位点、 pIX 编码区以及 trpA 转录终止子。FLAG 标签肽 DYKDDDDK 以及五氨基酸接头 (M13-99 ： GGTKT) 或九氨基酸接头 (M13-99L ： SGGSGGTKT) 包含在 pelB 与 IX 基因之间。 可用九氨基酸接头将具有各种长度和电荷的另外的肽 ( 例如， 但不限于表 1 中的 那些 ) 展示于 pIX 的氨基末端， 以确定最适合表达特定多肽的接头。此外， 将一种或多种外 源融合肽展示于 pIX 或 pVII 上。
可针对肽标签的展示分析最终噬菌体载体是否含有重组 pIX 基因， 如在 ELISA 实 验中进行分析。可用抗 M13/ 或靶标缀合物或任何其他表达外源肽的检测方法来检测结合 至固定化的靶标肽或蛋白质上的噬菌体。
优点。用于在 pIX 上展示肽的杂交系统相对于此前开发的 pIX 噬菌粒系统来说具 有速度和方便性方面的优点。可将噬菌体感染进宿主细胞中并扩增一个下午， 基本上在一 个步骤中进行。 相反， 噬菌粒的扩增需要进行噬菌粒感染和长出、 用辅助噬菌体以确定的培 养物浓度进行超感染以及对所救援的噬菌体进行扩增。 因此该过程必需要额外的步骤和操 作者输入， 并且 ( 至少 ) 要过夜培养。相对于典型选择实验中涉及的重复选择循环和多轮 筛选过程， 杂交系统的时间节省十分明显。 此外， 噬菌粒扩增可生成含有噬菌粒或辅助噬菌 体基因组的噬菌体混合物。因此精确定量含有噬菌粒基因组的病毒颗粒的数量更为困难。 杂交系统不需辅助噬菌体感染， 因而仅存在一种类型的噬菌体基因组可包装进噬菌体颗粒 中。这样便生成了均一的噬菌体群体， 从而可精确测量包含融合基因组的病毒颗粒。
虽然已概括地描述了本发明， 但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公 开， 所述实例不应理解为限制权利要求的范围。
实例 1 ： 示例性的工程化噬菌体载体的构建
噬菌体的构建。 M13-99 和 M13-99L 含有插入噬菌体基因组 M13KE(M13mp19 的衍生 物 ) 的重组 pIX 基因。 该重组区被插入 M13mp19 的 lacZα 区， 位于噬菌体基因组的基因间区 域， 因此 lac 启动子可驱动重组基因 IX 融合的转录。 插入序列 ( 图 1) 包含 Shine-Delgarno 序列 ( 核糖体结合位点 )、 果胶裂解酶 B 的信号序列 (pelB)、 用于后续克隆的双 BbsI 限制性
酶识别位点、 pIX 编码区以及 trpA 转录终止子。FLAG 标签肽 DYKDDDDK(SEQ ID NO ： 2) 和五 氨基酸接头 (M13-99 ： GGTKT(SEQ IDNO ： 7)) 或九氨基酸接头 (M13-99L ： SGGSGGTKT(SEQ ID NO ： 8)) 包含于 pelB 和基因 IX 之间。
具有各种长度和电荷的四种另外的肽 ( 表 1) 通过九氨基酸接头展示于 pIX 的氨 基末端。此外， 将表皮生长因子 (EGF)(5.6kDa) 展示于 pIX 上， 以评估通过多个二硫键展示 的球蛋白的可行性。
方法。 合成编码两侧有 HindIII 和 EcoRI 酶识别位点的 FLAG 盒 ( 图 1) 的 DNA(Blue Heron)， 通过限制性酶消化使之从其穿梭载体中释放出来， 然后连接进已经用 HindIII 和 EcoRI 消化过的 M13KE(New England Biolabs)。最终的噬菌体载体 M13-99(SEQ ID NO ： 1) 在图 2 中示出。对于其他肽， 使互补的寡核苷酸退火到一起而生成合适的 DNA 序列。退火 的寡核苷酸含有与 BbsI 消化的 13-99L 载体对应的相容悬突， 使得肽标签 DNA 和载体能连 接。 对 EGF 进行 PCR 扩增， 用 BbsI 限制性内切酶消化， 然后连接到 BbsI 消化的 M13-99L 中。 接种重组噬菌体以用于在 XL-1 蓝宿主大肠杆菌细胞 (Stratagene) 的菌苔上分离出单个菌 斑。将噬菌斑重新悬浮于介质中， 并让其在琼脂上扩散。将噬菌体感染进 XL-1 蓝大肠杆菌 细胞并在 37℃下培养 4.5 小时。1mM IPTG 是诱导 pIX 融合蛋白表达的标准手段， 但对于某 些实验， 可使用多种量 (1.0 至 0.01mM) 的 IPTG 来诱导 EGF 表达。在噬菌体生长和诱导之 后， 通过离心移除细菌， 用 4％ PEG-8000、 0.5M NaCl 将噬菌体从培养上清液中沉淀出来， 并 在 4℃下孵育过夜。通过离心回收噬菌体颗粒， 并将噬菌体粒料重新悬浮于磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。
pIX 展示的肽的分析。在 ELISA 实验中针对肽标签的展示对含有重组 pIX 基因的 噬菌体进行测试。用抗 M13/HRP 缀合物来检测结合在固定化的单克隆非抗体肽或蛋白质上 的噬菌体。除了 M13-99 和 M13-99L， 还包括了 M13KE 亲代载体作为阴性对照。在完全相同 的抗 FLAG 包被的小孔中， 将过量的合成 FLAG 肽包括在噬菌体结合反应物中作为竞争物。 相 对于抗多聚组氨酸抗体， M13-99 和 M13-99L 看起来都特异性地结合至抗 FLAG 抗体， 并且此 结合被过量的 FLAG 肽所抑制， 表明 FLAG 标签在重组 pIX 上成功展示 ( 图 3)。M13-99L 产 生较低的背景信号， 因此被用于其他肽的展示。
其他肽的 ELISA 数据示于图 4 中。抗 his、 抗 myc、 抗 V5 以及抗 HA 非抗体肽或蛋 白质被用于合适的噬菌体。在每个实验中包括 Fc 以作为阴性对照。这些结果表明这些肽 也在重组 pIX 上成功展示。
方法。将 Maxisorp ELISA 板 (NUNC) 的小孔用 250ng 单克隆非抗体肽或蛋白质 (PBS 中 4μg/mL) 包被， 在 4℃下过夜。用含有 0.1％ Tween-20 的 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 冲洗小孔两次， 然后用 Starting Block(Pierce) 在室温下封闭 1 小时。再次冲洗小孔。将 稀释于 Starting Block 中的 PEG 沉淀的噬菌体 ( 约 109pfu) 加入小孔中并且在室温下振 荡孵育 1.5 小时。对于 M13-99 和 M13-99L， 加入 FLAG 肽至终浓度为 0.1mg/mL 以作为竞 争剂并继续孵育 15 分钟。用 TBS-T 冲洗小孔三次， 将抗 M13/ 辣根过氧化物酶缀合物 (GE Healthcare)( 在 Starting Block 中以 1 ∶ 5000 稀释 ) 加入小孔中， 并在室温下振荡孵育 1 小时。用 TBS-T 冲洗小孔三次， 然后加入 POD 化学发光底物 (Roche) 并且在 Tecan 读板器 上进行检测。
pIX 展示的 EGF 的分析。在 ELISA 实验中测试了 pIX 展示的 EGF 与 EGFR-MMB 的结合， 并在 FACS 实验中测试了与在 A431 细胞上表达的 EGFR 的结合。( 注意， EGFR-MMB 融合 蛋白已在另一个最近的发明公开中有所描述。) 用抗 m13:HRP 单克隆抗体检测通过 ELISA 发现结合至 EGFR-MMB 的噬菌体颗粒 ( 图 5)， 而那些通过 FACS 发现结合至 A431 细胞上的 EGFR 的噬菌体颗粒则用抗 M13:FITC 单克隆抗体进行检测 ( 图 6)。 ELISA 数据证实 EGF 成功 展示于 pIX 杂交系统中。在 FACS 实验中， 将亲代载体 M13KE 和未诱经导的 EGF-pIX 杂交噬 菌体包括在内作为阴性对照。方法。对于 ELISA 实验， 用 5μg/mL 的抗 Fc 单克隆抗体包被 Maxisorp 板， 4℃下过夜。 用 TBS-T 冲洗板三次， 然后将 500ng EGFR-MMB 加至一半被包被小 孔中。用 TBS-T 处理剩余的小孔。洗涤该板， 并以每孔 300μL 的 Chemiblocker(Chemicon) 在室温下封闭 1 小时。用 TBS-T 冲洗小孔， 将噬菌体的系列稀释液加入小孔中， 使其结合 1 小时。 用 TBS-T 洗小孔 3 次后， 如上所述检测所结合的噬菌体。 对于 FACS 分析， 用 0.25％的 tyrpsin-EDTA 收获 A431 细胞， 用含 10％ FBS 和 1％ NEAA 的完全 DMEM 洗涤两次， 以 2.5×106 个细胞 / 毫升重新悬浮于含有叠氮化钠的 FACS 缓冲液中。将细胞 (2.5×105) 与滴定当量 的噬菌体或小鼠抗 M13:FITC(RDI， Fitzgerald Industries) 于 4℃在含有叠氮化钠的 FACS 缓冲液中一起孵育一小时。将细胞在 FACS 缓冲液中洗涤两次以移除任何未结合的噬菌体， 并将其与小鼠抗 M13:FITC 抗体于 4℃下在 FACS 缓冲液中孵育一小时。洗涤细胞以移除未 结合的抗体， 并用流式细胞仪分析噬菌体结合。
图 1. 克隆至 pIX 杂交表达载体中的肽序列。 肽标签 FLAG HA His MYC V5 氨基酸序列 DYKDDDDK(SEQ ID NO ： 2) YPYDVPDYA(SEQ ID NO ： 3) HHHHHH(SEQ ID NO ： 4) MEQKLISEEDLNS(SEQ ID NO ： 5) GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO ： 6)参考文献
1.Kehoe， J.W. 和 B.K.Kay， 2005， Filamentous phage display in the new millennium， Chem Rev 105 ： 4056。
2.Iannolo， G.、 O.Minenkova、 R.Petruzzelli 和 G.Cesareni， 1995， Modifying filamentous phage capsid ： limits in the size of the major capsid protein， J Mol Biol 248 ： 835。
3.Gao， C.、 S.Mao、 C.H.Lo、 P.Wirsching、 R.A.Lerner 和 K.D.Janda， 1999， Making artificial non-antibody peptides or proteins ： a format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays， Proc Natl Acad Sci U S A 96 ： 6025。
4.Gao， C.、 S.Mao、 G.Kaufmann、 P.Wirsching、 R.A.Lerner 和 K.D.Janda， 2002， A
method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display， Proc Natl Acad Sci USA 99 ： 12612。
5.Gao ， C. 、 S.Mao 、 H.J.Ditzel 、 L.Farnaes 、 P.Wirsching 、 R.A.Lerner 和 K.D.Janda.2002， A cell-penetratingpeptide from a novel pVII-pIX phage-displayed random peptide library， Bioorg Med Chem 10 ： 4057。
6.Endemann， H. 和 P.Model， 1995， Location of filamentous phage minor coat proteins in phage and in infected cells， J Mol Biol 250 ： 496。
7.Kwasnikowski P 、 P.Kristensen 和 W.T.Markiewicz ， 2005 ， Multivalent display system on filamentous bacteriophage pVII minor coat protein， J Immunol Methods 307 ： 135。
8.Hill， D.F. 和 G.B.Petersen， 1982， Nucleotide Sequence of Bacteriophage f1 DNA， Journal of Virology 44 ： 32。
序列表
SEQ ID NO ： 1
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgccccaaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaactaaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagacaccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaagctctaagcca 240
tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaatcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcgatatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctgactataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaactgtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgctatccagtct 540
aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctctcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttactatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaaatctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaacgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcataaggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgttctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgatttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctatgcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttcccttatgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcgacacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataatcgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttggtgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagtctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctgctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaatatatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagctgtttaagaa 150013101965402 A CN 101965403
说aaagcaagct tttcaacgtg ggccgaaact ctggaaagac tacaggcgtt tgggcttgct cggttctgag tacttatatc tcctaatcct gttccgaaat ccccgttaaa ctggaacggt ttgtgaatat ctctggtggt gggtggcggc tgaaaagatg acagtctgac tggtttcatt tggctctaat tttccgtcaa cgctggtaaa ctttgcgttt actgcgtaat ttcctcggtt ttcggtaaga attcttgtgg gttcagttaa gctgctattt taatatggct tggtaagatt gcttcaaaac ggataagcct aaataaaaac gaatgataag ggatattatt agctgaacat tttatattct taaatatggc tttgtataac明书tacaattaaa tattcgcaat gtttagcaaa tagatcgtta ctggtgacga atgagggtgg ctaaacctcc acggcactta agtctcagcc cattaactgt agtacactcc actgcgcttt cgtctgacct gcggctctga gcggttccgg ataagggggc aacttgattc ccggccttgc ctcaagtcgg ccctccctca tttctattga ttgccacctt aatcatgcca aactttgttc tatttcattg tgatattagc taatgcgctt cgttaaacaa taactggcaa ttgtagctgg tcgggaggtt atttgcttgc ttctcgatga cgattattga aggacttatc gtcgtcgtct gctcgaaaat taagccctac ctaaacaggc11/13 页attcacctcg ttttggagat attctcactc ttactaacgt tgtggaatgc gggttcctat ctgagggtgg ttccgggcta accccgctaa agaataatag aaggcactga atgacgctta atccattcgt ctggcggcgg gcggttctga attttgatta aaaacgcgct ctgctatcga gtgattttgc taatgaataa ttgtctttag tccgtggtgt ttgctaacat attattgcgt taaaaagggc gcttaactca tgttcagggt ctctgtaaag ttgggataaa tcgttagcgt ttgatttaag ttagaatacc cctacgatga cccgttcttg aattaggatg gttctgcatt ttgtcggtac ttggcgttgt ctggtaagaagataaaccga aaaaaattat gttgaaagtt gacaaaactt gtagtttgta atccctgaaa ggtggcggta aaccctctcg tctcttgagg aggcaggggg acttattacc aaattcagag caaggccaat ggttctggtg tctgagggag gcaaacgcta gctaaaggca ggtgacgttt tcccaaatgg tatttacctt ccatatgaat cttttatatg aaggagtctt tccttctggt tagctattgc gttatctctc ttctcccgtc tcatttttga gtttattttg caggataaaa ctcccgcaag tctatatctg ggcttgcttg gaaagacagc tttcttgttc gttgtttatt cttattactg gattctcaat gcatatgata14ggctccttttggagcctttt tcctttagtggtacctttct atcccatacagaaaattcat cgctaactatgagggttgtc aactcagtgttacggtacat tggctctgagggtggcggtt tgagtacggtgatacaccta tccgcctggtactgagcaaa tcttaatactttcatgtttc ttatacgggcactgttactc tgtatcatcaaaagccatgt ccattctggctttaatgaag gcctcaacctcctgtcaatg gggtggtggctctgagggtg tggtggctctggttccggtg tatgaccgaaaatgccgatg tgtcgctactgattacggtg taatggtaatggtgctactg tgacggtgataattcacctt atcggttgaatgtcgccctt ttgtgacaaaataaacttat tatgtatgtattttctacgt gttcttttgggtattccgtt ggctatctgcttacttttct tttcttgctcttattattgg gctcaattaccctctgactt ccctgtttttatgttattct aaaatcgtttcttatttgga attaggctctggaaagacgc gtgcaaaatagcaactaatc cgctaaaacgcctcgcgttc tattgggcgcggtaatgatt gtgcggtacttggtttaata ttggtttctacatgctcgta tattgttgataaacaggcgc ggacagaattactttacctt gcctctgcctaaattacatg tgttgagcgttggctttata tttttctagtaattatgatt1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840101965402 A CN 101965403
说ttcttattta gaagatgaaa tggatttgca ggtagtctct tctaagctat acagaagcaa taattcaaat cttcttttgc attcaaagca tatattcatc ctaataattt atcaggatta ctccttctgg ataacgttcg ctaaatcctc aagatatttt tattgattga ctgctggctc ttttatcttc ttcgcgcatt tttcaggtca tgactggtga gtatttccat ccagcaaggc gaagtattgc ctgattataa tcggcctcct tcaaagcaac acgcgcagcg ccttcctttc ttagggttcc ggttcacgta acgttcttta tattcttttg gcctgctggg agggcaatca cgcaaaccgc cccgactgga gcaccccagg明书tatcacacgg tatatttgaa catatagtta attttgataa tcaaggattc tcacatatat aatgtaatta gaaatgaata tccgttattg cctgaaaatc ggttcaattc ttgccatcat gttccgcaaa ttaatacgag tctattgacg cctcaattcc tttgaggttc actgttgcag tcgttcggta agccattcaa atctctgttg gtaaataatc cctgttgcaa agttcttcta aatttgcgtg caagattctg cgctctgatt gccctgtagc acttgccagc cgccggcttt tttacggcac gccctgatag cttgttccaa gattttgccg gtggaccgct gtctcgctgg gcgttggccg tgagcgcaac tatgcttccg12/13 页ccggtgttta atttaggtca gtcttgcgat aggttaaaaa agcgtcttaa gcgacgattt ttaaaaaagg gtttcatcat gtaacttggt actgttactg gttttacgtg aatccaaaca gataattccg tttaaaatta tctaatactt agtgcaccta actgaccaga ttttcatttg ctcacctctg gggctatcag attcttacgc actggtcgtg caaaatgtag ctggatatta actaatcaaa ggtggcctca atccctttaa tacgtgctcg tgtggtggtt cgctttcttc ggggctccct tttgggtgat gttggagtcc tatctcgggc caggattttc caggcggtga gcgcccaata cgacaggttt cactcattagacgccttatt ttaactaaaa tcagcattta cagacctatg cgctatgttt ggttattcac gaaattgtta tcaggtaatt atcaggcgaa tgacgttaaa tgatatggtt tattgatgaa tggtttcttt ggcaaaggat aaatgtatta agataacctt gggtttgata tcagcgtggc tgctggtggt aaagactaat gaagggttct atctgccaat gagcgttttt cgatagtttg tacaacggtt aaacacttct gtttagctcc catagtacgc tgaccgctac tcgccacgtt gatttagtgc gtgggccatc atagtggact atttataagg gcaaaccagc gctgttgccc ctctccccgc aagcgggcag ctttacactt15tcggtatttcaaaccattaa aaagttttctcgcgttcttt tataacccaacctaagccgg attcactattgactcttctc taagggaaaattaattaata tgatttatgtactgtttcca attttgttttcttgatgttt attcgcctctgcgcgatttt tttctcccgatgtaaaaggt tacgcaatttctttatttct cttccataattcagaagtat ctgataatcaggaatatgat atgataatgttactcaaact ttgtcgaattgtttgtaaag gctctaatctattagttgtt tttctactgttgatttgcca agcaaggtgatgctttagat gcggtgttaatactgaccgc tttttaatggcgatgtttta aaatattgtctgtgccacgt gccagaatgtcccttttatt catttcagacgattgagcgt tggctggcggtaatattgtt ctcaggcaagtgatgttatt atggacagactcttttactc gcgtaccgttcctgtctaaa ccaacgaggaaagcacgtta ggcgcattaagcgcggcggg gccctagcgcccgctccttt ccccgtcaagctctaaatcg ctcgaccccaaaaaacttga acggtttttcgccctttgac actggaacaacactcaaccc atttcggaaccaccatcaaa tgctgcaactctctcagggc tgaaaagaaaaaccaccctg attcattaatgcagctggca gcaattaatgtgagttagct gctcgtatgttgtgtggaat3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180101965402 A CN 101965403
本发明涉及使用源自 M13 噬菌体的 pIX 的工程化杂交噬菌体载体来生成 pIX 噬菌 体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。背景技术
噬菌体展示是基于亲和力的多肽选择的一种成熟工具。( 在典型的噬菌体展示选 择中， 多肽文库经基因工程融合至丝状噬菌体 M13 外壳蛋白之一的末端。噬菌体颗粒提供 所述文库的每个多肽成员与其编码基因之间的物理关联。 接着可针对与所需靶分子结合的 文库成员， 对噬菌体文库进行亲和选择即淘选。 将文库与靶分子混合， 洗掉未结合的噬菌体 颗粒， 洗脱剩下的噬菌体并通过在大肠杆菌细胞中培养而扩增。
尽管已经用 M13 的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示， 然而 pIII 和 pVIII 仍 是目前最常用的融合伙伴。pIII 是 42kD 的次要外壳蛋白， 其负责噬菌体感染进入大肠杆 菌。 每个噬菌体颗粒在其表面含有最多五个拷贝的 pIII 蛋白， 聚集在噬菌体的一端。 PVIII 是噬菌体的主要外壳蛋白 ； 数千个拷贝到 pVIII( 分子量为 5kD) 的拷贝在单链病毒基因组 周围以有序的方式排列而构成噬菌体衣壳。除了 pIII， M13 还有三种其他次要外壳蛋白 ： pVI(12kD 的蛋白 ) 以及 pVII 和 pIX， 其中 pVII 和 pIX 是涉及装配起始和稳定性维持的短 蛋白质 ( 分别具有 33 和 32 个氨基酸 )。五个拷贝的 pVI 蛋白位于噬菌体的与 pIII 相同的 一端， 而五个拷贝的 pVII 和 pIX 的每一者均位于噬菌体的相对两端。
虽然已证实在许多情况下可产生与 pIII 和 pVIII 融合的噬菌体文库展示融合物， 但由噬菌体展示的多肽却受到某些生物学约束。例如， 大多数长度为八个或更多个氨基酸 的肽不能很好地展示为与 pVIII 的融合物。此外， 与噬菌体蛋白自身相互作用或以其他方 式影响 pIII 或 pVIII 的表达、 结合或活性的多肽将不能在文库中充分表达， 因为展示它们 的噬菌体生长不良。最后， 因为 pIII 是相当大的蛋白， pIII 展示的多肽到某些靶位点的通 路 ( 例如， 蛋白表面的深而窄的缝隙 ) 或以多聚体形式存在时功能最佳的多肽的正确装配 将在空间上受到阻碍。因此， 根据利用其他外壳蛋白 ( 其具有不同结构和生物学功能， 因此 可预计会对所展示的多肽施加不同的约束 ) 的噬菌体文库选择将有助于确保搜寻最大量 的序列多样性。在概念验证实验中， 已证实 pVII 和 pIX 可用于展示抗体片段和肽。这些结 果是特别值得注意的， 因为早期研究表明将多肽融合至 pVII 和 pIX 的 N 末端使得这些外壳 蛋白失去功能。
可通过使用噬菌体、 噬菌粒或杂交载体实现在噬菌体上展示外源多肽。使用噬菌 体载体， 通过使用噬菌体载体， 所关注的基因可被引入噬菌体基因组中作为与天然外壳蛋 白基因的框内融合物。这些载体作为全功能噬菌体独立地繁殖并展示多拷贝的外源多肽。 相反， 噬菌粒载体是除细菌复制起点之外还含有噬菌体复制起点和包装信号的质粒。噬菌 粒带有融合到外壳蛋白基因的重组拷贝中的所关注的基因， 并且一旦用辅助噬菌体救援， 噬菌粒即被包装进子代病毒中， 其中展示的多肽整合在噬菌体外壳中。对辅助噬菌体的需要导致噬菌粒载体比噬菌体载体具有更大的工作强度， 并且使定量任何指定样品中所存在 噬菌体数量的工作复杂化。此外， 由于噬菌体颗粒可同时利用野生型外壳蛋白和融合外壳 蛋白进行装配， 因此所得噬菌体的某些部分将不展示所关注的多肽序列， 从而导致较低的 展示效率。杂交载体类似于噬菌体载体， 因为噬菌体基因组中携带有融合蛋白并且不需要 辅助噬菌体， 杂交载体还类似于噬菌粒系统， 因为基因组也携带有融合蛋白的野生型拷贝。 关于 pIX 噬菌体展示的先前报道描述了在噬菌粒载体环境中的融合 ； 关于在来自杂交载体 或噬菌体载体的 pIX 上展示多肽尚未见报道。 最近已报道了多肽在来自噬菌体载体的 pVII 上的展示。
需要提供合成的非抗体肽或蛋白质文库， 和同时提供人治疗性肽和蛋白质的高亲 和力和活性、 高产率、 良好的溶解性质以及在人中施用时低免疫反应倾向这些关键要素的 方法。 相对于现行方法， 还需要提高从合成文库中分离非抗体肽或蛋白质的效率， 以减少发 现非抗体肽或蛋白质的资源耗费以及加速提供非抗体肽或蛋白质用于生物学评价。 通过将 综合设计、 装配技术以及噬菌体 pIX 肽或蛋白质展示加以结合， 本发明的文库和方法满足 了这些需求。 发明内容 本发明提供可与 pVII 和 pIX 噬菌体展示一起使用的工程化 pIX 噬菌体载体， 用于 利用 M13 噬菌体的 pIX 生成肽或蛋白质文库， 如使用诱变或其他多样性产生技术， 可选地 使用同步成熟法 (in line maturation)， 从而为肽或蛋白质以及非抗体肽或蛋白质片段的 生成及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明， 提供了杂交噬 菌体载体， 其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组 pIX 编码 区。
本发明提供将肽和蛋白质展示为与 pIX 或 pVII 噬菌体蛋白的融合物的噬菌体载 体， 以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库， 所述文库用于例如 ( 但不限于 ) 筛 选、 选择、 工程改造、 成熟或其他用途， 例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。 因为天 然基因 IX 的调控区和编码区与 pVII 和 pVIII 的调控区和编码区重叠， 简单融合至该基因 的末端可能造成噬菌体失活 (Hill 和 Petersen， J.of Virol.44 ： 32-46， 1982)。作为替代， 已将 M13mp19 衍生物改造成含有连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组 pIX 编码 区。该载体 ( 而不是噬菌粒 ) 的使用不需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养 噬菌体所花费的时间和工作量。此外， 携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬菌粒的生 长噬菌体的数量更容易确定。
因此本发明提供了新型载体构建体， 其用于以 pIX 噬菌体展示形式表达肽或蛋白 质， 以构建多肽阵列。具体地讲， 本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组 pIX 编码序列 的工程化 pIX 噬菌体载体， 其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白的氨 基末端的外源多肽。优选地， 所述噬菌体颗粒在其表面包含表达的融合蛋白。
在一方面， 本发明提供了工程化的重组核酸噬菌体载体， 其用于表达结合至所选 生物活性配体上的噬菌体展示融合肽或蛋白质， 该载体包含 (a) 重组噬菌体前导编码核酸 序列 ； 可操作地连接至 ： (b) 编码重组标签、 启动子或选择序列的核酸序列 ； 可操作地连接 至： (c) 重组 pIX 或 pVII 编码核酸序列 ； 可操作地连接至 ： (d) 重组限制性位点 ； 可操作地
连接至 ： (e) 编码肽接头的核酸序列 ； 可操作地连接至 ： (f) 选择性地结合到生物活性配体 上的第一外源肽或蛋白质编码序列 ； (g)pVII 编码核酸序列 ； (h) 天然 pIX 编码核酸序列 ； (i)pIII 编码核酸序列 ； 以及 (j)pVI 编码核酸序列。
这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述噬菌体前导编码序列为 pelB 序 列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列为 FLAG 标签序列。这 种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列选自 SEQ ID NO ： 3、 4、 5 或 6。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述 FLAG 标签序列包含 SEQ ID NO ： 2。这种工 程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述启动子为诱导型启动子。 这种工程化的核酸噬菌体 载体可包括其中所述诱导型启动子为 lac 启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其 中所述肽接头选自 SEQ ID NO ： 7 和 8。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述第一 外源肽或蛋白质是推定的生物活性肽或蛋白质。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中 所述生物活性配体至少介导一种生物体内活性。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中 所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳蛋白上的第二外源肽或蛋白质。
本发明还包括包含工程化的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞。 该宿主细胞可表达 生物活性融合蛋白。 本发明还涉及由根据本发明的细菌宿主细胞表达的生物活性融合蛋白。 本发明还 涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白质。
本发明还涉及包含复数种根据本发明的工程化核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞 的噬菌体文库。所述噬菌体文库包括其中所述第一外源肽或蛋白质的变体得以表达。
本发明还提供针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文 库进行筛选的方法， 所述方法包括 ； (a) 由噬菌体文库表达外源肽或蛋白质， 以及 (b) 选择 表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。 本发明还提供了根据此方法得 到的外源肽或蛋白质编码核酸。
在一个实施例中， 噬菌体载体还编码第二融合多肽， 其中第二融合多肽包含融合 至 pIX 或 pVII 蛋白的氨基末端的第二外源多肽， 并且第一融合多肽中的第一外源多肽融合 至 pIX 或 pVII 蛋白的氨基末端。在一个实施例中， 第一和第二融合多肽可联合形成异型二 聚体蛋白质复合物， 例如靶标蛋白质、 受体、 核酸结合蛋白或酶。
在另一个实施例中， 本发明描述了用于在丝状噬菌体表面表达融合蛋白的载体， 所述载体具有用于表达所述融合蛋白的表达盒。该表达盒包含上游和下游可翻译 DNA 序 列， 该 DNA 序列通过适于插入 DNA 定向连接的核苷酸序列 ( 即多位点接头 ) 可操作地连接， 其中上游序列编码原核分泌信号， 下游序列编码 pVII 或 pIX 丝状噬菌体蛋白。 该可翻译 DNA 序列可操作地连接至一组 DNA 表达信号上， 以将该可翻译 DNA 序列表达为融合多肽的一些 部分。 在一个优选的变型中， 载体任选地还包含第二表达盒， 用于在丝状噬菌体表面上表达 第二融合蛋白， 其中第二表达盒具有第一表达盒的结构， 前提条件是第一融合蛋白表达盒 编码 pIX 或 pVII 蛋白和 / 或第二融合蛋白表达盒编码 pIX 或 pVII 蛋白。该载体被用作噬 菌体基因组来在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白质复合物， 其中该异型二聚体的两 种外源多肽通过融合至第一和第二噬菌体蛋白 (pVII 和 / 或 pIX) 而锚定在噬菌体颗粒上。
在另一个实施例中， 基于所述工程化的 pIX 噬菌体载体， 本发明设想了根据本发 明的噬菌体颗粒文库 ( 即组合文库 )， 其中该文库中的代表性颗粒各自展示不同的融合蛋
白。当颗粒展示异型二聚体蛋白复合物时， 该文库包含异型二聚体的组合文库， 如 Fv 分子 3 4 5 6 7 8 文库形式的非抗体肽或蛋白质。优选的文库具有至少 10 、 10 、 10 、 10 、 10 、 10 、 109、 1010、 1011、 1012、 1013( 或其中任何范围或数值 ) 种融合肽或蛋白的组合多样性。
一个相关的实施例描述了包含由本发明的工程化 pIX 噬菌体载体表达的第一和 第二多肽的融合蛋白， 其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋 白， 其中外源蛋白融合至丝状噬菌体蛋白的氨基末端上。
另外， 本发明还设想了多种从本发明的工程化 pIX 噬菌体载体表达蛋白质或肽的 方法， 用于产生噬菌体的组合文库， 包括将编码外源多肽的基因克隆到本发明的载体中、 通 过诱变来修饰文库中外源多肽的结构、 随机组合第一和第二融合蛋白文库的群体、 通过靶 向及亲和筛选 (“淘选” ) 来改变文库的多样性等等。
设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、 工业、 环境以及基 础研究应用的重要目标。在用工程化 pIX 噬菌体载体开发非抗体肽或蛋白质组合文库后， 强有力的下一步骤是朝着人造非抗体肽或蛋白质构建体以及其他蛋白质基序推进， 所述人 造抗体构建体以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。
本发明通过将工程化的 pIX 噬菌体载体用于构建多肽组合阵列而提供噬菌体展 示形式来应对这些挑战， 所述多肽组合阵列中 pVII 和 / 或 pIX 用来展示表达单体或二聚体 的肽或蛋白质种类的融合蛋白。 该技术的范围和能力所固有的是能够展示可参与单体或二聚相互作用的各种蛋 白质。这些蛋白质不仅包括非抗体肽或蛋白质， 还包括某些酶、 激素和激素受体以及 DNA 结 合蛋白。本文所述的展示技术可用于非抗体肽或蛋白质框架区的组合改变， 以及改组并微 型化非抗体肽或蛋白质结构， 或将 DNA 结合蛋白 ( 例如阻遏蛋白 ) 展示为异型二聚体文库， 供选择具有临床和治疗价值的特定 DNA 序列。
因此， 本技术提供了肽或蛋白质文库以及其中成员由单体、 同型二聚体或异型二 聚体阵列组成的组合文库的展示和选择。
应当理解， 以上一般性的描述和以下详细的描述都仅出于示例性和说明性目的， 不应限制受权利要求书保护的本发明。
【附图说明】
图 1.M13-99 载体中的用于表达重组 FLAG 标签 -pIX 融合蛋白的合成 DNA 插入序 图 2.M13-99 的图谱， 示出了天然噬菌体外壳蛋白基因以及插入的重组 pIX 基因的列。
位置。 图 3. 示出了抗 FLAG 标签抗体对展示在 M13-99 和 M13-99L 噬菌体上的 FLAG-pIX 融合蛋白的特异性结合的 ELISA。
图 4.ELISA 检测到的展示在 pIX 上的肽表位。
图 5.ELISA 检测到的展示在 pIX 上的 EGF。通过添加 IPTG(0.01mM-1mM) 来诱导 EGF-pIX 从杂交载体表达。[IPTG] 浓度＞ 0.05mM 时， 与 EGFR-MMB 的特异性结合明显。
图 6. 展示在 pIX 上的 EGF 的 FACS 分析。 噬菌粒 ： 展示在噬菌粒系统中的 EGF-pIX ； NT ： 含有 pIX-EGF 融合的杂交体， 生长时无 IPTG 诱导 ； 0.01mM 和 1mM:EGF-pIX 杂交体， 分别
由 0.01mM 和 1mM IPTG 诱导。 具体实施方式
本发明提供可与 pVII 和 pIX 噬菌体展示一起使用的工程化 pIX 噬菌体载体， 用于 利用 M13 噬菌体的 pIX 生成肽或蛋白质文库， 如使用诱变或其他多样性产生技术， 可选地使 用同步成熟法， 从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以及治疗性非抗体肽或 蛋白质的选择提供有效快速的平台。 根据本发明， 提供了杂交噬菌体载体， 其已经工程改造 而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组 pIX 编码区。
本发明提供将肽和蛋白质展示为与 pIX 或 pVII 噬菌体蛋白质的融合物的杂交载 体， 以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库， 所述文库用于例如 ( 但不限于 ) 筛 选、 选择、 工程改造、 成熟或其他用途， 例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。 因为天 然基因 IX 的调控区和编码区与 pVII 和 pVIII 的调控区和编码区重叠， 简单融合至该基因 的末端可能造成噬菌体失活 (Hill 和 Petersen， J.of Virol.44 ： 32-46， 1982)(8)。作为替 代， 已将 M13mp19 的衍生物进行工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二 重组 pIX 编码区。该载体的使用不同于噬菌粒， 其不需辅助噬菌体并显著减少在选择和分 析期间培养噬菌体所花费的时间和精力。此外， 携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬 菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。 因此本发明提供了新型载体构建体， 其用于以 pIX 噬菌体展示形式表达肽或蛋白 质， 以构建多肽阵列。具体地讲， 本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组 pIX 编码序列 的工程化 pIX 噬菌体载体， 其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白的氨 基末端的外源多肽。优选地， 噬菌体颗粒包含在其表面上表达的融合蛋白。
利用本文所述的这种工程化 pIX 噬菌体载体生成的人肽或蛋白质从头文库与现 有的非抗体肽或蛋白质文库技术现状不同之处在于它通过 M13 噬菌体的 pIX 基因来展示。
丝状噬菌体
本发明设想将本文所述的工程化 pIX 噬菌体载体与编码至少一种重组融合肽或 蛋白质的 pIX 或 pVII 噬菌体一起使用。该融合蛋白包含融合至丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋 白的氨基末端上的外源多肽部分。
所谓 “外源” 意指融合至噬菌体蛋白的多肽通常不与丝状噬菌体的野生型种类中 的噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白相缔合， 而是对于正常噬菌体蛋白来说是外来的。
在一个优选实施例中， 丝状噬菌体封装有编码第一和 / 或第二融合蛋白的基因 组， 其中第一融合蛋白包含融合至 pVII 或 pIX 的第一外源多肽， 第二融合蛋白包含融合至 pIX 或 pIX 的第二外源多肽。
如本文所述， 丝状噬菌体还包含展示于噬菌体颗粒表面上的一种或多种融合蛋 白。因此， 如果存在至少第一和第二融合蛋白， 则噬菌体可以功能性方式展示这些蛋白质， 使得第一和第二外源多肽可相互作用成为异型二聚体， 从而在噬菌体表面上形成功能性双 链蛋白质复合物。
在存在于本发明噬菌体上的融合蛋白中， 外源多肽与丝状噬菌体 pVII 或 pIX 蛋白 之间的 “融合” 可包含典型的酰胺键， 或可如实例中所述包含连接多肽 ( 即 “接头” )。可使 用多种接头中的任何一种， 所述接头通常为一段长度为 5 至 50 个氨基酸的序列。尤其优选
的接头可在连接点处给融合蛋白提供高度的活动性。
文库设计 ： 以前的合成文库并入了以下内容的一部分， 但没有一个全面地包含以 下全部内容。
序列多样性的位置和性质。序列多样性是如何内源提供具有高亲和力、 选择性结 合实体的人蛋白质的标志。这种序列多样性的产生和积累不是随机的。基因组序列的核苷 酸突变位点和类型因 DNA 序列和机理而具有偏向性， 但是只有提供结合和功能优势的突变 才被选择和存储， 并且通常还伴有中性置换。 虽然不易从机理预测， 但已知的人肽或蛋白质 序列和结构功能分析的数据库能鉴定在大多数情况下与所需靶标或抗原的识别 ( 包括蛋 白质、 肽和小分子抗原之间的区分 ) 相关的位置和氨基置换。本发明的文库通过利用设计 的简并寡核苷酸来在推定的结合区及功能区整合进置换， 从而提供这种天然的人多样性。
表达、 生物化学和生物物理特性。优选的人类非抗体肽或蛋白质不仅具有所需生 物活性和结合活性， 而且可由多种宿主有效生产， 并且具有稳定性和良好的溶解特性。 高频 率种系基因用法 (1d) 也表明其在哺乳动物系统中具有良好的表达。此外， 通过选择或筛选 的细菌噬菌体展示方法来从文库回收的非抗体肽或蛋白质应在细菌宿主中良好表达。 本发 明的文库是基于人种系衍生的模板， 所述模板是从标准的重组哺乳动物宿主 ( 如 HEK293 和 CHO 细胞 ) 以及细菌宿主良好表达和纯化的， 并且具有高稳定性和良好的溶解特性。
文库组装技术。一些优选的从头非抗体肽或蛋白质文库均具有高的多样性 ( ＞ 10 10 )， 易于改变， 容易组装， 并且不需要的序列的背景低。这些背景序列包括亲代模板和低 靶向多样性。 结合以下方法可加速文库组装并产生低的背景 ： (a) 基于 Kunkle 的单链诱变 ； (b) 具有限制性位点的回文环 ； (c) 大引物。
pIX 肽或蛋白质噬菌体展示。所有以前的丝状噬菌体从头人非抗体肽或蛋白质文 库均利用 pIII 或 pVIII 噬菌体外壳蛋白来进行展示。 pIX 与所选的肽或蛋白质模板的组合 是用于回收非抗体肽或蛋白质的更有效的选择系统， 所回收的非抗体肽或蛋白质在转化为 单克隆抗体及其他相关分子时保留它们的选定特性。
肽或蛋白质展示。肽或蛋白质是人非抗体肽或蛋白质的天然片段， 当它们通过基 因工程引入至完全非抗体肽或蛋白质中时可更好地重演它们的活性。 肽或蛋白质的有效丝 状噬菌体展示除了要求在细菌宿主中良好表达这个性质之外还要去其他特性。 本发明的文 库中所用的肽序列被选择用于通过 pIX 在丝状噬菌体上有效展示。
噬菌粒展示。相对于噬菌体 pIX 外壳蛋白而言肽或蛋白质分子可能较大， 因此如 果连接至在细菌细胞中产生的所有 pIX 蛋白的话， 则可能干扰重组噬菌体颗粒的装配。规 避此干扰的一种方法为利用 pIX 噬菌粒系统， 凭此野生型 pIX 蛋白和肽或蛋白质连接的 pIX 蛋白都可整合进重组噬菌体颗粒中。在一个优选应用中， 本发明的文库是通过 pIX 在噬菌 粒系统中展示。
用于展示的噬菌体外壳蛋白 pIX。类似于 pIII， pIX 以较低的拷贝数存在于噬菌 体上， 并适合于对所展示的肽或蛋白质进行亲和选择。然而， pIII 蛋白参与侵染过程并起 着关键作用， 展示在该 pIII 蛋白上的蛋白质可能会干扰侵染效率。此外， 重链 Fd 片段或轻 链片段均可与 pIX 融合以进行展示。预计展示在 pIX 蛋白上的本发明文库可被有效复制并 递呈， 以进行选择和 / 或筛选。
肽或蛋白质 -pIX 表达。筛选从噬菌体文库中回收的肽或蛋白质的一种方法是去除连接至用来展示的肽或蛋白质分子上的噬菌体外壳蛋白。pIX 蛋白的小尺寸提供了不需 此步骤而直接筛选肽或蛋白质的生产选择。
噬菌体构造。合适的 M13 或相似类型的噬菌体载体可用作根据本发明的工程化载 体。可根据已知技术对具有合适调节、 选择、 限性制酶切以及其他所需位点和序列 ( 如启动 子、 信号序列、 前导序列 ( 如 pelB)、 核糖体结合位点 ( 如 Shine-Delgano)、 标签 ( 如 FLAG 标签 )、 转录终止子 ( 如 trpA)、 选择序列 ( 如 LACZ)、 限制性位点 ( 如 HindIII、 EcoRI)、 肽 接头等等 ) 的编码 pIX 或 pVII 融合蛋白的这种载体进行修饰， 使其还包含连接至上游信号 肽编码序列和诱导型启动子 ( 如 LacZa) 的第二 pIX 和 / 或 pVII 编码序列。这消除了对辅 助噬菌体的需要， 并且还显著减少了在选择和 / 或分析步骤期间培养噬菌体所需的时间和 精力。另外， 与使用其他载体相比， 可更容易地确定需要培养的噬菌体数量。
举个非限制性的例子， 源自 M13mp19 的 M13KE 是已知的可通过插入重组 pIX 基因 来提供本发明的工程化 pIX 噬菌体载体的噬菌体载体。可将重组区插入 ( 例如 )M13mp19 的 lacZα 区， 位于噬菌体基因组的基因间区域中， 因此 lac 启动子可驱动重组基因 IX 融合 的转录。插入序列 ( 图 1) 可包含 Shine-Delgarno 序列 ( 核糖体结合位点 )、 来自果胶裂解 酶 B 的信号序列 (pelB)、 用于后续克隆的双 BbsI 限制性酶识别位点、 pIX 编码区以及 trpA 转录终止子。FLAG 标签肽 DYKDDDDK 以及五氨基酸接头 (M13-99 ： GGTKT) 或九氨基酸接头 (M13-99L ： SGGSGGTKT) 包含在 pelB 与 IX 基因之间。 可用九氨基酸接头将具有各种长度和电荷的另外的肽 ( 例如， 但不限于表 1 中的 那些 ) 展示于 pIX 的氨基末端， 以确定最适合表达特定多肽的接头。此外， 将一种或多种外 源融合肽展示于 pIX 或 pVII 上。
可针对肽标签的展示分析最终噬菌体载体是否含有重组 pIX 基因， 如在 ELISA 实 验中进行分析。可用抗 M13/ 或靶标缀合物或任何其他表达外源肽的检测方法来检测结合 至固定化的靶标肽或蛋白质上的噬菌体。
优点。用于在 pIX 上展示肽的杂交系统相对于此前开发的 pIX 噬菌粒系统来说具 有速度和方便性方面的优点。可将噬菌体感染进宿主细胞中并扩增一个下午， 基本上在一 个步骤中进行。 相反， 噬菌粒的扩增需要进行噬菌粒感染和长出、 用辅助噬菌体以确定的培 养物浓度进行超感染以及对所救援的噬菌体进行扩增。 因此该过程必需要额外的步骤和操 作者输入， 并且 ( 至少 ) 要过夜培养。相对于典型选择实验中涉及的重复选择循环和多轮 筛选过程， 杂交系统的时间节省十分明显。 此外， 噬菌粒扩增可生成含有噬菌粒或辅助噬菌 体基因组的噬菌体混合物。因此精确定量含有噬菌粒基因组的病毒颗粒的数量更为困难。 杂交系统不需辅助噬菌体感染， 因而仅存在一种类型的噬菌体基因组可包装进噬菌体颗粒 中。这样便生成了均一的噬菌体群体， 从而可精确测量包含融合基因组的病毒颗粒。
虽然已概括地描述了本发明， 但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公 开， 所述实例不应理解为限制权利要求的范围。
实例 1 ： 示例性的工程化噬菌体载体的构建
噬菌体的构建。 M13-99 和 M13-99L 含有插入噬菌体基因组 M13KE(M13mp19 的衍生 物 ) 的重组 pIX 基因。 该重组区被插入 M13mp19 的 lacZα 区， 位于噬菌体基因组的基因间区 域， 因此 lac 启动子可驱动重组基因 IX 融合的转录。 插入序列 ( 图 1) 包含 Shine-Delgarno 序列 ( 核糖体结合位点 )、 果胶裂解酶 B 的信号序列 (pelB)、 用于后续克隆的双 BbsI 限制性
酶识别位点、 pIX 编码区以及 trpA 转录终止子。FLAG 标签肽 DYKDDDDK(SEQ ID NO ： 2) 和五 氨基酸接头 (M13-99 ： GGTKT(SEQ IDNO ： 7)) 或九氨基酸接头 (M13-99L ： SGGSGGTKT(SEQ ID NO ： 8)) 包含于 pelB 和基因 IX 之间。
具有各种长度和电荷的四种另外的肽 ( 表 1) 通过九氨基酸接头展示于 pIX 的氨 基末端。此外， 将表皮生长因子 (EGF)(5.6kDa) 展示于 pIX 上， 以评估通过多个二硫键展示 的球蛋白的可行性。
方法。 合成编码两侧有 HindIII 和 EcoRI 酶识别位点的 FLAG 盒 ( 图 1) 的 DNA(Blue Heron)， 通过限制性酶消化使之从其穿梭载体中释放出来， 然后连接进已经用 HindIII 和 EcoRI 消化过的 M13KE(New England Biolabs)。最终的噬菌体载体 M13-99(SEQ ID NO ： 1) 在图 2 中示出。对于其他肽， 使互补的寡核苷酸退火到一起而生成合适的 DNA 序列。退火 的寡核苷酸含有与 BbsI 消化的 13-99L 载体对应的相容悬突， 使得肽标签 DNA 和载体能连 接。 对 EGF 进行 PCR 扩增， 用 BbsI 限制性内切酶消化， 然后连接到 BbsI 消化的 M13-99L 中。 接种重组噬菌体以用于在 XL-1 蓝宿主大肠杆菌细胞 (Stratagene) 的菌苔上分离出单个菌 斑。将噬菌斑重新悬浮于介质中， 并让其在琼脂上扩散。将噬菌体感染进 XL-1 蓝大肠杆菌 细胞并在 37℃下培养 4.5 小时。1mM IPTG 是诱导 pIX 融合蛋白表达的标准手段， 但对于某 些实验， 可使用多种量 (1.0 至 0.01mM) 的 IPTG 来诱导 EGF 表达。在噬菌体生长和诱导之 后， 通过离心移除细菌， 用 4％ PEG-8000、 0.5M NaCl 将噬菌体从培养上清液中沉淀出来， 并 在 4℃下孵育过夜。通过离心回收噬菌体颗粒， 并将噬菌体粒料重新悬浮于磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。
pIX 展示的肽的分析。在 ELISA 实验中针对肽标签的展示对含有重组 pIX 基因的 噬菌体进行测试。用抗 M13/HRP 缀合物来检测结合在固定化的单克隆非抗体肽或蛋白质上 的噬菌体。除了 M13-99 和 M13-99L， 还包括了 M13KE 亲代载体作为阴性对照。在完全相同 的抗 FLAG 包被的小孔中， 将过量的合成 FLAG 肽包括在噬菌体结合反应物中作为竞争物。 相 对于抗多聚组氨酸抗体， M13-99 和 M13-99L 看起来都特异性地结合至抗 FLAG 抗体， 并且此 结合被过量的 FLAG 肽所抑制， 表明 FLAG 标签在重组 pIX 上成功展示 ( 图 3)。M13-99L 产 生较低的背景信号， 因此被用于其他肽的展示。
其他肽的 ELISA 数据示于图 4 中。抗 his、 抗 myc、 抗 V5 以及抗 HA 非抗体肽或蛋 白质被用于合适的噬菌体。在每个实验中包括 Fc 以作为阴性对照。这些结果表明这些肽 也在重组 pIX 上成功展示。
方法。将 Maxisorp ELISA 板 (NUNC) 的小孔用 250ng 单克隆非抗体肽或蛋白质 (PBS 中 4μg/mL) 包被， 在 4℃下过夜。用含有 0.1％ Tween-20 的 Tris 缓冲盐水 (TBS-T) 冲洗小孔两次， 然后用 Starting Block(Pierce) 在室温下封闭 1 小时。再次冲洗小孔。将 稀释于 Starting Block 中的 PEG 沉淀的噬菌体 ( 约 109pfu) 加入小孔中并且在室温下振 荡孵育 1.5 小时。对于 M13-99 和 M13-99L， 加入 FLAG 肽至终浓度为 0.1mg/mL 以作为竞 争剂并继续孵育 15 分钟。用 TBS-T 冲洗小孔三次， 将抗 M13/ 辣根过氧化物酶缀合物 (GE Healthcare)( 在 Starting Block 中以 1 ∶ 5000 稀释 ) 加入小孔中， 并在室温下振荡孵育 1 小时。用 TBS-T 冲洗小孔三次， 然后加入 POD 化学发光底物 (Roche) 并且在 Tecan 读板器 上进行检测。
pIX 展示的 EGF 的分析。在 ELISA 实验中测试了 pIX 展示的 EGF 与 EGFR-MMB 的结合， 并在 FACS 实验中测试了与在 A431 细胞上表达的 EGFR 的结合。( 注意， EGFR-MMB 融合 蛋白已在另一个最近的发明公开中有所描述。) 用抗 m13:HRP 单克隆抗体检测通过 ELISA 发现结合至 EGFR-MMB 的噬菌体颗粒 ( 图 5)， 而那些通过 FACS 发现结合至 A431 细胞上的 EGFR 的噬菌体颗粒则用抗 M13:FITC 单克隆抗体进行检测 ( 图 6)。 ELISA 数据证实 EGF 成功 展示于 pIX 杂交系统中。在 FACS 实验中， 将亲代载体 M13KE 和未诱经导的 EGF-pIX 杂交噬 菌体包括在内作为阴性对照。方法。对于 ELISA 实验， 用 5μg/mL 的抗 Fc 单克隆抗体包被 Maxisorp 板， 4℃下过夜。 用 TBS-T 冲洗板三次， 然后将 500ng EGFR-MMB 加至一半被包被小 孔中。用 TBS-T 处理剩余的小孔。洗涤该板， 并以每孔 300μL 的 Chemiblocker(Chemicon) 在室温下封闭 1 小时。用 TBS-T 冲洗小孔， 将噬菌体的系列稀释液加入小孔中， 使其结合 1 小时。 用 TBS-T 洗小孔 3 次后， 如上所述检测所结合的噬菌体。 对于 FACS 分析， 用 0.25％的 tyrpsin-EDTA 收获 A431 细胞， 用含 10％ FBS 和 1％ NEAA 的完全 DMEM 洗涤两次， 以 2.5×106 个细胞 / 毫升重新悬浮于含有叠氮化钠的 FACS 缓冲液中。将细胞 (2.5×105) 与滴定当量 的噬菌体或小鼠抗 M13:FITC(RDI， Fitzgerald Industries) 于 4℃在含有叠氮化钠的 FACS 缓冲液中一起孵育一小时。将细胞在 FACS 缓冲液中洗涤两次以移除任何未结合的噬菌体， 并将其与小鼠抗 M13:FITC 抗体于 4℃下在 FACS 缓冲液中孵育一小时。洗涤细胞以移除未 结合的抗体， 并用流式细胞仪分析噬菌体结合。
图 1. 克隆至 pIX 杂交表达载体中的肽序列。 肽标签 FLAG HA His MYC V5 氨基酸序列 DYKDDDDK(SEQ ID NO ： 2) YPYDVPDYA(SEQ ID NO ： 3) HHHHHH(SEQ ID NO ： 4) MEQKLISEEDLNS(SEQ ID NO ： 5) GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO ： 6)参考文献
1.Kehoe， J.W. 和 B.K.Kay， 2005， Filamentous phage display in the new millennium， Chem Rev 105 ： 4056。
2.Iannolo， G.、 O.Minenkova、 R.Petruzzelli 和 G.Cesareni， 1995， Modifying filamentous phage capsid ： limits in the size of the major capsid protein， J Mol Biol 248 ： 835。
3.Gao， C.、 S.Mao、 C.H.Lo、 P.Wirsching、 R.A.Lerner 和 K.D.Janda， 1999， Making artificial non-antibody peptides or proteins ： a format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays， Proc Natl Acad Sci U S A 96 ： 6025。
4.Gao， C.、 S.Mao、 G.Kaufmann、 P.Wirsching、 R.A.Lerner 和 K.D.Janda， 2002， A
method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display， Proc Natl Acad Sci USA 99 ： 12612。
5.Gao ， C. 、 S.Mao 、 H.J.Ditzel 、 L.Farnaes 、 P.Wirsching 、 R.A.Lerner 和 K.D.Janda.2002， A cell-penetratingpeptide from a novel pVII-pIX phage-displayed random peptide library， Bioorg Med Chem 10 ： 4057。
6.Endemann， H. 和 P.Model， 1995， Location of filamentous phage minor coat proteins in phage and in infected cells， J Mol Biol 250 ： 496。
7.Kwasnikowski P 、 P.Kristensen 和 W.T.Markiewicz ， 2005 ， Multivalent display system on filamentous bacteriophage pVII minor coat protein， J Immunol Methods 307 ： 135。
8.Hill， D.F. 和 G.B.Petersen， 1982， Nucleotide Sequence of Bacteriophage f1 DNA， Journal of Virology 44 ： 32。
序列表
SEQ ID NO ： 1
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgccccaaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaactaaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagacaccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaagctctaagcca 240
tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaatcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcgatatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctgactataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaactgtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgctatccagtct 540
aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctctcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttactatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaaatctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaacgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcataaggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgttctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgatttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctatgcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttcccttatgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcgacacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataatcgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttggtgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagtctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctgctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaatatatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagctgtttaagaa 150013101965402 A CN 101965403
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