通过融合至M13噬菌体的PIX而实现的用于设计和生成人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的工程化杂交噬菌体载体.pdf

1、10申请公布号CN101965402A43申请公布日20110202CN101965402ACN101965402A21申请号200880126978522申请日2008112161/01477320071219USC12N15/0020060171申请人森托科尔奥索生物科技公司地址美国宾夕法尼亚州72发明人B王L尹K奥奈尔74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人权陆军郭文洁54发明名称通过融合至M13噬菌体的PIX而实现的用于设计和生成人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的工程化杂交噬菌体载体57摘要本发明涉及使用源自M13噬菌体的PIX的工程化杂交噬菌体载体来生成PIX噬菌体展示文

2、库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010081886PCT申请的申请数据PCT/US2008/0842812008112187PCT申请的公布数据WO2009/085464EN2009070951INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书13页序列表5页附图3页CN101965403A1/2页21一种工程化重组核酸噬菌体载体，其用于表达结合至选定的生物活性配体的噬菌体展示融合肽或蛋白质，所述载体包含A编码重组噬菌体前导序列的核酸序列；其可操作地连接至B编码重组标签、启动子或选择序列的核酸

3、序列；其可操作地连接至C编码重组PIX或PVII的核酸序列；其可操作地连接至D重组限制性位点；其可操作地连接至E编码肽接头的核酸序列；其可操作地连接至AF编码选择性结合至生物活性配体的第一外源肽或蛋白质的序列；G编码PVII的核酸序列；H编码天然PIX的核酸序列；I编码PIII的核酸序列；以及J编码PVI的核酸序列。2根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述编码噬菌体前导序列的序列为PELB序列。3根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中重组标签或选择序列为FLAG标签序列。4根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中重组标签或选择序列选自SEQIDNO3、4、5或6。5根

4、据权利要求4所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述FLAG标签序列包含SEQIDNO2。6根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述启动子为诱导型启动子。7根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述诱导型启动子为LAC启动子。8根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述肽接头选自SEQIDNO7和8。9根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述第一外源肽或蛋白质是推定的生物活性蛋白质或肽。10根据权利要求9所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述生物活性配体介导至少一种体内生物活性。11根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳

5、蛋白的第二外源肽或蛋白质。12一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞包含根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体。13一种生物活性融合蛋白，所述生物活性融合蛋白由根据权利要求11所述的细菌宿主细胞表达。14一种生物活性外源肽或蛋白质，所述外源肽或蛋白质源自根据权利要求13所述的融合蛋白。15一种细菌宿主细胞的噬菌体文库，所述噬菌体文库包含复数种根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体。权利要求书CN101965402ACN101965403A2/2页316根据权利要求14所述的噬菌体文库，其中所述第一外源肽或蛋白质的变体被表达。17一种针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文库进行

6、筛选的方法，所述方法包括A由根据权利要求16所述的噬菌体文库表达外源肽或蛋白质，以及B选择表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。18一种编码外源肽或蛋白质的核酸，所述核酸从根据权利要求17所述的方法获得。权利要求书CN101965402ACN101965403A1/13页4通过融合至M13噬菌体的PIX而实现的用于设计和生成人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的工程化杂交噬菌体载体技术领域0001本发明涉及使用源自M13噬菌体的PIX的工程化杂交噬菌体载体来生成PIX噬菌体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。背景技术0002噬菌体展示是基于亲和力的多肽选择

7、的一种成熟工具。在典型的噬菌体展示选择中，多肽文库经基因工程融合至丝状噬菌体M13外壳蛋白之一的末端。噬菌体颗粒提供所述文库的每个多肽成员与其编码基因之间的物理关联。接着可针对与所需靶分子结合的文库成员，对噬菌体文库进行亲和选择即淘选。将文库与靶分子混合，洗掉未结合的噬菌体颗粒，洗脱剩下的噬菌体并通过在大肠杆菌细胞中培养而扩增。0003尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而PIII和PVIII仍是目前最常用的融合伙伴。PIII是42KD的次要外壳蛋白，其负责噬菌体感染进入大肠杆菌。每个噬菌体颗粒在其表面含有最多五个拷贝的PIII蛋白，聚集在噬菌体的一端。PVIII是噬菌体的主

8、要外壳蛋白；数千个拷贝到PVIII分子量为5KD的拷贝在单链病毒基因组周围以有序的方式排列而构成噬菌体衣壳。除了PIII，M13还有三种其他次要外壳蛋白PVI12KD的蛋白以及PVII和PIX，其中PVII和PIX是涉及装配起始和稳定性维持的短蛋白质分别具有33和32个氨基酸。五个拷贝的PVI蛋白位于噬菌体的与PIII相同的一端，而五个拷贝的PVII和PIX的每一者均位于噬菌体的相对两端。0004虽然已证实在许多情况下可产生与PIII和PVIII融合的噬菌体文库展示融合物，但由噬菌体展示的多肽却受到某些生物学约束。例如，大多数长度为八个或更多个氨基酸的肽不能很好地展示为与PVIII的融合物。此

9、外，与噬菌体蛋白自身相互作用或以其他方式影响PIII或PVIII的表达、结合或活性的多肽将不能在文库中充分表达，因为展示它们的噬菌体生长不良。最后，因为PIII是相当大的蛋白，PIII展示的多肽到某些靶位点的通路例如，蛋白表面的深而窄的缝隙或以多聚体形式存在时功能最佳的多肽的正确装配将在空间上受到阻碍。因此，根据利用其他外壳蛋白其具有不同结构和生物学功能，因此可预计会对所展示的多肽施加不同的约束的噬菌体文库选择将有助于确保搜寻最大量的序列多样性。在概念验证实验中，已证实PVII和PIX可用于展示抗体片段和肽。这些结果是特别值得注意的，因为早期研究表明将多肽融合至PVII和PIX的N末端使得这些

10、外壳蛋白失去功能。0005可通过使用噬菌体、噬菌粒或杂交载体实现在噬菌体上展示外源多肽。使用噬菌体载体，通过使用噬菌体载体，所关注的基因可被引入噬菌体基因组中作为与天然外壳蛋白基因的框内融合物。这些载体作为全功能噬菌体独立地繁殖并展示多拷贝的外源多肽。相反，噬菌粒载体是除细菌复制起点之外还含有噬菌体复制起点和包装信号的质粒。噬菌粒带有融合到外壳蛋白基因的重组拷贝中的所关注的基因，并且一旦用辅助噬菌体救援，噬菌粒即被包装进子代病毒中，其中展示的多肽整合在噬菌体外壳中。对辅助噬菌体的需说明书CN101965402ACN101965403A2/13页5要导致噬菌粒载体比噬菌体载体具有更大的工作强度，

11、并且使定量任何指定样品中所存在噬菌体数量的工作复杂化。此外，由于噬菌体颗粒可同时利用野生型外壳蛋白和融合外壳蛋白进行装配，因此所得噬菌体的某些部分将不展示所关注的多肽序列，从而导致较低的展示效率。杂交载体类似于噬菌体载体，因为噬菌体基因组中携带有融合蛋白并且不需要辅助噬菌体，杂交载体还类似于噬菌粒系统，因为基因组也携带有融合蛋白的野生型拷贝。关于PIX噬菌体展示的先前报道描述了在噬菌粒载体环境中的融合；关于在来自杂交载体或噬菌体载体的PIX上展示多肽尚未见报道。最近已报道了多肽在来自噬菌体载体的PVII上的展示。0006需要提供合成的非抗体肽或蛋白质文库，和同时提供人治疗性肽和蛋白质的高亲和力

12、和活性、高产率、良好的溶解性质以及在人中施用时低免疫反应倾向这些关键要素的方法。相对于现行方法，还需要提高从合成文库中分离非抗体肽或蛋白质的效率，以减少发现非抗体肽或蛋白质的资源耗费以及加速提供非抗体肽或蛋白质用于生物学评价。通过将综合设计、装配技术以及噬菌体PIX肽或蛋白质展示加以结合，本发明的文库和方法满足了这些需求。发明内容0007本发明提供可与PVII和PIX噬菌体展示一起使用的工程化PIX噬菌体载体，用于利用M13噬菌体的PIX生成肽或蛋白质文库，如使用诱变或其他多样性产生技术，可选地使用同步成熟法INLINEMATURATION，从而为肽或蛋白质以及非抗体肽或蛋白质片段的生成及治疗

13、性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明，提供了杂交噬菌体载体，其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PIX编码区。0008本发明提供将肽和蛋白质展示为与PIX或PVII噬菌体蛋白的融合物的噬菌体载体，以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库，所述文库用于例如但不限于筛选、选择、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天然基因IX的调控区和编码区与PVII和PVIII的调控区和编码区重叠，简单融合至该基因的末端可能造成噬菌体失活HILL和PETERSEN，JOFVIROL443246，1982。作为替代，已将M13MP19衍生

14、物改造成含有连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PIX编码区。该载体而不是噬菌粒的使用不需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养噬菌体所花费的时间和工作量。此外，携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。0009因此本发明提供了新型载体构建体，其用于以PIX噬菌体展示形式表达肽或蛋白质，以构建多肽阵列。具体地讲，本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组PIX编码序列的工程化PIX噬菌体载体，其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体PVII或PIX蛋白的氨基末端的外源多肽。优选地，所述噬菌体颗粒在其表面包含表达的融合蛋白。0010在一方面，本发明提供了工程化的重组核

15、酸噬菌体载体，其用于表达结合至所选生物活性配体上的噬菌体展示融合肽或蛋白质，该载体包含A重组噬菌体前导编码核酸序列；可操作地连接至B编码重组标签、启动子或选择序列的核酸序列；可操作地连接至C重组PIX或PVII编码核酸序列；可操作地连接至D重组限制性位点；可操作地说明书CN101965402ACN101965403A3/13页6连接至E编码肽接头的核酸序列；可操作地连接至F选择性地结合到生物活性配体上的第一外源肽或蛋白质编码序列；GPVII编码核酸序列；H天然PIX编码核酸序列；IPIII编码核酸序列；以及JPVI编码核酸序列。0011这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述噬菌体前导编码序列

16、为PELB序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列为FLAG标签序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列选自SEQIDNO3、4、5或6。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述FLAG标签序列包含SEQIDNO2。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述启动子为诱导型启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述诱导型启动子为LAC启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述肽接头选自SEQIDNO7和8。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述第一外源肽或蛋白质是推定的生物活性肽或蛋白质。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述生物活性配体至少

17、介导一种生物体内活性。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳蛋白上的第二外源肽或蛋白质。0012本发明还包括包含工程化的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞。该宿主细胞可表达生物活性融合蛋白。0013本发明还涉及由根据本发明的细菌宿主细胞表达的生物活性融合蛋白。本发明还涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白质。0014本发明还涉及包含复数种根据本发明的工程化核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库。所述噬菌体文库包括其中所述第一外源肽或蛋白质的变体得以表达。0015本发明还提供针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文库进行筛选的方法，所述方法包括；

18、A由噬菌体文库表达外源肽或蛋白质，以及B选择表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。本发明还提供了根据此方法得到的外源肽或蛋白质编码核酸。0016在一个实施例中，噬菌体载体还编码第二融合多肽，其中第二融合多肽包含融合至PIX或PVII蛋白的氨基末端的第二外源多肽，并且第一融合多肽中的第一外源多肽融合至PIX或PVII蛋白的氨基末端。在一个实施例中，第一和第二融合多肽可联合形成异型二聚体蛋白质复合物，例如靶标蛋白质、受体、核酸结合蛋白或酶。0017在另一个实施例中，本发明描述了用于在丝状噬菌体表面表达融合蛋白的载体，所述载体具有用于表达所述融合蛋白的表达盒。该表达盒包含上游和下游可翻

19、译DNA序列，该DNA序列通过适于插入DNA定向连接的核苷酸序列即多位点接头可操作地连接，其中上游序列编码原核分泌信号，下游序列编码PVII或PIX丝状噬菌体蛋白。该可翻译DNA序列可操作地连接至一组DNA表达信号上，以将该可翻译DNA序列表达为融合多肽的一些部分。在一个优选的变型中，载体任选地还包含第二表达盒，用于在丝状噬菌体表面上表达第二融合蛋白，其中第二表达盒具有第一表达盒的结构，前提条件是第一融合蛋白表达盒编码PIX或PVII蛋白和/或第二融合蛋白表达盒编码PIX或PVII蛋白。该载体被用作噬菌体基因组来在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白质复合物，其中该异型二聚体的两种外源多肽通过融

20、合至第一和第二噬菌体蛋白PVII和/或PIX而锚定在噬菌体颗粒上。0018在另一个实施例中，基于所述工程化的PIX噬菌体载体，本发明设想了根据本发明的噬菌体颗粒文库即组合文库，其中该文库中的代表性颗粒各自展示不同的融合蛋说明书CN101965402ACN101965403A4/13页7白。当颗粒展示异型二聚体蛋白复合物时，该文库包含异型二聚体的组合文库，如FV分子文库形式的非抗体肽或蛋白质。优选的文库具有至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或其中任何范围或数值种融合肽或蛋白的组合多样性。0019一个相关的实施例描述了包含由本发明的工

21、程化PIX噬菌体载体表达的第一和第二多肽的融合蛋白，其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是丝状噬菌体PVII或PIX蛋白，其中外源蛋白融合至丝状噬菌体蛋白的氨基末端上。0020另外，本发明还设想了多种从本发明的工程化PIX噬菌体载体表达蛋白质或肽的方法，用于产生噬菌体的组合文库，包括将编码外源多肽的基因克隆到本发明的载体中、通过诱变来修饰文库中外源多肽的结构、随机组合第一和第二融合蛋白文库的群体、通过靶向及亲和筛选“淘选”来改变文库的多样性等等。0021设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、工业、环境以及基础研究应用的重要目标。在用工程化PIX噬菌体载体开发非抗体肽或蛋白质组合文库

22、后，强有力的下一步骤是朝着人造非抗体肽或蛋白质构建体以及其他蛋白质基序推进，所述人造抗体构建体以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。0022本发明通过将工程化的PIX噬菌体载体用于构建多肽组合阵列而提供噬菌体展示形式来应对这些挑战，所述多肽组合阵列中PVII和/或PIX用来展示表达单体或二聚体的肽或蛋白质种类的融合蛋白。0023该技术的范围和能力所固有的是能够展示可参与单体或二聚相互作用的各种蛋白质。这些蛋白质不仅包括非抗体肽或蛋白质，还包括某些酶、激素和激素受体以及DNA结合蛋白。本文所述的展示技术可用于非抗体肽或蛋白质框架区的组合改变，以及改组并微型化非抗体肽或蛋白质结构，或

23、将DNA结合蛋白例如阻遏蛋白展示为异型二聚体文库，供选择具有临床和治疗价值的特定DNA序列。0024因此，本技术提供了肽或蛋白质文库以及其中成员由单体、同型二聚体或异型二聚体阵列组成的组合文库的展示和选择。0025应当理解，以上一般性的描述和以下详细的描述都仅出于示例性和说明性目的，不应限制受权利要求书保护的本发明。附图说明0026图1M1399载体中的用于表达重组FLAG标签PIX融合蛋白的合成DNA插入序列。0027图2M1399的图谱，示出了天然噬菌体外壳蛋白基因以及插入的重组PIX基因的位置。0028图3示出了抗FLAG标签抗体对展示在M1399和M1399L噬菌体上的FLAGPIX融

24、合蛋白的特异性结合的ELISA。0029图4ELISA检测到的展示在PIX上的肽表位。0030图5ELISA检测到的展示在PIX上的EGF。通过添加IPTG001MM1MM来诱导EGFPIX从杂交载体表达。IPTG浓度005MM时，与EGFRMMB的特异性结合明显。0031图6展示在PIX上的EGF的FACS分析。噬菌粒展示在噬菌粒系统中的EGFPIX；NT含有PIXEGF融合的杂交体，生长时无IPTG诱导；001MM和1MMEGFPIX杂交体，分别说明书CN101965402ACN101965403A5/13页8由001MM和1MMIPTG诱导。具体实施方式0032本发明提供可与PVII和P

25、IX噬菌体展示一起使用的工程化PIX噬菌体载体，用于利用M13噬菌体的PIX生成肽或蛋白质文库，如使用诱变或其他多样性产生技术，可选地使用同步成熟法，从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明，提供了杂交噬菌体载体，其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PIX编码区。0033本发明提供将肽和蛋白质展示为与PIX或PVII噬菌体蛋白质的融合物的杂交载体，以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库，所述文库用于例如但不限于筛选、选择、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天然基因I

26、X的调控区和编码区与PVII和PVIII的调控区和编码区重叠，简单融合至该基因的末端可能造成噬菌体失活HILL和PETERSEN，JOFVIROL443246，19828。作为替代，已将M13MP19的衍生物进行工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PIX编码区。该载体的使用不同于噬菌粒，其不需辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养噬菌体所花费的时间和精力。此外，携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。0034因此本发明提供了新型载体构建体，其用于以PIX噬菌体展示形式表达肽或蛋白质，以构建多肽阵列。具体地讲，本发明描述了包含编码融合多肽的第二重

27、组PIX编码序列的工程化PIX噬菌体载体，其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体PVII或PIX蛋白的氨基末端的外源多肽。优选地，噬菌体颗粒包含在其表面上表达的融合蛋白。0035利用本文所述的这种工程化PIX噬菌体载体生成的人肽或蛋白质从头文库与现有的非抗体肽或蛋白质文库技术现状不同之处在于它通过M13噬菌体的PIX基因来展示。0036丝状噬菌体0037本发明设想将本文所述的工程化PIX噬菌体载体与编码至少一种重组融合肽或蛋白质的PIX或PVII噬菌体一起使用。该融合蛋白包含融合至丝状噬菌体PVII或PIX蛋白的氨基末端上的外源多肽部分。0038所谓“外源”意指融合至噬菌体蛋白的多肽通常不与丝状

28、噬菌体的野生型种类中的噬菌体PVII或PIX蛋白相缔合，而是对于正常噬菌体蛋白来说是外来的。0039在一个优选实施例中，丝状噬菌体封装有编码第一和/或第二融合蛋白的基因组，其中第一融合蛋白包含融合至PVII或PIX的第一外源多肽，第二融合蛋白包含融合至PIX或PIX的第二外源多肽。0040如本文所述，丝状噬菌体还包含展示于噬菌体颗粒表面上的一种或多种融合蛋白。因此，如果存在至少第一和第二融合蛋白，则噬菌体可以功能性方式展示这些蛋白质，使得第一和第二外源多肽可相互作用成为异型二聚体，从而在噬菌体表面上形成功能性双链蛋白质复合物。0041在存在于本发明噬菌体上的融合蛋白中，外源多肽与丝状噬菌体PV

29、II或PIX蛋白之间的“融合”可包含典型的酰胺键，或可如实例中所述包含连接多肽即“接头”。可使用多种接头中的任何一种，所述接头通常为一段长度为5至50个氨基酸的序列。尤其优选说明书CN101965402ACN101965403A6/13页9的接头可在连接点处给融合蛋白提供高度的活动性。0042文库设计以前的合成文库并入了以下内容的一部分，但没有一个全面地包含以下全部内容。0043序列多样性的位置和性质。序列多样性是如何内源提供具有高亲和力、选择性结合实体的人蛋白质的标志。这种序列多样性的产生和积累不是随机的。基因组序列的核苷酸突变位点和类型因DNA序列和机理而具有偏向性，但是只有提供结合和功能

30、优势的突变才被选择和存储，并且通常还伴有中性置换。虽然不易从机理预测，但已知的人肽或蛋白质序列和结构功能分析的数据库能鉴定在大多数情况下与所需靶标或抗原的识别包括蛋白质、肽和小分子抗原之间的区分相关的位置和氨基置换。本发明的文库通过利用设计的简并寡核苷酸来在推定的结合区及功能区整合进置换，从而提供这种天然的人多样性。0044表达、生物化学和生物物理特性。优选的人类非抗体肽或蛋白质不仅具有所需生物活性和结合活性，而且可由多种宿主有效生产，并且具有稳定性和良好的溶解特性。高频率种系基因用法1D也表明其在哺乳动物系统中具有良好的表达。此外，通过选择或筛选的细菌噬菌体展示方法来从文库回收的非抗体肽或蛋

31、白质应在细菌宿主中良好表达。本发明的文库是基于人种系衍生的模板，所述模板是从标准的重组哺乳动物宿主如HEK293和CHO细胞以及细菌宿主良好表达和纯化的，并且具有高稳定性和良好的溶解特性。0045文库组装技术。一些优选的从头非抗体肽或蛋白质文库均具有高的多样性1010，易于改变，容易组装，并且不需要的序列的背景低。这些背景序列包括亲代模板和低靶向多样性。结合以下方法可加速文库组装并产生低的背景A基于KUNKLE的单链诱变；B具有限制性位点的回文环；C大引物。0046PIX肽或蛋白质噬菌体展示。所有以前的丝状噬菌体从头人非抗体肽或蛋白质文库均利用PIII或PVIII噬菌体外壳蛋白来进行展示。PI

32、X与所选的肽或蛋白质模板的组合是用于回收非抗体肽或蛋白质的更有效的选择系统，所回收的非抗体肽或蛋白质在转化为单克隆抗体及其他相关分子时保留它们的选定特性。0047肽或蛋白质展示。肽或蛋白质是人非抗体肽或蛋白质的天然片段，当它们通过基因工程引入至完全非抗体肽或蛋白质中时可更好地重演它们的活性。肽或蛋白质的有效丝状噬菌体展示除了要求在细菌宿主中良好表达这个性质之外还要去其他特性。本发明的文库中所用的肽序列被选择用于通过PIX在丝状噬菌体上有效展示。0048噬菌粒展示。相对于噬菌体PIX外壳蛋白而言肽或蛋白质分子可能较大，因此如果连接至在细菌细胞中产生的所有PIX蛋白的话，则可能干扰重组噬菌体颗粒的

33、装配。规避此干扰的一种方法为利用PIX噬菌粒系统，凭此野生型PIX蛋白和肽或蛋白质连接的PIX蛋白都可整合进重组噬菌体颗粒中。在一个优选应用中，本发明的文库是通过PIX在噬菌粒系统中展示。0049用于展示的噬菌体外壳蛋白PIX。类似于PIII，PIX以较低的拷贝数存在于噬菌体上，并适合于对所展示的肽或蛋白质进行亲和选择。然而，PIII蛋白参与侵染过程并起着关键作用，展示在该PIII蛋白上的蛋白质可能会干扰侵染效率。此外，重链FD片段或轻链片段均可与PIX融合以进行展示。预计展示在PIX蛋白上的本发明文库可被有效复制并递呈，以进行选择和/或筛选。0050肽或蛋白质PIX表达。筛选从噬菌体文库中回

34、收的肽或蛋白质的一种方法是去说明书CN101965402ACN101965403A7/13页10除连接至用来展示的肽或蛋白质分子上的噬菌体外壳蛋白。PIX蛋白的小尺寸提供了不需此步骤而直接筛选肽或蛋白质的生产选择。0051噬菌体构造。合适的M13或相似类型的噬菌体载体可用作根据本发明的工程化载体。可根据已知技术对具有合适调节、选择、限性制酶切以及其他所需位点和序列如启动子、信号序列、前导序列如PELB、核糖体结合位点如SHINEDELGANO、标签如FLAG标签、转录终止子如TRPA、选择序列如LACZ、限制性位点如HINDIII、ECORI、肽接头等等的编码PIX或PVII融合蛋白的这种载体

35、进行修饰，使其还包含连接至上游信号肽编码序列和诱导型启动子如LACZA的第二PIX和/或PVII编码序列。这消除了对辅助噬菌体的需要，并且还显著减少了在选择和/或分析步骤期间培养噬菌体所需的时间和精力。另外，与使用其他载体相比，可更容易地确定需要培养的噬菌体数量。0052举个非限制性的例子，源自M13MP19的M13KE是已知的可通过插入重组PIX基因来提供本发明的工程化PIX噬菌体载体的噬菌体载体。可将重组区插入例如M13MP19的LACZ区，位于噬菌体基因组的基因间区域中，因此LAC启动子可驱动重组基因IX融合的转录。插入序列图1可包含SHINEDELGARNO序列核糖体结合位点、来自果胶

36、裂解酶B的信号序列PELB、用于后续克隆的双BBSI限制性酶识别位点、PIX编码区以及TRPA转录终止子。FLAG标签肽DYKDDDDK以及五氨基酸接头M1399GGTKT或九氨基酸接头M1399LSGGSGGTKT包含在PELB与IX基因之间。0053可用九氨基酸接头将具有各种长度和电荷的另外的肽例如，但不限于表1中的那些展示于PIX的氨基末端，以确定最适合表达特定多肽的接头。此外，将一种或多种外源融合肽展示于PIX或PVII上。0054可针对肽标签的展示分析最终噬菌体载体是否含有重组PIX基因，如在ELISA实验中进行分析。可用抗M13/或靶标缀合物或任何其他表达外源肽的检测方法来检测结合

37、至固定化的靶标肽或蛋白质上的噬菌体。0055优点。用于在PIX上展示肽的杂交系统相对于此前开发的PIX噬菌粒系统来说具有速度和方便性方面的优点。可将噬菌体感染进宿主细胞中并扩增一个下午，基本上在一个步骤中进行。相反，噬菌粒的扩增需要进行噬菌粒感染和长出、用辅助噬菌体以确定的培养物浓度进行超感染以及对所救援的噬菌体进行扩增。因此该过程必需要额外的步骤和操作者输入，并且至少要过夜培养。相对于典型选择实验中涉及的重复选择循环和多轮筛选过程，杂交系统的时间节省十分明显。此外，噬菌粒扩增可生成含有噬菌粒或辅助噬菌体基因组的噬菌体混合物。因此精确定量含有噬菌粒基因组的病毒颗粒的数量更为困难。杂交系统不需辅

38、助噬菌体感染，因而仅存在一种类型的噬菌体基因组可包装进噬菌体颗粒中。这样便生成了均一的噬菌体群体，从而可精确测量包含融合基因组的病毒颗粒。0056虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公开，所述实例不应理解为限制权利要求的范围。0057实例1示例性的工程化噬菌体载体的构建0058噬菌体的构建。M1399和M1399L含有插入噬菌体基因组M13KEM13MP19的衍生物的重组PIX基因。该重组区被插入M13MP19的LACZ区，位于噬菌体基因组的基因间区域，因此LAC启动子可驱动重组基因IX融合的转录。插入序列图1包含SHINEDELGARNO序列核糖体结合位点、果

39、胶裂解酶B的信号序列PELB、用于后续克隆的双BBSI限制性说明书CN101965402ACN101965403A8/13页11酶识别位点、PIX编码区以及TRPA转录终止子。FLAG标签肽DYKDDDDKSEQIDNO2和五氨基酸接头M1399GGTKTSEQIDNO7或九氨基酸接头M1399LSGGSGGTKTSEQIDNO8包含于PELB和基因IX之间。0059具有各种长度和电荷的四种另外的肽表1通过九氨基酸接头展示于PIX的氨基末端。此外，将表皮生长因子EGF56KDA展示于PIX上，以评估通过多个二硫键展示的球蛋白的可行性。0060方法。合成编码两侧有HINDIII和ECORI酶识别

40、位点的FLAG盒图1的DNABLUEHERON，通过限制性酶消化使之从其穿梭载体中释放出来，然后连接进已经用HINDIII和ECORI消化过的M13KENEWENGLANDBIOLABS。最终的噬菌体载体M1399SEQIDNO1在图2中示出。对于其他肽，使互补的寡核苷酸退火到一起而生成合适的DNA序列。退火的寡核苷酸含有与BBSI消化的1399L载体对应的相容悬突，使得肽标签DNA和载体能连接。对EGF进行PCR扩增，用BBSI限制性内切酶消化，然后连接到BBSI消化的M1399L中。接种重组噬菌体以用于在XL1蓝宿主大肠杆菌细胞STRATAGENE的菌苔上分离出单个菌斑。将噬菌斑重新悬浮于

41、介质中，并让其在琼脂上扩散。将噬菌体感染进XL1蓝大肠杆菌细胞并在37下培养45小时。1MMIPTG是诱导PIX融合蛋白表达的标准手段，但对于某些实验，可使用多种量10至001MM的IPTG来诱导EGF表达。在噬菌体生长和诱导之后，通过离心移除细菌，用4PEG8000、05MNACL将噬菌体从培养上清液中沉淀出来，并在4下孵育过夜。通过离心回收噬菌体颗粒，并将噬菌体粒料重新悬浮于磷酸盐缓冲液PBS中。0061PIX展示的肽的分析。在ELISA实验中针对肽标签的展示对含有重组PIX基因的噬菌体进行测试。用抗M13/HRP缀合物来检测结合在固定化的单克隆非抗体肽或蛋白质上的噬菌体。除了M1399和

42、M1399L，还包括了M13KE亲代载体作为阴性对照。在完全相同的抗FLAG包被的小孔中，将过量的合成FLAG肽包括在噬菌体结合反应物中作为竞争物。相对于抗多聚组氨酸抗体，M1399和M1399L看起来都特异性地结合至抗FLAG抗体，并且此结合被过量的FLAG肽所抑制，表明FLAG标签在重组PIX上成功展示图3。M1399L产生较低的背景信号，因此被用于其他肽的展示。0062其他肽的ELISA数据示于图4中。抗HIS、抗MYC、抗V5以及抗HA非抗体肽或蛋白质被用于合适的噬菌体。在每个实验中包括FC以作为阴性对照。这些结果表明这些肽也在重组PIX上成功展示。0063方法。将MAXISORPEL

43、ISA板NUNC的小孔用250NG单克隆非抗体肽或蛋白质PBS中4G/ML包被，在4下过夜。用含有01TWEEN20的TRIS缓冲盐水TBST冲洗小孔两次，然后用STARTINGBLOCKPIERCE在室温下封闭1小时。再次冲洗小孔。将稀释于STARTINGBLOCK中的PEG沉淀的噬菌体约109PFU加入小孔中并且在室温下振荡孵育15小时。对于M1399和M1399L，加入FLAG肽至终浓度为01MG/ML以作为竞争剂并继续孵育15分钟。用TBST冲洗小孔三次，将抗M13/辣根过氧化物酶缀合物GEHEALTHCARE在STARTINGBLOCK中以15000稀释加入小孔中，并在室温下振荡孵育

44、1小时。用TBST冲洗小孔三次，然后加入POD化学发光底物ROCHE并且在TECAN读板器上进行检测。0064PIX展示的EGF的分析。在ELISA实验中测试了PIX展示的EGF与EGFRMMB的结说明书CN101965402ACN101965403A9/13页12合，并在FACS实验中测试了与在A431细胞上表达的EGFR的结合。注意，EGFRMMB融合蛋白已在另一个最近的发明公开中有所描述。用抗M13HRP单克隆抗体检测通过ELISA发现结合至EGFRMMB的噬菌体颗粒图5，而那些通过FACS发现结合至A431细胞上的EGFR的噬菌体颗粒则用抗M13FITC单克隆抗体进行检测图6。ELIS

45、A数据证实EGF成功展示于PIX杂交系统中。在FACS实验中，将亲代载体M13KE和未诱经导的EGFPIX杂交噬菌体包括在内作为阴性对照。方法。对于ELISA实验，用5G/ML的抗FC单克隆抗体包被MAXISORP板，4下过夜。用TBST冲洗板三次，然后将500NGEGFRMMB加至一半被包被小孔中。用TBST处理剩余的小孔。洗涤该板，并以每孔300L的CHEMIBLOCKERCHEMICON在室温下封闭1小时。用TBST冲洗小孔，将噬菌体的系列稀释液加入小孔中，使其结合1小时。用TBST洗小孔3次后，如上所述检测所结合的噬菌体。对于FACS分析，用025的TYRPSINEDTA收获A431细

46、胞，用含10FBS和1NEAA的完全DMEM洗涤两次，以25106个细胞/毫升重新悬浮于含有叠氮化钠的FACS缓冲液中。将细胞25105与滴定当量的噬菌体或小鼠抗M13FITCRDI，FITZGERALDINDUSTRIES于4在含有叠氮化钠的FACS缓冲液中一起孵育一小时。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次以移除任何未结合的噬菌体，并将其与小鼠抗M13FITC抗体于4下在FACS缓冲液中孵育一小时。洗涤细胞以移除未结合的抗体，并用流式细胞仪分析噬菌体结合。0065图1克隆至PIX杂交表达载体中的肽序列。0066肽标签氨基酸序列FLAGDYKDDDDKSEQIDNO2HAYPYDVPDYASEQ

47、IDNO3HISHHHHHHSEQIDNO4MYCMEQKLISEEDLNSSEQIDNO5V5GKPIPNPLLGLDSTSEQIDNO60067参考文献00681KEHOE，JW和BKKAY，2005，FILAMENTOUSPHAGEDISPLAYINTHENEWMILLENNIUM，CHEMREV1054056。00692IANNOLO，G、OMINENKOVA、RPETRUZZELLI和GCESARENI，1995，MODIFYINGFILAMENTOUSPHAGECAPSIDLIMITSINTHESIZEOFTHEMAJORCAPSIDPROTEIN，JMOLBIOL248835。0

48、0703GAO，C、SMAO、CHLO、PWIRSCHING、RALERNER和KDJANDA，1999，MAKINGARTIFICIALNONANTIBODYPEPTIDESORPROTEINSAFORMATFORPHAGEDISPLAYOFCOMBINATORIALHETERODIMERICARRAYS，PROCNATLACADSCIUSA966025。00714GAO，C、SMAO、GKAUFMANN、PWIRSCHING、RALERNER和KDJANDA，2002，A说明书CN101965402ACN101965403A10/13页13METHODFORTHEGENERATIONOFC

49、OMBINATORIALANTIBODYLIBRARIESUSINGPIXPHAGEDISPLAY，PROCNATLACADSCIUSA9912612。00725GAO，C、SMAO、HJDITZEL、LFARNAES、PWIRSCHING、RALERNER和KDJANDA2002，ACELLPENETRATINGPEPTIDEFROMANOVELPVIIPIXPHAGEDISPLAYEDRANDOMPEPTIDELIBRARY，BIOORGMEDCHEM104057。00736ENDEMANN，H和PMODEL，1995，LOCATIONOFFILAMENTOUSPHAGEMINORCOATPROTEINSINPHAGEANDININFECTEDCELLS，JMOLBIOL250496。00747KWASNIKOWSKIP、PKRISTENSEN和WTMARKIEWICZ，2005，MULTIVALENTDISPLAYSYSTEMONFILAMENTOUSBACTERIOPHAGEPVIIMINORCOATPROTEIN，JIMMUNOLMETHODS307135。00758HILL，DF和GBPETERSEN，1982，NUCLEOTIDESEQUENCEOFBACTERIOPHAGEF1DNA，JOURNALOFVIROLOGY4432。