用傅立叶红外光谱鉴别微生物的方法.pdf

本发明涉及一种利用傅立叶红外光谱鉴别微生物的方法，包括：a)培养对照微生物；b)采集对照微生物的红外图谱；c)在3000-2800cm-1和1800至700cm-1区间内的一个或多个谱段建立微生物鉴别模型；d)在与步骤a)中相同的条件下培养待测微生物；e)在与步骤b)中相同的条件下采集待测微生物的红外图谱；f)将步骤e)中获得的红外图谱代入微生物鉴别模型中确定待测微生物的归属。本发明的微生物鉴别模型能够实现快速鉴别，对待测微生物的分类不需要用其他分类学方法进行预选择；方法特异性强，分类能按科、属、种等单位进行，甚至能够区分到亚种、血清型水平；一旦建立了鉴别模型，鉴定微生物的成本极低。

1.  一种利用红外光谱鉴别微生物的方法，包括：
a)培养对照微生物；
b)采集对照微生物的红外图谱；
c)在3000-2800cm^-1和1800至700cm^-1区间内的一个或多个谱段建立微生物鉴别模型；
d)在与步骤a)中相同的条件下培养待测微生物；
e)在与步骤b)中相同的条件下采集待测微生物的红外图谱；
f)将步骤e)中获得的红外图谱代入微生物鉴别模型中确定待测微生物的归属。

2.  权利要求1的方法，其中所述对照微生物的种类包括待测微生物的种类以及在红外光谱法鉴别过程中易于与其混淆误判的其他微生物种类，且其种类归属明确；所述微生物包括细菌或真菌。

3.  权利要求1的方法，其中所述对照微生物可选自肠杆菌科、葡萄球菌属、假单胞菌属或梭菌属；或它们的任意组合。

4.  权利要求1的方法，其中所述对照微生物或待测微生物的培养使用胰酪大豆琼脂培养基、普通营养琼酯培养基、哥伦比亚琼脂培养基、蛋白胨酵母粉琼脂培养基进行。

5.  权利要求1的方法，其中所述对照微生物或待测微生物的培养在25-55℃下进行，培养时间为18-30小时，优选22-24小时。

6.  权利要求5的方法，对于同一种微生物，在相同的培养温度下培养，更优选采用相同的培养时间进行培养。

7.  权利要求1的方法，其中对所述对照微生物或待测微生物的红外图谱采集方式在为4000至500cm^-1的中红外谱段内进行n次平行数据采集，并将以上多次采集的图谱的平均结果作为用于建立鉴定模型或检测的光谱数据，所述n为选自2-10的整数，优选2-5的整数，更优选为3。

8.  权利要求1的方法，其中步骤c)中所述的鉴别模型为聚类分析鉴别模型或定性分析鉴别模型，或者同时使用两种鉴别模型。

9.  权利要求8所述的方法，其特征在于在所述聚类分析鉴别模型中，所述步骤c)中的谱段选自3000-2800cm^-1和1800-900cm^-1区间内的一个或多个谱段。

10.  权利要求9所述的方法，其特征在于所述聚类分析鉴别模型的第一层采用的谱段为约1200cm^-1-约900cm^-1、约3000cm^-1-约2800cm^-1以及约1500cm^-1-约1200c^-1。

11.  权利要求10的方法，其特征在于所述聚类分析鉴别模型的第二层采用的谱段为约1200cm^-1-约900cm^-1、约1500cm^-1-约1230cm^-1以及约3000cm^-1-约2800cm^-1。

12.  权利要求11的方法，其特征在于所述聚类分析鉴别模型的第三层采用的谱段为约1500cm^-1-约1200cm^-1、约940cm^-1-约760cm^-1以及约3100cm^-1-约2900cm^-1；或约1480cm^-1-约1310cm^-1以及约920cm^-1-约870cm^-1；或约1500cm^-1-约1300cm^-1以及约950cm^-1-约800cm^-1，或者它们的任意组合。

13.  权利要求8所述的方法，在所述聚类分析鉴别模型中，待测微生物的归属如下进行：将光谱距离最近的两类合并成一个新类，并计算新类与其它类间的距离，再将距离最近的两类合并，重复此过程，这样每次减少一类，直到所有的样本都被归入对照微生物的类别中。

14.  权利要求8所述的方法，在所述定性分析鉴别模型中，所述步骤c)中的谱段为1200-900cm^-1、3000-2800cm^-1和1500-1400cm^-1。

15.  权利要求14所述的方法，其中在所述定性分析鉴别模型中，使用一组已知归属的红外光谱图建立鉴别初步模型。

16.  权利要求15所述的方法，其中针对鉴别初步模型，使用一组已知其归属但不同于权利要求14所述红外光谱图的对照微生物的红外光谱图对所得的鉴别初步模型进行验证，得到模型的识别率。

17.  权利要求16所述的方法，其中将模型的识别率大于95％、优选大于96％、更优选大于97％、更优选大于98％，更优选大于99％，最优选为100％的鉴别初步模型作为定性分析鉴别模型。

18.  权利要求17的方法，在所述定性分析鉴别模型中，待测微生物的归属如下进行：根据模型的识别率确定微生物鉴别模型的临界匹配值，对每一种对照微生物的数据的采集平行进行n次，将待测微生物与对照微生物的匹配值从小到大排列，至少前n个匹配值均小于临界匹配值，并且对应于这些匹配值的微生物属于同一类别，则该待测微生物被归入前n个匹配值所对应的微生物类别中，所述n为选自2-10的整数，优选2-5的整数，更优选为3。

19.  权利要求8的方法，在所述聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型同时使用的情况下，两种鉴别模型的鉴别结果相同时，为正确鉴别结果。

20.  权利要求8的方法，其中同时使用所述聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型的情况下，将采用聚类分析鉴别模型为阳性的结果判断为正确鉴别，将采用聚类分析鉴别模型为阴性但采用定性分析鉴别模型为阳性的结果也判断为正确鉴别，但该结果的可信程度低于两种鉴别模型的鉴别结论相同时的结果。

21.  权利要求1的方法，还包括以下步骤：将通过本发明或其它方法鉴定的新菌株的原始光谱和平均光谱添加至谱库中，基于新的谱库优化微生物鉴别模型。

用傅立叶红外光谱鉴别微生物的方法
技术领域
本发明涉及用傅立叶红外光谱鉴别微生物的方法。更具体地说，涉及一种用傅立叶红外光谱建立微生物鉴别模型并使用该模型鉴别药品中的微生物、例如污染菌的方法。
背景技术
药品中微生物的检定是药品质量检验的重要项目，该检验结果的准确性直接决定其可信性。其中，微生物污染的检验首先应能确认是否存在致病微生物。很多时候，还需进一步确定所存在的致病微生物的种类。
通常情况下，药典，例如中国药典，要求对药品进行微生物限度检查(包括污染菌数测定和控制菌检查)，规定的控制菌检查包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和梭菌。药典中对于以上六种控制菌的检定方法主要为选择性培养基结合颜色反应和生化反应来加以鉴别。该鉴定方法，也就是所谓的传统方法存在着培养基复杂、鉴定程序繁琐、鉴别周期长(需3-7天或更长)的缺陷，且鉴定结果带有一定主观性。另外，由于该类方法对于每一种细菌的鉴定并无通用的方法，难以实现自动化及计算机化。其他鉴定方法还有分子生物学方法，例如PCR、DNA(G+C)mol％值、DNA-DNA同源性分析、16S rRNA序列同源性分析等。这些方法的特异性好，灵敏度高，但需要专业人员完成，难以在普通实验室推广。在此情况下，需要一种能够对药品中是否存在污染微生物进行快速、准确的鉴别并且操作简便的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种快速、准确、操作简便的微生物鉴别方法。
本发明提供一种用傅立叶红外光谱(FTIR)鉴别微生物的方法，该方法包括如下步骤：
a)培养对照微生物；
b)采集对照微生物的红外图谱；
c)在3000-2800cm^-1和1800至700cm^-1区间内的一个或多个谱段建立微生物鉴别模型；
d)在与步骤a)中相同的条件下培养待测微生物；
e)在与步骤b)中相同的条件下采集待测微生物的红外图谱；
f)将步骤e)中获得的红外图谱代入微生物鉴别模型中确定待测微生物的归属。
本发明的方法不仅可以用于药品中的污染微生物鉴定，也可以用于例如食品等其他领域的微生物鉴定。可被鉴别的微生物包括但不限于上述药典规定的六种菌以及与这些菌种在分类学上相近的菌种，例如以下的具体实施方式中提及的微生物。
本发明的方法能够实现快速鉴别，对待鉴别微生物的分类不需要用其他分类学方法进行预选择；方法特异性强，分类能按科、属、种等单位进行，甚至能够区分到亚种、血清型水平；一旦建立了鉴别模型，鉴定微生物的成本极低。
附图说明
图1表明肠杆菌科的DNA相关性，数字代表相关％；
图2是本发明实施例1中采用的聚类分析鉴别方法及具体参数；
图3是本发明实施例1的定性分析鉴别方法中的内部图谱最大匹配值直方图；
图4是实施例2中同时采用本发明的聚类分析鉴别方法和定性分析鉴别方法的一种具体程序和结果判断方法；
图5是实施例2中同时采用本发明的聚类分析鉴别方法和定性分析鉴别方法的另一种具体程序和结果判断方法；
图6表明本发明方法对沙门氏菌在种以下进行的区分。
具体实施方式
本发明中提及的术语具有本领域技术人员已知的含义。
本发明中的“约”意味着在所述数值±5％范围内的数值也被包括在本发明中。
本方法中使用的微生物来自CMCC：中国医学细菌管理保藏中心(National Center for medical culture collections)、CSAR：国家细菌耐药性监测中心(National Center for Surveillance of AntimicrobialResistance)和CGMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center)。
1.对照微生物的选择及对照微生物、待测微生物的培养和处理
1.1对照微生物的选择
用于建立鉴别模型的对照微生物的种类包括待测微生物的种类，以及在红外光谱法鉴别过程中易于与其混淆误判的其他微生物种类，例如，在系统分类学中与待测微生物亲缘关系较近的其他微生物，且其种类归属明确。在确定对照微生物种类后，选择该微生物类别中尽可能多种类的微生物，采集其红外光谱数据用于建立鉴别模型。
本发明所称微生物包括细菌和真菌。
可依据药典所规定的控制菌的种类选取对照微生物，如选择肠杆菌科、葡萄球菌属、假单胞菌属和梭菌属等。
例如，当待检样品为药物时，如果控制菌(参见《中华人民共和国药典》2005版，二部附录XI J微生物限度检查法中的控制菌检查一章)为分属肠杆菌科(大肠埃希菌、大肠菌群、沙门氏菌)、假单胞菌科假单胞菌属、微球菌科葡萄球菌属和芽胞杆菌科梭菌属的大肠埃希菌、大肠菌群、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和梭菌时，可以选择以下菌种作为对照微生物：
(1)阴沟肠杆菌、费氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌及大肠埃希菌(肠杆菌科)；
(2)肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌(沙门氏菌属)；
(3)铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌及恶臭假单胞菌(假单胞菌属)；
(4)金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌(葡萄球菌属)；
(5)破伤风梭菌、生孢梭菌、产气荚膜梭菌及脓毒梭菌(梭菌属)。
1.2微生物的培养和红外光谱样品的制备
本发明对照微生物和待测微生物的培养需使用相同的培养基。其培养方法可以使用现有技术中已知的任何培养方法进行，例如参见《药品微生物学检验手册》马绪荣、苏德模著，华龄出版社，2007年1月中记载的方法。
优选使用的培养基例如市售的TSA(胰酪大豆琼脂)、普通营养琼酯培养基、哥伦比亚琼脂培养基、蛋白胨酵母粉琼脂培养基等。优选在实施本发明时使用同一种培养基；更优选使用来自相同供应商的相同批次的培养基；或在使用相同供应商不同批次的培养基时，用不同批号的培养基来培养同一菌株，通过采集相应的多组光谱数据取其平均值的方式消除因培养基不同可能带来的红外光谱差异。
微生物可依据其生长状况在25-55℃下培养，但对于同一种微生物，优选在相同的培养温度下培养，更优选采用相同的培养时间，如18-30小时，优选22-24小时。
用于进行红外光谱数据采集的样品按照现有技术中已知的方法制备，例如参见Microbiological characterizations by FT-IRspectroscopy，D.Naumann，D.Helm&H.Labischinski，Nature，Vol.351，No.6321，pp.81-82中记载的方法制备。
本发明的对照微生物和待测微生物应在相同的条件下培养，并使用与待测微生物相同的条件和方法制备其用于进行红外光谱数据采集的样品。
2.红外光谱数据的采集
本发明中，进行红外光谱测定使用的仪器与材料可以是本领域中任何已知的仪器和材料。
本发明的红外光谱的采集条件是现有技术中已知的条件，可由本领域技术人员根据有限次的实验获得，例如使用Bruker HTS-XT的高通量的微生物专用模块，并用OPUS/LAB软件控制样品的测量。图谱采集的波长范围为4000至500cm^-1的中红外谱段。
就每种微生物而言，优选对所得待测样品进行多次(即n次)，优选2至10次，更优选2至5次，最优选三次平行数据采集，将所得多份数据的原始结果和平均结果作为用于建立鉴定模型或检测的光谱数据。
3.微生物红外光谱鉴别模型的建立和完善
3.1红外光谱数据的参数化处理
建立所述鉴别模型前首先需要对光谱数据进行参数化处理。所述参数化处理方法可以是现有技术中用于建立模型的任意方法，例如对所测得的红外图谱进行平滑处理及一阶或二阶导数处理。
3.2谱段的选择与模型的建立
本发明的微生物红外光谱鉴别模型的类型可以是本领域中任何已知类型的红外光谱鉴别模型，例如聚类分析鉴别模型(ClusterAnalysis)或定性分析(Identity test)鉴别模型。
聚类分析鉴别模型是指使用相同的样本组，根据预先设定的步骤，依次改变聚类分析参数，通过一次或多次的聚类分析，确定样本归属分类的方法，其本质是基于无监督的模式识别方法，通常适用于在样品类别未知的情况下，将样品按照其性质的相近程度进行分类。系统聚类分析的基本思想首先是定义样本之间的距离和类与类之间的距离，选择距离最近的两类合并成一个新类，并计算新类与其它类间的距离，再将距离最近的两类合并，重复此过程，这样每次减少一类，直到所有的样本都成一类，最后形成聚类图或树状图。可以使用例如Bruker公司的OPUS软件建立该模型。
定性分析鉴别模型是通过将待测微生物的红外光谱数据与对照微生物的红外光谱数据库(下文中简称谱库)中的数据进行比较，定性地鉴定对照微生物红外光谱数据库中何种对照微生物的光谱与待测微生物的光谱数据最匹配，以确定待测微生物的归属。其本质是基于有监督的模式识别方法。该方法使用一组已知归属的红外光谱，例如对照微生物的红外光谱，作为训练集，并由这个训练集通过训练或学习得到相应的鉴别初步模型，该初步模型对于训练集微生物的识别率是100％；再用另一组已知其归属但未包括在上述训练集中的对照微生物的红外光谱作为验证集来对所得的鉴别模型进行验证，从而得到模型的识别率(即，将所有验证集光谱带入谱库，所得到的匹配值小于临界匹配值的所有光谱个数与全部带入光谱个数的比值)。然后将识别率符合要求的鉴别模型作为合格的定性分析鉴别模型用于判别未知红外光谱(如待测微生物红外光谱)所应归属的类别。应理解，识别率越高，漏检率越小。可以使用例如Bruker公司的OPUS软件建立该定性分析模型。定性分析模型的验证可按现有技术中已知的方法进行，例如参见OPUS-IDENT，User Manual，第6版，第77-103页。
当采用聚类分析鉴别模型时，建立模型谱段的选择以能够将不同种细菌的红外图谱在树状图(例如，见附图6)上按已知种属进行所需分类为准。优选地，选择3000-2800cm^-1和1800至700cm^-1区间内，优选地选择3000-2800cm^-1和1800至900cm^-1区间内的一个或多个谱段建立模型的一个层，并且根据需要，选择一至多个层，直至用于建立模型的对照微生物能够被确定归类鉴定。
例如，在一个具体实施方案中，建立模型的第一层时同时采用以下三个谱段：约1200cm^-1-约900cm^-1、约3000cm^-1-约2800cm^-1，以及约1500cm^-1-约1200cm^-1。建立模型的第二层时同时采用以下三个谱段：约1200cm^-1-约900cm^-1、约1500cm^-1-约1230cm^-1，以及约3000cm^-1-约2800cm^-1。建立模型的第三层时可选取以下谱段：约1500cm^-1-约1200cm^-1、约940cm^-1-约760cm^-1以及约3100cm^-1-约2900cm^-1；或者约1480cm^-1-约1310cm^-1，以及约920cm^-1-约870cm^-1；或者约1500cm^-1-约1300cm^-1，以及约950cm^-1-约800cm^-1，或者它们的结合。
当采用定性分析鉴别模型时，通过观察对照微生物红外光谱的差异选择谱段区域，即选择待鉴别的微生物类别内图谱差异小而类别间图谱差异大的谱段作为谱段组合。优选建立模型采用的谱段为约1200cm^-1-约900cm^-1、约3000cm^-1-约2800cm^-1以及约1500cm^-1-约1400cm^-1。
本发明的微生物鉴别模型对待测微生物的正确鉴别率高于70％，在一个实施方案中，正确鉴别率高于80％；在另一个实施方案中，正确鉴别率高于90％；在另一个实施方案中，正确鉴别率高于95％。
当发现不属于建立鉴别模型的对照微生物的新的微生物，特别是有代表性的微生物(例如通过其他方法，如使用API鉴定条，或者其他分子生物学反应鉴别为目标微生物，但红外鉴定为非目标菌株的微生物)时，可将其作为新的对照微生物进行光谱数据采集和处理，并将其与此前建立模型所用对照微生物的光谱数据一起用于建立新的鉴别模型，也即将其原始光谱和平均光谱(例如，由OPUS软件中自带的光谱平均功能获得)加入到本发明的微生物红外光谱鉴别模型的谱库中，重新建立微生物鉴别模型，以对微生物鉴别模型进行优化。
4.待测微生物的鉴别
按照与对照微生物相同的培养条件、样品制备方法和光谱采集条件处理待测微生物并进行光谱数据采集，再将与建立模型时的谱段相同谱段上的待测样品光谱数据代入到微生物鉴别模型中进行鉴别。
本发明中，可以分别使用一次或多次聚类分析鉴别模型或定性分析鉴别模型对待测微生物进行鉴别，也可以同时使用二者进行鉴别。
当同时采用聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型进行鉴别时，采用的谱段与上述单独使用聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型时采用的谱段相同。
优选同时采用上述两种鉴别模型进行鉴别。
鉴别结果的判断准则如下：
(1)使用聚类分析鉴别模型时
使用该模型进行待测微生物鉴别时，首先使用各对照微生物的平均光谱和未知微生物光谱一同进行聚类分析，计算光谱距离D值，进行聚类分析，并根据D值进行归属判断。
当Pearson相关系数r≥0.95时，认为两变量存在显著性相关；此时，相应的D≤50；故确定临界值为50，即D≤50时两株菌被认为具有高度相似性。
其中，Pearson相关系数r的计算方式如下：
r=Σ(x-x‾)Σ(Y-Y‾)Σ(x-x‾)2Σ(Y-Y‾)2---(1)]]>
其中X、Y代表响应频率范围的原始光谱强度；X，Y是平均光谱强度；
根据方程(2)，相关系数转化为D值(光谱距离)。
D＝(1.0-r)＊1000.0       (2)
在本发明中，通常选择所测得的光谱的若干个谱段进行距离计算，换言之，两个光谱之间的相似性以每个谱段相似性的权重(一般各权重系数选择为1)进行计算，并以此计算结果代表平均或总体的光谱相似性。可以使用例如Bruker公司OPUS程序中Scaling to 1strange或Normal to reprolevel运算方法进行该计算。
如第一层聚类分析不能确定待测微生物的归属，再依次按第二层、第三层聚类分析，直至确定所有待测微生物的归属。
(2)使用定性分析模型时
计算待测微生物红外光谱与对照微生物红外光谱数据库内各光谱的距离D_NR(匹配值)，将其与该模型相应于某一鉴定识别率的临界匹配值进行比较，如果对每一种对照微生物的数据的采集平行进行了n次，则将待测微生物与对照微生物的匹配值从小到大排列，至少前n个匹配值均小于临界匹配值，并且对应于这些匹配值的微生物属于同一类别，则该待测微生物被归入前n个匹配值所对应的微生物类别中。若前n个匹配值所对应的微生物类别不尽相同，则认为不能正确鉴别，因而不能归属微生物的类别。该过程可通过使用例如OPUS软件完成，具体而言，在OPUS软件的分析报告中若至少前n行的匹配值均小于临界匹配值并对应于同一微生物类别，则可认为正确鉴别待测微生物，并且待测微生物即被归入分析报告中前n行所示的微生物类别中；若前n行对应于不同的微生物类别，则认为不能正确鉴别，因而不能归属微生物的类别。
所述临界匹配值通过以下方式确定：均匀选取谱库中一定数量的对照微生物光谱带入谱库进行定性分析，得到一系列从小到大排列的匹配值，选取相应于所选定的每个待测微生物正确识别时的最小匹配值，汇总，绘制直方图和累积百分率表。将能够正确识别所选定的对照微生物图谱的最大匹配值设定为临界匹配值。该临界匹配值可以是约0.1-2，优选0.1至1.2，更优选0.1至1.0，最优选0.1-0.5。
所述光谱距离D_NR可以通过OPUS软件提供的Normal toreprolevel处理方法，即，重现性水平归一化法计算如下：
DNR=Σi=1nDireprolevelin---(3)]]>
式中，Di为第i个谱段的光谱距离，根据上文的公式(1)(2)计算得到；n为所选谱段的数目。Reprolevel为重现性水平值，
reprolevel＝D+2σ       (4)
式中，D和σ值分别为多次测量中相同微生物的红外光谱根据公式(1)(2)计算得到的距离平均值和标准偏差。
当红外光谱数据库按上文所述由每一条光谱作为一个独立的组组成时，为了能够体现该微生物本身的光谱差异，选择该重现性水平归一化法计算光谱距离。
(3)同时采用以上两种模型时
当同时采用聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型时，两种鉴别模型的鉴别结果相同时，为正确鉴别结果。
当同时采用聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型时，鉴别结果的另一个判断准则为：将采用聚类分析鉴别模型为阳性的结果判断为正确鉴别，将采用聚类分析鉴别模型为阴性但采用定性分析鉴别模型为阳性的结果也判断为正确鉴别。但该结果的可信程度低于两种鉴别模型的鉴别结论相同时的结果。
下面通过具体实例对本发明进行详细说明，但本发明不限于这些实例。
实施例1
步骤1对照微生物的选择及培养
为鉴别中国药典中规定的六种控制菌，共选择了4个科中的9个属23个种的191株细菌作为对照微生物构建参照谱库。具体菌种及数量见表1。
表1


步骤2对照微生物的光谱测定
将上述对照微生物菌在TSA培养基(美国BD公司)平板上纯化形成单菌落，然后挑选单菌落划线接种于该平板上，于35℃培养24±2h。
用经过校正的直径为1mm的振动铂金接种环(德国Braun公司产品)从TSA培养基上菌落汇集处取1-2环菌苔，置于100μl灭菌水中，启动振动开关制得均匀的菌悬液，量取15μl置于96孔Si片的载样处，立即置于装有硅胶的减压干燥器中，减压干燥使菌悬液成为透明的薄膜。取出Si片，立即置于HTS-XT(德国Braun公司产品)样品腔中，用TENSOR 27型FTIR分光光度计测定FTIR吸收光图谱。测量参数：波数范围4000-500cm^-1，扫描次数16次，分辨率4cm^-1。
步骤3.1聚类分析鉴别模型的建立
以表1中所选的菌种作为对照微生物菌建立谱库。由于其中许多菌种具有较近的亲缘关系，通过一次聚类分析无法将所有菌种区分开，为此采用聚类分析分析方法。在该步骤中通过三次聚类分析区分各菌种。具体流程及参数设置见图2。
步骤3.2定性分析鉴别模型的建立
重现性水平值的确定及谱段选择
上述菌种图谱在1200-900cm^-1、3000-2800cm^-1、1500-1400cm^-1三个谱段差异明显，因此选取这三个谱段的组合建立模型。
确定以下三株细菌n次采集的图谱在不同谱段的重现性水平值(参见”Working with the IFS 28/B and B-module”中的”SamplePreparation，Measurement and Evaluation of the FT-IR Spectra ofMicroorganisms”部分，第3版，第54-56页)。
表2

重现性水平值分别取10，5，20(为便于计算此处取整)。
临界匹配值的确定
从每组菌中抽取相同数量的不同对照微生物菌株样品的原始红外光谱共计140张作为为内部图谱，使用OPUS软件进行定性分析，分别得到一系列从小到大排列的匹配值，选取能正确识别光谱的最大匹配值，汇总，绘制直方图和累积百分率表。结果如图3及下表所示。
表3


由上表可见，内部图谱能正确识别的最大匹配值均小于或等于1.50(100％对照微生物菌被正确识别)，故选取临界匹配值为1.5。
步骤4鉴别模型的正确鉴别率
共选取90株菌411张红外光谱图，包括：铜绿假单胞菌：13株61张红外光谱；大肠埃希菌：32株141张红外光谱；金黄色葡萄球菌：12株54张红外光谱；表皮葡萄球菌：13株63张红外光谱；沙门氏菌：20株92张红外光谱。
聚类分析模型的正确鉴别率
铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和沙门氏菌全部能正确鉴别，32株大肠埃希菌中有5株归入其他类。正确鉴别率为：95.5％(85/90)。
定性分析模型的正确鉴别率
将上述90菌株的所有原始光谱及平均光谱逐一带入所建立的模型(谱段为3000-2800、1500-1400和1200-900，重现性水平分别为5，20，10)中计算，按所定判断准则进行判断，正确鉴别率为：93.4％(384/411)。
实施例2
使用与实施例1相同的方法和步骤进行试验，不同之处在于对待测微生物采用两种鉴别模型联合使用的方法，以提高鉴别正确率。
具体程序和结果判断方法如图5所示。
将第一步鉴别正确的菌种的原始图谱及平均图谱分别带入第二步鉴别方法，正确鉴别率为92.2％(379/411)。验证错误的菌株及结果见表4。由表4可知，鉴别错误主要发生在将E.coli鉴别为其他肠杆菌科的微生物，即呈现假阴性的结果。
针对原定性分析鉴别模型造成假阴性的结果，将以上未能正确鉴别的图谱添加至建模谱库中，使谱库中图谱的覆盖面更广，能够代表选定菌种所表现的生物差异，基于新的谱库重新建立微生物鉴别模型。调整后的定性测试的正确鉴别率为100％，结果见表4。
表4两步鉴别方法优化前后鉴别结果

此时，使用聚类分析分析模型进行第一步鉴别，将第一步鉴别中归为非控制菌的样品图谱再使用定性分析模型进行第二步鉴别，如仍被鉴别为非控制菌，认定该鉴别结果为最终鉴别结果。使用现有技术方法复核检验结果表明，采用以上两步法的正确鉴别率为100％。
为进一步评价上文所述的两步鉴别法中被归为控制菌结果的准确性，将鉴别为控制菌的菌种的原始图谱及平均图谱同时再用聚类分析鉴别模型和定性分析鉴别模型进行鉴别，具体程序和结果判断方法如图4所示。当两种鉴别模型得出相同的结论时，该菌株被肯定为控制菌；当两种鉴别模型得出不同的结论时，该菌株被认为是可疑控制菌。
实施例3在种以下进行区分
为将菌种区分到种以下，如血清型水平。在本实施例中，选取了一系列的沙门氏菌，并测定了它们的血清型和IR图谱，进行聚类分析。具体细节见图6，其中血清类型包括O9、O4、O7，所选谱段为1202-899、901-698，重现性值水平值均为1，图谱处理方法为First derivative+Vector normalization，算法为Ward’s algorithm。从图中可以看出，IR图谱按血清型类型很好地分类。