异柠檬酸测定试剂(盒)及异柠檬酸浓度测定方法 【技术领域】
本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术
异柠檬酸isocitric acid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶地作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)的作用下变成α-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，EC4.1.3.1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。
中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D-异柠檬酸的测定方法-紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓缩汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5％的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理：异柠檬酸脱氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型：以NAD为辅酶的酶(EC1.1.1.41)和要NADP为辅酶的酶(EC1.1.1.42)，两者催化同一反应。
在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明异柠檬酸浓度测定方法如下：
异柠檬酸+辅酶 异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶
二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A
+氧
丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A+
还原型辅酶
这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC1.1.1.42)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.3.6)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应比色终点法。异柠檬酸脱氢酶酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶的作用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂(盒)较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
丙酮酸脱氢酶 12000U/L
乙酰辅酶A 7mmol/L
过氧化氢 12mmol/L
辅酶A 3mmol/L
本发明的异柠檬酸测定试剂(盒)可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A。
试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。
辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。
辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A、过氧化氢、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
【具体实施方式】
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
丙酮酸脱氢酶 12000U/L
乙酰辅酶A 7mmol/L
过氧化氢 12mmol/L
辅酶A 3mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
乙酰辅酶A 7mmol/L
过氧化氢 12mmol/L
辅酶A 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
丙酮酸脱氢酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
乙酰辅酶A 7mmol/L
过氧化氢 12mmol/L
辅酶A 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
丙酮酸脱氢酶 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0009；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达20mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±3％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.024±0.012ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。