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1、(10)授权公告号 CN 102653720 B (45)授权公告日 2013.09.25 CN 102653720 B *CN102653720B* (21)申请号 201110050525.2 (22)申请日 2011.03.02 CCTCC NO:M2011046 2011.02.23 C12N 1/14(2006.01) C12P 17/18(2006.01) (73)专利权人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 王沫 徐晓苗 赵昕梅 舒少华 徐海杰 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 CN 10119。
2、5804 A,2008.06.11, 全文 . CN 101265451 A,2008.09.17, 全文 . CN 101942393 A,2011.01.12, 全文 . 张君诚 等 . 蕨类植物内生菌研究进展 .中 国农学通报 .2010, 第 26 卷 ( 第 20 期 ),70-72. (54) 发明名称 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌 ES026 (57) 摘要 本发明属于药用植物和农业微生物技术领 域， 具体涉及从药用植物蛇足石杉中分离一株内 生真菌， 它能产生石杉碱甲或类似物， 可用于大量 生产石杉碱甲或类似物。本发明分离的内生真菌 ES026 经分子生物学和形态学鉴定为炭疽。
3、属胶孢 种 Colletotrichum gloeosporioides)， 该 菌 株 已保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M2011046。 本发明显著的特征是该菌株 经液体发酵后能产具有可逆性抑制乙酰胆碱酯酶 的活性物质， 经高效液相色谱和质谱分析表明该 化合物为石杉碱甲 (HupA)， 为治疗老年痴呆症提 供了新药源。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王慧 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页。
4、 附图4页 (10)授权公告号 CN 102653720 B CN 102653720 B *CN102653720B* 1/1 页 2 1. 一株从石杉属植物蛇足石杉植物活体中分离得到的内生真菌， 其特征在于该菌株是 胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)ES026， 保藏在中国典型培养物保藏中心， 其保藏号为 ： CCTCCNO ： M2011046， 该菌株产生石杉碱甲。 2. 权利要求 1 所述的胶孢炭疽菌在提取石杉碱甲中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102653720 B 2 1/6 页 3 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌 ES026 技。
5、术领域 0001 本发明属于药用植物和农业微生物技术领域， 具体涉及从药用植物蛇足石杉中分 离一株内生真菌， 该菌株为炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)， 它能产生石杉碱甲或类似 物， 可用于大量生产石杉碱甲或类似物。 背景技术 0002 随着世界人口老龄化， 阿尔茨海默病 (Alzheimers disease， AD， 老年痴呆 ) 已 经成为全球性的公共健康问题。 老年痴呆患病率高、 病程长， 是所有慢性疾病中致残率最高 的疾病之一， 这将给家庭和社会都带来极大的疾病负担。根据国际阿尔茨海默联合会 2009 年发布的最新预测， 到 2010 年， 全球痴呆患者人数将达到。
6、 3,560 万， 2030 年达到 6570 万， 2050 年痴呆患者数量将达到 1.154 亿， 其中 59的患者在亚洲。几十年来， 随着人们对 AD 的认识， 增强胆碱能神经的传递已经成为减缓相关的认知障碍症状主要战略之一。如多奈 哌齐、 他克林或加兰他敏， 在临床治疗上已被证明具有治疗潜力， 已被美国和一些欧洲国家 批准用于 AD 的治疗。分离自我国药用植物蛇足石杉 (Hupperzia serrata)( 俗称千层塔 ) 的生物碱石杉碱甲 (huperzine A， Hup A) 类似或优于那些已被批准临床应用的 AChE 抑制 剂， 具有长效、 低毒、 口服利用度高等特点， 是治。
7、疗 AD 的一个前景药物。 0003 目前石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取， 存在以下缺点 ： 1. 蛇足 石杉属于高等蕨类植物， 由于其生长缓慢， 孢子萌发率低， 使得野生资源匮乏 (Ma X， et al.The Lycopodium alkaloidsJ.Nat.Prod.Rep.， 2004， 21 ： 752-772.)。2. 人工栽培技 术尚未攻克(Li N.Study on the effect of Promote growth on host and fermentation Products of endophytic fungi from Huperzia se。
8、rrataD.2007.)。3. 植株体内 HupA 含量相对较低 ( 王峻， 等 . 湖南省石杉属植物中石杉碱甲含量的研究 J. 中国药学杂志， 2005， 21 ： 1616-1618.)。20 世纪 90 年代， 掀起了人工合成 Hup A 的热潮， 虽取得一定成绩， 但因合成的石杉碱甲活性低、 成本高、 毒副作用大而无法工业化生产 ( 陈业高， 等 . 石松类 生物碱成分研究的新进展J.云南师范大学学报， 2010， 30(6) ： 12-24.)。 以上因素最终导 致 HupA 来源十分短缺， 因此寻找石杉碱甲新药源成为必须。 0004 目前有从石杉科植物中分离得到的内生菌产石杉碱甲。
9、及其类似物的相关报道 ( 见表 1)， 这些研究表明利用微生物发酵生产石杉碱甲成为一种可能， 而采用植物内生真 菌发酵生产石杉碱甲无疑是解决石杉碱甲原料来源的绿色途径。 但是目前所报道的菌株石 杉碱甲产量都存在一个瓶颈问题 ： 产量低。这和实现工业化生产所需要的毫克级仍有一段 距离。 与其它报道中产石杉碱甲的菌株相比， 本发明中炭疽属胶孢种(C.gloeosporioides) 石杉碱甲产量明显较高， 向实现工业化生产更迈进一步。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 从蛇足石杉中分离得到一株内生真菌 ES026， 该菌株为炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides。
10、)， 它能产生石杉碱甲或类似物， 可用于 说 明 书 CN 102653720 B 3 2/6 页 4 大量生产石杉碱甲或类似物。 0006 本发明的技术方案如下 ： 0007 本发明采用逆向筛选的方法， 从石杉科植物蛇足石杉活体植物中分离得到植物 内生菌的候选菌 ES026， 经 18S rDNA 鉴定和微生物学鉴定证明该菌株属于炭疽属胶孢种 (Colletotrichum.gloeosporioides)， 2011年2月23日将该菌株送交湖北省武汉市武汉大 学内的保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC NO ： M2011046。 0008 具体地， 本发。
11、明所述的炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 菌株的分离及 筛选流程如下 ： 0009 先从野外(中国湖北省利川市)采集蛇足石杉活体植株， 连土一起带回实验室， 再 选择健康完好的植株进行表面清洁和消毒， 无菌条件下对不同组织部位进行切段， 接着放 置于含有PDA的培养瓶中进行培养， 观察菌落生长情况， 一般5-7天可看到组织段有丝状真 菌长出 ； 对长出的菌落分离纯化培养后进行液体发酵培养， 提取菌丝体中的总生物碱， 以标 准品石杉碱甲做对照， 进行 HPLC 检测， 根据图谱筛选产石杉碱甲类似物的菌株 ； 对疑似菌 株发酵培养， 再次提取总生物碱， 利用 HSCC。
12、C 对总生物碱中的石杉碱甲类似物做分离纯化， 进行 LC-MS 分析 ； 对分析后确定产石杉碱甲的菌株进行系统分类学研究， 包括形态学和分 子生物学水平鉴定。 0010 菌株分类学地位的鉴定 ： 0011 1. 固体培养特征 ： 0012 采用 PDA 培养基 ( 按常规方法， 成分 ： 土豆 200g， 切小块后加少量水煮沸， 葡萄糖 20g， 琼脂 15g， 加水定容至 1L) 培养炭疽属胶孢种 ES026 菌株。 0013 菌落形态 ： 25培养3天， 菌落直径为30mm， 7天时基本长满整个培养皿， 菌落为圆 形， 前期为白色， 后变为青灰色 ； 菌落中间深灰色， 绒毛状， 生长稍微蓬。
13、松， 菌落边缘相对整 齐， 菌落背面可见黑色同心轮纹， 外缘呈现黄褐色。 0014 菌丝形态 ： 无色有隔菌丝。 0015 产孢特征 ： 产孢细胞瓶颈式， 分生孢子圆筒形或长椭圆形， 有时一端稍小， 单细胞无色， 具有 1 2 个油球 ； 在 PDA 培养基上， 产孢量低， 孢子大小为 10.62 21.38(15.21)4.65 6.02(5.16)m。 0016 2.ITS 序列测定 ： 0017 1) 提取菌丝体总 DNA( 见实施例 1)。 0018 2)以ITS1(5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 )和ITS4(5 -TCCTCCGCTTATTGATAGC-3 ) 为。
14、引物， 扩增出 18S rDNA 序列， 经过测序， 得到如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列。 0019 3) 将测序结果递交 http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast 进行序列比对， 根据 BLAST 结果并结合其形态学特征得出结论， 证明该分离的菌株属于炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)。 0020 本发明的效果 0021 1. 本发明为新药源石杉碱甲的开发提供了一株新的微生物。 0022 2. 本发明所述对象属于微生物领域， 具有生长繁殖迅速， 不受季节、 气候和地域限 制， 产量提升空间大等优点。 0023 3. 本发明。
15、成功避免过度采挖蛇足石杉野生植物资源， 有效保护生态环境， 实现环 说 明 书 CN 102653720 B 4 3/6 页 5 境友好型和资源节约型的资源永续利用。 0024 本发明具有潜在的开发应用前景， 其发明效果见表 1 所示。 0025 表 1 本发明与现有技术的比较 0026 附图说明 0027 序列表 SEQ ID NO ： 1 是本发明分离的炭疽属胶孢种 ES02618S rDNA 基因序列。 0028 图 1 ： 野外采集的蛇足石杉植物图片。 0029 图 2 ： 离体条件下从蛇足石杉茎部长出的丝状真菌。 0030 图3 ： 炭疽属胶孢种(C.gloeosporioides)。
16、ES026总生物碱HPLC检测结果(峰2为 石杉碱甲标准品， 峰 1 和 3 为样品峰 )。 0031 图 4 ： 炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 发酵产物的一级质谱和二级质谱 图。其中 ： 0032 图 4A 为一级质谱 ； 图 4B 为二级质谱。 0033 图 5 ： 炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 的 ITS PCR 产物电泳图。 0034 图 6 ： 炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 聚类分析图。 0035 图 7 ： 炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 在 PSA。
17、 培养基上的菌落形态。 0036 图 8 ： 炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 在 100 倍油镜视野下的显微结 构。 具体实施方式 0037 实施例 1 0038 1、 从中国湖北省利川市采集蛇足石杉野生植株， 连同泥土带回实验室培养 ( 见图 1)。 0039 2、 挑选健康、 株高 6-10cm 植株流水冲洗 30 分钟， 除去表面污垢。 0040 3、 进行表面消毒， 步骤如下 ： 0041 1) 先用 70 -75酒精浸泡 2 次， 每次 2-3 分钟。 0042 2) 接着用 0.1 HgCl2浸泡 5 分钟， 轻摇 3 次。 说 明 书 CN 102。
18、653720 B 5 4/6 页 6 0043 3) 沥干植株上的液体， 再用无菌水浸洗 5 遍， 充分洗净以避免 HgCl2残留， 并用最 后一次浸洗液涂布于含有 PDA 培养基 ( 按常规方法， 成分 ： 土豆 200g 切小块后加少量水煮 沸， 葡萄糖 20g， 琼脂 15g/L， 灭菌前 pH6.5 ； 加水定容至 1L， 在 121高压蒸汽下灭菌 20 分 钟 ) 的平皿上。按照 200( 最后一次浸洗液 )ul/ 皿， 制备 3-5 个皿 ( 对照组 ： 以排除表面灭 菌不彻底带来的干扰 )。 0044 4) 用无菌滤纸吸干残留液体， 将植株的茎段切至 1cm， 或将根、 茎、 叶。
19、分别截断置 于装有 PDA 培养基的培养瓶中。 0045 5) 将步骤 4) 的外植体连同对照组置于 25条件下， 每天人工光照 ( 光照强度为 2000lux)， 培养一周。 0046 4、 从步骤3得到的外植体上共分离到128株内生真菌(见图2)， 依据常规方法(张 昊， 等 . 一种简单快速的赤霉病菌单孢分离方法平板稀释画线分离法 J. 植物保护， 2008， 34(6) ： 134-136.) 对所得菌株进行分离纯化。 0047 5、 将纯化后的菌株用 PDB 液体培养基进行发酵培养， 收集菌丝体。 0048 其中 ： PDB 液体培养基的配方是 ： 0049 马铃薯 ( 切块 )20。
20、0g ； 葡萄糖 20g ； 补充蒸馏水至 1000ml， 灭菌前调 pH 至 6.5。 0050 PDB 液体培养基的制作方法是 ： 将洗净后去皮的马铃薯切碎， 加水 1000ml 煮沸半 个小时左右， 用4层纱布虑去马铃薯， 然后加入葡萄糖20g， 加水补足至1000ml， 搅拌溶解后 分装灭菌 ( 在 121高压蒸汽下灭菌 20 分钟 )。 0051 炭疽属胶孢种 ES026 菌丝体的获得， 包括以下步骤 ： 0052 1) 制备种子培养液 ： 将炭疽属胶孢种 ES026 接种于含有 100ml PDB 培养基的锥形 瓶中， 于 25， 160rpm， 培养 24 小时。 0053 2)。
21、 扩大培养 ： 将炭疽属胶孢种 ES026 种子液以 5 ( 体积比 ) 接种量接种于扩大 培养液中， 于 25， 160rpm， 培养 120 小时， 得到球状的菌丝体。 0054 3) 收集菌丝体 ： 将步骤 2) 的培养物过 60 目滤网， 用蒸馏水冲洗 3 次， 挤干后放置 于干燥箱中， 于 40下干燥至恒重。 0055 6、 利用酸碱 pH 值交替的方法 ( 具体见下面的步骤 ) 提取菌体内的总生物碱。 0056 总生物碱的提取， 其步骤如下 ： 0057 1) 液氮条件下研磨干燥后的菌丝体至粉末状 ； 0058 2)用pH1.5的盐酸溶液按130(g/v)比例浸泡菌丝体， 超声处理。
22、(江苏， 昆山市 超声仪器有限公司 KQ5200DE)， 40KHZ， 160W， 1 小时后， 过夜。 0059 3) 离心酸液， 收集上清液体部分。 0060 4) 用浓氨水调 pH 值至 9.0， 静置 2-3 小时。 0061 5) 用等体积氯仿抽提 3 次， 合并有机相。 0062 6) 使用旋转蒸发仪 ( 上海爱朗仪器有限公司， 型号 ： N-1100)40条件下浓缩有机 相至粘稠状， 再用甲醇溶解。 0063 7、 用高效液相色谱仪(HPLC)检测步骤6所提取的总生物碱， 并以石杉碱甲(HupA) 标准品 ( 购自上海同田生物技术有限公司 ) 做对照。技术条件如下 ： 流动相 ：。
23、 甲醇 -80mM 醋酸铵 ( 体积比 3 7) ； 流速 ： 1.0ml/min ； 温度 ： 25， ； 检测波长 ： 310nm ； 柱子 ： Eclipse XDB-C18-USP4.6*250mm。 说 明 书 CN 102653720 B 6 5/6 页 7 0064 8、 对步骤 7 所得的数据进行分析 ( 见图 3)， 结果表明从茎部分离到的一株内生真 菌产 HupA 类似物。 0065 9、 采用高速逆流色谱 (HSCCC， 上海同田生物技术有限公司 ) 分离纯化步骤 1 6 所得的总生物碱， 收集该类似物。 0066 10、 将步骤 9 所分离到的组分送至华中科技大学测试中。
24、心， HPLC-MS 检测后， 依据 峰谱特征确定该组分为 HupA( 见图 4)。 0067 11、 同时将步骤 9 分离到的组分进行乙酰胆碱酯酶活性抑制试验 ( 殷帅文， 等 . 不 同蕨类植物提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的评价 J. 天然产物研究与开发， 2009， 21 ： 854-857.)， 标准品HupA做对照， 浓度范围是0.01mg/ml到0.2mg/ml， 所得线性方程为 ： y 0.1317x-0.1073R2 0.994)。 0068 12、 在获得该微生物发酵产物的活性功能后， 再对该微生物进行分类学鉴定， 其鉴 定包括传统菌学特征 ( 如前所述 ) 鉴定和分子生物学鉴。
25、定。具体方法是 ： 0069 炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)ES026 的总 DNA 提取 ： 0070 1) 研磨 ： 在灭菌的小型研钵中加 0.2g 新鲜炭疽属胶孢种 ES026 菌丝， 再加入少量 2CTAB 提取液 (100mmol/L Tris-HCl pH 8.0， 1.4mol/LNaCl， 20mmol/L EDTA， 2 CTAB， 0.1 -2 - 巯基乙醇 )， 在冰上进行研磨， 时间不宜过长以防止 DNA 降解。将混合物转 移至 2.0mL 离心管， 其终量为 1000L。 0071 2) 水浴 ： 将研磨好的粘稠状炭疽属胶孢种 ES026 菌丝混。
26、合液放入 65水浴 1h。 0072 3) 收集上清 ： 水浴结束后， 12,000r/min 离心 10min， 取上清液 800L 转移至一个 灭菌的 2.0mL 离心管中。 0073 4) 抽提 ： 加入等体积的氯仿 /Tris- 饱和酚 ( 体积比为 1 1) 混合液， 12,000r/ min 离心 10min， 取上清液放入另一个灭菌的 2.0mL 离心管中。重复 2 次。 0074 5) 重提 ： 在上清液中加入等体积的氯仿 / 异戊醇 ( 体积比为 24 1) 混合液， 12,000r/min 离心 10min， 取上清液放入另一新的灭菌的 1.5mL 离心管中。 0075 6。
27、)沉淀 ： 于上清液中加3mol/L醋酸钾80-100L， 再加等体积冰冷的异丙醇， 混匀 后置于 -20或 4冰箱中沉淀 1h 或过夜， 12,000r/min 离心 10min， 弃上清液， 收集沉淀。 0076 7)洗涤 ： 用500L新鲜配制的70酒精洗涤沉淀， 12,000r/min离心10min， 弃上 清液 ( 防止倒流 )， 重复 2 次， 收集沉淀， 置 37的恒温箱中干燥 30min。 0077 8) 溶解 ： 在干燥后的离心管中加入 50L 去离子水或 1TE， 充分溶解后放入 4 冰箱中待电泳检测。 0078 9) 保存 ： 将通过电泳检测的总 DNA 放入 -20冰箱。
28、中保存备用。 0079 PCR 扩增体系及反应条件 ： 0080 PCR反应体系包括10buffer 2.5L， dNTP 2L(2.5mmol/L)， 引物ITS1和ITS4 各 1L(10m)， TaqDNA 聚合酶 0.2L(5U/L)， DNA 模板 1L， ddH2O 补足 25L。反应 条件为95.05min变性后进入循环， 循环参数为 ： 95.01min， 56.01min， 72.01min， 35 个循环后 72.0延伸 10min。反应结束后将 PCR 产物用 1.2琼脂糖电泳， 获得大小约 为 530bp 的基因片段， ( 见图 5)。测序结果如序列表 SEQ ID N。
29、O ： 1 所示。 0081 将测序结果递交至 http:/blast.ncbi.nih.gov/Blast. 进行比对， 再利用软件 MEGA3.1 和 BJOEDIT 对所克隆片段进行聚类分析 ( 见图 6)， 结合菌株形态学特征 ( 见图 7 说 明 书 CN 102653720 B 7 6/6 页 8 和图 8)， 该菌被鉴定为炭疽属胶孢种 (C.gloeosporioides)( 参见 ： 魏景超 . 真菌鉴定手册 M. 上海科学技术出版社， 1979.) 0082 本发明分离的炭疽属胶孢种 ES026 能产生石杉碱甲或类似物， 其生物学活性是可 以可逆性抑制乙酰胆碱酯酶， 为大量生产石杉碱甲提供了新的来源。本发明的实施可以采 用常规的生物发酵方法 ( 例如采用发酵罐的方法 ) 进行生产。 说 明 书 CN 102653720 B 8 1/1 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102653720 B 9 1/4 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102653720 B 10 2/4 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 102653720 B 11 3/4 页 12 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102653720 B 12 4/4 页 13 图 8 说 明 书 附 图 CN 102653720 B 13 。