技术领域
本发明涉及生物科技和医学领域，具体涉及一种简单、敏感且快速的实时 核酸扩增的聚合酶链反应恒温基因扩增方法、以及用于该方法的特殊引物组及 试剂盒。
本方面的方法、引物及试剂盒可广泛应用于基础研究和临床诊断中的血 液、细胞组织等各种生物样品中特定DNA基因野生型或突变样本的检测(例如包 括但不限于EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、PDGFR、ABL或其它 癌基因等野生型或突变基因)，也可用于特定基因的恒温扩增。
背景技术
A.基因检测的临床意义
基因检测主要是用于疾病的诊断，疾病的预防和指导个体化用药。例如，对 结核杆菌感染的诊断，以前主要依靠痰、粪便或血液培养，整个检验流程需要 在两周以上，现在采用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在1小时 内就能得出结果。疾病的预防，就是检测健康人群的基因型，预测个人患病的 风险，并向受检者提出生活上的指导，避免疾病的发生。比如结肠癌，APC基 因、DCC基因和P53基因的缺陷与肠癌的发生有密切的关系。这几个基因存在 缺陷的人具有患上结肠癌的高风险。通过基因检测，在上皮细胞的增生还没有 真正演化成结肠癌的时候，就能够发现结肠癌的苗头，及早采取措施进行预防， 就有可能防止结肠癌的产生。临床上研究发现基因UGT1A1启动子区域的多态 性与药物伊立替康的毒副作用有相关性。如果盲目用药可造成中性粒细胞减少 及腹泻的副作用。美国FDA已建议病人在使用伊立替康前要进行UGT1A1基 因型的检测。中国国家卫生部在新的临床检验项目目录中也增列了“化学药品个 体化用药基因检测项目”。UGT1A1基因型检测对于临床正确用药，减少毒副作 用，提高疗效具有明确的临床意义。
因此，从临床角度而言，本领域中迫切需要开发出更为简便、灵敏且快速的基 因检测方法以及适用于该方法的引物和试剂盒。
B.基因突变检测的临床意义
随着现代分子生物学研究的不断深入，对疾病发病机制、诊断及防治的研 究已达到分子水平，从基因水平诊断和防治疾病已成为现代医学的重要课题。
突变基因改变了原有的结构与功能，导致原有的遗传性状发生改变，其中 一部分基因突变可导致遗传病或具有遗传倾向的病甚至肿瘤。如血友病是凝血 因子基因的突变、地中海贫血是珠蛋白的基因突变等。具有遗传倾向的高血压 病、糖尿病、溃疡病等系多基因变异与环境因素共同作用的结果。肿瘤是体细 胞基因突变的结果。
基因诊断(gene diagnosis)就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术 方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的检测目的物是DNA或RNA，前者反映基因的存在状态，后者反映基 因的表达状态。传统的诊断方法主要以疾病的表型改变为依据，生物个体的表 型性状是基因在一定条件下的体现，基因的改变可导致各种表型的改变而出现 疾病。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，使开展基因诊断成为可能。
因此，基因突变的检测对于基因突变相关疾病的发病机理研究、诊断、易 感性评估、患者用药选择、和/或预后评估具有非常重要的意义。
以表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)和KRAS基 因为例。目前，EGFR与KRAS基因靶向治疗已成为晚期非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)易瑞 沙和特罗凯药物治疗的研究的热点。研究表明，易瑞沙和特罗凯治疗效果显著 的患者中EGFR基因突变的发生率明显高于治疗无效者。在有EGFR基因突变的 患者中易瑞沙和特罗凯的肿瘤客观缓解率明显高于无突变的患者。EGFR基因 突变率为33％，且突变部位90％左右位于编码酪氨酸激酶区的外显子19及外显 子21(如L858R)，为杂合突变。EGFR的突变表达对选择酪氨酸激酶抑制剂治疗 有着重要的指导意义，目前用于检测EGFR基因突变的标本多为手术切除的肿 瘤组织标本，但晚期病人很难获得肿瘤组织，寻找一种易获得的肿瘤组织替代 标本进行EGFR基因突变的检测，从中筛选出适合酪氨酸激酶抑制剂治疗的患 者，实现个体化治疗，对临床工作非常重要。
KRAS基因是EGFR信号通路中的重要分子之一，它是位于12号染色体 p12.1位置上的21kD大小的蛋白。突变型KRAS不依赖刺激信号的激活，即突变 型KRAS基因不受上游EGFR基因状态的影响，始终处于激活状态，只有野生型 KRAS基因受上游EGFR信号刺激的影响，这也是具有突变型KRAS基因患者对 抗EGFR药物(例如爱必妥(Erbitux)、维克替比(Vectibix，Panitumumab)等)治疗 无效的理论基础。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、 13、61密码子)上，占所有突变的90％以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸 凋亡，这种异常在胰腺癌、大肠癌、肺癌等肿瘤中的发生率较高。在胰腺癌中， KRAS基因的点突变发生率高达90％以上。
检测KRAS基因突变，对判断这些肿瘤的发生发展、预后以及了解肿瘤的 治疗效果具有积极的意义。在正常人血中检出KRAS基因突变则提示存在肿瘤 易感性；良性肿瘤患者若检出KRAS基因突可能提示有恶变的可能；KRAS基因 突变阳性则预示着癌症复发的可能性也很高，预后差；无KRAS基因突变的肺 癌、结直肠癌等肿瘤患者，经抗EGFR靶向药物治疗疗效明显。目前KRAS基因 突变检测已被写入美国最新版《NCCN结直肠癌临床实践指南》。因此，通过 检测KRAS基因突变状态可以筛选出针对抗EGFR靶向药物治疗有效的结直肠 癌患者，帮助临床医生选择制定对肿瘤患者最有效的治疗方法。在通常情况下， 60％左右结直肠癌患者的KRAS基因都是野生型的，如果都接受了KRAS基因突 变检测，通过个体化的综合治疗方案，有效率可显著增加。
因此，从临床角度而言，本领域中迫切需要开发出更为简便、灵敏且快速 的基因突变检测方法以及适用于该方法的引物和试剂盒。
C.基因突变的检测技术
基因突变，主要是指DNA分子发生的可遗传的变异，是基因在结构上发生 碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的形式可以是核酸置换、插入、缺失 和重叠等多种。
在当今生命科学研究中，基因突变与各种疾病(例如肿瘤)的相关性已成为 研究热点之一，检测方法也随之迅速发展。聚合酶链反应扩增技术(PCR)的应 用使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子 诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由于PCR衍生出的新方法不断出现， 分析结果的准确性、敏感性也有较大的提高。在这些方法中具有代表性的方法 包括：PCR联合核酸序列分析、Taqman探针实时PCR法、突变体富集PCR法、 DNA芯片技术、扩增阻碍突变系统等。
PCR联合核酸序列分析：这是一种基于PCR的核酸序列测定方法，是所有 其它快速简便检测变异技术的基础，也是检测点突变最直接、最基本的一种方 法。序列测定的模板主要来源于传统的PCR技术，最后都需用序列分析才能确 定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。测序方法的基本原理是Sanger 发明的双脱氧DNA链末端终止法。这种直接测序是检测基因突变的经典方法， 但敏感性低，只有当变异基因占总基因的25％以上时才能被检测到。
突变体富集PCR法：该方法利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在已 知的限制性内切酶位点(如KRAS基因第12密码子的BstNI位点)，用连续二次的 巢式PCR来扩增包括存在酶位点编码子的DNA片段(例如包括KRAS第12密码 子的DNA片段)，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段， 野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次 PCR扩增并得到产物的富集。该方法的敏感性在10％左右。
DNA芯片技术：该方法是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了 集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。其 基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之 间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变 DNA分别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的 DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生 的荧光信号，即可确定是否存在突变。该方法快速简单、自动化程度高。
扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)：用 于对已知突变基因进行检测。该方法是基于引物3′端错配PCR的方法，如引物 3′端碱基与模板错配会导致Taq酶扩增效率下降。该法通过设计两个5′端引物， 一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两 种引物及3′端引物进行两个平行PCR，与突变DNA完互补的引物才可延伸并得 到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3′端则导致PCR不能延伸，ARMS技术借 鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点，但 优点是反应将选择性扩增单链基因。该技术的敏感性提高到1％左右。
上述不同的方法在特异性方面上比起传统的PCR都有所提高，但灵敏度、 性价比、临床应用高通量等方面有待于进一步加强。由此，本领域中仍迫切需 要开发出更为简便、灵敏且快速的基因突变检测方法。
发明内容
本发明的主要目的就在于提供一种简便、灵敏且快速的基因检测方法。本 发明的另一目的在于提供适用于该方法的引物，以及包含适用于本发明方法的 引物和其它试剂的试剂盒。
在本发明的第一方面中，提供了一种用于基因检测的恒温聚合酶链式反应方 法，所述方法包括：
A)针对待检测的靶基因DNA序列，围绕其扩增基因片段周围的5个不同区域 提供如下5种引物：
(a)基于靶基因3’端的外部引物；
(b)基于靶基因3’端的外部引物内侧的转折引物；
(c)基于靶基因中间部位的激励扩增引物；
(d)基于靶基因外部引物内侧的折叠引物；和
(e)基于靶基因5’端的外部引物；
B)提供包含A)中所述引物的聚合酶链式反应体系，并将待测DNA样品加入所 述反应体系中，其中如果该样品所含为双链DNA，则在将其加入所述反应体系之 前，对该样品进行变性；
C)在50～70℃的恒温下进行聚合酶链式反应；
D)通过将待检测DNA的恒温基因扩增反应数据或图谱与阳性对照比较，获得 基因检测结果。
在本发明的一个实施方式中，所述待测DNA样品来自：血液、组织或组织切 片、培养细胞。
在一个优选例中，所述待测DNA样品来源于：人的细胞和外周血(如全血、血 清或血浆)。在另一个优选例中，所述待测DNA样品可获自：人的新鲜获取的或固 定的手术样品、内镜活检样品、或穿刺胸腹水样品。在另一个优选例中，所述待测 DNA样品来源于：人、动物或病原菌。在另一个优选例中，所述靶基因选自：EGFR、 KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、PDGFR、和ABL基因或它们的突变体。在另 一个优选例中，所述靶基因是野生型基因或突变基因。在另一个优选例中，所述突 变基因为纯合突变或杂合突变，且突变区位于扩增基因片段中。
在本发明的另一个实施方式中，所述引物是合成的核酸引物或肽核酸合成的 引物。
在本发明的另一个实施方式中，所述反应体系包含：DNA、水、MgCl2、4种 dNTP、缓冲液、以及脂肪芽胞杆菌聚合酶。
在一个优选例中，所述脂肪芽胞杆菌聚合酶的用量为2～12U，优选4～10U， 更优选4～6U。在另一个优选例中，所述脂肪芽胞杆菌聚合酶购自NEB。在另一个 优选例中，所述反应体系还包含：核酸染料(优选SYBR Green I)或标记分子。在另 一个优选例中，所述双链DNA的变性是在90～110℃，优选98±0.5℃的温度下， 处理3～10分钟，优选5分钟。
在本发明的另一个实施方式中，所述反应在55～65℃的温度下进行20～60分 钟。在一个优选例中，所述反应在60±0.5℃的温度下进行，反应时间为20～50分 钟。
在本发明的另一个实施方式中，所述反应数据或图谱是通过选自下组的方法 获得的：生物标记物的定量分析或荧光标记物的定量分析。
在一个优选例中，所述的基因检测结果选自：确定样品中靶基因的存在与否、 靶基因中是否存在突变、或突变为杂合突变还是纯合突变。在另一个优选例中，所 述阳性对照是：已知的靶基因序列、和/或包含已知突变的序列，所述序列可通过 人工合成制得、基因工程化方法获得、或通过本领域常规方法从生物样品中分离而 得。
在另一个优选例中，本发明的方法用于判定靶基因序列的存在与否，阳性 对照为靶基因序列，如果结果持续显示阳性信号(即出现与阳性对照相同或相似 的信号)，则表明样品中存在靶基因序列。
在另一个优选例中，本发明的方法用于判定靶基因中是否存在特定突变 时，阳性对照为包含该特定突变的靶基因序列，如果突变靶点引物反应结果持 续显示阳性信号时，表明靶基因中存在基因突变；如果结果未显示阳性信号时， 表明靶基因中无基因突变。
在另一个优选例中，本发明的方法用于判定靶基因中的突变为纯合突变还 是杂合突变，阳性对照分别为包含该特定突变的靶基因序列和不包含突变的正 常靶基因序列，当检测结果显示无正常基因靶点引物反应信号而只有突变靶点 引物反应结果时，表明靶基因中存在的是纯合突变；当结果显示正常基因靶点 引物反应结果和突变靶点引物反应结果都时存在时，表明靶基因中所存在的基 因突变是杂合突变。
在本发明的第二方面中，提供了一种引物组，其包括：
(a)基于靶基因3’端DNA序列的外部引物；
(b)基于靶基因3’端DNA序列的外部引物内侧的转折引物；
(c)基于靶基因DNA序列中间部位的激励扩增引物；
(d)基于靶基因DNA序列外部引物内侧的折叠引物；和
(e)基于靶基因DNA序列5’端的外部引物。
在本发明的第三方面中，提供了一种试剂盒，其包括：单独或混合的本发明 的引物组中的各成员；一个或多个容器。
在一个优选例中，所述试剂盒还任选包含选自下组物质中的一种或多种： DNA、水、MgCl2、4种dNTP、核酸染料、PCR缓冲液、以及脂肪芽胞杆菌聚合酶。 在另一个优选例中，所述脂肪芽胞杆菌聚合酶的量为2～12U，优选4～10U，更优 选4～6U。在另一个优选例中，所述核酸染料为任何能与dsDNA结合的，优选SYBR Green。
在本发明的第四方面中，提供了本发明的引物组在制备用于恒温基因扩增 或检测的聚合酶链反应的试剂盒中的用途。
在一个优选例中，所述试剂盒如前所述。在另一个优选例中，所述试剂盒 用于检测样品中靶基因的存在与否、靶基因中是否存在突变、或靶基因中的突变 为纯合突变还是杂合突变。
在另一个优选例中，所述试剂盒用于遗传或基因突变相关疾病的诊断、易 感性评估、患者用药选择、和/或预后评估。在另一个优选例中，所述遗传或基 因突变相关疾病选自：癌症、血液病或先天性遗传性疾病，所述癌症优选：直 肠癌、胃肠道癌、非小细胞肺癌、胃肠间质瘤、白血病(优选慢性粒细胞性白血 病)、腺癌等。
在本发明的第五方面中，提供了本发明的引物组在聚合酶链式反应中的用 途，所述反应选自：聚合酶链式反应扩增、环介导恒温聚合酶链式反应扩增、对称 或不对称的单链聚合酶链式反应扩增。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1：采用本发明的核酸基因恒温扩增方法所获得的阳性结果的典型荧光 峰图，其中：横坐标为反应时间(单位：分钟)，纵坐标为标准化的荧光强度值 (Fluorescence(norm))。
图2：采用本发明的核酸基因恒温扩增方法所获得的阴性结果的典型荧光 峰图，其中：横坐标为反应时间(单位：分钟)，纵坐标为标准化的荧光强度值。
图3：采用本发明的核酸基因恒温扩增方法对不同拷贝数DNA进行检测的 结果，其中：A：3000拷贝；B：600拷贝；C：300拷贝；D：60拷贝；E：30 拷贝；F：6拷贝；G：3拷贝；H：0拷贝；横坐标为反应时间(单位：分钟)，纵 坐标为标准化的荧光强度值。
图4：采用现有技术的荧光探针即时PCR扩增方法对不同拷贝数DNA进行 检测的结果，其中：A：3000拷贝；B：600拷贝；C：300拷贝；D：60拷贝；E： 30拷贝；F：6拷贝；G：3拷贝；H：0拷贝；横坐标为反应循环数，纵坐标为标 准化的荧光强度值。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究开发出一种简单、灵敏且快速进行核酸扩 增的聚合酶链反应恒温基因扩增技术方法，该方法可广泛应用于基础研究和临 床诊断中检测血液、细胞、组织中正常基因和/或突变基因。
如本文所用，术语“核酸基因恒温扩增方法”、“核酸聚合酶反应”、“本 发明的聚合酶链式反应”可互换使用，均是指本发明中采用特定引物组、在恒 温下进行的核酸扩增反应。
本发明的用于恒温基因扩增的聚合酶链反应方法包括如下步骤：
A)针对待检测的靶基因DNA序列，围绕其扩增基因片段周围的5个不同区域 提供如下引物：
(a)基于靶基因3’端的外部引物；
(b)基于靶基因3’端的外部引物内侧的转折引物；
(c)基于靶基因中间部位的激励扩增引物；
(d)基于靶基因外部引物内侧的折叠引物；和
(e)基于靶基因5’端的外部引物；
B)提供包含A)中所述引物的聚合酶链式反应体系，并将待测DNA样品加入所 述反应体系中，其中如果该样品所含为双链DNA，则在将其加入所述反应体系之 前，对该样品进行变性；
C)在50～70℃，优选55～65℃的恒温下进行聚合酶链式反应。
在本发明的方法用于恒温基因检测时，其在上述扩增的基础上还进一步包括 步骤：
D)通过将待检测DNA的恒温基因扩增反应数据或图谱与阳性对照比较，获得 基因检测结果。
本发明的一个示例性但非限制性的实施方式如下：
步骤1.样本采集：从人类全血、经皮肤穿刺采集的组织、手术中采集的组 织、以及冰冻和石蜡包埋组织等组织获得样品，作为DNA检测的来源。
步骤2.基因组DNA提取：根据本领域已知的方法或采用市售试剂盒，提 取基因组DNA(例如采用市售离心柱或溶液型全血提取试剂盒来提取全血 DNA)。
步骤3.DNA纯度和浓度检测：检测DNA纯度和浓度(例如采用分光光度 法)，并进行变性处理。
步骤4.引物设计：主要是针对靶基因围绕扩增点周围的5个不同的区域设 计5种不同引物和探针：基于靶基因3’端的外部引物和外部引物内侧的转折引 物、5’端的外部引物和外部引物内侧的折叠引物、以及中间部位的激励扩增引 物。
步骤5.聚合酶链式扩增反应体系配制：在聚合酶链扩增反应管中配制包含 5种不同引物和探针、dNTP、缓冲液、荧光标记物试剂、样本DNA、聚合酶(优 选脂肪芽胞杆菌聚合酶)等试剂的反应体系。
步骤6.实时聚合酶链扩增反应：对反应体系进行实时聚合酶链扩增反应， 反应条件为60～65℃、20～60分钟。
步骤7.结果分析和评价：通过观察比较各待测样品与采用相同检测方法所 得的阳性对照的实时荧光曲线图结果，分析判断是否存在靶基因、或基因中是 否存在突变、或所存在的突变为纯合突变还是杂合突变。
应理解，本领域普通技术人员在阅读本发明之后，可基于现有技术和/或实 际情况对该具体实施方式进行必要的改进或改变。
DNA样品的准备
用于本发明方法中的待测DNA样品，可通过本领域技术人员熟知的方法和 技术制备和获得。
可从例如血液样品(如全血、血清或血浆)、经皮肤穿刺采集的组织、手术 中采集的组织、培养物、冰冻、固定(例如福尔马林固定)或石蜡包埋组织中获 得样品，作为DNA的来源，优选从血液样品中获得DNA。在本发明的一个实施 方式中，DNA样品来源于：人、动物或病原菌。
可采用本领域已知的方法(如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989))或采用市售试剂盒提取样品 中的基因组DNA(例如采用市售离心柱或溶液型全血提取试剂盒来提取全血 DNA)，并对所得DNA的纯度和浓度进行检测(例如采用分光光度法)。
引物设计
在本发明中采用了特定的引物组，其中包括：(a)基于靶基因3’端的外部 引物；(b)基于靶基因3’端的外部引物内侧的转折引物；(c)基于靶基因中间 部位的激励扩增探针；(d)基于靶基因外部引物内侧的折叠引物；和(e)基于靶 基因5’端的外部引物。
如本文所用，术语“靶基因”是指待检测的目标基因，该基因可为野生型 基因或其中包含突变的特定基因，该靶基因的存在与否或其中是否存在突变可 与疾病的易感性、疾病的发生、针对疾病的用药选择、和/或疾病的预后等相关。 所述靶基因可选自(但不限于)：EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、PDGFR、 ABL基因或其它癌基因的野生型或突变型。
如本文所用，术语“外部引物”是指：针对基因片段端部的特异性引物。
如本文所用，术语“转折引物”是指：位于两外部引物之间，且其末端的 序列本身互补，可自身对折的引物。
如本文所用，术语“折叠引物”是指：位于两外部引物之间，与靶基因片 段上有相对应互补的序列，可与基因片段互补的引物。
如本文所用，术语“激励扩增引物”是指：位于转折引物和折叠引物之间， 并与转折引物或折叠引物为上下游关系的引物。
例如，当本发明的方法用于检测表皮生长因子(EGF)受体基因(NM_001982) 外显子21区突变时，可采用SEQ ID NOs：1-5的引物组来检测突变基因，而采用 SEQ ID NOs：6-10的引物组来检测正常基因。
又例如，当本发明的方法用于检测KRAS(NM_033360)12外显子突变基因 时，可采用SEQ ID NOs：11-15的引物组来检测突变基因，而采用SEQ ID NOs： 16-20的引物组来检测正常基因。
本领域普通技术人员在阅读了本发明的说明书之后，可根据本领域中已知 的引物设计方法，针对各种靶基因设计并制得这些引物。
反应体系和反应过程
本发明的反应体系中包含常规用量的模板DNA、水、MgCl2、4种dNTP、 PCR缓冲液、以及DNA聚合酶。本领域普通技术人员可根据常识选择这些组分 的用量。
在本发明的方法中，优选采用脂肪芽胞杆菌聚合酶，所述脂肪芽胞杆菌聚 合酶的用量为2～12U，优选4～10U，更优选4～6U。可通过市售获得市售脂肪 芽胞杆菌聚合酶，例如购自NEB公司。
在本发明的PCR反应体系中还可包含：任何能与dsDNA结合的核酸染料、 标记分子。所述的核酸染料包括但不限于：SYBR Green I。
可在将待测DNA加入本发明的PCR体系之前，对DNA进行变性处理，例如 在90～110℃(优选98±0.5℃)的温度下，处理3～10分钟(优选5分钟)。
本发明的恒温扩增反应可采用本领域常规的PCR仪或可提供恒温的其它仪 器或设备进行。反应温度通常为50～70℃，优选55～65℃，更优选60±0.5℃。 反应的时间通常为20～60分钟，优选30～40分钟。
反应结果及分析
可通过本领域中常规的方法获取实验结果(如数据或图谱)，例如(但不限 于)：生物标记物的定量分析或荧光标记物的定量分析。
在获得实验结果后，可通过将待测样品与采用相同方法检测的阳性和/或阴 性对照DNA样本的检测结果进行比较，分析待测样品中靶基因的情况(如定量、 存在与否、是否有突变、突变为纯合还是杂合突变)。
所述阳性对照可为例如：已知的靶基因序列、和/或包含已知突变的序列， 所述序列可通过人工合成制得、基因工程化方法获得、或通过本领域常规方法 从生物样品中分离而得。
阴性对照可采用无DNA样品和/或已知不含突变的样品。
当用于判定靶基因序列的存在与否时，阳性对照为靶基因序列，如果结果 持续显示阳性信号(即出现与阳性对照相同或相似的信号)，则表明样品中存在 靶基因序列。
当用于判定靶基因中是否存在特定突变时，阳性对照为包含该特定突变的 靶基因序列，如果突变靶点引物反应结果持续显示阳性信号时，表明靶基因中 存在基因突变；如果结果未显示阳性信号时，表明靶基因中无基因突变。
当用于判定靶基因中存在的突变为杂合突变还是纯合突变时，阳性对照分 别为包含该特定突变的靶基因序列和不包含突变的正常靶基因序列，当结果显 示无正常基因靶点引物反应信号而只有突变靶点引物反应结果时，表明靶基因 中存在的是纯合突变；当结果显示正常基因靶点引物反应结果和突变靶点引物 反应结果都时存在时，表明靶基因中所存在的基因突变是杂合突变。
引物组和试剂盒
本发明中还提供了用于本发明方法的引物组，所述引物组包含针对特定靶 基因设计的：(a)基于靶基因3’端的外部引物；(b)基于靶基因3’端的外部引 物内侧的转折引物；(c)基于靶基因中间部位的激励扩增探针；(d)基于靶基因 外部引物内侧的折叠引物；和(e)基于靶基因5’端的外部引物。
这些引物可单独存在或以2、3、4或5种混合的方式存在。可以本领域中常 规的方式制备(如人工合成)、提供(如溶液或固体)和保存(如低温冷藏)所述引 物。可在使用前用适当的溶剂或缓冲液将引物配制成所需的使用浓度。
本发明中还提供了一种试剂盒，其至少包含本发明的引物组和一个或多个 容器。所述试剂盒还任选包含选自下组的试剂中的一种或多种：溶剂(如水)、 MgCl2、dNTP、核酸染料(如SYBR Green I)、分子标记物、PCR缓冲液、DNA 聚合酶(优选脂肪芽胞杆菌聚合酶)。
本发明方法、引物组和试剂盒的用途
本发明的方法、引物组和试剂盒可通过对靶基因或基因突变的检测，为遗 传或基因突变相关疾病的诊断、易感性评估、患者用药选择、和/或预后评估提 供中间信息。在本发明中，术语“遗传或基因突变相关疾病”包括但不限于： 癌症、血液病、先天性遗传型疾病。
例如，本发明的方法可用于癌症患者的用药选择、易感性评估和/或预后评 估，所述癌症包括但不限于：直肠癌、胃肠道癌、非小细胞肺癌、胃肠间质瘤、 白血病(优选慢性粒细胞性白血病)、腺癌等。
此外，本发明的引物组和试剂盒也可用于靶基因的扩增反应、或用于其它 方式的聚合酶链式反应中，例如聚合酶链式反应扩增、环介导恒温聚合酶链式反 应扩增、对称或不对称的单链聚合酶链式反应扩增。
本发明的优点
本发明的方法具有如下优点：
1.检测灵敏度明显增强，且根据反应结果可明确判定样品中是否存在靶基 因或突变基因，可广泛应用于临床，为遗传或基因突变相关疾病的诊断、易感 性评估、患者用药选择、和/或预后评估提供相关信息；
2.检测流程简单，步骤少，且无需频繁变化温度，对操纵者和反应仪器的 要求也由此降低；
3.反应时间较现有技术中的1至数天乃至一周大大缩短，整个过程(包括 DNA分离纯化)仅需2小时左右，实现了快速检测；
4.本发明的方法可对血液样品进行检测，从而无需进行组织取样等复杂操 作，降低了对取样人员的要求、且提高了被检测对象的顺应性，在临床上具有 更为广泛的应用前景。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.EFGR突变基因的实时检测
本实施例中提供了一种表皮生长因子(EGF)受体基因(NM_001982)外显子 21区突变的检测方法，其可做为临床上选择酪氨酸激酶抑制剂治疗的方法。
A.检测方法
步骤1.样品采集
按照卫生部颁布的《人类常见肿瘤新鲜组织标本采集、处理和保存的技术 规程》中所规定的方法进行全血、手术组织标本采集。
采集200μl至1ml新鲜全血，置于含EDTA抗凝剂的采血管中，保存于-20℃ 至-80℃，一般2～3年内均可以提取，保存时间越短，提取的质量越高，最好 在2个月内提取。
阳性对照的样本可采用含有E21位点突变的1970细胞株(购自中科院上海 生科院)；阴性对照的样本为无DNA样本。
步骤2.基因组DNA的分离
采用Tiangen Inc公司的DNA提取试剂盒。取步骤1中的抗凝血200μl，加入 20μl蛋白酶K混匀。然后加入200μl缓冲液GB(Tiangen Inc试剂盒)，在56℃放置 10分钟至溶液变清亮。加入200μl无水乙醇至出现絮状沉淀。把含絮状沉淀的溶 液总体加入至吸附柱CB3中(Tiangen Inc试剂盒)，并以12000rpm离心30秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲 液GD(Tiangen Inc试剂盒)，以12000rpm离心30秒。向吸附柱CB3中分别加入三 次700μl漂洗液PW洗涤DNA(Tiangen Inc试剂盒)，以12000rpm离心30秒。将吸 附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱液 TB，室温放置2-5分钟，以12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。将离 心得到的溶液再加入同一个吸附柱CB3中，室温放置2分钟，以12000rpm离心2 分钟，即得到基因组DNA溶液。
此DNA可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
阳性对照和阴性对照样品的基因组DNA提取操作过程同上。
步骤3.DNA纯度检测
利用分光光度法(Nanodrop2000，Thermo Scientific)检测DNA纯度和浓度来 测定DNA浓度，要求OD260/OD280≈1.8，统一将各样品稀释成25ng/μl。
步骤4.DNA变性
取100μg的DNA放至PCR管中，加热至98℃3分钟使DNA变性，以用于后 续的聚合酶链反应。
步骤5.PCR体系的配制
在用于检测突变基因的PCR管中配制：0.5μl的100μM 3′端外部引物(各引物 购自上海生工)、0.5μl的100μM 3′端转折引物，0.5μl的50μM 5′端外部引物，0.5μl 的50μM 5′端折叠引物，0.5μl的12.5μM激励引物。这些引物的序列如表1所示：
表1.突变基因检测引物
在用于检测正常基因的PCR管中配制3′端外部引物、3′端转折引物、5′端外 部引物、5′端折叠引物、激励引物(各引物浓度同上)。这些引物的序列如表2所 示：
表2.正常基因检测引物
在装有引物的10μl的检测体系中，PCR管中分别加入：10ng DNA、1.125μl 的水、2.5μl的25mM MgCl2、1.25μl的10mM dNTPs、0.125μl的200×SYBR Green I、1.5μl的10×PCR缓冲液，并加入1μl的脂肪芽胞杆菌聚合酶(购自NEB，8U/μl)。
步骤6.实时聚合酶链扩增反应
将容纳有PCR体系的PCR管放入实时PCR仪中，记录各样品所在96孔的位 置，进行聚合酶链扩增反应，反应参数为：60℃，45分钟。
步骤7.测序验证
对扩增产物进行测序，以验证所得结果的正确性。
B.结果分析和评价
通过观察各样品的实时聚合酶链扩增反应荧光曲线图来判断结果，其中阳 性结果(即存在突变)的典型荧光峰图如图1所示，阴性结果(即无突变)的典型荧 光峰图如图2所示，图中的两条曲线分别为复孔检测结果。
测序验证结果证实了：显示阳性结果的样品所含确为突变序列，而显示阴 性结果的样品所含确为无突变序列。
上述结果表明本发明的方法可简便、准确而有效地用于EGFR突变基因的 检测。
实施例2.KRAS(NM_033360)12外显子突变基因的实时检测
A.检测方法
检测步骤同实施例1，阳性样本为SW480细胞株，阴性对照的样本为无DNA 样本。用于突变基因检测和正常基因检测的引物序列分别如表3和表4所示：
表3.突变基因检测引物
表4.正常基因检测引物
B.结果分析和评价
通过比较各样品与对照样品的实时聚合酶链扩增反应荧光曲线图来判断 样品中存在KRAS 12突变与否，并经测序验证。结果证实了显示阳性结果的样 品所含确为突变序列，而显示阴性结果的样品所含确为无突变序列。
上述结果表明本发明的方法可简便、准确而有效地用于KRAS12突变基因 的检测。
实施例3.核酸基因恒温扩增技术与荧光探针即时PCR扩增技术的方法学比较
A.核酸基因恒温扩增技术
步骤1.样品采集
如实施例1中所描述，进行全血采集。
步骤2.基因组DNA的分离
如实施例1中所描述，分离全血样品中的基因组DNA。
步骤3.DNA纯度检测
如实施例1中所描述，对所分离基因组DNA的纯度进行检测，并进行稀释。
步骤4.DNA变性
如实施例1所描述，对DNA进行变性，所不同的是在各PCR管中分别加入 不同拷贝数的DNA：3000、600、300、60、30、6、3、0拷贝数，共八种不同 拷贝数(如图3所示)。
步骤5.实时聚合酶链扩增反应的PCR体系配制
在核酸基因恒温扩增技术的PCR管中加入实施例1步骤5中所示浓度的各突 变基因检测引物(如表1所示)。
在装有引物10μl的检测体系中，PCR管中分别加入10ng DNA、1.125μl的水、 2.5μl的25mM MgCl2、1.25μl的10mM dNTPs、0.125μl的200X SYBR Green I、1.5μl 的10×PCR缓冲液，并加入1μl的脂肪芽胞杆菌聚合酶(购自NEB，8U/μl)。
步骤6.实时聚合酶链扩增反应
在核酸基因恒温扩增技术的PCR管中进行实时聚合酶链扩增反应。
将容纳有PCR体系的PCR管放入实时PCR仪中，记录各样品所在96孔的位 置，进行PCR反应。聚合酶链扩增反应参数为：60℃，45分钟。
B.荧光探针即时PCR
步骤1～4
同“A.核酸基因恒温扩增技术”，除了DNA变性步骤是在PCR时进行。
步骤5.荧光探针即时PCR体系的配制
在荧光探针即时PCR的管中配有(总体积为10μl)：2.5μM/L的3′端外部引物 (序列GCCAGTTAACGTCTTCCT(SEQ ID NO.：1))和2.5μM/L的5′端外部引物 (序列CCACACAGCAAAGCAG(SEQ ID NO.：3))、1μg的DNA、1.25mM/L的 MgCl2、200μM/L的dNTPs、1X SYBR Green I、1μl 10×PCR缓冲液和1.0U的 Taqman聚合酶(购自ABI)，以及余量的水。
步骤6.荧光探针即时PCR反应
在荧光探针即时PCR管中进行实时聚合酶链扩增反应。将PCR管放入实时 PCR仪中，记录各样品所在96孔的位置。聚合酶链扩增反应参数为变性95℃、 10分钟，和30个循环的95℃、30秒、退火56℃，30秒、延伸72℃，30秒、然 后延续72℃，10分钟。
C.结果分析和比较
本发明的实时聚合酶链扩增反应的结果如图3所示，荧光探针即时PCR反应 的结果如图4所示。
图3的结果显示：1)本发明的实时聚合酶链扩增反应方法稳定，且能够检 测DNA量低到3个拷贝数；2)由于该反应引物中加有针对突变点的高准引物， 故反应结果为突变产物。
图4的结果显示：1)采用荧光探针即时PCR扩增EGFR基因只能够检测到 DNA量低到300到60之间的拷贝数；2)由于该反应引物中无针对突变点的高准 引物，故反应结果不确定为正常基因或突变基因。
以上结果证明：本发明的聚合酶链反应恒温基因扩增技术的灵敏度明显优 于荧光探针即时PCR扩增技术，且对基因突变与否可做出直观而明确的判定。
并且，通过反应过程参数的比较可知：本发明的方法的反应时间短(仅45 分钟)，且反应温度保持恒定(65℃)；而荧光探针即时PCR的反应时间长，且需 频繁改变温度。由此证明了：本发明的方法具有简便、高效的优点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。