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编码 N- 甲基腐胺氧化酶之核酸及其应用
    临时专利申请之优先权
     本发明要求于 2006 年 6 月 19 日所申请美国临时专利申请， 申请号为 60/814,542 及于 2007 年 2 月 16 日所申请美国临时专利申请， 申请号为 60/901,654 之优先权。
     技术领域
     本发明涉及植物， 植物细胞或其它类细胞之分子生物学及生物碱合成。除与其它 事项相关外， 该发明还涉及编码 N- 甲基腐胺氧化酶 (N-methylputrescine oxidase， MPO) 的核酸序列以及应用该核酸序列改良植物中生产生物碱的方法， 尤其是但不完全是应用该 核酸序列在烟草植物中生产烟碱， 及在植物细胞或其它类细胞中生产生物碱合成酶的方 法。 背景技术 吡咯烷类生物碱 ( 例如烟碱 ) 及托烷类生物碱 ( 例如东茛菪碱和古柯碱 ) 是具有 多种不同药理活性的植物天然产物。 例如， 烟碱可以促进认知机能， 并应用于戒烟治疗中的 烟碱替代疗法。托烷类生物碱是重要的抗胆碱能类药物。古柯碱被用作局部麻醉药。这些 化合物均从植物分离， 并被作为药物使用。
     人们有兴趣通过遗传工程方式来增加植物和植物细胞中吡咯烷类生物碱及托烷 类生物碱的生产， 以便更有效地商业化生产这些化合物以用于药物制造业。增加上述两种 生物碱的生产可以通过选择育种， 或通过使用编码这些生物碱合成酶基因的遗传工程。累 积代谢途径中间产物或减少生物碱终末产物的遗传工程方法包括经典或定向诱变， 如定向 诱导基因组局部突变技术 (Targeting Induced Local Lesions in Genomes， TILLING)， 或 利用 RNA 干扰及相关技术特异性沉默编码这些酶的基因。
     人们也有兴趣阻断上述生物碱合成途径中某些特定的代谢步骤， 以累积本身可 能具有高价值的代谢途径中间产物， 或生产包括修饰过或含量减少的生物碱终末产物的 植物。烟碱含量经遗传工程而减少的烟草植物可能有助于生产来自于植物的药物， 烟碱 含量低或无烟碱的香烟。所述香烟可以用于辅助戒烟 (Benowitz et al.Clin Pharmocol Ther.80(6) ： 703-14(2006))， 和用于生产低毒性工业产品， 食品或生物量农作物。
     人们对编码吡咯烷类生物碱及托烷类生物碱的生物合成酶的基因知之甚少， 这限 制了通过遗传工程生成这些有效化合物代谢途径的能力。
     一个编码参与吡咯烷类生物碱合成酶的已知基因的例子是喹啉磷酸核糖转移酶 (QPT) 基因， 所述的 QPT 基因从烟草和黄花烟草中克隆的。见美国专利 6,423,520 及专利 6,586,661 及 Sinclair et al.， Plant Mol.Biol.44 ： 603-17(2000)。抑制 QPT 基因表达能 显著降低转基因烟草植物中烟碱含量。 Xie et al.， Recent Advances in Tobacco Science 30 ： 17-37(2004)。
     美国专利 5,369,023 及 5,260,205 讨论通过抑制腐胺甲基转换酶 (PMT) 核酸序列 来降低烟碱含量。抑制内源性 PMT 核酸序列降低烟碱含量， 并增加去氢新烟碱含量 2 至 6
     倍。 Hibi et al.， Plant Cell 6 ： 723-35(1994) ； Sato et al.Proc Natl Acad Sci USA 98 ： 367-72(2001) ； Chintapakorn and Hamill， Plant Mol.Biol.53 ： 87-105(2003) ； Steppuhn et al.， PLoS Biol.2 ： 8： e217 ： 1074-1080(2004)。烟草 PMT 基因在美花烟草超表达可增加 烟碱含量。(Satoet al.Proc Natl Acad Sci USA 98 ： 367-72(2001))。
     抑制内源性基因序列 A622 及 NBB1 可降低烟草植物中烟碱含量。见国际专利公 开号 WO 2006/109197。已从烟草中克隆转换烟碱为去甲烟碱的细胞色素 P450 单氧化酶基 因。Siminszky B.， et al.， Proc Natl Acad Sci USA102 ： 14919-24， (2005) ； Gavilano et al.J.Agric.Food Chem.54， 9071-9078(2006)。
     MPO 酶 活 性 是 三 十 年 前 在 烟 草 植 物 根 部 最 初 检 测 到， Mizusaki S et al.， Phytochemistry 11 ： 2757-2762(1972)， 但 MPO 基因在本发明前并未得到确定。
     MPO 在植物生物碱包括药用托烷类生物碱的合成途经中起作用。Hashimoto and Yamada， Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45 ： 257-285(1994) ； Kutchan， In ： Cordell， G.A.(ed.)ALKALOIDS(San Diego)， vol.50.Academic Press， Inc.， San Diego， CA， USA， (1998)pp.257-316。
     已 从 烟 草， 黄 花 烟 草， 天 仙 子， 及白曼陀罗与黄花曼陀罗杂种植物根部纯 化 MPO 酶， 与 氧 化 腐 胺 和 尸 胺 相 比， 该 酶 能 更 有 效 地 氧 化 N- 甲 基 腐 胺。Mizusaki et al.， Phytochemistry 11 ： 2757-2762(1972) ； Feth and Wagner， Phytochemistry 24 ： 1653-1655(1985) ； Davies et al.， Phytochemistry 28 ： 1573-1578(1989) ； Hashimoto et al.Plant Physiol.93 ： 216-221(1990) ； Waltonand McLauchlan， Phytochemistry 29 ： 1455-1457(1990) ； Haslam and Young ， Phytochemistry 31 ： 4075-4079(1992) ； McLauchlan et al.， Planta 19 ： 440-445(1993) ； Boswell et al.， Phytochemistry 52 ： 871-878(1999)。
     消旋毒藜碱和新烟草灵 [ 顺 -2， 4 娣 (3- 吡啶基 ) 哌啶 ] 含有哌啶成分， 消旋 毒藜碱的哌啶成分被认为经由烟草中 Δ-1- 哌啶来自尸胺。Watson andBrown， J.Chem. Soc.Perkin Trans.1 ： 2607-2610(1990)。虽然其亲合性低于 N- 甲基化二氨， 尸胺是二 氨氧化酶的良性底物， 亦是 MPO 的底物。Hashimoto et al.(1990)， supra ； Walton and McLauchlan， Phytochemistry 29 ： 1455-1457(1990) ； Boswell et al.， Phytochemistry 52 ： 871-878(1999)。
     在 我 们 申 请 美 国 临 时 专 利 60/814， 542 之 后， Katoh 等 在 Plant CellPhysiol.48(3) ： 550-554(2007) 及 Heim 等在 Phytochemistry 68 ： 454-463(2007) 披 露了烟草中参与烟碱合成途经的 MPO 基因。但是， 他们在文献中并未提及利用该基因在烟 草植物中改变烟碱或其它生物碱含量的方法或用途。
     因此， 有必要持续认定其它表达可以调节的基因， 以减少或增加生物碱生物合成， 或通过改变植物中某一特定生物碱的合成来改变该植物的生物碱生成图谱。 发明内容
     一方面， 本发明提供一种分离的核酸分子， 其包括选自以下的核苷酸序列 ： (a)SEQ ID NO ： 1 表示的核苷酸序列 ； (b)SEQ ID NO ： 2 表示的核苷酸序列 ； (c) 编码具有 SEQ ID NO ： 3 表示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列 ； (d) 与 (a)， (b) 或 (c) 的核苷酸序列至少 85％相同， 并编码 MPO 酶的核苷酸序列 ； (e) 与 (a)， (b)， (c) 或 (d) 的核苷酸序列在严格条件下 杂交， 并编码 MPO 酶的核苷酸序列 ； 和 (f) 因遗传密码的简并性而与 (a) 或 (b) 的核苷酸序 列不同并编码 MPO 酶的核苷酸序列。
     另一方面， 本发明提供一种生产 MPO 酶的方法， 包括 ： (a) 使用包含权利要求 1 所 述分离的核酸分子的核酸构建体遗传改造细胞和 ； (b) 在可以产生 MPO 酶的条件下培养所 述细胞。
     另一方面， 本发明提供一种重组 MPO 酶， 其具有 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸序列或 SEQ ID NO ： 3 的变体。
     在一个实施例中， 一种遗传工程宿主细胞包含权利要求 1 所述的核酸序列。在进 一步实施例中， 宿主细胞选自 ： 细菌、 酵母、 丝状真菌、 藻类、 绿色植物及哺乳动物细胞。 在另 一个实施例中， 一种植物包含所述宿主细胞。
     另一方面， 本发明提供减少植物中生物碱的方法， 所述方法包括相对于对照植物， 下调 N- 甲基腐胺氧化酶的表达。在一个实施例中， 生物碱是吡咯烷类生物碱。在进一步实 施例中， 吡咯烷类生物碱是烟碱。 在另一个实施例中， 植物属于菸草属。 在另一个实施例中， 植物是菸草。在另一个实施例中， 通过 (a) 在所述植物中引入核酸序列， 所述核酸序列包含 i)SEQ ID NO ： 1 的至少 21 个连续核苷酸， 其中所述连续核苷酸位于正义或反义方向上 ； 和 (b) 在与相似条件下培养的对照植物相比， 所述核苷酸序列减少所述植物中 N- 甲基腐胺氧 化酶的水平的条件下培养所述植物， 来下调 N- 甲基腐胺氧化酶的表达。在一个实施例中， 所述条件诱导内源性 MPO 基因的共抑制。 另一方面， 本发明提供一种减少植物中吡咯烷类生物碱的方法， 所述方法包括下 调 MPO 及下调 NBB1、 A622、 QPT 和 PMT 中的至少一种。
     另一方面， 本发明提供一种减少植物种群中吡咯烷类生物碱的方法， 其包括 ： (a) 提供突变的植物种群 ； (b) 检测所述植物种群内的靶向突变植物， 其中与相似条件下提供 的对照植物相比， 所述靶向突变植物的 N- 甲基腐胺氧化酶基因表达降低， 或 N- 甲基腐胺氧 化酶的活性降低， 所述检测包括 (i) 利用根据 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 设计的引物来 PCR 扩增来自突变植物种群中突变植物中的 N- 甲基腐胺氧化酶基因区域， (ii) 确定在被扩 增区域和野生型基因相应区域之间导致 N- 甲基腐胺氧化酶基因的表达降低或 N- 甲基腐胺 氧化酶的活性降低的错配， 和 (iii) 确定含有所述错配的突变植物 ； 和 (c) 选择性培育所述 靶向突变的植物， 以产生下述植物种群， 即其与相似条件下产生的对照植物种群相比， N- 甲 基腐胺氧化酶基因的表达降低或 N- 甲基腐胺氧化酶的活性降低。
     在一个实施例中， 所述吡咯烷类生物碱是烟碱。 在另一个实施例中， 所述植物是菸 草。
     另一方面， 本发明提供一种使用包含 SEQ ID NO ： 1 的至少 21 个连续核苷酸的核 苷酸序列遗传工程化的宿主细胞， 其中所述连续核苷酸位于正义或反义方向上。在一个实 施例中， 细胞是茄科或古柯科植物细胞。在另一个实施例中， 细胞是烟草属， 曼陀罗属， 颠 茄属， 澳茄属， 天仙子属， 茄参属， 木曼陀罗属， 赛莨菪属及红木属植物细胞。在另一个实施 例中， 该细胞为烟草植物细胞。在进一步实施例中， 该核苷酸序列包含 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2。
     在另一个实施例中， 本发明提供通过前述任一方法生产的生物碱减少的植物。在
     另一个实施例中， 减少的生物碱是烟碱。 在进一步实施例中， 生物碱减少的产品产自生物碱 减少的植物。在另一个实施例中， 减少的生物碱是烟碱。
     另一方面， 本发明提供一种增加植物中 MPO 酶的方法， 包括 (a) 在所述植物中引入 含有编码 MPO 酶的核苷酸序列的核酸构建体 ； (b) 在所述核苷酸被表达的条件下培养所述 植物， 从而与相似条件下培养出的对照植物相比， 增加所述植物中 MPO 酶的水平。
     在一个实施例中， 所述植物是茄科或古柯科植物。在另一个实施例中， 所述植物 是烟草属， 曼陀罗属， 颠茄属， 澳茄属， 天仙子属， 茄参属， 木曼陀罗属， 赛莨菪属及红木属植 物。在另一个实施例中， 托烷类生物碱被增加， 所述托烷类生物碱包括东茛菪碱或古柯碱。
     另一方面， 本发明提供一种增加植物中吡咯烷类生物碱水平的方法， 其包括 ： (a) 在所述植物中引入编码 MPO 酶的核苷酸序列和编码至少一种选自 NBB1、 A622、 QPT 和 PMT 的 酶的核苷酸序列 ； 和 (b) 在与相似条件下培养出的对照植物相比， 所述植物产生增加的水 平的 N- 甲基腐胺氧化酶和至少一种选自 NBB1， A622， QPT 和 PMT 的酶的条件下培养所述植 物。
     在一个实施例中， 本发明提供一种通过前述任一方法生产的生物碱增加的植物。 附图说明
     图 1 描述吡咯烷类生物碱 ( 烟碱 ) 及托烷类生物碱 ( 东茛菪碱和古柯碱 ) 生物合成途经。 图 2 描述用 RT-PCR 分析本塞姆氏烟草不同组织中 MPO 的表达。
     图 3 描述用定量 RT-PCR(qRT-PCR) 分析经茉莉酸甲酯 (MeJa) 处理后本塞姆氏烟 草根部 PMT 及 MPO 的表达。
     图 4 描述用病毒诱导的基因沉默 (virus induced gene silencing， VIGS) 技术在 本塞姆氏烟草沉默生成烟碱的基因， 图 4 标示出这些基因片段相对于全长 MPO cDNA 的位置 及长度。
     图 5A 描述用 HPLC 方法测定对照植物及 MPO VIGS 载体侵染的植物叶部烟碱含量。
     图 5B 描述经茉莉酸甲酯 (MeJa) 处理后对照植物及 TRV-MPO 核酸建构物 403B01 侵染的植物烟碱含量。
     图 6 描述用 HPLC 方法测定 MPO VIGS 载体或含有 GFP 序列对照载体侵染的植物根 部组织 N- 甲基腐胺含量。
     图 7 描述 MPO VIGS 载体侵染的植物根部 MPO 转录水平。
     图 8 描述 MPO VIGS 载体侵染的植物根部 MPO 活性。
     图 9 描述重组 MPO 的底物特异性及酶动力学。
     图 10 描述质谱 (MS) 检测分析 MPO 产物。
     图 11 描述气相色谱 - 质谱 (GC-MS) 联用分析 MPO 衍生产物。
     图 12 描述电泳分析 MPO 超表达核酸建构物转染的植物的 PCR 放大产物。
     图 13 描述野生型及超表达 MPO 的转基因植物叶部烟碱含量。
     具体实施方式
     本发明者克隆了编码 MPO 的基因。MPO 基因的核酸序列， 序列 1(SEQ ID NO ： 1)， 已经确定。序列 2(SEQ ID NO ： 2) 列出序列 1(SEQ IDNO ： 1) 中的开放读码区 (ORF)， 其编码序 列 3(SEQ ID NO ： 3) 中的多肽序列。
     根据图 1， 吡咯烷类生物碱 ( 例如烟碱 ) 及托烷类生物碱 ( 古柯碱和例如东茛菪 碱 ) 的生物合成均涉及中间代谢产物 N- 甲基吡咯啉离子。很明显， 可以通过影响代谢途经 中的酶和 / 或中间产物来调控这些生物碱的生成。
     MPO 催化 N- 甲基腐胺的氧化脱胺反应形成 4- 甲基氨基丁醛， 后者自动环化形成 N- 甲基吡咯啉离子。N- 甲基吡咯啉离子是合成高价值生物碱的一个关键构件分子。图 1 显示这一关键中间代谢产物的结构， 以及它在烟碱， 古柯碱和东茛菪碱中的位置。图 1 亦标 明两个已知酶 QPT 及 PMT。
     假设有足够的 N- 甲基腐胺， 根据图 1， 很明显 MPO 含量和 / 或酶活性增加会增加 N- 甲基吡咯啉离子含量， 这会进一步增加烟碱， 古柯碱和东茛菪碱的生成。另一方面， 如果 MPO 含量和 / 或酶活性足够地降低， 烟碱， 古柯碱和 / 或东茛菪碱生物合成亦相应下降。
     在天然合成吡咯烷类生物碱的植物中， MPO 基因或基因片段可以用来抑制吡咯烷 类生物碱的生物合成 ( 例如， 烟碱的生物合成 )。例如， 烟草属植物 ( 例如， 烟草， 黄花烟 草和本塞姆氏烟草 ) 天然合成烟碱。烟草为高价值农作物， 其在生物科技中的应用日益 增加。通过抑制 MPO 阻断烟碱生物合成， 这可以用来生产不含烟碱或烟碱含量低的烟草 植物， 这些植物可作为低毒性产品平台以生产来自于植物的药物， 即所谓产于植物的药物 (plant-madepharmaceuticals， PMPs)( 例如， 重组蛋白和抗体 )， 或作为工业产品， 食品或 生物量农作物生产平台。 定义
     本说明书所用所有技术术语在生物化学， 分子生物学和农业学中通常使用 ； 因此， 本发明所属领域的技术人员通晓这些术语。那些技术术语可以在下列出版物查找到， 例如 在： MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL3rd ed.， vol.1-3， ed.Sambrook and Russel， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 2001 ； C URRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， ed.Ausubel et al.， Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience， NewYork， 1988(including periodic updates) ； SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY ： A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY 5th ed.， vol.1-2， ed.Ausubel et al.， John Wiley & Sons， Inc.， 2002 ； GENOME ANALYSIS ： A LABORATORY MANUAL， vol.1-2， ed.Green etal.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 1997。植物生物学技术方 法在本处描述和在下列文献中详细阐述， 例如 METHODS INPLANT MOLECULAR BIOLOGY ： A LABORATORY COURSE MANUAL， ed.Maliga etal.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， 1995。
     术语 “编码 (encoding 和 coding)” 指基因通过转录和翻译机制把信息提供到细胞 里， 一系列氨基酸在细胞中被装配成特定氨基酸序列以产生活性酶的过程。由于遗传密码 的简约性， DNA 序列中某些碱基变化并不改变蛋白质的氨基酸序列。
     正如这里所使用， “表达 (expression)” 指通过基因转录生成 RNA 产物， 或经由核 苷酸序列编码产生蛋白质。
     “超表达 (overexpression)” 或 “上调 (up-regulation)” 是指相对对照细胞或植 物， 在细胞或植物其及衍生后代植物通过遗传工程增加某一基因序列或其变异的表达 ( 例
     如， “MPO 超表达” )。
     术语″抑制 (suppression) ″或″下调 (down-regulation) ″同义， 表示相对对 照细胞或植物， 在细胞或植物及其衍生后代植物通过遗传工程降低某一基因序列或其变异 的表达 ( 例如， “MPO 下调” )。.
     “生物碱 (alkaloid)” 指植物中次级代谢生成的含氮基本化合物。 “吡咯烷类生物 碱 (pyrrolidine alkaloid)” 指分子结构中含有吡咯烷环的生物碱， 例如， 烟碱。烟碱和相 关生物碱在已发表文献中亦指吡啶烷类生物碱。 “吡啶烷类生物碱 (pyridine alkaloid)” 指分子结构中含有吡啶烷环的生物碱， 例如， 烟碱。 “托烷类生物碱 (tropane alkaloid)” 指分子结构中含有双环托烷环的生物碱， 例如， 东茛菪碱或古柯碱。″烟碱类生物碱 (nicotinicalkaloid)″指烟碱或结构上与烟碱相关的生物碱， 或指烟碱合成途径中生成 的生物碱。具有代表性的烟碱类生物碱包括， 但不局限于， 烟碱， 去甲烟碱， 去氢新烟碱， 消 旋毒藜碱， 新烟草灵 [ 顺 -2， 4 娣 (3- 吡啶基 ) 哌啶 ]， N- 甲基去氢新烟碱， N- 甲基消旋毒 藜碱， 麦斯明， 假木贼因， 甲酸基去甲烟碱， 二烯烟碱及古丁尼。 亦有报道烟草叶中含有其它 非常次要的烟碱类生物碱， 例如， Hecht， S.S.et al.， Accounts of Chemical Research 12 ： 92-98(1979) ； Tso， T.C.， Production， Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant. Ideals Inc.， Beltsville， MD(1990)。
     正如这里所使用， “生物碱含量 (alkaloid content)” 指植物中生物碱总量， 例如， 以 pg/g 干重 (DW) 或 ng/mg 鲜重 (FW) 为单位。 “烟碱含量 (nicotine content)” 指植物中 烟碱总量， 例如， 以 mg/g DW 或 FW 为单位。
     “烟碱含量减少的烟草植物 (decreased nicotine tobacco plant)” 或 “烟碱含量 下降的烟草植物” 包括经遗传工程改良烟碱含量减少至不超过 50％的烟草植物， 最好烟碱 含量少于对照的同种或同类植物的 10％或 1％。
     “烟碱含量增加的烟草植物 (increased nicotine tobacco plant)” 包括经遗传 工程改良烟碱含量多于对照的同种或同类植物 10％， 最好烟碱含量多于对照的同种或同类 植物的 50％， 100％或 200％。
     “MPO 酶活性 (MPO activity)” 指 N- 甲基腐胺经 N- 甲基腐胺氧化酶 (MPO) 催化形 成 4- 甲基氨基丁醛和过氧化氢的氧化过程。
     “N- 甲基腐胺氧化酶 (N-methylputrescine oxidase)， ” “MPO”或 “MPO 酶 (MPO enzyme)” 指氧化 N- 甲基腐胺形成 N- 甲基氨基丁醛的酶。
     I. 减少植物中生物碱生成
     A. 通过抑制 MPO 减少生物碱。
     利用本发明中的 MPO 核酸序列可以以若干本领域已知的技术抑制内源性 MPO 基因 以减少生物碱 ( 例如， 烟碱 ) 生成， 例如， RNA 干扰 (RNAi) 技术， 人工微小 RNA 技术， 病毒诱 导的基因沉默 (VIGS) 技术， 反义技术， 有义协同抑制技术和定向突变技术。因此， 本发明提 供通过抑制 MPO 基因减少植物中生物碱含量的方法和核酸建构物。抑制一个以上的 MPO 基 因可以进一步减少植物中生物碱含量。
     B. 通过抑制 MPO 和 A622， NBB1， QPT 及 PMT 其中至少之一减少生物碱。
     以往报告显示在烟草中抑制一个以上的生物碱合成基因比仅抑制一个基因能更 有效地减少烟碱类生物碱含量。例如， 同时抑制 A622 和 NBB1 要比抑制其中之一能更有效减少烟碱含量。见 WO/2006/109197。因此， 本发明考虑协同抑制 MPO 和 A622， NBB1， QPT， 和 PMT 其中至少之一来进一步减低生物碱含量。根据本法明的一个方面， 将含有 MPO 和 A622， NBB1， QPT 及 PMT 其中至少之一的核酸建构物导入细胞或植物中。一个有说明性的核酸建 构物可以包括 MPO 和 QPT。
     II. 增加植物中生物碱生成
     A. 通过超表达 MPO 增加生物碱。
     本发明还涉及通过在植物中超表达 MPO 增加生物碱相关。MPO 基因或其开放读码 区可以用来增加药用生物碱含量， 例如， 植物中的吡咯烷类生物碱 ( 例如， 烟碱 ) 及托烷类 生物碱 ( 例如， 东茛菪碱和古柯碱 )。
     B. 通过超表达 MPO 和 A622， NBB1， QPT 及 PMT 其中至少之一增加生物碱。
     WO 2005/018307 探讨通过超表达生物碱合成途经中一个以上的基因以进一 步 增 加 生 物 碱， 如 烟 碱。Sato， F.， et al.Metabolic engineering of plantalkaloid biosynthesis.Proc Natl Acad Sci U S A.98(1) ： 367-72(2001)。因此， 本发明考虑超表 达 MPO 和至少另外一个基因如 PMT， 与单独上调 MPO 相比， 将导致进一步增加生物碱含量。
     根据本发明的一个方面， 将含有 MPO 和 A622， NBB1， QPT 及 PMT 至少其中之一的核 酸建构物导入植物细胞中。一个有说明性的核酸建构物可以包括例如 MPO 和 PMT。类似地， 例如， 可以通过杂交超表达 MPO 的转基因植物和超表达 PMT 的转基因植物这一遗传工程方 式来产生超表达 MPO 和 PMT 的植物。连续杂交和选择可生成超表达 MPO 和 PMT 的植物。 III. 生产 MPO 酶
     MPO 可以导入宿主细胞， 从而在先前不产生该酶的生物或细胞中制造 MPO 酶。 从这 些经遗传工程改良的生物或细胞中可以生产若干系列产品， 包括生物碱， 生物碱前驱物， 生 物碱类似物和生物碱合成酶。 这些产品可以包括烟碱， 烟碱前驱物， 烟碱类似物和烟碱合成 酶。因为 MPO 催化托烷类生物碱 ( 例如， 东茛菪碱和古柯碱 ) 合成途径的一个关键步骤， 含 有导入 MPO 基因的细胞可以用来生产托烷类生物碱， 托烷类生物碱前驱物， 托烷类生物碱 类似物及托烷类生物碱合成酶。有代表性的宿主细胞包括， 但不局限于， 绿色植物细胞， 细 菌， 酵母， 丝状真菌， 藻类及哺乳动物细胞。
     生物碱合成序列
     已在若干植物中确定生物碱合成基因， 例如烟草植物。 因此， 本发明包含旨在增加 生物碱合成的任何核酸， 基因， 多聚核苷酸， DNA， RNA， mRNA， 或 cDNA 分子， 无论它来自何种 植物的染色体或由人工合成。此外， 这些生物碱合成序列在细胞如昆虫细胞表达产生生物 碱。DNA 或 RNA 可以是双链或单链。单链 DNA 可以是编码链， 亦称为有义链， 它也可以是非 编码链， 亦称为反义链。
     本领域的技术人员知晓本发明中的 MPO 包括序列 1(SEQ ID NO ： 1) 和 2(SEQ ID NO ： 2) 所含序列， 其中包括含至少 21 个连续核苷酸的片段， 该片段长度足以有效沉默植物 中基因 (Hamilton， AJ and Baulcombe， DCScience 286， 950-952(1999))。本发明还由序列 1(SEQ ID NO ： 1) 和 2(SEQID NO ： 2) 的各种 “变异序列” 中核酸分子组成， 包括在序列中删 除， 替代， 插入或加入一个或多个碱基， 而该 “变异序列” 编码具有生物碱合成活性的多肽。 因此， “删除， 替代， 插入或加入一个或多个碱基” 的序列编码多肽， 该多肽即使是在一个或 多个氨基酸被删除， 替代， 插入或加入的情况下仍保持生理活性。此外， 可能由于基因产物
     翻译后修饰或 MPO 基因的多态性， MPO 能以多种形式存在。本发明的范围涵盖含有这样修 饰且能编码生物碱合成酶的核苷酸序列。
     例如， 可删除多聚腺苷酸尾链， 删除 5′ - 或 3′ - 端， 删除非翻译区和删除碱基 在一定程度导致删除氨基酸。只要不导致移码突变， 碱基也可以被替代。也可以通过 “加 入” 碱基加入氨基酸。但任何改变不应导致生物碱合成酶活性的丢失。在这个意义上， 可以通过改变本发明中 DNA 碱基序列来修饰 DNA 以达到在某些特定位点替代， 删除， 插入 或加入氨基酸， 或通过定向突变加入氨基酸， 见 Zoller & Smith， Nucleic Acid Res.10 ： 6487-500(1982)。
     也可以用适当的碱基从头开始合成生物碱合成序列， 例如， 引用我们在这里披露 的蛋白质序列来制造 DNA 分子， 虽然不同于天然 DNA 序列， 合成的 DNA 分子可以编码产生具 有相同或相似氨基酸序列的蛋白质。 这类合成 DNA 分子有益于将 DNA 序列导入非植物细胞， 编码外源蛋白， 由于不同的 ( 非植物 ) 密码子利用频率， 如果不修饰而应用， 会导致宿主细 胞翻译效率低效。
     在这里所说的 “分离的” 核酸分子是指从天然环境分离的核酸分子， DNA 或 RNA。 例如， 包含在 DNA 建构物中的重组 DNA 分子在本发明中被认为是分离的核酸分子。其它例 子包括外源宿主细胞中的重组 DNA 分子或在溶液中部分或大部分纯化的 DNA 分子。分离的 RNA 分子包括本发明中 DNA 分子体外转录的 RNA。根据本发明， 分离的核酸分子也包括合成 产生的分子。 “嵌合核酸” 包括编码序列或片段， 其连接到与细胞中天然核苷酸编码序列不同的 核苷酸序列。
     “异源性核酸” 指导入细胞 ( 或祖先细胞 ) 中的核酸， DNA 或 RNA， 该异源性核酸不 是所导入细胞中天然核酸序列的拷贝。 该异源性核酸可以包含其导入细胞中天然核酸序列 的部分拷贝， 或包含其部分片段。
     “内源性核酸” 或 “内源性序列” 指将通过经遗传工程改变的植物或生物中 “天然 的， ” 即固有的， 核酸序列。它将通过经遗传工程改变的植物或有机体之基因组中存在的核 酸， 基因， 多核苷酸， DNA， RNA， mRNA， 或 cDNA 分子。
     “外源性核酸” 指人为导入细胞 ( 或祖先细胞 ) 中的核酸， DNA 或 RNA。该外源性核 酸片段可以是其导入细胞中天然核酸序列的部分拷贝或是天然核酸序列的部分片段。
     除非另外标明， 这里所有通过 DNA 分子测序确定的核苷酸序列均用 DNA 自动测序 仪 ( 例如 Model 3730xl， Applied Biosystems， Inc.) 确定。因此， 作为本领域的一个常识， 使用这种自动测序方式确定的任何 DNA 序列可能含有差错， 这里确定的任何核苷酸序列也 可能含有差错。自动测定的核苷酸序列典型地与所测序的 DNA 分子实际序列至少 95％同 序， 更典型地至少与所测序的 DNA 分子实际序列 96％到 99.9％同序。DNA 分子实际序列可 以通过其它方式更为准确地确定， 例如， 通过本领域所熟知的人工 DNA 测序。也正如本领域 普通技术人员所熟知， 与实际序列相比， 插入或删除一个确定的核苷酸序列， 在翻译该核苷 酸序列时会导致移码 ； 因此， 根据某一确定核苷酸序列预测的氨基酸序列， 其可能与被测序 的 DNA 分子实际编码的氨基酸序列从插入或删除点起开始完全不同。
     为实现本发明， 两个序列在杂交液中杂交形成双链复合物， 杂交液含有 6X SSC， 0.5％ SDS， 5X Denhardt 氏溶液和 100μg 非特异性载体 DNA。见 Ausubel et al. 上述， 及
     部分 2.9， 补充 27(1994)。序列在 “中杂交严格度” 杂交， 中杂交严格度指在温度 60℃使用 上述杂交液进行杂交。在 “高杂交严格度” 杂交， 温度升至 68℃。在中杂交严格度下杂交反 应后， 在室温下用 2X SSC 加 0.05％ SDS 溶液清洗核苷酸 5 次， 而后在 60℃用 0.1X SSC 加 0.1％ SDS 溶液清洗核苷酸 1 小时。 高杂交严格度杂交反应后， 清洗核苷酸在 68℃条件下进 行。 为实现本发明， 杂交核苷酸是指用 1ng， 比放射性为 10,000cpm/ng 的放射标记探针能检 测到的杂交核苷酸， 其中在 -70℃ X- 射线胶片曝光不超过 72 小时杂交核苷酸清晰可见。
     在有两个多核苷酸 ( 核酸 ) 或多肽序列的情况下， “序列同源性” 或 “同源性” 指在 某一特定区域比对两个序列时残基相同。当序列同源性百分比指蛋白质时， 人们认识到残 基的不同源通常通过保守氨基酸替代不同来体现， 既氨基酸残基被具有相似化学特性 ( 例 如， 电荷及疏水性 ) 的其它氨基酸残基代替， 而该分子的功能特性不改变。当序列在保守替 代上不同时， 可以上调序列同源性百分比以纠正替代的保守性。具有该种保守替代不同的 序列可以说具有 “序列相似性” 或 “相似性” 。调整序列同源性百分比的方法为本领域普通 技术人员所熟知。这典型地涉及给保守性替代作为部分而不是完全错配评分， 从而增加同 源性百分比， 例如， 一个同源氨基酸给 1 分， 非保守性替代氨基酸给 0 分， 保守性替代氨基酸 则介乎于 0 到 1 分。例如， 保守性替代氨基酸评分通过装载有 Meyers & Miller 算法的程 序 PC/GENE(Intelligenetics， Mountain View， California， USA) 计算， Meyers & Miller， Computer Applic.Biol.Sci.4 ： 11-17(1988)。 本说明书所使用的序列同源性百分比是指通过在某一比较窗口内比较两个最佳 比对序列值， 两个最佳比对序列在比较窗口内的多核苷酸序列部分与参照序列 ( 其不含加 入或删除 ) 比较可能含有加入或删除 ( 即空位 )。序列同源性百分比的计算是通过确定两 个序列中同源核酸碱基或氨基酸残基发生的数量以产生匹配残基数量， 匹配残基数量再除 以比较窗口内全部残基数量， 其结果再乘以 100 以产生序列同源性百分比。
     本发明中的核酸序列应与序列 1-2(SEQ ID NO ： 1-2) 的核酸序列至少 60％， 65％， 70 ％， 75 ％， 80 ％， 85 ％， 90 ％， 95 ％， 96 ％， 97 ％， 98 ％， 99 ％或 100 ％同源， 最好应与序列 1-2(SEQ ID NO ： 1-2) 的核酸序列至少 95％， 96％， 97％， 98％， 99％或 100％同源。两个核 酸序列间的差异可以发生在参照核苷酸序列 5’ 或 3’ 末端部位， 或两末端间的任何部位， 或 单独分散在参照序列的核苷酸中， 或在参照序列中簇集。
     从实用方面讲， 任何特定的核酸分子与参照核苷酸序列是否至少 85 ％， 90 ％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％同源是通过使用本领域所熟知的标准算法比较两个分子， 并 可以利用公开的计算机程序如 BLASTN 程序来确定。见 Altschul et al.， Nucleic Acids Res.25 ： 3389-402(1997)。
     本发明进一步提供含序列 1(SEQ ID NO ： 1) 和序列 2(SEQ ID NO ： 2) 中核苷酸序列 的核酸分子， 其编码具活性的生物碱合成酶， 该酶的氨基酸序列相对于序列 3(SEQ ID NO ： 3)， 并且本发明中的蛋白质包括未改变生物碱合成酶功能的氨基酸替代， 加入和删除。
     “变异序列” 指与标准或某一给定基因或蛋白质的核苷酸或氨基酸序列有差异的 核苷酸或氨基酸序列。术语″同种异形″， ″同种异体″和″类似物″亦指核苷酸或氨基 酸序列的 “变异序列。 ” 通过加入， 删除， 或替代一个或多个氨基酸而改变的氨基酸序列， 或 发生改变的核苷酸序列， 可以被认为是 “变异序列。 ” “变异序列” 也可以是″保守性″改变， 即一个氨基酸被结构或化学特性类似的氨基酸所替代， 例如， 异亮氨酸替代亮氨酸。 “变异
     序列” 也可能由于″非保守性″改变， 例如， 色氨酸替代苷氨酸。类似次要序列变异也可包 括删除和 / 或插入氨基酸。可以利用本领域所熟知的计算机程序所提供的指南， 如 Vector NTI Suite(InforMax， MD) 软件， 来确定哪些氨基酸残基可以被替代， 插入或删除。 “变异序 列” 也可指如 Maxygen 公司专利中所描述的那些″重排基因” ( 例如， 美国专利 6,602,986 号 )。
     减少生物碱的方法
     在一方面， 本发明提供减少 MPO 活性和生物碱含量的方法和核酸建构物， 也提供 生产生物碱含量减少的植物的方法和核酸建构物。 虽然其它方法也可以用来减少生物碱含 量， 本发明主要应用反义技术， 有义协同抑制技术， RNA 干扰 (RNAi) 技术， 人工微小 RNA 技 术， 病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术， 反义技术， 有义协同技术和定向突变技术。
     RNAi 技 术 利 用 RNAi 质 粒 建 构 物 进 行 稳 定 转 染 (Helliwell andWaterhouse， Methods Enzymol.392 ： 24-35(2005))。 该质粒由反向重复结构中要被沉默的靶基因片段组 成。DNA 间区， 通常是内含子， 隔离反向重复结构。由适当启动子驱动的 RNAi 建构物， 例如， 花椰菜镶嵌 ( 花叶 ) 病毒 (CaMV)35S 启动子， 其整合在植物基因组中， 驱动转基因转录合 成 RNA 分子， 后者通过碱基配对形成双链发夹结构 RNA(hairpin RNA， hpRNA)。植物识别该 双链 RNA 结构， 并将其切为小片段 RNAs( 长约 21 个核苷酸 )， 即小片段干扰 RNAs(siRNAs)。 siRNAs 与蛋白质复合物 RISC 相结合， RISC 直接引导降解靶基因 mRNA。
     人工微小 RNA(amiRNA) 技术利用可以沉默植物和其它真核细胞内源性基因的微 小 RNA(miRNA) 途径 (Schwab et al.， Plant Cell 18 ： 1121-33(2006) ； Alvarez et al， Plant Cell 18 ： 1134-51(2006))。 该方法使用大约由 21 个核苷酸组成的沉默基因片段， 将 其导入先质 miRNA 基因以形成先质 amiRNA 构建物。后者通过本领域普通技术人员所熟知 的转染方法转移至植物基因组。先质人工微小 RNA(Pre-amiRNA) 转录后经加工生成人工微 小 RNA(amiRNA) 靶基因， 其与人工微小 RNA 序列的 21 个核苷酸同序。
     RNAi 沉默技术中， 两个因素可能影响所用片段的长度。片段越短， 基因沉默成功 的可能性越小， 但是发夹结构很长会增加其在细菌宿主细胞重组的机会。沉默的有效性似 乎也依赖于靶基因， 这可能反映靶 mRNA 的可接近度， 或在该基因活跃的细胞中靶 mRNA 和 hpRNA 的相对多寡。长度为 100 到 800 的碱基对片段， 最好是 300 和 600 碱基对之间， 通常 适于以最大程度增加沉默的有效性。另外一个考虑是靶基因所在部位， 在 5’ - 非翻译区， 编码区和 3’ - 非翻译区沉默基因均可取得良好效果。由于沉默的机制取决于序列同源性， 有可能交叉沉默相关 mRNA 序列。如果不想这样， 应选择与其它序列同源性低的区域， 例如， 5’ - 或 3’ - 非翻译区。避免交叉沉默同源性序列的一条规则是在核酸建构物和非靶基因序 列间的同源性少于 20 个碱基。这些原则大部分也适用于设计 amiRNAs 时靶区域的挑选。
     病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术利用植物天然抗病毒机制， 其类似于 RNAi 技术。 VIGS 重组病毒含有宿主 DNA 片段， 感染植物后导致靶基因转录后基因沉默。在一个实施 例中， 可以使用基于 VIGS 系统的烟草脆裂病毒 (TRV)。有关该系统的描述参见如下文献， Baulcombe D.C.， Curr.Opin.Plant Biol.2 ： 109-113(1999) ； Lu R， et al.， Methods 30 ： 296-303(2003) ； RatcliffF.et al.， The Plant Journal 25 ： 237-245(2001) ； 及美国专利 7,229,829。
     反义技术将能与靶基因产生的信使 RNA(mRNA) 结合的反义寡核苷酸导入植物。该“反义” 寡核苷酸的碱基序列与靶基因 mRNA 的序列， 即 “有义” 序列， 互补。反义 mRNA 片段 阻止有义 mRNA 片段的活性， 从而有效地灭活该基因的表达。有关应用反义技术沉默植物基 因更详尽的描述参见 Stam et al.， Plant J.21 ： 27-42(2000)。
     有义协同抑制技术将高度表达的有义转基因导入植物， 造成该转基因及内源性基 因表达的下降 (Depicker and van Montagu， Curr Opin Cell Biol9 ： 373-82(1997))。其 效果取决于转基因与内源性基因之间的序列同源性。
     可以利用诸如定向局部病变的诱发基因组 (TILLING) 及快速中子撞击 “删除基 因” 等定向突变技术敲除植物基因 (Henikoff， et al.， Plant Physiol135 ： 630-6(2004) ； Li et al.Plant J.27 ： 235-242(2001))。TILLING 使用诱变剂处理种子或个体细胞以引发 点突变， 使用检测单个核苷酸突变的敏感方法可以发现靶基因中的点突变。 可以用诸如 PCR 方法检测所需突变 ( 例如， 导致靶基因产物灭活的突变 )。例如， 可以预备根据靶基因设计 的寡核苷酸引物， 也可以通过 PCR 在诱变植物群体放大靶基因区域。经放大的诱变基因与 野生基因退火， 从而可以发现诱变基因与野生基因间的错配。检测到的基因序列差异可以 溯源于含有诱变基因的植物， 从而显露哪些突变植物会有所需的表达 ( 例如， 靶基因的沉 默 )。这些植物可以通过选择育种来产生具备所需表达的植物群体。TILLING 可以提供包 括错义和敲除突变等使靶基因表达下降的等位基因系列， 它被视为是一种不需要导入转基 因就可能敲除基因的方法， 更可能被消费者所接受。 快速中子撞击在植物基因组引发突变， 即基因删除， 这可以通过与 TILLING 相似的方式用 PCR 检测到。
     核酸建构物
     根据本发明的一个方面， 抑制生物碱合成的序列被加入适合导入植物或细胞内的 核酸建构物。因此， 该类核酸建构物可以用于在植物或细胞中抑制 MPO， 并抑制 A622， NBB1， PMT 及 QPT 中至少之一。
     另一方面， 增加生物碱合成的序列被加入适合导入植物或细胞内的核酸建构物。 因此， 该类核酸建构物可以用于在植物中超表达 MPO 和可选择地超表达例如 A622， NBB1， PMT 及 QPT 中至少之一以及在细胞中表达 MPO 和表达例如 A622， NBB1， PMT 及 QPT 中至少之 一。
     可以利用标准技术构建重组核酸建构物。例如， 可以用限制性内切酶切割载体中 含有供转录用 DNA 序列的相关片段。供转录用 DNA 序列也可以通过退火和连接人工寡核苷 酸， 或经聚合酶链反应 (PCR) 利用人工寡核苷酸在 DNA 末端生成适当的内切酶切割位点。 然 后， 将该 DNA 序列克隆入含有适当调控元素例如上游启动子和下游终止子的载体。
     本发明的一个重要方面是对核酸建构物的利用， 其中生物碱合成酶编码序列与一 个或多个调控序列操纵联结， 在不影响正常发育或生理的情况下， 这些调控序列驱动生物 碱合成酶编码序列在某些细胞类型， 器官或组织的表达。
     “启动子” 指转录起始点上游参与识别和结合 RNA 聚合酶及其它蛋白质以启动转录 的 DNA 区域。 “组成型启动子” 指在植物中终生活跃和在绝大多数环境条件下活跃的启动 子。组织特异的， 组织优先的， 细胞类型特异的和可诱导启动子构成所谓的 “非组成型启动 子。 ” “操纵联结” 指启动子与第二个序列在功能上联结， 启动子序列启动和介导第二个 DNA 序列的转录。通常， “操纵联结” 意味着联结的核酸序列是连续的。
     组成型启动子有助于导入细胞中的核酸序列的表达， 以减少或增加 MPO， A622，NBB1， PMT， 或 QPT 的表达， 例如， 香石竹 ( 康乃馨 ) 蚀环病毒 (CERV) 启动子， 花椰菜镶嵌 ( 花 叶 ) 病毒 (CaMV)35S 启动子， 或更特别的双重增强的 CaMV 启动子， 其由两个 CaMV 35S 启动 子串联排列组成 ( 称为″双 35S″启动子 )。组织特异的， 组织优先的， 细胞类型特异的和 可诱导启动子可能适用于某些情况。 例如， 在不影响在其它组织表达的情况下， 组织特异的 启动子允许上述蛋白质在某些组织中超表达。
     组织优先的启动子包括在根部组织活跃的启动子， 例如， 烟草 RB7 启动子 (Hsu et al.Pestic.Sci.44 ： 9-19(1995) ； 美 国 专 利 号 5,459,252)， 玉 米 CRWAQ81 启 动 子 ( 美 国公开专利申请 20050097633) ； 拟南芥 ARSK1 启动子 (Hwang and Goodman， Plant J 8 ： 37-43(1995))， 玉米 MR7 启动子 ( 美国专利号 5,837,848)， 玉米 ZRP2 启动子 ( 美国专利 号 5,633,363)， 玉米 MTL 启动子 ( 美国专利号 5,466,785 和 6,018,099)， 玉米 MRS1， MRS2， MRS3， 和 MRS4 启动子 ( 美国专利申请 20050010974)， 拟南芥隐蔽性启动子 ( 美国专利申请 20030106105) 和在导致烟碱生物合成酶表达升高的条件下激活的启动子， 例如， 烟草 RD2 启动子 ( 美国专利号 5,837,876)， PMT 启动子 (Shoji T.et al.， Plant Cell Physiol.41 ： 831-39(2000b)， WO2002/038588) ； 或 A622 启动子 (Shoji T.et al.， Plant Mol Biol.50 ： 427-40(2002))。 本发明中的载体也可以含有终止序列， 其位于本发明涵盖的核酸分子的下游， 终 止 mRNA 转录， 导致聚腺苷酸序列的加入。此类终止子的例子包括根癌农杆菌胭脂碱合酶终 止子 (Tnos)， 根癌农杆菌甘露碱合酶终止子 (Tmas) 和 CaMV 35S 终止子 (T35S)。根据本发 明， 尤为优先使用的终止区域包括豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基终止区 (TrbcS) 或 Tnos 终止区。表达载体也可以含有增强子， 起始密码子， 剪接信号序列及靶序列。
     本发明中的载体也可以含有选择标记， 以便于识别培养细胞中被转化细胞。该选 择标记可以和外源核酸分子结合， 即该基因与启动子操纵联结。正如在此所使用的， “标记” 指编码某一特征或表型的基因， 其允许选择或筛选含有该标记的植物或细胞。 例如， 植物中 编码对抗菌素或除草剂有抗性的标记基因， 其允许选择被转化细胞。
     合适的选择性标记包括腺苷脱氨酶， 二氢叶酸还原酶， 潮霉素磷酸转移酶， 胸苷激 酶， 黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶， 草甘膦和草铵膦抗性及氨基糖苷 3’ -O- 磷酸转移酶 ( 卡那霉素， 新霉素和 G418 抗性 )。 这些标记可以包括对 G418， 潮霉素， 博来霉素， 卡那霉素 和庆大霉素抗性。 核酸建构物也可以含有选择性标记基因 Bar， 其提供对除草剂草丁膦类似 物如草铵膦的抗性。Thompson et al.， EMBO J.9 ： 2519-23(1987)。亦有其它合适的选择性 标记。
     也可以使用可视标记， 如绿色荧光蛋白 (GFP)。 根据控制细胞分裂来确定或选择转 化植物的方法亦有描述。见 WO 2000/052168 和 WO 2001/059086。
     也可以包括源于细菌或病毒的复制序列， 以便在细菌或噬菌体宿主克隆载体。优 选地， 使用源自原核细胞宿主范围广的复制序列。可以在细菌中放入合适的选择性标记以 选择含有所需核酸建构物的细菌细胞。 合适的原核细胞选择性标记也包括抗菌素如卡那霉 素或四环素抗性。
     正如本领域所熟知的， 载体也可含有编码其它功能的核酸序列。 例如， 根癌农杆菌 为宿主时， 可以加入 T-DNA 序列以易化随后向植物染色体的转移和整合。
     该类基因建构物活性的筛选可以通过根癌农杆菌转染宿主植物及筛选改变的生
     物碱水平。
     可以适当地从 GenbankTM 核苷酸数据库获取基因核苷酸序列， 并寻找核酸内切酶 不能切割的位点。可以通过常规方法给这些基因加入上述位点， 如用 PCR 引物或通过亚克 隆加入上述位点。
     优选地， 核酸建构物包含在载体内， 最为合适的是， 其包含在能在适合表达的合适 宿主 ( 植物 ) 细胞内表达的载体内。任一能够产生含有导入 DNA 序列植物的载体均可达到 这一目的。
     这 些 合 适 的 载 体 为 本 领 域 的 普 通 技 术 人 员 所 熟 知， 并在普通技术参考书中 有 描 述， 如 Pouwels et al.， Cloning Vectors.A Laboratory Manual， Elsevier， Amsterdam(1986)。尤为合适的载体包括 Ti 质粒载体。
     遗传工程和选择
     本发明包括通过导入编码生物碱合成酶的多聚核苷酸序列来遗传操纵植物或细 胞， 以达到调控生物碱合成的目的。 因此， 本发明提供在植物中减少或增加生物碱合成的方 法和核酸建构物。此外， 本发明提供在宿主细胞如细菌， 酵母， 丝状真菌， 藻类， 绿色植物及 哺乳动物细胞生产生物碱及其关联化合物的方法。 “遗传工程” 包括将核酸或特定突变导入生物宿主的任何方法。例如， 植物遗传工 程包括在植物中转染能抑制某一靶基因表达的多聚核苷酸序列， 以达到和对照植物相比降 低该靶基因表达的目的。 植物遗传工程也包括在植物中导入多聚核苷酸序列以表达某一新 基因， 或增加植物中天然存在基因产物的含量。在本申请文件中， “遗传工程” 包括转基因 植物和植物细胞， 以及通过定向诱变生成的植物和植物细胞， 例如， 通过使用嵌合 RNA/DNA 寡核苷酸， 描述见 Beetham et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 ： 8774-8778(1999) 和 Zhu et al.， Proc Natl Acad Sci USA.96 ： 8768-8773(1999)， 或所谓的 “重组诱导寡聚核碱基， ” 描述见 PCT 申请 WO 2003/013226。类似地， 植物遗传工程也包括在植物或植物细胞导入修 饰过的病毒， 后者导致宿主遗传改变， 正如这里所描述的那样， 产生类似于转基因植物的结 果。见， 例如， 美国专利号 4,407,956。此外， 也可以通过简单的 ( 即不涉及外源核苷酸序 列 ) 方法导入仅从宿主同类植物或性匹配植物获得的核酸序列， 生成经遗传工程改变的植 物或植物细胞。例如， 见美国公开专利申请号 2004/0107455。
     A. 植物
     “植物” 一词包括整个植物， 植物器官 ( 例如， 根， 茎， 叶等 )， 种子， 分化或未分化植 物细胞及其子代。植物物质不受限地包括种子悬浮培养物， 胚胎， 分生组织， 愈伤组织， 叶， 根， 茎， 芽， 果， 配子体， 孢子体， 花粉及小孢子。 可以在本发明中应用的植物种类通常与可以 接受遗传工程技术改变的高等植物的范围一样广， 包括单子叶植物和双子叶植物以及裸子 植物。 生产烟碱较好的植物包括茄科中的烟草属， 澳茄属， 茄属， 花烛属， 和蛾蝶花属或菊科 中的鳢肠属和百日菊属。
     “烟草″或 “烟草植物”指烟草属中任何产生烟碱的物种， 包括但不局限于如 下成员 ： 丛 生 烟 草 (Nicotiana acaulis)， 渐 尖 叶 烟 草 (Nicotiana acuminata)， 渐尖 叶 烟 草 (Nicotiana acuminata var.Multzjlora)，非 洲 烟 草 (Nicotianaafricana)， 花 烟 草 (Nicotiana alata)， 抱 茎 烟 草 (Nicotiana amplexicaulis)， 阿伦特氏烟草 (Nicotiana arentsii)， 渐狭叶烟草 (Nicotiana attenuata)， 贝纳米特氏烟草 (Nicotiana
     benavidesii)， 本 塞 姆 氏 烟 草 (Nicotiana benthamiana)， 毕 基 劳 氏 烟 草 (Nicotiana bigelovii)， 博内里烟草 (Nicotiana bonariensis)， 洞生烟草 (Nicotiana cavicola)， 克 利 夫 兰 式 烟 草 (Nicotiana clevelandii)， 心 叶 烟 草 (Nicotiana cordifolia)， 伞状 烟草 (Nicotiana corymbosa)， 迪勃纳氏烟草 (Nicotiana debneyi)， 高烟草 (Nicotiana excelsior)， 福尔吉特氏烟草 (Nicotiana forgetiana)， 香烟草 (Nicotiana fragrans)， 粉 蓝 烟 草 (Nicotianaglauca)， 粘 烟 草 (Nicotiana glutinosa)， 古特斯皮德氏烟草 (Nicotianagoodspeedii)，哥 西 氏 烟 草 (Nicotiana gossei)，混 合 烟 草 (Nicotiana hybrid)， ， 因 古 儿 巴 烟 草 (Nicotiana ingulba)， 川 上 烟 草 (Nicotiana kawakamii)， 奈 特氏烟草 (Nicotiana knightiana)， 蓝格斯多夫烟草 (Nicotiana langsdorfi)， 狭叶烟 草 (Nicotiana linearis)， 长 花 烟 草 (Nicotiana longiflora)， 海 滨 烟 草 (Nicotiana maritima)， 拟 似 烟 草 (Nicotiana megalosiphon)， 摩 西 烟 草 (Nicotiana miersii)， 夜 花 烟 草 (Nicotiana noctiflora)，裸 茎 烟 草 (Nicotiananudicaulis)，耳 状 烟 草 (Nicotiana obtusifolia)， 西 方 烟 草 (Nicotianaoccidentalis)， 西 方 subsp.Hesperis 烟 草 (Nicotiana occidentalis subsp.Hesperis)， 耳 状 烟 草 (Nicotiana otophora)， 圆 锥 烟 草 (Nicotiana paniculata)， 少 花 烟 草 (Nicotiana pauczjlora)， 碧东烟草 (Nicotiana petunioides)， 蓝 茉 莉 叶 烟 草 (Nicotiana plumbaginifolia)， 四科烟草 (Nicotiana quadrivalvis)， 雷蒙德氏烟草 (Nicotiana raimondii)， 残波烟草 (Nicotiana repanda)， 莲 座 叶 烟 草 (Nicotiana rosulata)， 莲 座 叶 subsp.Ingulba 烟 草 (Nicotiana rosulata subsp.Ingulba)， 圆叶烟草 (Nicotiana rotundifolia)， 黄花烟草 (Nicotiana rustica)， 赛特式烟草 (Nicotiana setchellii)， 特大管烟草 (Nicotiana simulans)， 茄 叶烟草 (Nicotiana solanifolia)， 斯佩格茨烟草 (Nicotiana spegauinii)， 斯托克通氏 烟草 (Nicotiana stocktonii)， 香甜烟草 (Nicotiana suaveolens)， 林烟草 (Nicotiana sylvestris)， 普 通 烟 草 (Nicotiana tabacum)， 蓝 烟 草 (Nicotianathyrsiflora)， 绒毛 烟 草 (Nicotiana tomentosa)， 绒 毛 状 烟 草 (Nicotianatomentosifomis)， 三角叶烟草 (Nicotiana trigonophylla)， 阴 生 烟 草 (Nicotianaumbratica)， 波 叶 烟 草 (Nicotiana undulata)， 颤 毛 烟 草 (Nicotiana velutina)， 芹 烟 草 (Nicotiana wigandioides)， 和 Sanderae 烟草 (Nicotiana x sanderae)。
     “烟草产品” 指含有烟草植物物质的产品， 包括例如用于戒烟的尼古丁胶姆糖和尼 古丁贴片， 卷烟烟叶， 膨化烟叶和再造烟叶， 雪茄烟叶， 烟斗烟， 卷烟， 雪茄， 和所有类型的无 烟烟叶如嚼烟， 鼻烟叶， 唇齿烟和尼古丁含片。
     古柯科为开花植物， 由 4 个属和大约 240 种组成， 其最著名成员为古柯。曾有 报道， 被标记的 4- 甲胺基丁醛缩二乙醇 (N- 甲基吡咯啉离子的乙缩醛二乙醇衍生物 ) 加入古柯叶中后， 标记物参入到古柯碱的托烷类生物碱部分。Leete， Planta Med.56 ： 339-352(1990)。因此， 可以有理由地推测本发明中的 MPO 基因参与古柯碱的形成。
     正如本领域所熟知的， 有若干种方式可以将基因和基因建构物导入植物， 植物转 染和组织培养技术的结合已成功地成为创造转基因植物有效策略不可缺少的一部分。
     本发明中可使用的这些方法已在它处描述 (Potrykus， Annu.Rev.PlantPhysiol. Plant Mol.Biol.42 ： 205-225(1991) ； Vasil ， Plant Mol.Biol.5 ： 925-937(1994) ； Walden and Wingender， Trends Biotechnol.13 ： 324-331(1995) ； Songstad et al.，Plant Cell， Tissue and Organ Culture 40 ： 1-15(1995))， 并为本领域普通技术人员 所熟知。例如， 本领域普通技术人员知道， 通过真空浸渗 (Bechtold et al.， C.R.Acad. Sci.Ser.III Sci.Vie， 316 ： 1194-1199(1993)) 或有伤接种 (Katavic et al.， Mol.Gen. Genet.245 ： 363-370(1994)) 根癌农杆菌能够介导拟南芥的转染 ； 此外， 利用根癌农杆菌 Ti- 质粒同样可以介导其它植物或作物的转染 ( 例如， 下胚轴 (DeBlock et al.， Plant Physiol.91 ： 694-701(1989)) 或子叶柄伤口感染 (Moloney et al.， Plant Cell Rep.8 ： 238-242(1989))， 亦 可 以 利 用 颗 粒 撞 击 / 生 物 弹 道 法 (Sanford et al.， J.Part.Sci. Technol.5 ： 27-37(1987) ； Nehra.et al.， Plant J.5 ： 285-297(1994) ； Becker et al.， Plant J.5 ： 299-307(1994)) 或聚乙烯乙二醇辅助的原生质体转染方法 (Rhodes et al.， Science240 ： 204-207(1988) ； Shimamoto et al.， Nature 335 ： 274-276(1989))。
     发根农杆菌可以用于生产转基因植物发根培养物， 包括烟草， 正如所描述的那样， 例如， Guillon et al.， Curr.Opin.Plant Biol.9 ： 341-6(2006)。 “烟草发根” 指烟草根部 含有来自发根农杆菌 Ri 质粒并整合到基因组的 T-DNA， 其在不补充生长素和其它植物激素 情况下能培养生长。烟草发根和完整烟草植物根部一样能够生产烟碱。
     此外， 可以用根瘤菌属， 中华根瘤菌属， 或中慢生根瘤菌属转染植物 (Broothaerts et al.， Nature 433 ： 629-633(2005))。
     植物或植物细胞转染后， 已整合所需 DNA 的植物或植物可以通过如下方法筛选， 抗生素抗性， 杀草剂抗性， 氨基酸类似物耐性， 或表型标记。
     可以用若干种方法如 Northern 杂交或定量反转录 PCR(RT-PCR) 确定植物细胞是 否发生基因表达改变。完整转基因植物可以通过常规方法从转化细胞产生。这样的转基因 植物可以繁殖和自花授粉来产生纯合株系。这些植物产生种子， 后者含有编码引入特征的 基因， 可以生长具有产生选择表型的植物。
     通过本发明实现的生物碱成分改良可以和其它令人感兴趣的性状相结合， 如疾病 抗性， 害虫抗性， 高产量， 或其它性状。 例如， 含有改良生物碱成分的适合的转基因的遗传工 程生成的稳定转染植物， 可以被用来将改良生物碱成分的性状渗入到一个商业上可以接受 的遗传背景中， 从而获得既含有改良生物碱成分又具有所需遗传背景的品种。 例如， 遗传工 程生成的烟碱含量减少的烟草植物， 可以将烟碱含量减少的性状渗入到具有抗病性如 TMV， 烟草黑胫病菌， 或青霉抗性的烟草品种中。 此外， 可以将能够赋予其它性状的核酸建构物转 染至本发明中含有改良生物碱成分植物的细胞中。
     B. 细胞
     本发明考虑用编码生物碱合成酶的核酸序列来经由遗传工程生成细胞。例举的 细胞包括， 但不局限于植物细胞， 例如颠茄， 莨菪叶， 拟南芥， 及昆虫， 哺乳动物细胞， 酵母， 真菌， 藻类或细菌细胞。有关适用的宿主细胞的进一步讨论见 Goeddel， GENE EXPRESSION TECHNOLOGY ： METHODS INENZYMOLOGY 185， Academic Press， San Diego， Calif(1990)。
     “昆虫细胞” 指任何可以被编码生物碱合成酶的基因转染的昆虫细胞， 其表达的酶 或其产物在产量上足以被回收。有说明性的昆虫细胞包括 Sf9 细胞 (ATCC CRL 1711)。
     “真菌细胞” 指任何可以被编码生物碱合成酶的基因转染的真菌细胞， 其表达 的酶或其产物在产量上足以被回收。有说明性的真菌细胞包括酵母细胞如啤酒酵母 (Baldari， et al.， 1987.EMBO J.6 ： 229-234) 和甲醇酵母 ( 例如， Invitrogen 提供的 KM714甲醇酵母 )。也可以使用丝状真菌细胞如曲霉菌和木霉。Archer， et al.， Antonie van Leeuwenhoek 65 ： 245-250(2004)。
     “细菌细胞” 指任何可以被编码生物碱合成酶的基因转染的细菌细胞， 其表达的酶 或其产物在产量上足以被回收。有说明性的细菌细胞包括大肠杆菌， 如 QIAGEN 商业上提供 的 M15/rep4 大肠杆菌。
     “哺乳动物细胞” 指任何可以被编码生物碱合成酶的基因转染的哺乳细胞， 其表 达的酶或其产物在产量上足以被回收。有说明性的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 或 COS 细胞。哺乳动物细胞也可以包括导入编码生物碱合成酶序列的受精卵细胞或 胚胎干细胞。该类宿主细胞可以用来制造人以外的转基因动物。应用在哺乳动物细胞调控 蛋白表达的系统的例子包括 Clontech 公司的 Tet-Off 及 Tet-On 基因表达系统和其它类似 系统。Gossen and Bujard， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 55475551(1992)。
     “藻类细胞”指在不影响藻类正常发育或生理的情况下任何可以被编码生物 碱合成酶的基因转染的藻类细胞。有说明性的藻类细胞包括莱茵衣藻 (Mayfield and Franklin， Vaccine 23 ： 1828-1832(2005)。
     由于在昆虫细胞中生产生物碱可能对昆虫的生长和发育产生不利影响， 使用诱导 表达系统可以减轻这些副作用。 例如， 昆虫细胞可以先在非诱导条件下生长至所需状态， 然 后再诱导酶表达。
     此外， 可以给表达生物碱合成酶基因的细胞提供前驱物质以增加烟碱合成底物的 可利用度。也可以给细胞提供前驱物质类似物， 后者可以参合到天然烟碱类生物碱的类似 物中。
     根据本发明， 可以利用适当的技术将核酸建构物导入细胞， 这些技术包括根癌农 杆菌介导的植物细胞转染， 颗粒撞击， 电穿孔和聚乙烯乙二醇融合， 磷酸钙法转染， DEAE- 葡 聚糖介导的转染或阳离子脂质介导的转染。
     在不使用选择性或可视标记的情况下， 可以使用本发明中的核酸建构物对该类细 胞施行遗传工程， 所生成的转基因生物可以通过检测导入的核酸建构物来识别。 例如， 可以 测量一个特定细胞中的蛋白， 多肽或核酸来确定一个细胞是否被成功转染。正如在本行业 常规进行的， 例如， 可以通过 PCR 或其它适当方法检测特定核酸序列或多肽序列以确定导 入的核酸建构物的存在。此外， 可以通过与在相似条件下生长的非转化细胞对比来识别生 长率的差异或形态学特征上的差异以确定经遗传工程改良的细胞。见 WO2004/076625。
     IV. 定量测定生物碱含量
     A. 生物碱含量下降
     在本发明的一个方面， 遗传工程生成的植物和细胞以生物碱含量下降为特征。
     有若干方法可以定量检测生物碱水平的减少， 例如根据气液色谱法， 高效液相色 谱法， 放射免疫法及酶联免疫法定量测量生物碱水平。本发明使用 Waters 公司的 2695 型 分离模块进行高效液相色谱分析测量生物碱水平， 该分离模块在色谱柱温度 60℃条件下装 备有 Waters X-Terra RP18 5μm4.6×150mm 预柱。等度洗脱系统由 80％ A ： 20％ B 组成， 溶剂 A 成份为 50mM 柠檬酸， 10mM 辛基磺酸 (pH 3.0)(pH 由三乙胺调节 ) 及 5％ MeOH ； 溶剂 B 成份为甲醇 ； 流速为 1ml/ 分钟， 共 15 分钟。注射容积为 20μl。用光电二极管阵列检测 法在 261nm 检测烟碱。在描述本发明中植物时， “生物碱含量减少的植物” 或 “生物碱含量下降的植物” 一 语包括生物碱含量是同种或同品种对照植物的 50％以下， 最好是所述对照植物的 10％或 1％以下的植物。
     B. 生物碱含量增加
     在本发明的一个方面， 遗传工程生成的植物和细胞以生物碱含量增加为特征。类 似地， 遗传工程生成的细胞以生物碱含量增加为特征。
     在描述本发明中植物时， “生物碱含量增加的植物” 一语包括生物碱含量是同种或 同品种对照植物的 10％以上， 最好是所述对照植物的 50％， 100％或 200％以上的植物。
     遗传工程生成的细胞以烟碱类生物碱合成为特征。例如， 遗传工程发明的细胞比 对照细胞能生产更多的烟碱。
     有若干方法可以定量检测生物碱水平的增加， 例如根据气液色谱法， 高效液相色 谱法， 放射免疫法及酶联免疫法定量测量生物碱水平。本发明使用装备有上述逆相色谱柱 和光电二极管阵列检测仪的高效液相色谱法检测生物碱水平。
     产物
     MPO 基因可以用于在宿主细胞生产 MPO。此外， 可利用重组 MPO 的活性生产产物。 例如， 重组 MPO 可以用来合成或部分合成生物碱。MPO 作用于部分 N- 甲基腐胺类似物产生 非天然产物。见 Boswell et al.， Phytochemistry 52 ： 855-869(1999) ； Boswell et al.， Phytochemistry 52 ： 871-878(1999)。因此， 重组 MPO 有助于生产生物碱类似物， 包括烟碱 类似物。为此目的， 有若干种方法生产大规模或商业化数量的 MPO， 包括从遗传工程生成的 植物， 细胞或培养系统提取重组酶， 这包括， 但不局限于， 发根培养物， 昆虫， 细菌， 真菌， 植 物， 藻类， 哺乳动物细胞培养和体外翻译系统。
     **********************************************************
     下列例子利用功能基因组学阐释 MPO 基因在吡咯烷类生物碱 ( 例如， 烟碱 ) 和托 烷类生物碱 ( 例如， 东茛菪碱和古柯碱 ) 生物合成中的重要作用。从模本植物本塞姆氏烟 草通过测定消减 cDNA 文库序列获得表达序列标签 (ESTs)， 该文库富含茉莉酸甲酯处理过 的本塞姆氏烟草根部表达的基因。分析 EST 数据集以确定编码烟碱生物合成酶 DNA 序列的 存在。利用病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术沉默候选基因， 参与烟碱生物合成基因的沉默 导致烟碱水平显著降低。
     本发明实验数据显示从本塞姆氏烟草分离出的基因， 其编码参与烟碱生物合成的 N- 甲基腐胺氧化酶 (MPO)。这些结果表明被克隆的 MPO 属于胺氧化酶超家族， 在原核细胞 和真核细胞广泛存在， 其含有结合紧密的 CuII 和来自酪氨酸的 6- 羟基多巴醌 (TPQ) 成份。
     下述这些例子只是说明而已， 不应解读为对本发明的限制。
     例 1. 消减 cDNA 文库的建立， EST 序列测定和 MPO 候选基因的选择。
     烟碱生物合成在烟草根部进行 (Dawson RF， Science 94 ： 396-397(1941))， 通 过昆虫伤害， 创伤和施用茉莉酮酸酯 (MeJa) 诱导烟碱生物合成 (WinzRA et al.， Plant Physiol.125 ： 2189-2202(2001))。 为了识别编码烟碱生物合成酶的基因， 采用 MeJa 诱导的 本塞姆氏烟草根部 ESTs 序列测定与利用 VIGS 功能分析相结合的新方式。
     本塞姆氏烟草的无基质栽培
     本塞姆氏烟草 ( 茄科 ) 秧苗在无基质栽培条件下生长， 营养液为 0.25xHoagland氏溶液， 其配有螯合铁溶剂， 并用起泡器加入氧气。 在 3 周大的植物根部加入 MeJa 至最后的 浓度为 11μM， 分别在处理前 (t ＝ 0) 和处理后 1， 4， 和 7 小时取样分析。利用 RNeasy Midi 试剂盒 (Qiagen) 分离全部 RNA， 即从未处理的叶和根部， 各 450mg， 分离 RNA， 以及从 MeJa 处 理 1， 4， 和 7 小时的根部， 各 150mg， 分别分离 RNA， 并将其合并。 我们构建了三个不同的消减 cDNA 文库 ： NBREL2， 用合并的 MeJa 处理的根部 mRNA 做检测子和未处理的根部 mRNA 做驱赶 子； NBLEL3， 用合并的 MeJa 处理的根部 mRNA 做检测子和未处理的叶部 mRNA 做驱赶子 ； 及 NBREL4， 用合并的 MeJa 处理的根部 mRNA 做检测子和驱赶子。
     消减 VIGS-cDNA 文库的建立
     利用 PCR 选择消减 cDNA 文库试剂盒 (Clontech) 进行 cDNA 合成， 并作出部分改 良。简单地， 约 250μg 全体 RNA 与 300μl Oligo(dT)25Dynabeads(Dynal Biotech) 在结 合液 (20mM Tris-HCl pH 7.5， 1M LiCl， 2mM EDTA) 中混合。 孵育 10 分钟后， 用洗液 B(10mM Tris-HCl pH 7.5， 0.15M LiCl， 1mM EDTA) 洗涤微球 3 次， 再用一链缓冲液洗 2 次。洗涤后 含有 mRNA 的微球重新悬浮于 40μl cDNA 合成液 (8μl 5X 一链缓冲液， 4μl 10mM dNTPs， 24μl 不含 RNA 酶的水和 4μl(8U)AMV 反转录酶 )， 并在 42℃孵育 1.5 小时。加入 120μl 二链合成液 (32μl 5X 次链缓冲液， 3.2μl 10mM dNTPs， 8μl 20X 混合酶和 77μl 不含 RNA 酶的水 ) 进行二链合成， 并在 16℃孵育 2 小时， 而后加入 4μl(12U)T4DNA 聚合酶， 孵育 30 分 钟。加入 20μl 0.5M EDTA 终止反应。磁性分离微球， 除去上清液， 将微球再悬浮于 500μl 洗液 (5mM Tris-HCl pH 7.5， 0.5mM EDTA， 1M NaCl， 1％ SDS 和 10μg/ml 糖原 )， 在 75℃加 热 15 分钟。用洗液 (5mM Tris-HCl pH 7.5， 0.5mM EDTA， 1M NaCl 和 200μg/mlBSA) 洗涤 微球 3 次， 再用 RsaI 液洗涤 2 次。将微球悬浮于 84μl H2O， 10μl 10x RsaI 液， 3μl(30U) RsaI， 在 37℃过夜孵育。通过磁性分离微球来分离未结合的 cDNA， 并根据厂家的说明， 将 cDNA 用于适配器连接， 杂交和初次 PCR。第 2 次 PCR 使用的引物为 5’ -CGGGATCCTCGAGCGGC CGCCCGGGCAGGT-3’ (BamH1 位点底部划有横线 ) 和 5’ -CGGAATTCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’ ( EcoR1 位点底部划有横线 )。用 EcoRI 和 BamHI 消化 PCR 选择放大的 cDNA 片段 (700ng) 和 TRV-RNA2 载体 pYL156， 将消化产物连接 (Liu Y， et al.， PlantJ.30 ： 415-429， 2002)。将联 结产物经电穿孔导入 DH10B 大肠杆菌以生成初级文库。将其在琼脂平板放大， 经电穿孔分 离质粒 DNA， 将质粒 DNA 转染 C58 根癌农杆菌。连接效率经菌落 PCR 确定为 98％。
     消减 VIGS-cDNA 文库 EST 测序和确定 MPO 候选基因
     用 如 下 载 体 引 物 5 ’- G T T A C T C A A G G A A G C A C G A T G A G - 3 ’ 和 5’ -CAGTCGAGAATGTCAATCTCGTAG-3’ 进行 PCR 来放大 cDNA 插入物以用于序列测定， 并随机 选择根癌农杆菌菌落作为模版。生成的 PCR 产物用 Big Dye Terminators 测序试剂盒和引 物 5’ -GTTACTCAAGGAAGCACGATGAG-3’ 直接进行测序。分别从 NBREL2， NBLEL3 和 NBREL4 测 定了 2016， 1920 和 1920 个 ESTs 序列。去除质量不良的序列后， 把 3 个数据集合并后共获 得 3480 个特异转录体， 包括 606 邻接片段和 2874 单例片段。全部 VIGS-EST 数据集通过经 BLASTX 与 NCBI 非冗赘数据库比较来注解。
     已证明 N- 甲基腐胺氧化酶 (MPO) 是烟碱和其它生物碱生物合成的主要酶蛋 白 ( 图 1)， 其为含铜的醌蛋白， 氧化 N- 甲基腐胺形成 N- 甲基氨基丁醛 (Mizusaki S.et al.， Phytochemistry 11 ： 2757-2762， (1972) ； Davies HM et al.， Phytochemistry 28 ： 1573-1578(1989))。N- 甲基氨基丁醛自动环化形成 N- 甲基吡咯啉离子。利用主题词查找BLASTX 结果， 我们确定 7 个被注解为铜胺氧化酶的 ESTs。7 个克隆形成 2 个簇 (CL181 邻接 片段 1， 3 个成员 ； CL547 邻接片段 1， 2 个成员 ) 和 3 个单例片段 ( 表 1)。
     例 2. 克隆 N- 甲基腐胺氧化酶候选基因全长度 cDNA
     cDNA 片段用于 EST 测序和 VIGS 分析， 因此有必要利用 RACEPCR 获得全长度 cDNA 序列。
     N- 甲基腐胺氧化酶候选基因全长度 cDNA RACE PCR
     根据生产商说明， 利用 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen) 对 5μg MeJa 处理的本塞 姆氏烟草根部全体 RNA 进行逆转录以获取 MPO5’ cDNA 末端。使用 PCR 程序 (95℃ 2 分钟 ； 循 环 35 次， 95℃ 30 秒， 58℃ 30 秒， 66℃ 30 秒， 72℃ 1 分钟 ； 72℃ 10 分钟 ) 和 Pfu Turbo 聚合 酶 (Stratagene) 以 GeneRacer 5’ 引物和基因特异引物 (5’ -CTTGAGCATCTATGGGTGGC-3’ ) 进行 5’ RACE PCR 的反应， 。使用同一 PCR 程序以 GeneRacer 3’引物和基因特异引物 (5’ -AGCAATGCGTGACTGTGATCCG-3’ ) 进行 3’ RACE 反应。形成的平端 PCR 产物被克隆至 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen)， 并从两端测序。
     MPO 基因全长 2738 碱基对 (bp)， 编码 2379bp 的开放读码区 (ORF)。该 MPO 基因序 列列于 SEQ ID NO ： 1。MPO 开放读码区序列 (ORF) 列于 SEQ ID NO ： 2。预测的氨基酸序列 列于 SEQ ID NO ： 3。 根据对一级氨基酸序列的计算机分析 (SEQ ID No ： 3)， 烟草 MPO 含有若干个具有 铜胺氧化酶特征的功能区。 氨基酸残基 96-141 形成铜胺氧化酶 N2 区， 氨基酸残基 221-325 形成铜胺氧化酶 N3 区。MPO 氨基酸 514 为保守的酪氨酸， 其被翻译后修饰为氧化还原因子 6- 羟基多巴醌 (TPQ)。在 562， 564 和 728 位点保守的组氨酸残基可能行使与铜结合的功 能。因此， 很显然， 来自某一对应物种的 MPO 可能在这些区域更为高度保守并含有类似的功 能区。物种间这些功能区的高度同源性提供了烟草 MPO 基因靶区域， 其核苷酸序列有助于 在其它相关植物制备干扰 RNA 或其它基因沉默建构物。
     例 3.MPO 候选基因表达分析
     正如腐胺甲基转换酶 (PMT) 和催化烟碱生物合成的其它酶蛋白在烟草根部特异 性表达所证明的， 烟碱生物合成发生在烟草根部 (Sinclair SJ et al.， Functional Plant Biol.31 ： 721-729， (2004))。为确定克隆的 MPO 是否在根部表达， 并为 MeJa 诱导， 我们使用 逆转录 PCR(RT-PCR) 测量 MPO 转录体的水平。
     RT-PCR 分析 MPO 和 PMT 在本塞姆氏烟草不同组织的表达
     使用逆转录 PCR(RT-PCR) 测定 MPO 在本塞姆氏烟草不同组织的表达， 并将其与 PMT 相比较， 已知后者参与烟碱生物合成， 并作用于紧接 MPO 上游的一步 ( 图 1)。利用 RNeasy Plant Mini 试剂盒 (Qiagen)， 并根据生产商的说明， 从本塞姆氏烟草组织 ( 嫩叶， 老叶， 茎， 主根部， 侧根部和整个幼苗 ) 分离 RNA。根据 SuperScript III 一链 RT-PCR 合成系统所描 述的步骤 (Invitrogen)， 从 1.7μg 全体 RNA 合成一链 cDNA， 随后进行 PCR 放大 2μl cDNA， 反应容积为 50μl， 使用 PCR 程序 (95℃ 30 秒， 58℃ 30 秒， 72℃ 50 秒， 循环 30 次 ) 和 Taq 聚 合酶。肌动蛋白引物为 5’ -CTACAATGAGCTTCGTGTTGC-3’ 和 5’ -TGCTGAGGGAAGCCAAGATA-3’ ； PMT 引物为 5’ -TCATGCTCTTTGAGTCAGCAA’ -3’ 和 5’ -CACCAGTGTTCATTGTTCACT-3’ ； MPO 引物 为 5’ -AGGTGGACATCACAGAGGAA-3’ 和 5’ -AGTCGTTTCAACTCCTCCCGTA-3’ 。各反应的一部分经 含有溴化乙锭的 1％琼脂糖凝胶电泳分析。
     如图 2 所示， MPO 在本塞姆氏烟草植物的细侧根部表达最高。在主根部和包括根 部和叶组织的整个幼苗均检测到 MPO 转录体。因此， MPO 在根部的特异性表达支持其在烟 碱生物合成的作用。
     qRT-PCR 分析 MPO 和 PMT 在 MeJa 处理的本塞姆氏烟草根部的表达
     我们利用定量 RT-PCR(qRT-PCR) 测定 MeJa 对 MPO 的诱导。我们使用和在 RT-PCR 分析 MPO 在不同组织表达相同的 PCR 引物。分别在处理前和加入 MeJa(11μM) 到无基质 溶液后 1， 4， 和 7 小时提取无基质栽培生长的根部组织全体 RNA。无基质栽培条件已在 例 1 中 详 述。 利 用 RNeasy Plant Mini 试 剂 盒 (Qiagen) 分 离 RNA。 根 据 SuperScript IIIPlatinum SYBR Green 两步 qRT-PCR 试剂盒 (Invitrogen) 所描述的步骤， 我们使用 iCycler iQ Real-Time 测定系统 (BioRad) 进行 qRT-PCR。简单地， 在 20μl 反应容积中使 用 1.7μg 全体 RNA 进行一链 cDNA 合成， 随后在 96 孔光学 PCR 板 (BioRad) 对 1μl cDNA 进行实时 PCR 放大， 反应容积为 25μl， 反应条件为 95℃ 30 秒， 58℃ 15 秒， 72℃ 50 秒， 循环 40 次。 用肌动蛋白作为转录体标准化的参考基因， 靶基因表达水平的变化根据 Ramakers et al.(Neuroscience Letters 339 ： 62-66(2003)) 描述的方法确定。
     图 3 显示 MeJa 诱导的 PMT 和 MPO 表达的改变。和诱导前水平相比， MeJa 增加 MPO 表达 23 倍。MPO 表达跟随 PMT 的表达， 虽然 MeJa 导致后者转录体水平发生更为戏剧性的增 加。
     例 4. 利用病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术在植物沉默 MPO 表达。
     利用病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术检测沉默候选 MPO 基因对烟碱生物合成的 作用。VIGS 是功能性基因组学工具， 可在植物进行快速功能缺失或下降实验 (Baulcombe D.C.， Curr.Opin.Plant Biol.2 ： 109-113(1999))。 VIGS 的优缺点已有论述 (Lu R， et al.， Methods 30 ： 296-303(2003))。
     含 MPO 片段的 VIGS 沉默建构物
     我们检测了 3 个代表 MPO 不同区域独立的 VIGS 建构物降低烟碱水平的能力。图 4 标明这些片段相对于 MPO ORF 的位置。 VIGS 建构物 214D11 长度为 378bp， 对应于全长度 MPO cDNA 核苷酸 754-1132。214D11 与烟草脆裂病毒 (TRV) 外壳蛋白反方向 ( 反义方向 ) 排列。 VIGS 建构物 317A08 长度为 252bp， 对应于全长度 MPO cDNA 核苷酸 1521-1772。317A08 亦 逆向排列。VIGS 建构物 403B01 长度为 277bp， 对应于全长度 MPO cDNA 核苷酸 1129-1405。 403B01 相对于 TRV 外壳蛋白正义方向排列。
     VIGS 方法
     本塞姆氏烟草植物在可控环境箱生长， 白天 23℃， 16 小时 ； 黑夜， 20° C， 8 小时 ； 2 光强度约为 100μmol/m /s。 含有 TRV-RNA1 质粒或 TRV-RNA2 建构物 (pYL156)(Liu et al， 2002) 的 C58 根癌农杆菌培养物在 28℃过夜生长。离心后， 将细菌悬浮于含有 1mM MES(pH 5)， 10mMMgCl2 和 100μM 乙酰丁香酮的渗透液， OD600 ＝ 1， 在渗透前置于室温 3-6 小时。 TRV-RNA1 和 TRV-RNA2 建构物悬液 1 ∶ 1 混合， 并用 1ml 注射器将其渗透至年龄为 3-4 周植 物上方叶子的底部。仅用缓冲液或含无功能的绿色荧光蛋白 (GFP)TRV-RNA2 建构物渗透阴 性对照植物。植物生长 3 周后用离子对 -HPLC 法测定叶子中烟碱含量。
     离子对 -HPLC 法分析烟碱
     从各植物切割年幼 ( ～ 3-5cm) 叶子的一半作为样品。测定样品鲜重后， 加入200μl 锆微球和 300μl 50mM 柠檬酸缓冲液 (pH 3) ∶甲醇 (70 ∶ 30)。 用 Beadbeater 使样 品均质， 超声水浴 10 分钟。 所产生的提取液在 4℃过夜孵育， 离心和过滤 (0.45μm， Spin-X) 以澄清提取液。使用 Waters 公司的 2695 型分离模块进行离子对 -HPLC， 该分离模块在色 谱柱温度 60℃条件下装备有 Waters X-Terra RP18 5μm 4.6×150mm 预柱。等度洗脱系 统由 80％ A ∶ 20％ B 组成， 溶剂 A 成份为 50mM 柠檬酸， 10mM 辛基磺酸 pH3.0(pH 由三乙胺 调节 ) 及 5％ MeOH， 溶剂 B 成份为甲醇， 流速为 1ml/ 分钟， 共 15 分钟。注射容积为 20μl。 2 用光电二极管阵列检测法在 261nm 检测烟碱。 标准曲线 (r 0.999) 通过注入 1040μg/ml 到 10.4μg/ml 真正烟碱溶液获得， 通过与该标准曲线比较， 利用峰区面积进行烟碱定量。
     3 个 MPO VIGS 建构物在被感染的植物中均导致烟碱水平降低 ( 图 5)。TRV-GFP 对照植物的烟碱水平与只用缓冲液处理的植物的烟碱水平相似。这表明 TRV 感染对烟碱 生物合成几乎没有影响。我们对 VIGS 建构物 403B01 进行进一步检测。MeJa(0.1％ (v/v) 溶解于含有 0.1％ (v/v)Tween-20 的水中， 我们测定给叶子喷洒 MeJa 前和喷洒 5 天后感染 有 403B01 的植物的烟碱含量 ( 图 4)。MeJa 诱导的烟碱水平在 MPO 被沉默， 感染有建构物 403B01 的植物中与 TRV-GFP 对照相比降低了 77％。
     MPO 被沉默植物 N- 甲基腐胺水平的测定
     用 Minocha SC et al.， (J.Chromatography 511 ： 177-183(1990)) 描述的方法测 量 MPO 被沉默的植物根部的多胺。简单地， 用液氮冷冻根部组织并将其磨成细粉末状。确 定样品鲜重后， 加入 200μl 锆微球和 300μl 含 100nmol/ml 1， 7- 二氨基庚烷 (DAH) 的冰 冷 5％高氯酸， 用 Beadbeater 使样品均质。离心和过滤 (0.45μm， Spin-X) 以澄清提取液。 50μl 样品中加入 100μl 饱和碳酸钠， 再加入 100μl 丹磺酰氯 (10mg/ml)。涡激振动混 合样品， 在暗处 60℃孵育 1 小时。加入 50μl 脯氨酸 (100mg/ml 溶解在 5％高氯酸 ) 和剩 余的丹磺酰氯反应。用 400μl 甲苯提取反应物， 涡激振动， 离心分离有机相。用 SpeedVac 烘干 200μl 甲苯层， 残余物悬浮于 1ml 乙腈。使用 Waters 公司的 2695 型分离模块进行 离子对 -HPLC， 该分离模块在色谱柱温度 40℃条件下装备有 Waters X-Terra RP18 5μm 4.6×150mm 预柱。洗脱剂由乙腈 ( 溶剂 A) 和 10mM 辛基磺酸 (pH 3.0)(pH 由磷酸调节 ) 及 10％乙腈 ( 溶剂 B)。30％ A 到 100％ A 梯度 30 分钟， 而后 100％ A 3 分钟。注射容积为 10μl， 流速为 1ml/ 分钟。通过 Waters 2475 荧光检测器在 340nm 激发和在 510nm 发射检 测多胺。
     N- 甲基腐胺在感染有 TRV-MPO 沉默建构物 214D11 的本塞姆氏烟草植物根部聚集 ( 图 6)。MPO 底物在这些植物中的聚集进一步支持我们的结论， 即我们用 VIGS 方法识别出 在烟碱生物合成中发挥功能的 MPO 酶的基因。 N- 甲基腐胺也在 TRV-GFP 对照植物中低水平 地检测出。
     感染 MPO-VIGS 建构物之植物 MPO 表达的测定
     qRT-PCR 被用于检测 MPO 在感染有 TRV-MPO 建构物 214D11 或 TRV-PMT 建构物的植 物根部的表达。根部从缓冲液或 TRV-GFP 对照植物取样。RNA 分离， cDNA 合成和 qRT-PCR 条件， 包括引物序列， 前面已有描述。与缓冲液对照植物相比， MPO 和 PMT 在 TRV-GFP 植物 中表达增加， ( 图 7) 而 TRV-MPO 介导的沉默大大减少了 MPO 转录体的水平。
     感染 MPO-VIGS 建构物之植物 MPO 活性的测定
     从缓冲液对照组植物根部及 TRV-GFP 和 TRV-MPO(214D11) 感染植物根部制备蛋白质提取液。按 Hashimoto T.et al.(Plant Physiol.93 ： 216-221(1990)) 描述的方法进 行提取。简单地， 1g 根部组织在液氮中磨碎， 并悬浮在 20ml 提取缓冲液中， 该缓冲液含有 100mM 磷酸钾， (pH 7.5)， 0.25M 蔗糖， 5mM EDTA， 0.3％抗坏血酸和 10％ PVPP。在 500g 离心 30 分钟， 上清液在 11,000g 再次离心 30 分钟。用 20％和 40％硫酸铵两度沉淀上清液， 将沉 淀物悬浮于 1ml 水中， 然后用 2 升缓冲液过夜透析， 缓冲液含有 20mM 磷酸钾， (pH 7.5)， 1mM DTT 及 20％甘油。用 DC 蛋白试剂盒 (BioRad) 测定蛋白质浓度。用 Amplex 红过氧化氢 / 过氧化物酶试剂盒 (Molecular Probes) 检测 N- 甲基腐胺氧化后的 MPO 生成的 H2O2。简单 地， 50μl 反应中含有 8μg 蛋白粗提物， 1mM N- 甲基腐胺和 20mM 磷酸钾缓冲液 (pH 7.5) 与 50μl H2O2 检测剂混合， 该检测剂含有 0.1mM Amplex 红和 0.2U/ml 过氧化物酶。混合 物在 30℃孵育 30 分钟后， 用微板萤光光度计 (Victor3UV 多标记光度计， PerkinElmer) 在 530-560nm 激发和在 590nm 发射的设定中读取荧光强度。
     如图 8 所示， 感染 TRV-MPO 的植物根部 MPO 活性低于缓冲液对照和 TRV-GFP 植物。
     例 5. 重组 MPO 催化活性分析。
     为确实证明所克隆的基因编码 MPO 酶， 我们阐述其生物化学特性并确定 MPO 与 N- 甲基腐胺孵育后生成产物的结构。
     重组 MPO 表达与纯化
     在大肠杆菌表达本塞姆氏烟草 MPO ORF， 纯化重组酶蛋白以用于生物化学分析。 设 计 引 物 5’ -ATGGCCACTACTAAACAGAAAG-3’和 5’ -TAGTTTAGCGGCCGCTCAAAGCTTGGCCAGCAAGC T-3’ 以放大 MPO ORF。利用一链 cDNA 为模版， 用 Pfu(Stratagene) 放大 cDNA 克隆， PCR 条 件为 95℃ 30 秒， 58℃ 30 秒 72℃ 2.5 分钟， 循环 35 次。产物与 Taq 聚合酶在 72℃孵育 15 分钟加入附加的 “A” 碱基。将生成的 PCR 产物克隆至 pCR8/GW/TOPO 载体 (Invitrogen) 以 生成 Gateway 入门载体， 其与目的载体 pHIS8GW 通过 Gateway LR 克隆酶 (Invitrogen) 重 组生成表达克隆 pHIS8GW-MPO。 用 pHIS8GW-MPO 载体转染 Rosetta(DE3)pLysS(Novagen) 大 肠杆菌菌株， pHIS8GW-MPO 载体 N- 末端含有由 8 个组氨酸组成的融合标签。将单一菌落接 种于 100ml 隔夜自我诱导表达系统 (Novagen)， 其含有 50μg/ml 卡那霉素和 34μg/ml 氯霉 素， 在 28℃过夜振荡孵育。 使用 Talon Superflow 金属亲合树脂 (Clontech) 纯化重组 MPO。 隔夜细菌培养物离心后， 将细菌悬浮于 10ml 裂解缓冲液， 后者含有 50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 8.0)， 150mM NaCl， 0.1％ Triton-X100， 5mM 咪唑和混合蛋白酶抑制剂 (Novagen)。声纳处 理细胞悬液 2 分钟以裂解细菌。裂解物在 12,000rpm 离心 15 分钟， 将上清液加入 200μl Talon 树脂交换柱。 交换柱用 30ml 洗涤液洗涤， 洗涤液成份为 50mM 磷酸钠 (pH 7.0)， 150mM NaCl 和 10mM 咪唑， 然后用 10ml 洗脱液洗脱， 洗脱液成份为 50mM 磷酸钠 (pH 7.0)， 150mM NaCl 和 200mM 咪唑。聚积含有 MPO 的部分， 用 2L 储藏液透析， 储藏液成份为 50mM 磷酸钾 (pH 7.5) 和 50 ％甘油。用 DC 蛋白试剂盒 (BioRad) 测定蛋白质浓度。用 SDS-PAGE 电泳 (BioRad) 分析 MPO 纯度。100ml 隔夜细菌培养物可生成 1mg 可溶性 MPO。
     重组 MPO 酶功能测定 ： 底物选择
     我们使用前述的 Amplex 红系统检测重组 MPO， 在此处还使用了 1μgTalon 纯化的 MPO。为测量 MPO 动力学参数， 在 30℃ 30 分钟我们对 N- 甲基腐胺从 10mM 到 0.01mM 进行了 2 倍系列稀释。
     用 1mM N- 甲基腐胺， 腐胺， 1， 3- 二氨基丙烷， 尸胺， 精胺及精脒进行上述的底物特异性实验。
     N- 甲基腐胺 Km 值被确定为 100μM。重组 MPO 优选采用 N- 甲基腐胺作底物 ( 图 9)。 在 pH 为 6.5， 7.0， 7.5， 8.0， 8.5and 9.5 的范围内， 用 20mM 磷酸钾缓冲液和 0.5mM N- 甲 基腐胺确定 MPO 的最佳 pH 为 7.5。
     阳离子电喷雾离子阱质谱法 (ESI-MS) 分析 MPO 反应产物
     用质谱 (MS) 和气相色谱法 - 质谱 (GC-MS) 方法确定重组 MPO 氧化 N- 甲基腐胺形 成的催化产物。
     在容积为 50μl 的反应中， 1μg 纯化 MPO， 2mM N- 甲基腐胺和 20mM 磷酸钾缓冲液 (pH 7.5) 在 30℃孵育 1 小时， 而后进行质谱分析以确定产物成份。亦使用蛋百储藏液代替 MPO 溶液作为对照反应。利用配有充气式电喷雾离子源 (Z-spray， Micromass) 的串联四极 体质谱仪 (Quattro LC， Micromass， UK) 通过电喷雾离子阱质谱法 (ESI-MS) 进行 MS 分析。 利用流速为 20μL/ 分钟的二元溶剂泵和自动进样器 (1100 系列， HewlettPackard) 通过流 动注射加入样本。载体溶剂由 50 ∶ 50v/v 甲醇 / 水组成， 含有 0.1％蚁酸。
     反应产物在 m/z 84Da 产生峰形， 相应于预期的 N- 甲基吡咯啉离子的大小 ( 图 10)。
     GC-MS(ESI-MS) 分析 MPO 反应产物
     按 Hashimoto et al.， (Plant Physiol.93 ： 216-221(1990)) 描述的进行氰化物捕 集 N- 甲基吡咯啉阳离子和 GC-MS 分析。N- 甲基吡咯啉离子与 KCN 反应产生 1- 甲基 -2- 氰 吡咯烷， GC-MS 可以分离和分析后者。简单地， MPO 反应混合物与 10μl 10％ KCN 溶剂混 合， 在室温孵育 30 分钟， 加入 100μl 氯仿。涡激振动后， GC-MS 分析氯仿液相。用 KCN 处 理真正的 N- 甲基吡咯啉阳离子， 产生 1- 甲基 -2- 氰吡咯烷作为参照化合物。用 Agilent 5973 质谱选择性检测仪进行 GC-MS 分析， 该检测仪与配备有 30-m X 0.25-mmDB5MS 色谱柱 且膜厚度为 0.25μm(J&W Scientific) 的 Agilent 6890N 气相色谱仪偶联。由 G1701DA MSD ChemStation 软件控制该系统。色谱分析条件包括色谱柱分流进样 (20 ∶ 1)， 氦流速 为 0.4ml/ 分钟， 初始温度为 70℃ 1 分钟， 随后温度以 10℃ / 分钟速度升高至 300℃。质谱 选择性检测仪在标准电子轰击条件 (70eV) 下运行， 有效扫描范围为 40 至 700m/z， 速度为 2.26 扫描 / 秒。
     GC-MS 分析显示氰化物捕集 N- 甲基吡咯啉离子产生的 1- 甲基 -2- 氰吡咯烷参 照物在 6.1 分钟及 m/z 109 产生峰形。MPO 反应混合物亦产生具有相同保留时间 (6.1 分钟 ) 和质谱的峰形。每一峰形的质谱亦有与 Hashimoto et al.， Plant Physiol.93 ： 216-221(1990) 报道的 N- 甲基吡咯啉离子的质谱相对映的具有相同诊断性意义的离子。 该 产物的检测核实重组 MPO 催化 N- 甲基腐胺氧化形成 N- 甲基吡咯啉离子。
     例 6.MPO 超表达建构物对植物的稳定转染
     用 MPO 超 表 达 建 构 物 对 本 塞 姆 氏 烟 草 进 行 转 染。 设 计 引 物 5’ -ATGGCCACTACTAAACAGAAAG-3’和 5’ -TAGTTTAGCGGCCGCTCAAAGCTTGGCCAGCAAGCT-3’以 放 大 MPOORF。 利 用 一 链 cDNA 为 模 版， 用 Pfu(Stratagene) 放 大 cDNA 克 隆， PCR 条 件 为 95℃ 30 秒， 58℃ 30 秒 72℃ 2.5 分钟， 循环 35 次。产物与 Taq 聚合酶在 72℃孵育 15 分钟 加入附加的 “A” 碱基。将生成的 PCR 产物克隆至 pCR8/GW/TOPO 载体 (Invitrogen) 以生 成 Gateway 入门克隆， 其与目的载体 pK7GWG2 通过 Gateway LR 克隆酶 (Invitrogen) 重组生成表达克隆 pK7GWG2-MPO。将该克隆经电穿孔导入根癌农杆菌 (C58)， 并用叶碟法转 染植物 (Draper et al， 1988)。转基因植物在含卡那霉素的选择性琼脂培养基再生， 并用 PCR 分析核实转基因状态， PCR 分析所用引物被涉及用来放大 MPO 转基因和启动子融合区域 (5’ -ACTCCTCCCGTAAAATTTGTGA-3’ 及 5’ -GCGGCCGCACTAGTGATATC-3’ )( 图 12)。在土壤生 长 T1 种子， 用前述的离子对 -HPLC 法检测叶子中烟碱水平。在含有 3 个叶碟 ( ～ 50mg FW) 的样品而不是基于鲜重检测烟碱。
     筛选含 MPO 超表达建构物的转基因植物以识别 MPO 转录体和酶含量高的植物， 以 识别 MPO 的活性。使用 Northern 杂交， RT-PCR 或实时 qRT-PCR 等方法确定转染植物 MPO 转 录体的含量。利用 MPO 蛋白特异性抗体通过 Western 印迹法检测 MPO 酶含量， 或使用其它 定量蛋白质的方法， 包括蛋白质组学分析， 检测 MPO 酶含量。 以 N- 甲基腐胺为底物测定 MPO 超表达植物中 MPO 酶活性含量的生物化学方法亦可用来确定含 MPO 转基因的植物是否生产 更高含量的 MPO 蛋白质。与野生植物或只转染载体建构物的对照植物相比， MPO 转录体， 蛋 白和酶活性较高的植物有助于增加生物碱的种类。27102083987 A CN 102083995序列表1/4 页表 1. 本塞姆氏烟草根部消减 EST 数据集中的铜胺氧化酶1BLASTX 与 NCBI 非冗赘 (nr) 数据库比较 序列表序列 1(SEQ ID No ： 1) MPO 多聚核苷酸 GAAAACAAACGTACACACACAGTCAAGAAACTATATACTGACAGACATAGTTTGAAGGGACGC TAAAAGTGATTTAAGTTATAATCACAGTATATGTCAGTAGCCTCTAATAATCACTGTTGGGGT TCTCATCACAGATTTCTTCCTAGCTAACCAGTAGTCTCAATGGCCACTACTAAACAGAAAGTG ACGGCACCTTCTCCTTCTCCTTCTCCTTCTTCTTCGACTGCTTCTTGCTGTCCTTCCACTTCC ATCCTCCGTCGTGAGGCGACAGCGGCCATTTCAGTCGTGGGTGACGGACTGCAGAATTGGACG TCCAACATCCCCTCCGTCGATGATAAACAGAAAAAGACGGCCTCATCAGCTCTAGCATCATTG28102083987 A CN 102083995序列表2/4 页CCAACCACTGAACCTCTTTCCTCAAATACCTCTACCAAAGGTATCCAAATCATGACAAGGGCT CAGACCTGCCATCCTTTGGACCCTTTATCTGCTGCTGAGATCTCAGTGGCTGTGGCAACTGTT AGAGCTGCCGGTGAAACACCTGAGGTCAGAGATGGGATGCGATTTATTGAGGTGGTTCTGGTA GAACCAGATAAAAGTGTAGTTGCACTGGCAGATGCATATTTCTTCCCACCTTTTCAGTCATCA TTGATGCCGAGAACCAAAGGAGGATCTCATATTCCTACTAAGCTTCCACCAAGGAGAGCTAGG CTTATTGTTTACAATAAGAAAACAAATGAGACAAGCATATGGATTGTTGAGCTAACTGAAGTA CATGCTGCTGCTCGAGGTGGACATCACAGAGGAAAAGTCATCTCATCCAATGTTGTCCCTGAT GTTCAGCCACCCATAGATGCTCAAGAGTATGCTGAATGTGAAGCTGTGGTGAAAAGTTATCCT CCCTTTCGAGACGCAATGAGGAGAAGGGGTATTGATGACTTGGATCTTGTGATGGTTGACCCT TGGTGTGTTGGTTATCATAGTGAGGCTGATGCTCCTAGCCGCAGGCTCGCGAAACCACTTGTA TTCTGCAGGACAGAGAGTGACTGCCCAATGGAAAATGGATATGCAAGACCAGTTGAAGGAATA TATGTGCTTGTTGATGTACAAAACATGAAGATTATAGAATTTGAAGACCGAAAACTTGTACCG TTACCTCCAGTTGATCCACTGAGGAACTACACTGCTGCTGAGACAAGAGGAGGGGTTGATCGA AGTGATGTGAAACCTCTACATATTATTCAGCCCGAGGGTCCAAGCTTTCGTATCAGTGGAAAC TACGTAGAGTGGCAGAAGTGGAATTTTCGGATTGGTTTCACCCCTAGAGAGGGTTTAGTCATA CACTCTGTGGCGTATCTTGATGGTAGCAGAGGTCGTAGACCAATAGCACATAGGTTGAGTTTT 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ATTTTTGGAATCACACATGTTCCTCGGTTGGAAGACTGGCCTGTTATGCCAGTCGAACACATT GGTTTTGTGCTACAGCCACATGGATTCTTTAACTGCTCCCCGGCTGTTGATGTCCCTCCGCCC TTTGCTTGCGACTCAGAGAGCACAGACAGTGATGTTACTGAAACTAGTGTAGCAAAGTCCACT GCCACTAGCTTGCTGGCCAAGCTTTGAATGATTATGTTATCCTAACATGAGTCCTCCTCGATC GCCTATTTACCTACGGATACCAAACTTCCATTTTCTTTTGATAGAGTATTGAATTAGTTGGTG CAGGAACATTGTTTTGATTGGTCTCATATATGGCACGTTTAAGCAAAGCAAGTCCCTTTGTGT ATTGATCTTGAATTAAGCATGTTATAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA29102083987 A CN 102083995序列表3/4 页序列 2(SEQ ID No ： 2) 全长 MPO 多聚核苷酸开放读码区 (ORF) ATGGCCACTACTAAACAGAAAGTGACGGCACCTTCTCCTTCTCCTTCTCCTTCTTCTTCGACT GCTTCTTGCTGTCCTTCCACTTCCATCCTCCGTCGTGAGGCGACAGCGGCCATTTCAGTCGTG GGTGACGGACTGCAGAATTGGACGTCCAACATCCCCTCCGTCGATGATAAACAGAAAAAGACG GCCTCATCAGCTCTAGCATCATTGCCAACCACTGAACCTCTTTCCTCAAATACCTCTACCAAA GGTATCCAAATCATGACAAGGGCTCAGACCTGCCATCCTTTGGACCCTTTATCTGCTGCTGAG ATCTCAGTGGCTGTGGCAACTGTTAGAGCTGCCGGTGAAACACCTGAGGTCAGAGATGGGATG CGATTTATTGAGGTGGTTCTGGTAGAACCAGATAAAAGTGTAGTTGCACTGGCAGATGCATAT TTCTTCCCACCTTTTCAGTCATCATTGATGCCGAGAACCAAAGGAGGATCTCATATTCCTACT AAGCTTCCACCAAGGAGAGCTAGGCTTATTGTTTACAATAAGAAAACAAATGAGACAAGCATA TGGATTGTTGAGCTAACTGAAGTACATGCTGCTGCTCGAGGTGGACATCACAGAGGAAAAGTC ATCTCATCCAATGTTGTCCCTGATGTTCAGCCACCCATAGATGCTCAAGAGTATGCTGAATGT GAAGCTGTGGTGAAAAGTTATCCTCCCTTTCGAGACGCAATGAGGAGAAGGGGTATTGATGAC TTGGATCTTGTGATGGTTGACCCTTGGTGTGTTGGTTATCATAGTGAGGCTGATGCTCCTAGC CGCAGGCTCGCGAAACCACTTGTATTCTGCAGGACAGAGAGTGACTGCCCAATGGAAAATGGA TATGCAAGACCAGTTGAAGGAATATATGTGCTTGTTGATGTACAAAACATGAAGATTATAGAA TTTGAAGACCGAAAACTTGTACCGTTACCTCCAGTTGATCCACTGAGGAACTACACTGCTGCT GAGACAAGAGGAGGGGTTGATCGAAGTGATGTGAAACCTCTACATATTATTCAGCCCGAGGGT CCAAGCTTTCGTATCAGTGGAAACTACGTAGAGTGGCAGAAGTGGAATTTTCGGATTGGTTTC ACCCCTAGAGAGGGTTTAGTCATACACTCTGTGGCGTATCTTGATGGTAGCAGAGGTCGTAGA CCAATAGCACATAGGTTGAGTTTTGTAGAGATGGTTGTCCCTTATGGGGATCCAAATGATCCA CATTATAGGAAGAATGCATTTGATGCAGGAGAAGATGGCCTTGGAAAGAATGCTCATTCACTG AAGAGGGGGTGTGATTGTTTGGGGTACATTAAGTACTTTGATGCCCATTTCACAAATTTTACG 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GAAACTAGTGTAGCAAAGTCCACTGCCACTAGCTTGCTGGCCAAGCTT 序列 3(SEQ ID No ： 3) MPO 多肽 MATTKQKVTAPSPSPSPSSSTASCCPSTSILRREATAAISVVGDGLQNWTSNIPSVDDKQKKT ASSALASLPTTEPLSSNTSTKGIQIMTRAQTCHPLDPLSAAEISVAVATVRAAGETPEVRDGM RFIEVVLVEPDKSVVALADAYFFPPFQSSLMPRTKGGSHIPTKLPPRRARLIVYNKKTNETSI WIVELTEVHAAARGGHHRGKVISSNVVPDVQPPIDAQEYAECEAVVKSYPPFRDAMRRRGIDD LDLVMVDPWCVGYHSEADAPSRRLAKPLVFCRTESDCPMENGYARPVEGIYVLVDVQNMKIIE FEDRKLVPLPPVDPLRNYTAAETRGGVDRSDVKPLHIIQPEGPSFRISGNYVEWQKWNFRIGF TPREGLVIHSVAYLDGSRGRRPIAHRLSFVEMVVPYGDPNDPHYRKNAFDAGEDGLGKNAHSL KRGCDCLGYIKYFDAHFTNFTGGVETTENCVCLHEEDHGMLWKHQDWRTGLAEVRRSRRLTVS FVCTVANYEYAFYWHFYQDGKIEAEVKLTGILSLGALQPGEYRKYGTTILPGLYAPVHQHFFV ARMNMAVDCKPGEAHNQVVEVNVKVEEPGKENVHNNAFYAEETLLSSELQAMRDCDPFSARHW IVRNTRTVNRTGQLTGYKLVPGPNCLPLAGPEAKFLRRAAFLKHNLWVTQYAPGEDFPGGEFP NQNPRVGEGLASWVKQDRPLEESDIVLWYIFGITHVPRLEDWPVMPVEHIGFVLQPHGFFNCS PAVDVPPPFACDSESTDSDVTETSVAKSTATSLLAKL