猪MHCⅡTA基因作为免疫相关分子标记的鉴定与应用.pdf

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与猪免疫性状相关的分子标记制备与应用。所述的分子标记以猪MHCIITA基因mRNA序列为模板设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列中发现了9个单链核苷酸多态位点(SNP)，并开发了PCR-PvuII-RFLP方法检测其位于第188bp处的分子标记即碱基突变C188-T188。本发明公开了扩增的猪MHCIITA基因部分编码区和非翻译区的序列以及PCR扩增所用的引物和用于分子标记的检测方法。

1、  一种与猪免疫性状相关的分子标记，它是序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，在序列表SEQ ID NO：2的第188bp处有1个C188-T188的碱基突变，导致PvuII-RFLP多态性。

2、  检测权利要求1所述分子标记的正、反向引物对的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5′-GTTCTCTGAGGACGCTGA-3′，反向引物：5′-TTTTGAAGACTGAATAAGCC-3′；
正向引物：5′-GTTCTCTGAGGACGCTGA-3′，反向引物：5′-CCGTAAGGTCTGGCGTGTCT-3′。

3、  一种制备猪免疫性状相关的分子标记的方法，其特征在于按照以下步骤：
以猪MHCIITA基因mRNA序列为模板设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化、测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，应用PCR-PvuII-RFLP方法检测猪MHCIITA基因的多态性。

4、  权利要求1所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。

5、  权利要求2所述的引物在猪标记辅助选择中的应用。

猪MHCIITA基因作为免疫相关分子标记的鉴定与应用
技术领域
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪MHCIITA基因作为免疫相关分子标记的鉴定与应用。
背景技术
猪肉是我国居民最主要的动物蛋白质食物来源，家猪在畜牧业中占有举足轻重的地位。数十年来，家猪遗传改良成效显著，但主要针对的是生产性状，即生长性状与繁殖性状等。相对于生产性状，针对猪的健康及抵抗疾病能力的研究却较为薄弱。以高瘦肉型猪为目标的近现代育种使相关等位基因丢失或频率降低面导致现代商业品种的体质和抗病能力急剧下降。随着集约化饲养方式的普及，猪病特别是一些呼吸系统与繁殖系统的传染病给养猪生产带来了巨大的经济损失，疾病已成为现代养猪业的最大威胁之一，严重制约的中国养猪业的健康发展。可喜的是，越来越多的畜牧工作者开始意识到提高猪群健康以维持稳定生产的重要性。
面对目前养猪生产中生产性状的提高和抗病性下降的矛盾，仅仅依靠药物和疫苗既加大了养猪成本，又给食品安全带来了隐患，因此，这需要我们寻找更加有效的方法来提高猪群的抗病能力和健康水平。在对家畜的长期观察中人们发现，并非所有感染病原微生物的动物都发病，而且已有研究表明部分猪对引起仔猪腹泻的肠毒性大肠杆菌K88具有天然抗性，而这些猪对疾病的抵抗是受遗传控制的。由此可知动物传染性疾病的发生与动物本身的遗传背景是密切相关的。从长远角度来看，采用遗传学方法来提高猪群健康水平和抗病能力是治本的策略，而筛选与鉴定猪免疫力相关基因与分子标记是这项工作的基础和关键。因此，寻求免疫抗病基因进行育种，提高猪群先天抗病能力是当前发展猪育种工作的大势所趋。MHCIITA基因就是一个与机体抗病和免疫力密切相关的关键基因。
MHCIITA(MHC class II transactivator)是调节主要组织相容性复合体II类分子(MHCII)的分子开关。主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)是与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群。猪的MHC(命名为SLA)位于猪的7号染色体上，有I和II两种类型。MHC II类分子在体内主要发挥抗原递呈作用，在诱发获得性免疫反应中起核心作用，MHCII类分子的异常表达通常会引起严重的免疫缺陷疾病，如淋巴细胞综合征(BLS)等。与MHC II类分子相一致，仅抗原递呈细胞可以组成性表达MHCIITA，但是其它各种细胞可以诱导表达MHCIITA。
MHCIITA在与MHCII类分子有关的免疫反应中发挥重要作用。有研究表明病原体逃脱免疫系统的途径涉及到对MHCIITA表达的调节。比如巨细胞病毒通过改变IFN-γ信号转导途径而下调MHCIITA的表达，这样降低了MHCII类的免疫刺激作用。小鼠巨噬细胞受到牛分枝杆菌BCG感染时，其基因产物可抑制IFN-γ介导的STAT-1的磷酸化，导致MHCIITA和MHCII类分子的表达降低。衣原体通过使上游刺激因子1变性而干扰了MHCIITA基因的转录。因此，MHCIITA基因在机体抵抗各种病原的过程中发挥重要作用。
目前为止，关于猪MHCIITA基因的研究很少，且没有关于其遗传多态性的相关研究报道。因此，介于MHCIITA在机体抗病免疫反应中发挥的重要作用，申请人选择了该基因并对其进行了相关研究和免疫性状关联分析。中请人通过克隆MHCIITA的部分序列，并利用软件对测序结果进行分析，在该基因3′UTR区鉴定出9个SNP位点。选取了其中位于第188bp的C188-T188碱基突变位点，对其做了与免疫性状的关联分析，同时，进一步检测了该突变在国内外6个猪血缘中的遗传多样性；从而，成功地鉴定出了一个新的与猪免疫力相关的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克隆一种猪MHCIITA基因作为免疫相关分子标记，并将其应用于猪分子标记辅助育种，以期获得较高的社会和经济效益。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人克隆得到一种与猪免疫力相关的分子标记，它是序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO：2的第188bp处发现1个C188-T188的碱基突变，导致PvuII-RFLP多态性。
其中，克隆猪MHCIITA基因的编码区(CDS)引物对的和核苷酸序列如下：
正向引物：5′-TGGTGACTGGCACTTTCCT-3′，反向引物：5′-TGAGCATTGGGTGGGG-3′。
克隆猪MHCIITA基因的3′非翻译区(3′UTR)引物对的核苷酸序列如下：
正向引物：5′-GTTCTCTGAGGACGCTGA-3′，反向引物：5′-TTTTGAAGACTGAATAAGCC-3′。
PCR-PvuII-RFLP检测SEQ ID NO：2所述的分子标记(即检测碱基突变)所用的引物对的核苷酸序列如下：
正向引物：5′-GTTCTCTGAGGACGCTGA-3′，反向引物：5′-CCGTAAGGTCTGGCGTGTCT-3′。
申请人建立了一种制备和检测与猪免疫力相关的分子标记的方法，其步骤如下：
以猪MHCIITA基因mRNA序列为模板设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化并克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，应用PCR-PvuII-RFLP方法检测猪MHCIITA基因的多态性。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
图1：是本发明的技术流程图。
图2：是本发明中猪MHCIITA基因编码区(CDS)部分序列扩增的电泳图谱，片段大小为455bp(琼脂糖胶浓度为2％)。图中：Marker泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
图3：本发明克隆测序获得的猪MHCIITA基因部分CDS序列(即序列表SEQ ID NO：1所示的信息)。
图4：是本发明中猪MHCIITA基因3′UTR部分序列扩增的电泳图谱，片段大小为719bp(琼脂糖胶浓度为2％)。图中：Marker泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
图5：本发明克隆测序获得的不同猪种(分别属于中国地方猪和国外猪种)的MHCIITA基因3′UTR部分序列。其中图5A、图5B、图5C、图5D依次为长白猪(国外猪中)、二花脸(中国地方猪)、大白猪(国外猪种)和清平猪(中国地方猪)的序列(分别对应于序列表SEQ ID NO：2-5所示的序列)。
图6：是猪MHCIITA基因测序后发现的9个突变位点，以图5A测得序列为参考序列(在序列表中编号为SEQ ID NO：2)，从左到右依次是：A33-G33、A62-T62、C188-T188、G271-A271、A543-G543、G565-T565、A581-C581、C587-T587和A632-G632。
图7：A是本发明中用于检测猪MHCIITA基因C188-T188多态位点扩增的电泳图谱，片段大小为589bp(琼脂糖胶浓度为2％)。图中：Marker泳道为DNA分子量标准(DL2000)。B是本发明中猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP的三种基因型(CC、CT和TT)电泳图谱。C是本发明中猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP的一个家族(亲本与子代)基因型(CC、CT和TT)的电泳图谱。
具体实施方式
实施例1：
一、MHCIITA基因CDS区的克隆
1.引物设计
利用引物设计软件Primer 5.0，以NCBI上猪的MHCIITA基因mRNA序列(Genebank登录号AY084053.1)为模版设计扩增引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，合成的引物对的核苷酸序列如下：
正向引物：5′-TGGTGACTGGCACTTTCCT-3′，
反向引物：5′-TGAGCATTGGGTGGGG-3′。
2.PCR产物的纯化和测序
(1)PCR扩增
PCR反应总体积为10μL，其中模板DNA为50ng，含10×buffer(含Mg2+，Takara)，dNTP终浓度为75μmol/L，引物终浓度为0.3μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(Takara)，不足部分以双蒸水补足。
PCR扩增程序是：95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照(见图2)。
(2)PCR产物的纯化及测序：
利用北京博大泰克生物基因技术公司生产的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行纯化回收，具体方法参考该试剂盒的操作说明书，步骤如下：收集足够的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，胶块要尽量小；按100μl胶块加700μl溶胶液的比例，在75℃的烘箱中使凝胶完全溶解；在溶解后装入3S柱，12000rpm离心1分钟，去掉废液；500μl漂洗液漂洗，12000rpm离心30秒钟，重复漂洗一次。倒掉废液后，再于12000rpm离心1分钟；在3S柱中加入30μl的洗脱缓冲液(上述试剂盒自带)12000rmp离心1分钟洗脱。纯化回收的目的片段就在洗脱所得的液体中，将部分产物送北京奥科生物公司直接测序。
(3)DNA序列同源性检索鉴定
通过NCBI-BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的参考序列进行比对，结果显示成功克隆得到猪MHCIITA基因CDS的部分片段(见图3)。
二、MHCIITA基因SNP扫描
1.引物设计
利用引物设计软件Primer5.0，以猪的MHCIITA基因mRNA(Genebank登录号AY084053.1)为模版设计出用于多态位点扫描的PCR扩增引物对。引物由北京奥科生物技术公司合成，所述引物对的核苷酸序列如下：
正向引物：5′-GTTCTCTGAGGACGCTGA-3′，
反向引物：5′-TTTTGAAGACTGAATAAGCC-3′。
2.PCR产物的纯化和测序
(1)PCR扩增
PCR扩增4个猪种DNA，分别是梅山猪和清平猪(中国地方猪血缘)，大白猪和长白猪(国外猪种血缘，下同)。
10uL的反应体系中加入DNA模板0.5μL，双蒸水4.1μL，Mix(buffer、dNTP与Taq酶混合物)5ul，10mM引物前后各0.2μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、54.5℃退火40s、72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min。
PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到了719bp特异性扩增片段(见图4)，用于回收测序。
(2)PCR产物的纯化及测序：
利用北京博大泰克生物基因技术公司生产的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行纯化回收，具体方法参考该试剂盒的操作说明书，步骤如下：收集足够的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，胶块要尽量小；按100μl胶块加700μl溶胶液的比例，在75℃的烘箱中使凝胶完全溶解；在溶解后装入3S柱，12000rpm离心1分钟，去掉废液；500μl漂洗液漂洗，12000rpm离心30秒钟，重复漂洗一次。倒掉废液后，再于12000rpm离心1分钟；在3S柱中加入30μl的洗脱缓冲液(该试剂盒自带)12000rmp离心1分钟洗脱。纯化回收的目的片段就在洗脱所得的液体中；将部分产物送北京奥科生物公司直接测序。
(3)DNA序列中突变位点的确定
通过NCBI-BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的参考序列进行比对，结果显示4个品种中的克隆测序均获得成功(见图5)。
将4个品种猪的测序峰图导入SeqMan软件进行比对分析，结果显示测序质量很高，在猪MHCIITA基因3′UTR有9个位点出现明显的双峰，这说明该基因在这9个位点处发生了碱基突变(见图6)。这9个位点分别是：在序列表SEQ ID NO：2的第33bp处有1个A33-G33的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第62bp处有1个A62-T62的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第188bp处有1个C188-T188的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第271bp处有1个G271-A271的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第543bp处有1个A543-G543的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第565bp处有1个G565-T565的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第581bp处有1个A581-C581的碱基突变；在序列表SEQ ID NO：2的第587bp处有1个C587-T587的碱基突变；在序列表SFQ ID NO：2的第632bp处有1个A632-G632的碱基突变。其中，在序列表SEQ ID NO：2的第188bp处C188-T188的碱基突变导致PCR-PvuII-RFLP多态性。
三、PCR-RFLP基因型检测方法的建立
1.引物设计
根据克隆测序的结果，申请人在MHCIITA基因第188bp处的序列附近，利用Primer 5.0软件设计扩增该多态位点的引物，其DNA序列如下：
正向引物：5’-GTTCTCTGAGGACGCTGA-3′，
反向引物：5′-CCGTAAGGTCTGGCGTGTCT-3′。
2.PCR扩增
10uL的反应体系中加入DNA模板0.5μL，双蒸水4.1μL，Mix(buffer、dNTP与Taq酶混合物)5ul，10mM引物前后各0.2μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min。2μLPCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品用于下一步酶切检测，结果见图7-A。
3.PCR-PvuII-RFLP检测分子标记C188-T188
将PCR产物5μL，限制性内切酶PvuII为0.25μL(2U)，加双蒸水补至10μL，把样品混匀后离心，37℃培养箱放置10h，然后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并在紫外灯下拍照，记录基因型，结果见图7-B。同时，申请人还做了一个家族基因型判别图谱，其目的是为了进一步验证实验结果的可靠性，结果见图7-C，基因型检测结果符合孟德尔遗传定律。
分子标记基因型分析：如图7-B所示，三种基因型中：CC型为未发生酶切的纯合型个体(电泳检测时有501bp和88bp两条DNA带)，TT型为DNA双链全部发生酶切的纯合型个体(电泳检测时出现227bp、224bp和88bp三条DNA带)，CT为只有一条DNA链被PvuII酶切开的杂合型个体(电泳检测时出现501bp、227bp、224bp和88bp四条DNA带)。
实施例2：
检测猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性在不同品种中的分布
(一)PCR-PvuII-RFLP检测
利用PCR-PvuII-RFLP检测了6个品种猪的DNA样，其中有3个中国地方猪种血缘，分别是二花脸猪、大花白和藏猪；3个国外猪血缘分别是长白猪、大白猪和杜洛克猪。
(二)检测结果分析
突变C188-T188在不同猪种中的基因型个体数和等位基因频率如表1所示。结果显示在中国地方猪中等位基因C占优势，即在3′UTR区188位主要以碱基C的形式存在；仅在藏猪中出现CT基因型个体，其余全部为CC型。在国外猪中等位基因C亦是占优势，但T的出现频率明显高于国内地方猪种；三种基因型在国外猪血缘中均能检测到，而且在长白猪和杜洛克中，等位基因T的频率很高。卡方检验表明MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性在不同猪种中的分布存在差异，且达到极显著水平。六个猪种的两两卡方检验的结果如表2所示。
表1.不同品种猪MHCIITA 3’UTR区188位(C188T)等位基因与基因型频率


表2.不同品种猪MHCIITA 3′UTR区188位(C188T)基因型分布的卡方检验

实施例3：
本发明克隆的猪MHCIITA分子标记在免疫性状关联分析中的应用
(一)构建家系及基因型扫描
用于关联分析的免疫性状资源家系是由华中农业大学和广东省华农温氏畜牧股份有限公司联合组建的纯种长白猪群体(外来猪血缘)，亲本为17头长白猪公猪和36头长白猪母猪，F1代长白仔猪共302头。F1代在0、17、32日龄分别采集抗凝血和非抗凝血样本，采用常规方法对3种病毒抗体水平(猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬病毒抗体水平)和18项血常规进行测定。
根据免疫性状资源家系的群体结构及其影响因素，申请人运用混合线性模型来分析猪MHCIITA基因的不同基因型对测定的免疫指标的影响，采用SAS(Version 8.1)软件中Mixed Models程序进行数据处理与统计分析，模型如下：
Y_ijklmn＝μ+Genotype_i+Sex_j+Parity_k+Environment_l+Sire_m+Dam_n(Sire_m)+ε_ijklmn
其中Y表示上述免疫指标；μ表示每个性状的均值；Genotype表示基因型效应，(i＝3：1个突变产生3种基因型)，sex表示性别(j＝2)，parity表示胎次(k＝2:)，environment表示环境效应(l＝2)，这些都是固定效应；sire表示公畜效应(m＝17)，dam表示母畜效应(n＝36)，这些是随机效应：ε表示随机残差。
(二)猪MHCIITA基因分子标记C188-T188与免疫性状的关联分析
分子标记C188-T188(即猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性)
应用PCR-PvuII-RFLP检测猪MHCIITA基因分子标记C188-T188基因型并进行关联分析，结果表明：在检测猪群体中，CC基因型个体有147个，CT基因型个体有165个，TT基因型个体有32个。该标记对猪的0日龄平均红细胞体积、平均HGB量和32日龄的猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)抗体水平影响显著。
具体结果描述如下：
表3：猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性与0日龄免疫性状的关联分析结果

^*表示差异显著，P＜0.05；^**表示差异极显著P＜0.01。
由表3可知，猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性与0日龄平均红细胞体积显著关联(p＝0.0231＜0.05)，与0日龄平均HGB量呈极显著关联(p＝0.0006＜0.01)，此位点对该日龄的其它免疫性状没有显著影响。
表4：猪MHCIITA基因PvuII-RFLP不同基因型仔猪0日龄红细胞平均体积的最小二乘均值

由表4可知，CC基因型仔猪的RBC平均体积极显著高于CT基因型(p＜0.05)，也高于TT基因型。红细胞平均体积是判断贫血的重要免疫指标，红细胞平均体积长期处于异常状态会引起严重的血液及相关疾病。本实施例中三种基因型个体的红细胞平均体积均符合正常值范围内，无法区分何种等位基因为有利基因。对于平均血红蛋白(HGB)量而言，CC型个体最高，CT型最低；CC型表型值极显著高于CT型个体(p＜0.01)，从而说明CC型个体的肺部结合氧气并将其运送到全身各组织，以及将组织中的二氧化碳送到肺部的能力比其它基因型个体强，同时也说明CC基因型个体具有更好的健康状况。因此，携带基因C的个体具有更好的健康状况和生活力，等位基因C为有利基因。
利用本发明建立的方法，对17日龄仔猪的MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性进行了检测分析，其结果如表5所示：
表5：猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性与17日龄免疫性状的关联分析结果

^*表示差异显著，P＜0.05：^**表示差异极显著P＜0.01。
由表5可知，猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性对仔猪17日龄所测免疫性状都没有显著影响。
利用本发明建立的方法，对32日龄仔猪的MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性进行了检测分析，其结果如表6、表7所示：
表6：猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性与32日龄免疫性状的关联分析结果

^*表示差异显著，P＜0.05；^**表示差异极显著P＜0.01。
由表6可知，猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP多态性与32日龄的猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)抗体水平呈显著关联(p＝0.0426＜0.05)，与所测其它免疫性状没有显著关联。
表7：猪MHCIITA基因PCR-PvuII-RFLP不同基因型仔猪32日龄血红蛋白含量的最小二乘均值

由表7可知，TT基因型个体的32日龄的猪繁殖与呼吸综合症病毒(蓝耳病病毒)抗体水平为0.7442±0.1420，显著高于CT基因型0.5544±0.1189(p＜0.05)，同时也高于CC基因型0.6710±0.1201。这说明TT基因型个体更有利于机体产生高水平的抗体和抵抗疾病，从而在后天免疫中发挥重要作用。
序列表
<110>华中农业大学
<120>猪MHCIITA基因作为免疫相关分子标记的鉴定与应用
<130>
<141>2009-06-11
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>410
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>mRNA
<222>(1)..(410)
<223>
<400>1
ttggtgactg cactttcctg gtggggccag tgagcgactc ctcagctcga ccctgcccat   60
cacctcctgc tctgttcaac aaggaatcaa cacccagcca ggcccagctg gaggacgctg   120
tcccaatgcc ggcgccccct tcaggttcct tgttgagctg cctgagtgtc cctgctggac   180
tatccagat  catccccacg ctctccaccc tgccccaggg gctctggcac atctcagggg   240
ccgggacagg ggtctccagt atactcatct accaaggtga gatgacccag gccagccaag   300
caccccctgt ccatagcctc ccaaagtccc cagaccggcc tggctccacc agtcccttcg   360
ccccgtcagc agctgacctc cccagcatgc ctgaaccagc cctgacctcc              410
<210>2
<211>670
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>3’UTR
<222>(1)..(670)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(188)..(188)
<223>
<400>2
atcatctgtg gacacagctc ttcttaggct gtatcccgtg agctttggcg atctggtgcc    60
ctgccctggt ggctcagagt cagcccccac tctgctgggg aaaggaccca cggcctgctc    120
tgtggacaga ccccaggccc ggccccaggc tccttcgggg cccagactga tgtcagcctt    180
gctcagctgc tgcagtcctg gcagacaggc gggcacccag tggcagctag ggtccacccg    240
ggagccctga agcactccct gcaggacact gcagacagtg gtggccaggt cagagtgagg    300
gatgtggcgg ccacatcacc tgcccaggtc ctgctggccg ggggagaaag cacctctcca    360
cactgctccc ctggtggggt aagcttggcg ctcagaagat accagccagc accccccagc    420
gtgttgattt cccaaacggt gaccgacggg gtgtccacgg cagctgccct ctgcctccgg    480
cacctgcggg tttgcactca ctttgtttgc cgaggccaaa gctgggcctg gccagacacg    540
ccagacctta gcgggggaag agccgacagt acactacggg ccgaggtggg gtggcgaggg    600
tctggaacca catccgcctt cttgccctca catcctgtgt ctttttttca ctacattata    660
catggttatc                                                           670
<210>3
<211>682
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>3’UTR
<222>(1)..(682)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(188)..(188)
<223>
<400>3
atcatctgtg gacacagctc ttcttaggct gtatcccgtg agctttggcg atctggtgcc    60
cagccctggt ggctcagagt cagcccccac tctgctgggg aaaggaccca cggcctgctc    120
tgtggacaga ccccaggccc ggccccaggc tccttcgggg cccagactga tgtcagcctt    180
gctcagccgc tgcagtcctg gcagacaggc gggcacccag tggcagctag ggtccacccg    240
ggagccctga agcactccct gcaggacact gcagacagtg gtggccaggt cagagtgagg    300
gatgtggcgg ccacatcacc tgcccaggtc ctgctggccg ggggagaaag cacctctcca    360
cactgctccc ctggtggggt aagcttggcg ctcagaagat accagccagc accccccagc    420
gtgttgattt cccaaacggt gaccgacggg gtgtccacgg cagctgccct ctgcctccgg    480
cacctgcggg tttgcactca ctttgtttgc cgaggccaaa gctgggcctg gccagacacg    540
ccagacctta gcgggggaag agccgacagt acactacggg ccgaggcggg gtggcgaggg    600
tctggaacca catccgcctt cttgccctca cgtcctgtgt cttttttcac tacattatac    660
atggttatcg cctctgctaa aa                                             682
<210>4
<211>670
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>3’UTR
<222>(1)..(670)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(188)..(188)
<223>
<400>4
atcatctgtg gacacagctc ttcttaggct gtatcccgtg agctttggcg atctggtgcc    60
ctgccctggt ggctcagagt cagcccccac tctgctgggg aaaggaccca cggcctgctc    120
tgtggacaga ccccaggccc ggccccaggc tccttcgggg cccagactga tgtcagcctt    180
gctcagccgc tgcagtcctg gcagacaggc gggcacccag tggcagctag ggtccacccg    240
ggagccctga agcactccct gcaggacact gcagacagtg gtggccaggt cagagtgagg    300
gatgtggcgg ccacatcacc tgcccaggtc ctgctggccg ggggagaaag cacctctcca    360
cactgctccc ctggtggggt aagcttggcg ctcagaagat accagccagc accccccagc    420
gtgttgattt cccaaacggt gaccgacggg gtgtccacgg cagctgccct ctgcctccgg    480
cacctgcggg tttgcactca ctttgtttgc cgaggccaaa gctgggcctg gccagacacg    540
ccagacctta gcgggggaag agccgacagt acactacggg ccgaggtggg gtggcgaggg    600
tctggaacca catccgcctt cttgccctca catcctgtgt ctttttttca ctacattata    660
catggttatc                                                           670
<210>5
<211>687
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>3’UTR
<222>(1)..(687)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(188)..(188)
<223>
<400>5
atcatctgtg gacacagctc ttcttaggct gtatcccgtg agctttggcg atctggtgcc    60
cagccctggt ggctcagagt cagcccccac tctgctgggg aaaggaccca cggcctgctc    120
tgtggacaga ccccaggccc ggccccaggc tccttcgggg cccagactga tgtcagcctt    180
gctcagccgc tgcagtcctg gcagacaggc gggcacccag tggcagctag ggtccacccg    240
ggagccctga agcactccct gcaggacact gcagacagtg gtggccaggt cagagtgagg    300
gatgtggcgg ccacatcacc tgcccaggtc ctgctggccg ggggagaaag cacctctcca    360
cactgctccc ctggtggggt aagcttggcg ctcagaagat accagccagc accccccagc    420
gtgttgattt cccaaacggt gaccgacggg gtgtccacgg cagctgccct ctgcctccgg    480
cacctgcggg tttgcactca ctttgtttgc cgaggccaaa gctgggcctg gccagacacg    540
ccagacctta gcgggggaag agccgacagt acactacggg ccgaggtggg gtggcgaggg    600
tctggaacca catccgcctt cttgccctca cgtcctgtgt cttttttcac tacattatac    660
atggttatcg cctttcccta aaaaaaa                                        687