一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010298771.5	申请日：	2010.09.30
公开号：	CN102021192A	公开日：	2011.04.20
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/57申请日:20100930\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/57; C12N15/70; C12N9/68	主分类号：	C12N15/57
申请人：	西北大学
发明人：	边六交; 妙亮
地址：	710069 陕西省西安市太白北路229号
优先权：
专利代理机构：	西安智邦专利商标代理有限公司 61211	代理人：	商宇科
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内容摘要

一种高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle 5三聚体的高效表达方法，方法包括：1)制备Kringle 5基因的上、下游引物、pET15b质粒DNA以及感受态细胞BL21(DE3)plys；2)对Kringle 5基因进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；3)分别PCR扩增产物以及pET15b质粒进行双酶切；4)利用T4DNA连接酶对PCR扩增产物经酶切后的产物以及pET15b质粒经酶切后的产物进行酶连接，得到重组质粒pET15b/K5；5)将重组质粒pET15b/K5转化至感受态细胞BL21(DE3)plys中培养并进行保存；6)对重组质粒进行低温诱导表达。本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle 5三聚体的高效表达方法。

权利要求书

1：一种高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法包括以下步骤： 1) 制备 Kringle 5 基因的上游引物、Kringle 5 基因的下游引物、pET15b 质粒 DNA 以及感受态细胞 BL21(DE3)plys ；所述 Kringle 5 基因的上游引物含有 Nco I 酶切位点；所述 Kringle 5 基因的下游引物含有 Xho I 酶切位点； 2) 根据步骤 1) 所得到的 Kringle 5 基因的上游引物以及 Kringle 5 基因的下游引物对 Kringle 5 基因进行 PCR 扩增，获取 PCR 扩增产物； 3) 利用限制性内切酶分别对 pET15b 质粒以及步骤 2) 所得到的 PCR 扩增产物进行双酶切，分别得到 pET15b 质粒经酶切后的产物以及 PCR 扩增产物经酶切后的产物；所述限制性内切酶是 Nco I 酶以及 Xho I 酶； 4) 利用 T4DNA 连接酶对步骤 3) 中所得到的 PCR 扩增产物经酶切后的产物以及 pET15b 质粒经酶切后的产物进行酶连接，得到重组质粒 pET15b/K5 ； 5) 将步骤 4) 获取得到的重组质粒 pET15b/K5 转化至感受态细胞 BL21(DE3)plys 中培养并进行保存； 6) 对步骤 5) 中已经转化至感受态细胞 BL21(DE3)plys 中的重组质粒进行诱导表达。
2：根据权利要求 1 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 1) 中，所述 Kringle 5 基因的上游引物是 ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中 CCATGG 是 Nco I 酶切位点；所述 Kringle 5 基因的下游引物是 ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中 CTCGAG 是 Xho I 酶切位点。
3：根据权利要求 2 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 2) 中对 Kringle 5 基因进行 PCR 扩增的反应体系是：Kringle 5 基因的上游引物和 Kringle 5 基因的下游引物各 1μl，模板 1μl， Taq 酶 25μl，加无菌水至 50μl ；PCR 扩增的反应条件是：95℃ 5min 预变性；95℃ 30s 变性，55℃ 30s 退火， 72℃ 30s 延伸，30 个循环；72℃ 7min 延伸。
4：根据权利要求 3 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 3) 中利用限制性内切酶对 PCR 扩增产物进行双酶切的反应体系是：Noc I 1μl，Xho I 1μl，10×M Buffer 4μl，PCR 产物 10μl，BSA 0.4μl，加无菌水至 40μl ；酶切温度 37℃，时间 2h ；利用限制性内切酶对 pET15b 质粒进行双酶切的反应体系是：Noc I 1μl， Xho I 1μl，10×M Buffer 4μl， pET15b 20μl， BSA 0.4μl，加无菌水至 40μl ；酶切温度 37℃，时间 2h。
5：根据权利要求 4 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 4) 中对 PCR 扩增产物经酶切后的产物以及 pET15b 质粒经酶切后的产物进行酶连接的反应体系是：pET15b 质粒 10μl， Kringle 5 片段 2μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl， T4DNA Ligase 1μl，加无菌水到 20μl ；反应条件是 16℃保温过夜， -20℃保存备用。
6：根据权利要求 5 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法， 2 其特征在于：所述步骤 5) 中的具体实现方式是：将 10μL 连接产物加到 200μL 感受态细胞 BL21(DE3)plys 的悬液中，混匀，冰浴 30-40min，42℃水浴保温 90s，立即置冰上 3min，加入 790μl LB 培养基，180rpm，37℃震荡培养 60min，然后吸取 200μl 培养液转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行培养。
7：根据权利要求 6 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 6) 的具体实现方式是：选取转化后培养出的单菌落至含有 5ml 培养液的试管中，30 ℃ 200 ～ 250rpm 振荡过夜；吸取 50μl 培养物以 1 ∶ 100 接种于含 100μg/ml 氨卞的 5ml LB 培养基中，30 ℃ 220rpm 振荡 3 小时，加入诱导剂 IPTG，使其终浓度为 1mM，再于 30 ℃ 200 ～ 250rpm 振荡 4 小时；离心收集菌体，用 200μl 0.1M Tris-HCl 重悬菌体并洗涤，于 5000rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，所述 200μl 0.1M Tris-HCl 的 pH 是
8： 0。 8. 根据权利要求 1 或 2 或 3 或 4 或 5 或 6 或 7 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 1) 中感受态细胞 BL21(DE3)plys 的制备方法是：冰冷的 CaCl2 溶液的制备：0.1mol/L CaCl2 溶液，使用一次性滤器过滤除菌后， -4℃ 冰箱存储备用；0.05mol/L CaCl2 甘油溶液：30％的甘油 +0.1M CaCL2 ；使用一次性滤器过滤除菌后， -4℃冰箱保存备用；无菌条件下接种大肠杆菌 BL21 菌株单菌落入 5ml LB 液体培养基中，37 ℃培养过夜；将过夜培养 BL21 菌株单菌液倒入 250ml 的 LB 液体培养基中，37℃振荡 3.5-4.0h，当 LB 液体培养基的 OD600 值介于 0.4-0.6 时停止培养；将培养液分装到 8 个 25ml 预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置 5-10 分钟，然后 4℃，8000rmp 离心 8min ；细胞沉淀用 10ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬，4℃ 6000rmp 离心 5 分钟；弃上清后，加入 10ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4℃，6000rmp 离心 5 分钟；弃上清后，加入 2ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬细胞，按每管 200μl 量分装于预冷的 0.5ml 离心管中，立即冻存于 -75℃冰柜中备用。
9：根据权利要求 8 所述的高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特征在于：所述步骤 1) 中 pET15b 质粒 DNA 的制备方法是：质粒的放大培养：在 2ml 含有 100μg/ml 氨卞抗生素的 LB 培养基中，接入含有 pET15b 质粒的 Top10 单菌落，于 37℃，220rpm 振摇下培养过夜；吸取 1.5ml 培养物于离心管中，10000g 离心 30 秒，吸去培养液；离心柱的活化：取 750μl GPS 缓冲液加入分离柱中，静置 4min，12000g 离心 2min ；质粒的提取：在上述沉淀中加入 250μl 溶液 I，吹吸使沉淀完全分散；加入 250μl 溶液 II，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混匀溶液，静置 2min ；加入 350μl 溶液 III，盖紧管口，温和振荡 10 秒，使溶液 III 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，静置 4min ； 12000g 离心 10min，吸取上清至分离柱中 10000g 离心 1min，弃去液体，加入 500μl Buffer HB 10000g 离心 1min，弃去液体，加入 500μl DNA Wash，10000g 离心 1min，重复此步骤；换离心管，加入 40μl Elution Buffer 放置 2min，13600g 离心 2min，紫外分光光度计测含量，27.5ng/μl，A260/A280 在 1.80 以上；取 5μl 做 1％琼脂糖凝胶电泳检测， 3 剩余储存于 -20℃ ；所述溶液 I 和溶液 II 是指质粒小量提取试剂盒中标注的溶液。

说明书

一种高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法
    【技术领域】
     本发明属分子生物学领域，涉及一种血管生长抑制剂的制备方法，尤其涉及一种高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法。背景技术
     全世界每年约有 500 万人死于肿瘤。早在 20 世纪 70 年代， Folkman 就提出，肿瘤生长是血管依赖性的。血管的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段到有血管的快速生长阶段。血管的生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。血管的生成主要依赖于血管生成刺激剂和抑制剂的调节，内源性的血管生成刺激剂的下调和血管生成抑制剂的上调，引起血管生成平衡失调，可能是血管生长抑制剂抑制血管活性的机制。
     在此之前，在肿瘤治疗领域一直占主导地位的策略是直接杀伤肿瘤细胞，即先进行肿瘤切除手术或通过放疗使原发瘤消退，然后再进行放化疗，以消除体内残留的癌细胞。这种策略的缺点是特异性不高，对病人的副作用太大，甚至有时会加速病人的死亡。而且癌细胞反复暴露于化疗下会产生抗药性，严重影响治疗的效果。因此，很多肿瘤专家的注意力就从肿瘤细胞本身转移到总体肿瘤组织，尤其是血管的生成过程。
     以肿瘤组织血管为靶标与直接针对肿瘤细胞本身相比有两个显著的优点：首先，由于许多固体瘤 ( 或许还有某些白血病 ) 是血管生成依赖的，因而这种方法不必为某种特定的肿瘤而制定特定的治疗方案；其次，抗血管生成药物只是阻止新生血管的生长，不攻击健康血管，理论上对正常血管无害并且不产生抗药性。正常成年人体内新生血管的生成处于相对静息的状态，只有 0.01％左右的内皮细胞处于分裂期，而肿瘤血管处于分裂周期的内皮细胞比例要高出 2-3 个数量级。因此，抑制内皮细胞增殖对正常组织影响非常小。
     有人从荷瘤的小鼠尿液和血清中分离到血管抑素，它与人纤维蛋白溶酶原 Kringle 1-4 区有高度的同源性。随后有实验证明血管抑素能特异性的抑制血管内皮细胞的增殖，也可以抑制原发瘤以及转移瘤组织中的血管生成。
     人纤维蛋白溶酶原是一种含有 5 个 Kringle 结构域和一个丝氨酸蛋白酶的分泌性糖蛋白，每个 Kringle 环由 76-80 个氨基酸组成。 1996 年 Cao 等人比较了血管抑素中各个 Kringle 区的抗血管增生活性后发现，每个独立的 Kringle 片段都能不同程度地抑制内皮细胞增殖。 Kringle 1、Kringle 2 和 Kringle 3 具有较强的抑制活性而 Kringle 4 仅仅具有很低的抑制活性，Kringle 1 和 Kringle 3 的抑制活性要强于 Kringle 2，而单独的 Kringle 5 片段抗血管增殖活性最强，它是目前所知道的抑制内皮细胞增殖和迁移最有效的纤维蛋白溶酶原片段，也是目前国际上研究和开发的最具前途的肿瘤血管生长抑制剂。血管生长抑制剂 Kringle 5 被认为是目前抑制血管内皮细胞增殖和迁移活性最强的纤溶酶原片段。但目前血管生长抑制剂 Kringle 5 制备工艺复杂，表达效率低下。发明内容为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法。
     本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，其特殊之处在于：所述高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法包括以下步骤：
     1) 制备 Kringle 5 基因的上游引物、 Kringle 5 基因的下游引物、 pET15b 质粒 DNA 以及感受态细胞 BL21(DE3)plys ；所述 Kringle 5 基因的上游引物含有 Nco I 酶切位点；所述 Kringle 5 基因的下游引物含有 Xho I 酶切位点；
     2) 根据步骤 1) 所得到的 Kringle 5 基因的上游引物以及 Kringle 5 基因的下游引物对 Kringle 5 基因进行 PCR 扩增，获取 PCR 扩增产物；
     3) 利用限制性内切酶分别对步骤 2) 所得到的 PCR 扩增产物以及 pET15b 质粒进行双酶切，分别得到 PCR 扩增产物经酶切后的产物以及 pET15b 质粒经酶切后的产物；所述限制性内切酶是 Nco I 酶以及 Xho I 酶；
     4) 利用 T4 DNA 连接酶对步骤 3) 中所得到的 PCR 扩增产物经酶切后的产物以及 pET15b 质粒经酶切后的产物进行酶连接，得到重组质粒 pET15b/K5 ；
     5) 将步骤 4) 获取得到的重组质粒 pET15b/K5 转化至感受态细胞 BL21(DE3)plys 中培养并进行保存；
     6) 对步骤 5) 中已经转化至感受态细胞 BL21(DE3)plys 中的重组质粒进行低温诱导表达。
     上述步骤 1) 中，所述 Kringle 5 基因的上游引物是 ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中，CCATGG 是 Nco I 酶切位点；所述 Kringle 5 基因的下游引物是 ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中， CTCGAG 是 Xho I 酶切位点。
     上述步骤 2) 中对 Kringle 5 基因进行 PCR 扩增的反应体系是：Kringle 5 基因的上游引物和 Kringle 5 基因的下游引物各 1μl，模板 1μl，Taq 酶 25μl，加无菌水至 50μl ； PCR 扩增的反应条件是：95℃ 5min 预变性；95℃ 30s 变性，55℃ 30s 退火，72℃ 30s 延伸，30 个循环；72℃ 7min 延伸。
     上述步骤 3) 中利用限制性内切酶对 PCR 扩增产物进行双酶切的反应体系是： Noc I 1μl， Xho I 1μl，10×M Buffer 4μl， PCR 产物 10μl， BSA 0.4μl，加无菌水至 40μl ；酶切温度 37℃，时间 2h ；
     利用限制性内切酶对 pET15b 质粒进行双酶切的反应体系是：Noc I 1μl， Xho I 1μl，10×M Buffer 4μl， pET15b 20μl， BSA 0.4μl，加无菌水至 40μl ；酶切温度 37℃，时间 2h。
     上述步骤 4) 中对 PCR 扩增产物经酶切后的产物以及 pET15b 质粒经酶切后的产物进行酶连接的反应体系是：pET15b 质粒 10μl， Kringle 5 片段 2μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl， T4DNA Ligase 1μl，加无菌水到 20μl ；
     反应条件是 16℃保温过夜， -20℃保存备用。
     上述步骤 5) 中的具体实现方式是：将 10μL 连接产物加到 200μL 感受态细胞 BL21(DE3)plys 的悬液中，混匀，冰浴 30-40min，42 ℃水浴保温 90s，立即置冰上 3min，加入 790μl LB 培养基，180rpm，37℃震荡培养 60min，然后吸取 200μl 培养液转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行培养。
     上述步骤 6) 的具体实现方式是：选取转化后培养出的单菌落至含有 5ml 培养液的试管中，30℃ 220rpm 振荡过夜；吸取 50μl 培养物以 1 ∶ 100 接种于含 100μg/ml 氨卞的 5ml LB 培养基中，30℃ 220rpm 振荡 3 小时，加入诱导剂 IPTG，使其终浓度为 1mM，再于 30℃ 220rpm 振荡 4 小时；离心收集菌体，用 200μl 0.1MTris-HCl 重悬菌体并洗涤，于 5000rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，所述 200μl 0.1MTris-HCl 的 pH 是 8.0。
     上述步骤 5) 中感受态细胞 BL21(DE3)plys 的制备方法是：
     冰冷的 CaCl2 溶液的制备：0.1mol/L CaCl2 溶液，使用一次性滤器过滤除菌后， -4℃冰箱存储备用；0.05mol/L CaCl2 甘油溶液：30％的甘油 +0.1M CaCl2 ；使用一次性滤器过滤除菌后， -4℃冰箱保存备用；
     无菌条件下接种大肠杆菌 BL21 菌株单菌落入 5ml LB 液体培养基中，37℃培养过夜；第二天，倒入 250ml 的 LB 液体培养基中，37℃振荡 3.5-4.0h，当 LB 液体培养基的 OD600 值介于 0.4-0.6 时停止培养；将培养液分装到 8 个 25ml 预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置 5-10 分钟，然后 4℃，8000rmp 离心 8min ；细胞沉淀用 10ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬，4℃ 6000rmp 离心 5 分钟；弃上清后，加入 10ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4℃，6000rmp 离心 5 分钟；弃上清后，加入 2ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬细胞，按每管 200μl 量分装于预冷的 0.5ml 离心管中，立即冻存于 -75℃冰柜中备用。
     上述步骤 1) 中 pET15b 质粒 DNA 的制备方法是：
     质粒的放大培养：在 2ml 含有 100μg/ml 氨卞抗生素的 LB 培养基中，接入含有 pET15b 质粒的 Top10 单菌落，于 37℃，220rpm 振摇下培养过夜；吸取 1.5ml 培养物于离心管中，10000g 离心 30 秒，吸去培养液；
     离心柱的活化：取 750μl GPS 缓冲液加入分离柱中，静置 4min，12000g 离心 2min ；
     质粒的提取：在上述沉淀中加入 250μl 溶液 I，吹吸使沉淀完全分散；加入 250μl 溶液 II，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混匀溶液，静置 2min ；加入 350μl 溶液 III，盖紧管口，温和振荡 10 秒，使溶液 III 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，静置 4min ；12000g 离心 10min，吸取上清至分离柱中 10000g 离心 1min，弃去液体，加入 500μl Buffer HB 10000g 离心 1min，弃去液体，加入 500μl DNA Wash，10000g 离心 1min，重复此步骤；换离心管，加入 40μl Elution Buffer 放置 2min，13600g 离心 2min，紫外分光光度计测含量，27.5ng/μl， A260/A280 在 1.80 以上；取 5μl 做 1 ％琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于 -20℃ ；所述溶液 I 和溶液 II 是指质粒小量提取试剂盒中标注的溶液。
     本发明的优点是：
     本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，该方法根据 Kringle 5 基因序列设计 PCR 引物，通过 PCR 从模板扩增出人纤维蛋白溶酶原 Kringle 5 非融合单基因，在 Nco I 和 Xho I 两酶切位点分别对 Kringle 5 和 pET15b 基因双酶切后再将二者相连，成功构建了 pET15b-K5 基因非融合表达载体；将重组载体导入 BL21(DE3)plys 大肠杆菌细胞中低温诱导表达，结果表明 Kringle 5 蛋白以可溶型三聚体形式获得了高效表达，目标蛋白表达占菌体总蛋白的 25％左右；将上清液经过一步 SP Sepharose Fast Flow 介质分离纯化后可获得高纯度和活性的非融合 Kringle 5 三聚体蛋白，经高效凝胶排阻色谱和反相色谱分析检测其纯度在 96％以上；鸡胚尿囊膜刺激实验结果表明，表达的 Kringle 5 三聚体蛋白的抑制血管生成活性约是 Kringle 5 蛋白的三倍。本发明所提供的非融合可溶型高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，所表达的血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体蛋白比血管生长抑制剂 Kringle 5 蛋白具有更高的抑制血管生成活性，在肿瘤治疗方面具有巨大的潜在价值和广阔的应用前景。非融合可溶型高活性血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的设计和高效表达方法为将其开发成一种新型抗血管生成药物奠定了基础。附图说明
     图 1 是本发明所提供的模板 PCR 电泳图；
     图 2 是本发明所提供的 Kringle 5 和 pET15bk5 双酶切电泳图；
     图 3 是本发明所提供的重组质粒 PCR 电泳图；图 4 是本发明所提供的 IPTG 诱导的菌体蛋白电泳图；图 5 是本发明所提供的重组蛋白质表达上清和沉淀的电泳图；图 6 是本发明所提供的重组蛋白的活性检测示意图。具体实施方式
     本发明所选择的试验材料是：
     1、主要试剂：限制性内切酶、T4DNA 连接酶、高保真 Taq 酶均购自 Promega 公司， Taq 酶购自 MBI ；质粒小量提取试剂盒， DNA 凝胶回收试剂盒均购自 OMEGA ；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
     2、菌株和质粒：大肠杆菌 BL21(DE3)plys 和质粒 pET15b。
     3、培养基：LB 培养基：胰蛋白冻 10g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，加水至 1000ml，121℃灭菌 20 分钟；琼脂培养基：胰蛋白冻 10g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，琼脂粉 15g，加水至 1000ml，121℃灭菌 20 分钟。
     本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂 Kringle 5 三聚体的高效表达方法，该方法包括：
     Kringle 5 基因上下游引物的设计与合成：
     上游引物：ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中 CCATGG 是 Nco I 酶切位点；
     下游引物：ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中 CTCGAG 是 Xho I 酶切位点。
     Kringle 5 基因的 PCR 扩增，其具体实现方式是：
     1)PCR 扩增体系是：上游引物和下游引物各 1μl，模板 1μl， Taq 酶 25μl，加无菌水至 50μl ；PCR 反应条件是：95℃ 5min 预变性；95℃ 30s 变性，55℃ 30s 退火，72℃ 30s 延伸，30 个循环；72℃ 7min 延伸。
     PCR 后，取 5ul PCR 反应产物和 5ul marker 进行 2％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物大小。
     2)PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳：称取 0.20g 琼脂糖置专用三角瓶，加入 20ml 蒸馏水，加热至沸腾。待冷却后加入少许 Goldview 贮存液，混匀后倒入事先插好梳子的电泳槽中，待其冷却凝固后加入适量的电泳缓冲液，小心取出梳子；用微量移液枪吸取 PCR 产物 5μl 加入加样孔中，在旁边加样孔中加入 DNA Marker 做对照；接通电泳池的电源调节电压至 80v，进行电泳。之后在凝胶成像仪下观察。
     参考图 1，该图是模板 PCR 电泳结果，泳道 1 代表 DL2000 分子量 marker ；泳道 2-7 是六个平行样品的模板 PCR 电泳结果；泳道 8 代表阴性对照，其结果表明，在 300bp 处显示出条带，与目的基因大小一致，从模板质粒中能够扩增出大量的模板 DNA 分子。
     3)pET15b 质粒 DNA 的小量制备，其具体实现方式是：
     (1) 质粒的放大培养：在 2ml 含有 100μg/ml 氨卞抗生素的 LB 培养基中，接入含有 pET15b 质粒的 Top10 单菌落，于 37℃，220rpm 振摇下培养过夜。吸取 1.5ml 培养物于离心管中，10000g 离心 30 秒，尽量吸去培养液。
     (2) 离心柱的活化：取 750μl GPS 缓冲液加入分离柱中，静置 4min，12000g 离心 2min。
     (3) 质粒的提取：在上述沉淀中加入 250μl 溶液 I，吹吸使沉淀完全分散；加入 250μl 溶液 II，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混匀溶液，静置 2min ；加入 350μl 溶液 III，盖紧管口，温和振荡 10 秒，使溶液 III 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，静置 4min。 12000g 离心 10min，吸取上清至分离柱中 10000g 离心 1min，弃去液体，加入 500μl Buffer HB 10000g 离心 1min，弃去液体，加入 500μl DNAWash，10000g 离心 1min，重复此步骤。换离心管，加入 40μl Elution Buffer 放置 2min，13600g 离心 2min，紫外分光光度计测含量，27.5ng/μl， A260/A280 在 1.80 以上。取 5μl 做 1％琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于 -20℃。
     4)PCR 产物的凝胶回收，其具体实现方式是：
     采用 DNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物。将 Kringle 5 基因的 PCR 产物按步骤 2) 所述方法进行凝胶电泳，在紫外灯下切下含有目的 DNA 的凝胶，凝胶重 0.144g，假设胶密度为 1g/ml，按一个凝胶体积加入等体积 Binding Buffer 计算，向其中加入 150μl Binding Buffer，混和均匀后于 60℃加热，间断混合直至凝胶完全融化。将混合溶液加入分离柱中，10000g 离心 1min，弃去下液，加入 300μl Binding Buffer 至分离柱中，10000g 离心 1min。加入 700μl SPW( 已经用乙醇处理 )，10000g 离心 1min，重复一遍，弃去下液，13000g 离心 2min。将分离柱放入 1.5ml 离心管中，加入 40μl Elution Buffer，静置 1min，13000g 离心 1min。紫外分光光度计测含量为 60ng/μl，A260/A280 为 1.80。取 5μl 胶回收产物进行电泳检测。
     5) 双酶切 PCR 产物和载体质粒 DNA，其具体实现方式是：
     反应体系：Noc I 1μl， Xho I 1μl，10×M Buffer 4μl， pET15b 20μl， PCR 产物 10μl， BSA 0.4μl，加无菌水至 40μl ；酶切温度 37℃，时间 2h。
     6)pET15b 和 Kringle 5 基因双酶切产物胶回收，其具体实现方式是：具体步骤同 4) 所述。紫外分光光度计测含量 Kringle 5 基因浓度为 12.0ng/μl， pET15b 浓度为 4.5ng/μl。取 10μl 电泳检测。
     参见图 2，该图表示了 Kringle 5 和 pET15bk5 双酶切电泳图，其中，泳道 1 代表 DNA 分子量 marker ；泳道 2 是 Kringle 5 双酶切结果；泳道 3-4 是 pET15b 双酶切结果；泳道 5 是 pET15b 未酶切。结果表明，模板质粒和 pET15b 质粒均能有效进行双酶切，模板酶切位点设置正确。
     7) 重组载体 pET15b/K5 的制备，其具体实现方式是：
     反应体系组成为：回收的 pET15b 质粒 10μl，回收 K5 片段 2μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl， T4DNA Ligase 1μl，加无菌水到 20μl。
     反应条件：16℃保温过夜， -20℃保存备用。
     8) 感受态细胞的制备，其具体实现方式是：
     CaCl2 溶液 ( 冰冷 ) ：0.1mol/L CaCl2 溶液，使用一次性滤器过滤除菌后， -4℃ 冰箱存储备用；0.05mol/L CaCl2 甘油溶液：30％的甘油 +0.1M CaCL2。使用一次性滤器过滤除菌后， -4℃冰箱保存备用。
     (1) 无菌条件下接种大肠杆菌 BL21 菌株单菌落入 5ml LB 液体培养基中，37℃培养过夜。第二天，倒入 250ml 的 LB 液体培养基中，37℃振荡 3.5-4.0h(OD6000.4-0.6)，停止培养。 (2) 将培养液分装到 8 个 25ml 预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置 5-10 分钟，然后 4℃，8000rmp 离心 8min。
     (3) 细胞沉淀用 10ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬，4℃ 6000rmp 离心 5 分钟。
     (4) 弃上清后，加入 10ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4 ℃， 6000rmp 离心 5 分钟。
     (5) 弃上清后，加入 2ml 冰冷的 CaCl2 溶液重悬细胞，按每管 200μl 量分装于预冷的 0.5ml 离心管中，立即冻存于 -75℃冰柜中备用。
     9) 重组质粒的转化以及保存，其具体实现方式是：
     (1) 将 10μL 连接产物加到 200μL 感受态细胞悬液中，混匀，冰浴 30-40min， 42 ℃水浴保温 90s，立即置冰上 3min，加入 790μl LB 培养基，180rpm，37 ℃震荡培养 60min，然后吸取 200μl 培养液转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行培养。
     (2) 将转化成功的大肠杆菌，挑取单菌落于液体培养基，进行纯化扩增培养， 37℃剧烈振摇过夜。吸取过夜摇床培养的培养物 500μl 加入 1.5ml 的离心管中，再加 30％的甘油 500μl 混合均匀后于 -20 或 -70℃保藏，定期进行活化重保藏，以防菌种退化或质粒丢失。
     10) 重组质粒的提取、 PCR 检测和序列测定，其具体实现方式是：
     质粒提取方法同步骤 3)，质粒 PCR 检测所用程序和反应体系同步骤 1)，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测；序列测定采用 T7 Promoter 作为起始引物，结果显示序列正确。
     序列测定采用 T7 promoter 作为起始引物，结果如下：结果显示序列正确。
     ATGGTGCTGCTCCGGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTAAATTTG GGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGC CAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAA
     TCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGG TCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCA GTGTGCGGCCCCGTAA，结果表明，所测定序列与设计序列一致。
     参见图 3，该图反应了重组质粒 PCR 电泳图，其中泳道 1 是 DL2000 分子量 marker ；泳道 2-5 是四个平行样品；泳道 6 表示阴性对照；结果表明，重组质粒中含有 Kringle 5 模板分子，模板分子和载体质粒连接正确。
     11) 培养和重组蛋白的诱导表达，其具体实现方式是：
     挑取上述转化后培养出的单菌落至含有 5ml 培养液的试管中，30 ℃ 220rpm 振荡过夜。吸取 50μl 培养物以 1 ∶ 100 接种于含 100μg/ml 氨卞的 5ml LB 培养基中， 30℃ 220rpm 振荡 3 小时，加入诱导剂 IPTG，使其终浓度为 1mM，再于 30℃ 220rpm 振荡 4 小时。离心收集菌体，用 200μl 0.1M Tris-HCl(pH 8.0) 重悬菌体并洗涤，于 5000rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。诱导菌体以及未加诱导的对照菌体分别做 SDS-PAGE，染色，脱色，成像。
     参见图 4，泳道 1 是蛋白质分子量 marker ；泳道 2 是未诱导对照；泳道 3-5 是 IPTG 诱导后的结果；结果表明，经 IPTG 诱导后，重组菌体在分子量约为 2.8kD 处有明显的表达条带。这表明它们是以三聚体分子形式存在的，其表达量约占菌体总蛋白的 25％。 12) 重组蛋白质表达分布位置的鉴定，其具体实现方式是：
     挑取上述转化后培养出的单菌落至含有 5ml 培养液的试管中，30 ℃ 220rpm 振荡过夜。吸取 1ml 培养物以 1 ∶ 100 接种于含 100μg/ml 氨卞的 100ml LB 培养基中， 30℃ 220rpm 振荡 3 小时，加入诱导剂 IPTG，使其终浓度为 1mM，再于 30℃ 220rpm 振荡 4 小时。离心收集菌体，用 200μl 0.1M Tris-HCl(pH8.0) 重悬菌体并洗涤，于 5000rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。
     将菌体加入到 5ml 破碎缓冲液中，进行超声波破碎，破碎后于 12000rpm 离心 10 分钟，分别收集上清和沉淀部分，沉淀用 2.0M 尿素洗涤两次后用 7.0M 尿素溶解。上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做 SDS-PAGE，染色，脱色，成像。
     参见图 5，泳道 1 是 2.0M 尿素洗涤沉淀一次电泳图；泳道 2 是 2M 尿素洗涤沉淀二次电泳图；泳道 3 是 2M 尿素洗涤三次电泳图；泳道 4 是沉淀 8M 尿素溶解；泳道 5 是上清电泳图；泳道 6 是蛋白 marker ；泳道 7 是 IPTG 诱导裂解液；结果表明，所表达的三聚体 Kringle 5 不是以包涵体的形式存在的，它们以可溶形式存在于上清中。
     13) 重组蛋白质的活性检测，其具体实现方式是：
     采用鸡胚绒毛尿囊膜法对获得的重组 kringle 5 进行生物活性鉴定。选择表面清洁、蛋形规范、气室、气孔均匀的鸡胚 ( 已孵化 7-9 天 )，酒精消毒蛋气室表面，用牙科钻划刻凹痕，实验组用微量注射器注入 100μL 纯化得到的蛋白溶液，对照组注射等量磷酸盐缓冲液，在 37.8℃、 CO2 浓度为 5％、相对湿度为 50％的条件下继续孵育 72h，观察鸡胚绒毛尿囊膜血管生长情况。然后计数单位视域面积内的一级、二级和三级血管，并计算单位视域面积内的一级、二级和三级血管所占面积的百分数。
     参见图 6，该图反应了采用鸡胚绒毛尿囊膜法测定的重组三聚体 kringle 5 的生物活性，其中左图阴性对照的鸡胚绒毛尿囊膜，右图为加三聚体 kringle 5 后的鸡胚绒毛尿
     囊膜。结果表明，所表达的三聚体 Kringle 5 具有很强的血管生长抑制活性，且其抑制血管生成活性约是 Kringle 5 蛋白的三倍。

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1、10申请公布号CN102021192A43申请公布日20110420CN102021192ACN102021192A21申请号201010298771522申请日20100930C12N15/57200601C12N15/70200601C12N9/6820060171申请人西北大学地址710069陕西省西安市太白北路229号72发明人边六交妙亮74专利代理机构西安智邦专利商标代理有限公司61211代理人商宇科54发明名称一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法57摘要一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，方法包括1制备KRINGLE5基。

2、因的上、下游引物、PET15B质粒DNA以及感受态细胞BL21DE3PLYS；2对KRINGLE5基因进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；3分别PCR扩增产物以及PET15B质粒进行双酶切；4利用T4DNA连接酶对PCR扩增产物经酶切后的产物以及PET15B质粒经酶切后的产物进行酶连接，得到重组质粒PET15B/K5；5将重组质粒PET15B/K5转化至感受态细胞BL21DE3PLYS中培养并进行保存；6对重组质粒进行低温诱导表达。本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书8。

3、页附图3页CN102021206A1/3页21一种高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法包括以下步骤1制备KRINGLE5基因的上游引物、KRINGLE5基因的下游引物、PET15B质粒DNA以及感受态细胞BL21DE3PLYS；所述KRINGLE5基因的上游引物含有NCOI酶切位点；所述KRINGLE5基因的下游引物含有XHOI酶切位点；2根据步骤1所得到的KRINGLE5基因的上游引物以及KRINGLE5基因的下游引物对KRINGLE5基因进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；3利用限制性内切酶分别对P。

4、ET15B质粒以及步骤2所得到的PCR扩增产物进行双酶切，分别得到PET15B质粒经酶切后的产物以及PCR扩增产物经酶切后的产物；所述限制性内切酶是NCOI酶以及XHOI酶；4利用T4DNA连接酶对步骤3中所得到的PCR扩增产物经酶切后的产物以及PET15B质粒经酶切后的产物进行酶连接，得到重组质粒PET15B/K5；5将步骤4获取得到的重组质粒PET15B/K5转化至感受态细胞BL21DE3PLYS中培养并进行保存；6对步骤5中已经转化至感受态细胞BL21DE3PLYS中的重组质粒进行诱导表达。2根据权利要求1所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述步骤。

5、1中，所述KRINGLE5基因的上游引物是ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中CCATGG是NCOI酶切位点；所述KRINGLE5基因的下游引物是ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中CTCGAG是XHOI酶切位点。3根据权利要求2所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述步骤2中对KRINGLE5基因进行PCR扩增的反应体系是KRINGLE5基因的上游引物和KRINGLE5基因的下游引物各1L，模板1L，TAQ酶25L，加无菌水至50L；PCR扩增的反应条件是955MIN预变性；9530S变性。

6、，5530S退火，7230S延伸，30个循环；727MIN延伸。4根据权利要求3所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述步骤3中利用限制性内切酶对PCR扩增产物进行双酶切的反应体系是NOCI1L，XHOI1L，10MBUFFER4L，PCR产物10L，BSA04L，加无菌水至40L；酶切温度37，时间2H；利用限制性内切酶对PET15B质粒进行双酶切的反应体系是NOCI1L，XHOI1L，10MBUFFER4L，PET15B20L，BSA04L，加无菌水至40L；酶切温度37，时间2H。5根据权利要求4所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效。

7、表达方法，其特征在于所述步骤4中对PCR扩增产物经酶切后的产物以及PET15B质粒经酶切后的产物进行酶连接的反应体系是PET15B质粒10L，KRINGLE5片段2L，10T4DNALIGASEBUFFER2L，T4DNALIGASE1L，加无菌水到20L；反应条件是16保温过夜，20保存备用。6根据权利要求5所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，权利要求书CN102021192ACN102021206A2/3页3其特征在于所述步骤5中的具体实现方式是将10L连接产物加到200L感受态细胞BL21DE3PLYS的悬液中，混匀，冰浴3040MIN，42水浴保温90S，立。

8、即置冰上3MIN，加入790LLB培养基，180RPM，37震荡培养60MIN，然后吸取200L培养液转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行培养。7根据权利要求6所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述步骤6的具体实现方式是选取转化后培养出的单菌落至含有5ML培养液的试管中，30200250RPM振荡过夜；吸取50L培养物以1100接种于含100G/ML氨卞的5MLLB培养基中，30220RPM振荡3小时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1MM，再于30200250RPM振荡4小时；离心收集菌体，用200L01MTRISHCL重悬菌体并洗涤，于5000RPM离。

9、心5分钟，弃去上清液，所述200L01MTRISHCL的PH是80。8根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述步骤1中感受态细胞BL21DE3PLYS的制备方法是冰冷的CACL2溶液的制备01MOL/LCACL2溶液，使用一次性滤器过滤除菌后，4冰箱存储备用；005MOL/LCACL2甘油溶液30的甘油01MCACL2；使用一次性滤器过滤除菌后，4冰箱保存备用；无菌条件下接种大肠杆菌BL21菌株单菌落入5MLLB液体培养基中，37培养过夜；将过夜培养BL21菌株单菌液倒入250ML的LB液体培养基中，37振荡3540H。

10、，当LB液体培养基的OD600值介于0406时停止培养；将培养液分装到8个25ML预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置510分钟，然后4，8000RMP离心8MIN；细胞沉淀用10ML冰冷的CACL2溶液重悬，46000RMP离心5分钟；弃上清后，加入10ML冰冷的CACL2溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4，6000RMP离心5分钟；弃上清后，加入2ML冰冷的CACL2溶液重悬细胞，按每管200L量分装于预冷的05ML离心管中，立即冻存于75冰柜中备用。9根据权利要求8所述的高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特征在于所述步骤1中PET15B质粒DNA的制备方法是质粒的放大培养。

11、在2ML含有100G/ML氨卞抗生素的LB培养基中，接入含有PET15B质粒的TOP10单菌落，于37，220RPM振摇下培养过夜；吸取15ML培养物于离心管中，10000G离心30秒，吸去培养液；离心柱的活化取750LGPS缓冲液加入分离柱中，静置4MIN，12000G离心2MIN；质粒的提取在上述沉淀中加入250L溶液I，吹吸使沉淀完全分散；加入250L溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀溶液，静置2MIN；加入350L溶液III，盖紧管口，温和振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，静置4MIN；12000G离心10MIN，吸取上清至分离柱中10000G离心1MI。

12、N，弃去液体，加入500LBUFFERHB10000G离心1MIN，弃去液体，加入500LDNAWASH，10000G离心1MIN，重复此步骤；换离心管，加入40LELUTIONBUFFER放置2MIN，13600G离心2MIN，紫外分光光度计测含量，275NG/L，A260/A280在180以上；取5L做1琼脂糖凝胶电泳检测，权利要求书CN102021192ACN102021206A3/3页4剩余储存于20；所述溶液I和溶液II是指质粒小量提取试剂盒中标注的溶液。权利要求书CN102021192ACN102021206A1/8页5一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达。

13、方法技术领域0001本发明属分子生物学领域，涉及一种血管生长抑制剂的制备方法，尤其涉及一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法。背景技术0002全世界每年约有500万人死于肿瘤。早在20世纪70年代，FOLKMAN就提出，肿瘤生长是血管依赖性的。血管的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段到有血管的快速生长阶段。血管的生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。血管的生成主要依赖于血管生成刺激剂和抑制剂的调节，内源性的血管生成刺激剂的下调和血管生成抑制剂的上调，引起血管生成平衡失调，可能是血管生长抑制剂抑制血管活性的机制。0003在此之前，。

14、在肿瘤治疗领域一直占主导地位的策略是直接杀伤肿瘤细胞，即先进行肿瘤切除手术或通过放疗使原发瘤消退，然后再进行放化疗，以消除体内残留的癌细胞。这种策略的缺点是特异性不高，对病人的副作用太大，甚至有时会加速病人的死亡。而且癌细胞反复暴露于化疗下会产生抗药性，严重影响治疗的效果。因此，很多肿瘤专家的注意力就从肿瘤细胞本身转移到总体肿瘤组织，尤其是血管的生成过程。0004以肿瘤组织血管为靶标与直接针对肿瘤细胞本身相比有两个显著的优点首先，由于许多固体瘤或许还有某些白血病是血管生成依赖的，因而这种方法不必为某种特定的肿瘤而制定特定的治疗方案；其次，抗血管生成药物只是阻止新生血管的生长，不攻击健康血管，理。

15、论上对正常血管无害并且不产生抗药性。正常成年人体内新生血管的生成处于相对静息的状态，只有001左右的内皮细胞处于分裂期，而肿瘤血管处于分裂周期的内皮细胞比例要高出23个数量级。因此，抑制内皮细胞增殖对正常组织影响非常小。0005有人从荷瘤的小鼠尿液和血清中分离到血管抑素，它与人纤维蛋白溶酶原KRINGLE14区有高度的同源性。随后有实验证明血管抑素能特异性的抑制血管内皮细胞的增殖，也可以抑制原发瘤以及转移瘤组织中的血管生成。0006人纤维蛋白溶酶原是一种含有5个KRINGLE结构域和一个丝氨酸蛋白酶的分泌性糖蛋白，每个KRINGLE环由7680个氨基酸组成。1996年CAO等人比较了血管抑素中。

16、各个KRINGLE区的抗血管增生活性后发现，每个独立的KRINGLE片段都能不同程度地抑制内皮细胞增殖。KRINGLE1、KRINGLE2和KRINGLE3具有较强的抑制活性而KRINGLE4仅仅具有很低的抑制活性，KRINGLE1和KRINGLE3的抑制活性要强于KRINGLE2，而单独的KRINGLE5片段抗血管增殖活性最强，它是目前所知道的抑制内皮细胞增殖和迁移最有效的纤维蛋白溶酶原片段，也是目前国际上研究和开发的最具前途的肿瘤血管生长抑制剂。血管生长抑制剂KRINGLE5被认为是目前抑制血管内皮细胞增殖和迁移活性最强的纤溶酶原片段。但目前血管生长抑制剂KRINGLE5制备工艺复杂，表达。

17、效率低下。说明书CN102021192ACN102021206A2/8页6发明内容0007为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法。0008本发明的技术解决方案是本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，其特殊之处在于所述高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法包括以下步骤00091制备KRINGLE5基因的上游引物、KRINGLE5基因的下游引物、PET15B质粒DNA以及感受态细胞BL21DE3PLYS；所述KRINGLE5基因的上游引物含有NCOI酶切位。

18、点；所述KRINGLE5基因的下游引物含有XHOI酶切位点；00102根据步骤1所得到的KRINGLE5基因的上游引物以及KRINGLE5基因的下游引物对KRINGLE5基因进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；00113利用限制性内切酶分别对步骤2所得到的PCR扩增产物以及PET15B质粒进行双酶切，分别得到PCR扩增产物经酶切后的产物以及PET15B质粒经酶切后的产物；所述限制性内切酶是NCOI酶以及XHOI酶；00124利用T4DNA连接酶对步骤3中所得到的PCR扩增产物经酶切后的产物以及PET15B质粒经酶切后的产物进行酶连接，得到重组质粒PET15B/K5；00135将步骤4获取得到的。

19、重组质粒PET15B/K5转化至感受态细胞BL21DE3PLYS中培养并进行保存；00146对步骤5中已经转化至感受态细胞BL21DE3PLYS中的重组质粒进行低温诱导表达。0015上述步骤1中，所述KRINGLE5基因的上游引物是ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中，CCATGG是NCOI酶切位点；所述KRINGLE5基因的下游引物是ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中，CTCGAG是XHOI酶切位点。0016上述步骤2中对KRINGLE5基因进行PCR扩增的反应体系是KRINGLE5基因的上游引物和KRINGLE5基因的下游。

20、引物各1L，模板1L，TAQ酶25L，加无菌水至50L；PCR扩增的反应条件是955MIN预变性；9530S变性，5530S退火，7230S延伸，30个循环；727MIN延伸。0017上述步骤3中利用限制性内切酶对PCR扩增产物进行双酶切的反应体系是NOCI1L，XHOI1L，10MBUFFER4L，PCR产物10L，BSA04L，加无菌水至40L；酶切温度37，时间2H；0018利用限制性内切酶对PET15B质粒进行双酶切的反应体系是NOCI1L，XHOI1L，10MBUFFER4L，PET15B20L，BSA04L，加无菌水至40L；酶切温度37，时间2H。0019上述步骤4中对PCR扩增。

21、产物经酶切后的产物以及PET15B质粒经酶切后的产物进行酶连接的反应体系是PET15B质粒10L，KRINGLE5片段2L，10T4DNALIGASEBUFFER2L，T4DNALIGASE1L，加无菌水到20L；0020反应条件是16保温过夜，20保存备用。说明书CN102021192ACN102021206A3/8页70021上述步骤5中的具体实现方式是将10L连接产物加到200L感受态细胞BL21DE3PLYS的悬液中，混匀，冰浴3040MIN，42水浴保温90S，立即置冰上3MIN，加入790LLB培养基，180RPM，37震荡培养60MIN，然后吸取200L培养液转移到加有抗生素氨苄。

22、的培养基上进行培养。0022上述步骤6的具体实现方式是选取转化后培养出的单菌落至含有5ML培养液的试管中，30220RPM振荡过夜；吸取50L培养物以1100接种于含100G/ML氨卞的5MLLB培养基中，30220RPM振荡3小时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1MM，再于30220RPM振荡4小时；离心收集菌体，用200L01MTRISHCL重悬菌体并洗涤，于5000RPM离心5分钟，弃去上清液，所述200L01MTRISHCL的PH是80。0023上述步骤5中感受态细胞BL21DE3PLYS的制备方法是0024冰冷的CACL2溶液的制备01MOL/LCACL2溶液，使用一次性滤器过滤除。

23、菌后，4冰箱存储备用；005MOL/LCACL2甘油溶液30的甘油01MCACL2；使用一次性滤器过滤除菌后，4冰箱保存备用；0025无菌条件下接种大肠杆菌BL21菌株单菌落入5MLLB液体培养基中，37培养过夜；第二天，倒入250ML的LB液体培养基中，37振荡3540H，当LB液体培养基的OD600值介于0406时停止培养；将培养液分装到8个25ML预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置510分钟，然后4，8000RMP离心8MIN；细胞沉淀用10ML冰冷的CACL2溶液重悬，46000RMP离心5分钟；弃上清后，加入10ML冰冷的CACL2溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4，6000RMP离心5分钟。

24、；弃上清后，加入2ML冰冷的CACL2溶液重悬细胞，按每管200L量分装于预冷的05ML离心管中，立即冻存于75冰柜中备用。0026上述步骤1中PET15B质粒DNA的制备方法是0027质粒的放大培养在2ML含有100G/ML氨卞抗生素的LB培养基中，接入含有PET15B质粒的TOP10单菌落，于37，220RPM振摇下培养过夜；吸取15ML培养物于离心管中，10000G离心30秒，吸去培养液；0028离心柱的活化取750LGPS缓冲液加入分离柱中，静置4MIN，12000G离心2MIN；0029质粒的提取在上述沉淀中加入250L溶液I，吹吸使沉淀完全分散；加入250L溶液II，盖紧管口，快速。

25、颠倒离心管5次，以混匀溶液，静置2MIN；加入350L溶液III，盖紧管口，温和振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，静置4MIN；12000G离心10MIN，吸取上清至分离柱中10000G离心1MIN，弃去液体，加入500LBUFFERHB10000G离心1MIN，弃去液体，加入500LDNAWASH，10000G离心1MIN，重复此步骤；换离心管，加入40LELUTIONBUFFER放置2MIN，13600G离心2MIN，紫外分光光度计测含量，275NG/L，A260/A280在180以上；取5L做1琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于20；所述溶液I和溶液II是指质粒小量提取试。

26、剂盒中标注的溶液。0030本发明的优点是0031本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，该方法根据KRINGLE5基因序列设计PCR引物，通过PCR从模板扩增出人纤维蛋白溶酶原KRINGLE5非融合单基因，在NCOI和XHOI两酶切位点分别对KRINGLE5和PET15B基说明书CN102021192ACN102021206A4/8页8因双酶切后再将二者相连，成功构建了PET15BK5基因非融合表达载体；将重组载体导入BL21DE3PLYS大肠杆菌细胞中低温诱导表达，结果表明KRINGLE5蛋白以可溶型三聚体形式获得了高效表达，目标蛋白表达占菌体总蛋白的。

27、25左右；将上清液经过一步SPSEPHAROSEFASTFLOW介质分离纯化后可获得高纯度和活性的非融合KRINGLE5三聚体蛋白，经高效凝胶排阻色谱和反相色谱分析检测其纯度在96以上；鸡胚尿囊膜刺激实验结果表明，表达的KRINGLE5三聚体蛋白的抑制血管生成活性约是KRINGLE5蛋白的三倍。本发明所提供的非融合可溶型高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，所表达的血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体蛋白比血管生长抑制剂KRINGLE5蛋白具有更高的抑制血管生成活性，在肿瘤治疗方面具有巨大的潜在价值和广阔的应用前景。非融合可溶型高活性血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的设。

28、计和高效表达方法为将其开发成一种新型抗血管生成药物奠定了基础。附图说明0032图1是本发明所提供的模板PCR电泳图；0033图2是本发明所提供的KRINGLE5和PET15BK5双酶切电泳图；0034图3是本发明所提供的重组质粒PCR电泳图；0035图4是本发明所提供的IPTG诱导的菌体蛋白电泳图；0036图5是本发明所提供的重组蛋白质表达上清和沉淀的电泳图；0037图6是本发明所提供的重组蛋白的活性检测示意图。具体实施方式0038本发明所选择的试验材料是00391、主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、高保真TAQ酶均购自PROMEGA公司，TAQ酶购自MBI；质粒小量提取试剂盒，DNA凝。

29、胶回收试剂盒均购自OMEGA；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。00402、菌株和质粒大肠杆菌BL21DE3PLYS和质粒PET15B。00413、培养基LB培养基胰蛋白冻10G，酵母提取物5G，氯化钠10G，加水至1000ML，121灭菌20分钟；琼脂培养基胰蛋白冻10G，酵母提取物5G，氯化钠10G，琼脂粉15G，加水至1000ML，121灭菌20分钟。0042本发明提供了一种高活性可溶型血管生长抑制剂KRINGLE5三聚体的高效表达方法，该方法包括0043KRINGLE5基因上下游引物的设计与合成0044上游引物ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中。

30、CCATGG是NCOI酶切位点；0045下游引物ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中CTCGAG是XHOI酶切位点。0046KRINGLE5基因的PCR扩增，其具体实现方式是00471PCR扩增体系是上游引物和下游引物各1L，模板1L，TAQ酶25L，加无菌水至50L；PCR反应条件是955MIN预变性；9530S变性，5530S退火，说明书CN102021192ACN102021206A5/8页97230S延伸，30个循环；727MIN延伸。0048PCR后，取5ULPCR反应产物和5ULMARKER进行2琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物大小。00492PCR。

31、产物的琼脂糖凝胶电泳称取020G琼脂糖置专用三角瓶，加入20ML蒸馏水，加热至沸腾。待冷却后加入少许GOLDVIEW贮存液，混匀后倒入事先插好梳子的电泳槽中，待其冷却凝固后加入适量的电泳缓冲液，小心取出梳子；用微量移液枪吸取PCR产物5L加入加样孔中，在旁边加样孔中加入DNAMARKER做对照；接通电泳池的电源调节电压至80V，进行电泳。之后在凝胶成像仪下观察。0050参考图1，该图是模板PCR电泳结果，泳道1代表DL2000分子量MARKER；泳道27是六个平行样品的模板PCR电泳结果；泳道8代表阴性对照，其结果表明，在300BP处显示出条带，与目的基因大小一致，从模板质粒中能够扩增出大量的。

32、模板DNA分子。00513PET15B质粒DNA的小量制备，其具体实现方式是00521质粒的放大培养在2ML含有100G/ML氨卞抗生素的LB培养基中，接入含有PET15B质粒的TOP10单菌落，于37，220RPM振摇下培养过夜。吸取15ML培养物于离心管中，10000G离心30秒，尽量吸去培养液。00532离心柱的活化取750LGPS缓冲液加入分离柱中，静置4MIN，12000G离心2MIN。00543质粒的提取在上述沉淀中加入250L溶液I，吹吸使沉淀完全分散；加入250L溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀溶液，静置2MIN；加入350L溶液III，盖紧管口，温和振荡10秒，。

33、使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，静置4MIN。12000G离心10MIN，吸取上清至分离柱中10000G离心1MIN，弃去液体，加入500LBUFFERHB10000G离心1MIN，弃去液体，加入500LDNAWASH，10000G离心1MIN，重复此步骤。换离心管，加入40LELUTIONBUFFER放置2MIN，13600G离心2MIN，紫外分光光度计测含量，275NG/L，A260/A280在180以上。取5L做1琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于20。00554PCR产物的凝胶回收，其具体实现方式是0056采用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。将KRINGLE5基因的PCR产物。

34、按步骤2所述方法进行凝胶电泳，在紫外灯下切下含有目的DNA的凝胶，凝胶重0144G，假设胶密度为1G/ML，按一个凝胶体积加入等体积BINDINGBUFFER计算，向其中加入150LBINDINGBUFFER，混和均匀后于60加热，间断混合直至凝胶完全融化。将混合溶液加入分离柱中，10000G离心1MIN，弃去下液，加入300LBINDINGBUFFER至分离柱中，10000G离心1MIN。加入700LSPW已经用乙醇处理，10000G离心1MIN，重复一遍，弃去下液，13000G离心2MIN。将分离柱放入15ML离心管中，加入40LELUTIONBUFFER，静置1MIN，13000G离心1。

35、MIN。紫外分光光度计测含量为60NG/L，A260/A280为180。取5L胶回收产物进行电泳检测。00575双酶切PCR产物和载体质粒DNA，其具体实现方式是0058反应体系NOCI1L，XHOI1L，10MBUFFER4L，PET15B20L，PCR产物10L，BSA04L，加无菌水至40L；酶切温度37，时间2H。00596PET15B和KRINGLE5基因双酶切产物胶回收，其具体实现方式是说明书CN102021192ACN102021206A6/8页100060具体步骤同4所述。紫外分光光度计测含量KRINGLE5基因浓度为120NG/L，PET15B浓度为45NG/L。取10L电泳。

36、检测。0061参见图2，该图表示了KRINGLE5和PET15BK5双酶切电泳图，其中，泳道1代表DNA分子量MARKER；泳道2是KRINGLE5双酶切结果；泳道34是PET15B双酶切结果；泳道5是PET15B未酶切。结果表明，模板质粒和PET15B质粒均能有效进行双酶切，模板酶切位点设置正确。00627重组载体PET15B/K5的制备，其具体实现方式是0063反应体系组成为回收的PET15B质粒10L，回收K5片段2L，10T4DNALIGASEBUFFER2L，T4DNALIGASE1L，加无菌水到20L。0064反应条件16保温过夜，20保存备用。00658感受态细胞的制备，其具体实。

37、现方式是0066CACL2溶液冰冷01MOL/LCACL2溶液，使用一次性滤器过滤除菌后，4冰箱存储备用；005MOL/LCACL2甘油溶液30的甘油01MCACL2。使用一次性滤器过滤除菌后，4冰箱保存备用。00671无菌条件下接种大肠杆菌BL21菌株单菌落入5MLLB液体培养基中，37培养过夜。第二天，倒入250ML的LB液体培养基中，37振荡3540HOD6000406，停止培养。00682将培养液分装到8个25ML预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置510分钟，然后4，8000RMP离心8MIN。00693细胞沉淀用10ML冰冷的CACL2溶液重悬，46000RMP离心5分钟。00704弃上。

38、清后，加入10ML冰冷的CACL2溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4，6000RMP离心5分钟。00715弃上清后，加入2ML冰冷的CACL2溶液重悬细胞，按每管200L量分装于预冷的05ML离心管中，立即冻存于75冰柜中备用。00729重组质粒的转化以及保存，其具体实现方式是00731将10L连接产物加到200L感受态细胞悬液中，混匀，冰浴3040MIN，42水浴保温90S，立即置冰上3MIN，加入790LLB培养基，180RPM，37震荡培养60MIN，然后吸取200L培养液转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行培养。00742将转化成功的大肠杆菌，挑取单菌落于液体培养基，进行纯化扩增培养，37剧。

39、烈振摇过夜。吸取过夜摇床培养的培养物500L加入15ML的离心管中，再加30的甘油500L混合均匀后于20或70保藏，定期进行活化重保藏，以防菌种退化或质粒丢失。007510重组质粒的提取、PCR检测和序列测定，其具体实现方式是0076质粒提取方法同步骤3，质粒PCR检测所用程序和反应体系同步骤1，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测；序列测定采用T7PROMOTER作为起始引物，结果显示序列正确。0077序列测定采用T7PROMOTER作为起始引物，结果如下结果显示序列正确。0078ATGGTGCTGCTCCGGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTAAATTTGGGAATGGGA。

40、AAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAA说明书CN102021192ACN102021206A7/8页11TCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCGTAA，结果表明，所测定序列与设计序列一致。0079参见图3，该图反应了重。

41、组质粒PCR电泳图，其中泳道1是DL2000分子量MARKER；泳道25是四个平行样品；泳道6表示阴性对照；结果表明，重组质粒中含有KRINGLE5模板分子，模板分子和载体质粒连接正确。008011培养和重组蛋白的诱导表达，其具体实现方式是0081挑取上述转化后培养出的单菌落至含有5ML培养液的试管中，30220RPM振荡过夜。吸取50L培养物以1100接种于含100G/ML氨卞的5MLLB培养基中，30220RPM振荡3小时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1MM，再于30220RPM振荡4小时。离心收集菌体，用200L01MTRISHCLPH80重悬菌体并洗涤，于5000RPM离心5分钟，。

42、弃去上清液。诱导菌体以及未加诱导的对照菌体分别做SDSPAGE，染色，脱色，成像。0082参见图4，泳道1是蛋白质分子量MARKER；泳道2是未诱导对照；泳道35是IPTG诱导后的结果；结果表明，经IPTG诱导后，重组菌体在分子量约为28KD处有明显的表达条带。这表明它们是以三聚体分子形式存在的，其表达量约占菌体总蛋白的25。008312重组蛋白质表达分布位置的鉴定，其具体实现方式是0084挑取上述转化后培养出的单菌落至含有5ML培养液的试管中，30220RPM振荡过夜。吸取1ML培养物以1100接种于含100G/ML氨卞的100MLLB培养基中，30220RPM振荡3小时，加入诱导剂IPTG。

43、，使其终浓度为1MM，再于30220RPM振荡4小时。离心收集菌体，用200L01MTRISHCLPH80重悬菌体并洗涤，于5000RPM离心5分钟，弃去上清液。0085将菌体加入到5ML破碎缓冲液中，进行超声波破碎，破碎后于12000RPM离心10分钟，分别收集上清和沉淀部分，沉淀用20M尿素洗涤两次后用70M尿素溶解。上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDSPAGE，染色，脱色，成像。0086参见图5，泳道1是20M尿素洗涤沉淀一次电泳图；泳道2是2M尿素洗涤沉淀二次电泳图；泳道3是2M尿素洗涤三次电泳图；泳道4是沉淀8M尿素溶解；泳道5是上清电泳图；泳道6是蛋白MARKER；泳道7是。

44、IPTG诱导裂解液；结果表明，所表达的三聚体KRINGLE5不是以包涵体的形式存在的，它们以可溶形式存在于上清中。008713重组蛋白质的活性检测，其具体实现方式是0088采用鸡胚绒毛尿囊膜法对获得的重组KRINGLE5进行生物活性鉴定。选择表面清洁、蛋形规范、气室、气孔均匀的鸡胚已孵化79天，酒精消毒蛋气室表面，用牙科钻划刻凹痕，实验组用微量注射器注入100L纯化得到的蛋白溶液，对照组注射等量磷酸盐缓冲液，在378、CO2浓度为5、相对湿度为50的条件下继续孵育72H，观察鸡胚绒毛尿囊膜血管生长情况。然后计数单位视域面积内的一级、二级和三级血管，并计算单位视域面积内的一级、二级和三级血管所占。

45、面积的百分数。0089参见图6，该图反应了采用鸡胚绒毛尿囊膜法测定的重组三聚体KRINGLE5的生物活性，其中左图阴性对照的鸡胚绒毛尿囊膜，右图为加三聚体KRINGLE5后的鸡胚绒毛尿说明书CN102021192ACN102021206A8/8页12囊膜。结果表明，所表达的三聚体KRINGLE5具有很强的血管生长抑制活性，且其抑制血管生成活性约是KRINGLE5蛋白的三倍。说明书CN102021192ACN102021206A1/3页13图1图2说明书附图CN102021192ACN102021206A2/3页14图3图4图5说明书附图CN102021192ACN102021206A3/3页15图6说明书附图CN102021192A。

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