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1、10申请公布号CN102108389A43申请公布日20110629CN102108389ACN102108389A21申请号200910200494722申请日20091223C12Q1/68200601G01N21/6420060171申请人上海主健生物工程有限公司地址200433上海市国定路335号2号楼6楼72发明人冯哲民邹祖烨贺宪民54发明名称替比夫定耐药变异检测试剂盒57摘要本发明公开了一种检测个体替比夫定耐药变异遗传的试剂盒。该试剂盒包括检测替比夫定耐药变异位点YMDD基因RTM204位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测替比。
2、夫定用药靶向位点基因多态性来评估个体替比夫定耐药性。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页CN102108392A1/1页21一种检测个体替比夫定耐药变异遗传的试剂盒，包括特异性引物对及特异性荧光探针对，TAQ酶，DNTP混合液，MGCL2溶液，荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水，其特征在于所述的特异性引物对及特异性荧光探针对是针对YMDD基因RTM204位点多态性设计的。权利要求书CN102108389ACN102108392A1/2页3替比夫定耐药变异检测试剂盒技术领域0001本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体替。
3、比夫定耐药变异遗传的试剂盒，通过检测替比夫定用药靶向位点基因多态性来评估个体替比夫定耐药性。背景技术0002替比夫定，其化学名为12S，4R，5S4羟基5羟甲基四氢呋喃2Y15甲基1H嘧啶2，4二酮；为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L对映体，是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷类抗乙肝病毒HBV药物，对HBV复制有强大的抑制作用，优于拉米夫定，且耐药基因突变率低于拉米夫定。对人类DNA聚合酶无影响，对哺乳动物无细胞毒反应，故耐受良好。0003替比夫定为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L对映体，是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷类抗乙肝病毒DNA聚合酶药物。替比夫定在细胞激酶的作用下被磷酸化为有活性的代谢产物腺苷，腺苷。
4、的细胞内半衰期为14小时。替比夫定5腺苷通过与乙肝病毒中自然底物胸腺嘧啶5腺苷竞争，从而抑制乙肝病毒DNA聚合酶的活性；通过整和到乙肝病毒DNA中造成乙肝病毒DNA链延长终止，从而抑制乙肝病毒的复制。0004核苷类抗乙肝病毒药物具有交叉耐药的特点。发生RTM204I变异或者RTL180M/RTM204V双变异的对拉米夫定耐药的乙肝病毒对替比夫定抗病毒应答率效果降低超过1000倍。替比夫定对与RTM204V变异有关的拉米夫定耐药的病毒仍有效效果降低12倍，表现出中度的抗病毒活性。在细胞培养中，与阿德福韦酯耐药有关的RTA181V变异的病毒对替比夫定的敏感度减低3到5倍；与阿德福韦酯耐药有关的N2。
5、36T变异的病毒对替比夫定仍然敏感。0005替比夫定与拉米夫定同属于L核苷酸类似物，因此与拉米夫定具有几乎相同的耐药性位点，即YMDD位点突变为YIDD。发明内容0006本发明提供一种检测个体替比夫定耐药变异遗传靶向位点基因多态性的试剂盒。0007该试剂盒包括检测YMDD基因RTM204位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，TAQ酶，DNTP混合液，MGCL2溶液，反应缓冲液，去离子水。0008本试剂盒中所述的特异性引物和荧光探针对于本领域的普通技术人员来说是能够轻易完成设计的，特异性引物和荧光探针对可用常规的DNA合成技术进行合成。具体实施方式0009下面结合具体实施例，进一步阐述本发。
6、明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。0010实施例检测试剂盒的使用说明书CN102108389ACN102108392A2/2页40011步骤1DNA模板的抽取0012用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。0013步骤2荧光定量PCR反应0014使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总体积10L，包含浓度为20NG/L的DNA模板2L、1L10X荧光定量PCR反应缓冲液、01L25MMDNTP混合液、06L25MMMGCL2溶液、0025L5UNITS/LTAQDNA聚合酶、20M的有义引物和反义引物各0225L、10M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各025L，去离子水5325L。0015在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50、2分钟，95、10分钟，进行60个循环的95、30秒，60、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。0016步骤4基因型分析0017根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。0018熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。说明书CN102108389A。