鸡传染性法氏囊病毒广西流行代表株鸡胚增殖的最佳条件 【技术领域】
本发明本发明属生物学领域，具体是鸡传染性法氏囊病毒广西流行代表株鸡胚增殖的最佳条件。
背景技术
传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种主要危害幼鸡的急性、高度接触性、溶淋巴细胞性传染病。它既可以引起幼鸡的临床发病，也可以因亚临床的感染使导致的免疫抑制造成免疫功能下降，而使得多种疫苗的免疫应答水平降低以及抵抗力下降，从而导致多种疾病的发生，造成更大的损失。因此，IBD的有效防控不仅可免遭IBD本身所引起的直接损失，而且由于避免了IBD所引起免疫抑制，从而有助于其他疾病的防控。
疫苗预防接种仍然是养鸡业当前乃至将来很长一段时间里重要也是最有效的防控措施。在疫苗生产中，应用鸡胚来增殖病毒以生产足够多的疫苗抗原则是一种目前普遍采用而且比较有效的方法。疫苗病毒株在鸡胚中的各种增殖条件即成为疫苗抗原生产过程中最为关键的因素。
【发明内容】
本发明的目的是提供鸡传染性法氏囊病毒广西流行代表株鸡胚增殖的最佳条件。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
鸡传染性法氏囊病毒广西流行代表株鸡胚增殖的最佳条件，是通过生物统计软件设计出疫苗种毒候选株即广西流行代表株040124、BH11和TSC-2(9)在鸡胚中进行增殖时，种毒接种的途径、接胚的天龄、接种的浓度以及收获鸡胚的时间和收获的部位的正交设计组合，以探索出最佳的生产参数，为疫苗的商业生产提供有用的数据，其实验步骤如下：
1)各毒株最佳接种途径和鸡胚各部位病毒增殖产量的摸索：
选择发育良好的9天龄鸡胚各8枚/毒株，0.2mL/胚，分别进行绒毛尿囊膜接种和尿囊腔接种，收集24h-96h的死胚和出现IBDV特征病变活胚，分别收获绒毛尿囊膜、胚体和尿囊液，剪刀剪细后再用研钵磨碎，冻融3次后离心取上清，分别装于灭菌瓶内，用鲜血琼脂平板进行无菌检查，与1％鸡红细胞进行血凝试验，菌检和HA检测结果均为阴性后，即可作为毒株各部位增殖的培养物，置-20℃冰箱保存，在一个月内使用Reed-Muench法计算各病毒培养物中的病毒含量即鸡胚半数感染量；
2)各毒株最佳接胚天龄、最佳接种浓度和最佳收胚时间的摸索：
按照正交试验设计查表得出9个组合，取不同稀释度的各个病毒液经绒毛尿囊膜接种8d、9d和10d的鸡胚，每个组合接种8枚，0.2mL/胚；接种后封蜡，置37℃温箱孵育，每12h照蛋检查一次，弃去24h内死亡的鸡胚；然后分别接种后的84h、96h和108h分别取出各组的鸡胚置4℃过夜，解剖鸡胚并无菌收集其尿囊液、绒毛尿囊膜及胚体。在一个月内使用Reed-Muench法计算各病毒培养物中的病毒含量即鸡胚半数感染量；
3)结果判断：
(1)各毒株最佳接种途径和鸡胚各部位病毒增殖产量的确定：
将各毒株不同接种途径在不同鸡胚部位收获的培养物的病毒产量的测定结果经过统计学软件分析，每个接种途径三个组合之间均存在显著性差异，由数据大小可看出，绒毛尿囊膜途径接种及绒毛尿囊膜部位收获的病毒产量最高，而且从两种不同途径接种的结果均一致，鸡胚各部位病毒含量由高到低依次为：绒毛尿囊膜＞胚体＞尿囊液；
(2)各毒株最佳接胚天龄、最佳接种浓度和最佳收胚时间的测定结果：
三个毒株按照正交设计组合经绒毛尿囊膜途径接种鸡胚，收获胚毒测EID50，EID50数据都以Log10为底数，利用生物统计软件对正交设计组合的数据进行分析，绘制折线图，从折线图中可看出各个毒株的最优组合分别为：BH11在9d龄接种、病毒液浓度为104.80TCID50/0.2mL/胚和接种后96h收获；TSC-2(9)在8d龄接种、病毒液浓度为105.00TCID50/0.2mL/胚和接种后108h收获；040124在9d龄接种、病毒液浓度为104.84TCID50/0.2mL/胚和接种后108h收获。
本发明的有益效果是：本发明探索出最佳条件，为疫苗的商业生产提供有用的数据。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
鸡传染性法氏囊病毒广西流行代表株鸡胚增殖的最佳条件的实验步骤如下：
一、各毒株最佳接种途径和鸡胚各部位病毒增殖产量的摸索
选择发育良好地9天龄鸡胚各8枚/毒株，0.2mL/胚，分别进行绒毛尿囊膜接种和尿囊腔接种。收集24h-96h的死胚和出现IBDV特征病变活胚，分别收获绒毛尿囊膜、胚体和尿囊液，剪刀剪细后再用研钵磨碎，冻融3次后离心取上清，分别装于灭菌瓶内。用鲜血琼脂平板进行无菌检查，与1％鸡红细胞进行血凝试验。菌检和HA检测结果均为阴性后，即可作为毒株各部位增殖的培养物，置-20℃冰箱保存，在一个月内使用Reed-Muench法计算各病毒培养物中的病毒含量即鸡胚半数感染量。
将收获的绒毛尿囊膜、胚体和尿囊液分别用灭菌生理盐水进行10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍系列稀释，每稀释度经绒毛尿囊膜接种5个9日龄的健活鸡胚，0.2mL/胚，封蜡后置37℃温箱培养至168h，弃去24h前死亡的鸡胚不计，将在24-168h内死亡的鸡胚随时取出，统计死亡胚数，观察病变情况，同时将培养168h还存活的鸡胚进行剖检，观察胚体有无全身出血，明显水肿等病变，作好记录，然后按Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量。
距离比＝高于50％的百分数-50％/高于50％的百分数-低于50％的百分数
lgEID50＝高于50％病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
二、各毒株最佳接胚天龄、最佳接种浓度和最佳收胚时间的摸索
正交试验设计根据因子设计的分式原理，采用由组合理论推导而成的正交表来安排设计试验，并对结果进行统计分析设计的多因子试验方法。为了解决多因子全面实施试验次数过多，条件难以控制的问题，有必要选出部分代表性很强的处理组合来做试验，这些具有代表性的部分处理组合，一般可通过正交表来确定。
接种日龄、接种浓度和收胚时间这三个因素各有三个水平，按照正交试验设计查表得出9个组合，取不同稀释度的各个病毒液经绒毛尿囊膜接种8d、9d和10d的鸡胚，每个组合接种8枚，0.2mL/胚；接种后封蜡，置37℃温箱孵育，每12h照蛋检查一次，弃去24h内死亡的鸡胚；然后分别接种后的84h、96h和108h分别取出各组的鸡胚置4℃过夜，解剖鸡胚并无菌收集其尿囊液、绒毛尿囊膜及胚体。在一个月内使用Reed-Muench法计算各病毒培养物中的病毒含量即鸡胚半数感染量。
三、结果判断
1.各毒株最佳接种途径和鸡胚各部位病毒增殖产量的确定
将各毒株不同接种途径在不同鸡胚部位收获的培养物的病毒产量的测定结果经过统计学软件分析，每个接种途径三个组合之间均存在显著性差异。由数据大小可看出，绒毛尿囊膜途径接种及绒毛尿囊膜部位收获的病毒产量最高，而且从两种不同途径接种的结果均一致，鸡胚各部位病毒含量由高到低依次为：绒毛尿囊膜＞胚体＞尿囊液。
2.各毒株最佳接胚天龄、最佳接种浓度和最佳收胚时间的确定
三个毒株按照正交设计组合经绒毛尿囊膜途径接种鸡胚，收获胚毒测EID50。EID50数据都以Log10为底数，利用生物统计软件对正交设计组合的数据进行分析，绘制折线图。从折线图中可看出各个毒株的最优组合分别为：BH11在9d龄接种、病毒液浓度为104.80TCID50/0.2mL/胚和接种后96h收获；TSC-2(9)在8d龄接种、病毒液浓度为105.00TCID50/0.2mL/胚和接种后108h收获；040124在9d龄接种、病毒液浓度为104.84TCID50/0.2mL/胚和接种后108h收获。