米多霉素生物合成基因簇 【技术领域】
本发明涉及一种生物技术领域的基因簇，具体是一种米多霉素生物合成基因簇。
背景技术
核苷类抗生素是一类通常由微生物次级代谢产生的，在结构上含有修饰的核苷和核苷酸的分子的总称。它们具有广泛的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗线虫、抗肿瘤、抗病毒、除草、免疫刺激和免疫抑制等活性(J.Antibiot.(1998)41，1711-39)。米多霉素(mildiomycin)是由生裂链轮丝菌(Streptoverticilliumrimofaciens)产生的一种水溶性碱性抗生素(J.Antibiot.(1978)31，511-8)，在化学结构上包括一个5-羟甲基胞嘧啶(自然界中仅发现存在于T偶数噬菌体的DNA中)、一个特殊的带有γ-羟化的胍基和一个带有丝氨酸残基的4-氨基-吡喃-3-烯部分(J.Am.Chem.Soc.(1978)100，4895-7)，属于核苷类抗生素(结构见图1)。米多霉素并不像其它核苷类和氨基糖苷类抗生素那样容易通过细胞膜，它作用机制在于能够抑制蛋白质合成中肽键的转移(J.Antibiot.(1985)38，415-9)。米多霉素对多数细菌和真菌都有抑制活性，尤其对植物白粉病具有强烈的抑制活性。白粉病是由子囊菌纲白粉菌目(Erysiphales)白粉菌引起的植物真菌性病害。白粉菌能侵染650多种单子叶植物和9000多种双子叶植物。目前用于防治白粉病的主要是三唑类化学农药，然而，化学农药对人类的可持续发展的危害日益引起关注(农药学学报，(2001)3，12-8)。米多霉素低毒高效的特点成为良好的抑制植物白粉病的农药。目前，市场上销售的是日本武田药业(TAKADA)生产的米多霉素可湿性粉剂，由于价格较高，多用于防治高档观赏植物的白粉病原菌。
Kishimoto等人研究发现，在亚铁离子存在的情况下，培养基中添加适当的无机磷酸盐能够提高米多霉素的产量(J.Antibiot.(1996)49，775-80)；Sawade等通过用环丝氨酸(D-Cycloserine)诱变，并在含氨蝶呤(aminopterin)的平板上进行筛选米多霉素高产菌株，得到了产量是原始菌株2.6倍的高产突变株(J.Antibiot.(1997)50，206-11)。通过原生质体融合等手段，徐志南教授得到了一株突变株Sv.rimofaciens ZJU5119，其米多霉素产量比出发菌株ZD615提高了170％，达到了1015mg/L(浙江大学学报(工学版)(2006)40，1262-6)。Sawada等在Sv.rimofaciens的培养基中添加5-羟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-methyl-cytosine)、5-溴胞嘧啶(5-bromo-cytosine)、5-碘胞嘧啶(5-iodo-cytosine)和5-氟胞嘧啶(5-fluoro-cytosine)，能够分别得到一系列对应的米多霉素衍生物(J.Ferment.Technol.(1984)62，537-43)。通过改变发酵条件，我们前期还在生裂链轮丝菌ZJU5119分离到去羟甲基米多霉素、去羟基米多霉素和去羟基去羟甲基米多霉素(上海交通大学学报(2009)43，1-4)。
通过DNA重组技术可以对抗生素化学结构进行改造，提高效价、扩大抗菌谱、降低毒性，同时对调节基因的遗传工程改造还可以提高抗生素的产量，这方面的先驱Hopwood等利用来自不同链霉菌菌株的结构基因转移产生出新的杂合的抗生素(Nature(1985)314，642-4)。由于抗生素生物合成的相关基因，包括结构基因，抗性基因以及调节基因一般都成簇存在(Annu.Rev.Microbiol.(1989)43，173～06)。我们以生裂链轮丝菌ZJU5119产生的米多霉素为目标分子，从克隆其生物合成基因簇出发，阐明了合成米多霉素的基因簇。
经对现有技术的文献检索发现，尚未见到有关于米多霉素生物合成基因簇的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种米多霉素生物合成基因簇。本发明提供了米多霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，为生物合成米多霉素和遗传改造提供了基础；本发明的米多霉素生物合成基因簇及其蛋白可广泛用于农业、工业和医药领域。
本发明是通过以下的技术方案实现的：
本发明涉及一种米多霉素生物合成基因簇，其序列如SEQID NO：1所示。
所述米多霉素生物合成基因簇包含16个基因：
结构基因11个：milA，milB，milC，milD，milE，milG，milH，milJ，milM，milN和milQ；其中：
所述基因milA，位于SEQ ID NO：1的第6125～7126位，
所述基因milB，位于SEQ ID NO：1的第7252～7761位，
所述基因milC，位于SEQ ID NO：1的第7906～9165位，
所述基因milD，位于SEQ ID NO：1的第9185～10369位，
所述基因milE，位于SEQ ID NO：1的第10380～11198位，
所述基因milG，位于SEQ ID NO：1的第11627～12631位，
所述基因milH，位于SEQ ID NO：1的第12729～14948位，
所述基因milJ，位于SEQ ID NO：1的第16202～17152位，
所述基因milM，位于SEQ ID NO：1的第19548～20714位，
所述基因milN，位于SEQ ID NO：1的第20710～21483位，
所述基因milQ，位于SEQ ID NO：1的第25168～25935位；
调节基因2个：milK和milO；其中：
所述基因milK，位于SEQ ID NO：1的第17152～18477位，
所述基因milO，位于SEQ ID NO：1的第23289～22222位；
抗性基因1个：milP，所述基因milP，位于SEQ ID NO：1的第23298～24878位；
其他基因2个：milF、milI；其中：
所述基因milF，位于SEQ ID NO：1的第11194～11664位，
所述基因milI，位于SEQ ID NO：1的第14948～16027位。
所述11个结构基因编码的蛋白具体为：
所述基因milA编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示，该蛋白为CMP羟甲基转移酶；
所述基因milB编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：3所示，该蛋白为CMP/羟甲基水解酶；
所述基因milC编码的蛋白的序列如SEQID NO：4所示，该蛋白为胞嘧啶/羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶；
所述基因milD编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：5所示，该蛋白为degT/dnrT/eryC1/strS氨基转移酶；
所述基因milE编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：6所示，该蛋白为氨基糖苷类磷酸转移酶；
所述基因milG编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：8所示，该蛋白为RadicalSAM蛋白；
所述基因milH编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：9所示，该蛋白为连接酶；
所述基因milJ编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：11所示，该蛋白为精氨酸羟化酶；
所述基因milM编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：14所示，该蛋白为Asp/Tyr/Aro氨基转移酶；
所述基因milN编码的蛋白的序列如SEQID NO：15所示，该蛋白为二氢二吡啶甲酸合酶；
所述基因milQ编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：18所示，该蛋白为氨基糖苷磷酸转移酶。
所述2个调节基因编码的蛋白具体为：
所述基因milK编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：12所示，该蛋白为Majorfacilitator superfamily家族蛋白；
所述基因milO编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：16所示，该蛋白为LuxR家族调节蛋白。
所述1个抗性基因编码的蛋白具体为：
所述基因milP编码的蛋白的序列如SEQ ID NO：17所示，该蛋白为ABCtransporter。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：利用本发明的基因簇可实现以下目的：
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从生裂链轮丝菌(Sv.rimofaciens ZJU5119)基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有基因组中以前临近区域未克隆的DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失、聚合酶链式反应、错误介导聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列的重新连接、序列的不同部分或其它来源的同源序列进行定向进化(DNA Shuffling)，或提供紫外线或化学试剂诱变等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以提供合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其它更高的生物活性物质及产量。这些外源宿主包括链霉菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列可以用来分离所需要的蛋白质并可用于抗体的制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。
包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸，进一步催化合成抗生素-米多霉素。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断米多霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的米多霉素结构类似物或前体。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以用来提高米多霉素或其衍生物的产量，例如增加正调节基因的拷贝数或增强其表达以及负调节基因的敲除等。本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。
总之，本发明提供了米多霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，为生物合成米多霉素和遗传改造提供了基础；本发明的米多霉素生物合成基因簇及其蛋白可广泛用于农业、工业和医药领域。
【附图说明】
图1为米多霉素和去羟甲基米多霉素的化学结构示意图；
图2生裂链轮丝菌产生米多霉素及去羟甲基米多霉素的LC-MS检测结果图；
图3为米多霉素的异源表达示意图；
图4为米多霉素生物合成基因簇边界的确定示意图；
图5为与米多霉素生物合成的相关基因分析示意图；
图6为MilC蛋白催化胞嘧啶葡萄糖醛酸和羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的合成示意图；
图7为MilG蛋白负责4’-酮基羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的合成示意图；
图8为推导的米多霉素生物合成途径示意图。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下结合图1～8对本发明做进一步说明
图1中：米多霉素：R＝CH
2OH；去羟甲基米多霉素：R＝H
(1)米多霉素的发酵及LC-MS检测
将米多霉素的产生菌生裂链轮丝菌ZJU5119接种到TSBY(10.3％蔗糖)培养基于含有弹簧的三角瓶中30℃培养6天。调节发酵液ph至5，离心取上清进行LC-MS检测，所用仪器为安捷伦公司的Agilent 1100series LC/MSD Trap system。采用Agilent TC-C18(5μm，4.6×250mm反向柱，流动相为10m M三氯乙酸(Sigma公司)/HPLC级乙腈(Merck公司)(92∶8，v/v)，流速为0.3ml/min。质谱检测是在离子阱的正离子模式下进行。干燥气流为8l/min，喷雾器压力为40psi。干燥气温为325℃。多级质谱断裂分析轰击电压在1.0～1.8V之间。以米多霉素标准品(购自武田药业公司)为对照，结果见图2，可见生裂链轮丝菌ZJU5119不仅能够产生米多霉素，同时能够产生米多霉素的衍生物-去羟甲基米多霉素。
(2)米多霉素的异源表达
利用来自杀稻瘟菌素生物合成基因簇上的胞嘧啶核苷单磷酸水解酶基因blsM及其同源基因设计兼并引物，从生裂链轮丝菌ZJU5119的基因组文库中筛选出六个相互重叠的包含有blsM同源基因的科斯质粒。基因敲除milA和milB证明了它们是合成米多霉素生物合成的必须基因。将包含milA和milB基因的一个科斯质粒14A6提供原生质体转化的方式转入到链霉菌模式菌株变铅青链霉菌1326(Streptomyces lividans 1326)中，并将转化子在YEME培养基中(Difco酵母提取粉3g、Difco蛋白胨5g、Oxoid麦芽糖3g、葡萄糖10g、蔗糖340g、蒸馏水1000ml，灭菌后补加2ml 2∶5M MgCl
2)发酵6天。
生物测定：将指示菌红酵母接种到10.3％YEME液体培养基中，30℃摇床(220rpm/min)培养约24小时，离心收集菌体，用LB培养基洗涤一次，融化PDA培养基并冷却至50℃左右，每20ml培养基中加入100μl上述指示菌，立即混匀后倒入培养皿，使其凝固。收集20μl发酵液，利用灭菌后的牛津杯放置在制备好的含红酵母指示菌的PDA平板上，30℃培养1～2天后观察指示菌生长被抑制的结果。
HPLC-MS分析：将收集的发酵液用草酸调节pH 5.0，12，000g离心5分钟，用阳离子交换小柱(Supelclean LC-SCX，500mg/3ml，Supelco公司)处理上清。小柱先用3ml甲醇活化，上样后分别用2ml纯水和2ml 0.5％氨水洗涤，最后收集3％氨水洗脱组份供测定分析。在检测米多霉素中所用的高压液相色谱-质谱联用是安捷伦公司的Agilent 1100series LC/MSD Trap system。采用AgilentTC-C18(5μm，4.6×250mm)反向柱，流动相为10m M三氯乙酸(Sigma公司)/HPLC级乙腈(Merck公司)(92∶8，v/v)，流速为0.3ml/min。质谱检测是在离子阱的正离子模式下进行。干燥气流为8l/min，喷雾器压力为40psi。干燥气温为325℃。多级质谱断裂分析轰击电压在1.0～1.8V之间。
如图3A所示，指示菌为红酵母，I米多霉素；II和III分别是从两个携带14A6的变铅青链霉菌的发酵提取物；IV从携带空载体的变铅青链霉菌的发酵提取物；科斯质粒14A6的变铅青链霉菌1326的转化子发酵液和米多霉素标准品一样产生了抑菌圈，而空载体的转化子的发酵液不能够产生抑菌圈。图3B为米多霉素和14A6和空载体的变铅青链霉菌转化子在YEME培养基中的发酵提取物的HPLC图谱；显示了14A6的变铅青链霉菌转化子发酵液提取物中的米多霉素的峰，而空载体的转化子没有此峰。
这样通过生物测定和HPLC-MS的数据证明了科斯质粒14A6能够赋予变铅青链霉菌1326米多霉素的生产能力，也就表明了14A6包含了米多霉素生物合成所必须的全部功能基因。
(3)米多霉素生物合成基因簇的边界确定
突变株LL2(敲除milA)丧失了生产米多霉素的能力，仅能够产生去羟甲基米多霉素，证明了milA是必须基因，因此对其上游基因进行了敲除，通过筛选得到了生裂链轮丝菌突变株LL4(敲除orf-1的突变株)和LL23(敲除orf-5至orf-1的突变株)，生物测定实验结果表明它们仍然能够产生米多霉素，因此米多霉素生物合成基因簇的上游边界确定在orf-1和milA之间。LL17(敲除orf+1至orf+2的突变株)、LL18(敲除orf+3至orf+6的突变株)和LL9((敲除orf+7的突变株)的生测实验结果表明它们仍然能够正常产生米多霉素；(见图4A LL4：敲除orf-1的突变株；LL23：敲除orf-1至orf-5的突变株；LL17：敲除orf+1至orf+2的突变株；LL18：敲除orf+3至orf+6的突变株；LL9：敲除orf+7的突变株；WT：野生型；CK：琼脂块对照)；
而milQ的突变株LL11丧失了生产米多霉素的能力(图4B，从下至上分别为米多霉素；生裂链轮丝菌野生型ZJU5119和生裂链轮丝菌LL11：milQ突变株发酵液的HPLC图谱)。因此，把米多霉素生物合成基因簇下游边界确定在milQ和orf+1之间。这样，米多霉素的生物合成基因簇就确定在milA至milQ范围内。
(4)米多霉素生物合成基因簇的功能分析
通过对生裂链轮丝菌ZJU5119的米多霉素生物合成基因簇上的基因进行系统的敲除和各个突变株的发酵产物检测，这些基因在米多霉素生物合成中的相关可通过图5所示的内容阐述，其中，结构基因、调节基因和抗性基因等用不同的颜色表示。+表示基因的敲除丧失了米多霉素的生产能力；-表示基因敲除对米多霉素的生产没有影响；/表示基因的敲除降低了米多霉素的产量。包括相关的结构基因11个(包括milA、milB、milC、milD、milE、milG、milH、milJ、milM、milN、和milQ)，它们的突变株丧失了米多霉素的生产能力；负责米多霉素生物合成的调节基因(milO和milK)，LuxR家族的调节蛋白MilO的突变株样丧失了米多霉素的生产能力，而主要易化家族蛋白MilK突变株的米多霉素产量降低；米多霉素生物合成的抗性基因milP的突变株不能够生产米多霉素；功能未知的基因milF、milI和milL，其中敲除milL的突变株仍然能够正常的产生米多霉素，而敲除milF和milI突变株丧失了米多霉素的生产能力，这说明了milF和milI和米多霉素生物合成的相关性，证明了它们是米多霉素生物合成基因簇的一部份。
(5)体外反应进一步证明MilC的功能
MilC是由463个氨基酸编码的蛋白质，序列比对的结果显示它和杀稻瘟菌素生物合成中的BlsD(AAP03118)具有一定的同源性(Identities＝144/338(42％)，Positives＝180/338(53％)，e-value＝2e-49)，BlsD被认为是一种UDP-葡萄糖转移酶，负责在杀稻瘟菌素生物合成中cytosylglucuronic acid(CGA)的合成，称之为CGA合成酶。Guo等在1991年发现S：griseochromogenes中存在着催化胞嘧啶和UDP葡萄糖醛酸合成CGA的酶，并在1994年从菌体中纯化了CGA合成酶，研究发现，UDP-葡萄糖(UDP-glucose)、UDP-半乳糖(UDP-galactose)和UDP-半乳糖醛酸(UDP-galacturonic acid)都不是CGA的合适底物，同时除了胞嘧啶外，腺嘌呤(adenine)、尿嘧啶(uracil)、4-硝基酚(4-nitrophenol)和α-萘酚(α-naphthol)都不是合适的糖基配体。Cone等在分析杀稻瘟菌素生物合成基因簇的时候发现，把包含blsD的6∶5kb DNA片段克隆到pIJ702上，并在S：lividans中表达，有胞嘧啶存在条件下，能够产生CGA，表明BlsD就是Guo等人纯化的CGA合成酶。然而，Guo等人纯化的CGA合成酶大小是43kD与通过氨基酸序列计算出的Bl sD大小34∶5kD并不一致[J：Bacteriol：1994(176)：1282-6；ChemBioChem 2003(4)：821-9]。通过MilC做BLASTP仅能找到BlsD，并且在保守域的搜索中也没有如何结果。于是我们采用了PSI-BLAST。Position specific iterative BLAST(PSI-BLAST)是位点特异的迭代blast搜索，主要针对蛋白序列。第一次blast搜索后，结果中最相似的序列重新构建PSSM(位点特异性打分矩阵)，然后再使用该矩阵进行第二轮blast搜索，再调整矩阵，搜索，如此迭代。最终高度保守的区域就会得到比较高的分值，而不保守的区域则分数降低，趋近0。这样可以提高blast搜索的灵敏度。在检索结果中我们发现了一些相似的N-己酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl transferase)序列，这让我们相信MilC可能与CGA合成有关(UDP-葡萄糖醛酸为底物)，负责糖基的转移。尽管UDP-葡萄糖醛酸基转移酶在哺乳动物的异生物质代谢(Xenobiotic metabolism)中非常普遍，在真菌中也有发现，但在细菌中却很少报道。
敲除milC的突变株丧失了米多霉素的生产能力，证明了它的必要性。为了进一步研究milC的确切功能，进行了蛋白的表达和纯化，我们把MilC基因克隆到原核表达载体pET28a+上，并在大肠杆菌中进行超表达。然而，几乎所有的重组蛋白均以包含体形式存在。经过复性纯化后得到了可溶的重组MilC蛋白，如图6A所示，其中，MW：蛋白质分子量标准；泳道1：透析后重新折叠的可溶性蛋白；泳道2：从可溶性蛋白中纯化的MilC。
分别以胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶为底物，分析它们在MilC的催化下与UDP-葡萄糖醛酸(UDP-glucoronic acid)的作用，结果见图6B，(以失活的MilC作为对照)。在A中，经过30分钟的温浴，做为对照的加入煮沸失活的MilC的HPLC图谱显示仍然只有底物胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸(下部)，而在上部的HPLC图谱中可以发现，不仅存在着胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸，而且出现了两个产物UDP和cytosylglucuronic acid(CGA)，它们的保留时间，紫外吸收和MS都与标准品一致。在B中，经过30分钟的温浴，做为对照的加入煮沸失活的MilC的HPLC图谱显示仍然只有底物羟甲基胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸(下部)，而在上部的HPLC图谱中可以发现，不仅存在着羟甲基胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸，而且出现了两个产物UDP和HM-cytosylglucuronic acid(HM-CGA)。可见，胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶都能够在MilC的作用下与UDP-葡萄糖醛酸反应，分别生成CGA和HM-CGA。在对糖基供体的实验中，MilC不能够催化UDP-葡萄糖(UDP-glucose)和胞嘧啶或羟甲基胞嘧啶的反应。
MilC的酶动力学参数的研究具有非常重要的意义，因为它可以表明对于胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶哪一个是酶的最适底物。因此，我们在反应体系中加入过量的UDP-葡萄糖醛酸，来计算胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶对MilC的米氏常数，结果见图6C和表1，可见，MilC对胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶来说有着近似的Km值，但胞嘧啶的Kcat值却是羟甲基胞嘧啶的1.9倍，可见对MilC来说胞嘧啶是更适合的底物。
表1MilC对胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶的酶动力学参数比较
胞嘧啶 羟甲基胞嘧啶
Kcat(10-4s-1) 1.070±0.0037 0.5623±0.0257
Km(μm) 200.0±18.26 206.8±24.49
Kcat/Km(M-1s-1) 0.5250±0.0019 0.2719±0.0012
MilC在米多霉素生物合成途径中所催化的反应如图6D所示。
(6)检测到中间产物进一步证明Radical SAM家族蛋白MilG的功能
milG编码一335氨基酸残基的蛋白，通过对MilG的Pfam数据库检索发现它属于一类被称为Radical SAM的超家族蛋白(Radical SAM superfamily，PF04055)。这类蛋白通过一个特殊的铁硫中心来还原性的分解S-腺苷甲硫氨酸(SAM)产生自由基。这类蛋白家族的发现表明了自由基依赖的催化反应对以前未能解决的一些复杂的化学反应途径的重要性，同时也反映了这个家族蛋白既古老而又保守的性质。Radical SAM能够催化多种反应，包括特殊的甲基化反应、异构化反应、硫的搀入、成环反应、厌氧氧化反应和蛋白自由基的形成等。它们在DNA前体物、维生素、辅酶、抗生素和除草素的生物合成和生物降解过程中起着重要作用，如赖氨酸2，3变位酶(lysine 2，3-aminomutase)、孢子光合产物裂解酶(spore photoproduct lyase)、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formatelyase)、厌氧核糖核苷酸还原酶(anaerobic ribonucleotide reductase)和生物素合成酶(biotin synthase)等(Chem：Rev：2003(103)：2129-48)。
图7A(MIL：米多霉素；WT：生裂链轮丝菌野生型ZJU5119；LL8：生裂链轮丝菌milG突变株LL8，羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的化学结构显示在图上)显示敲除milG的生裂链轮丝菌丧失了生产米多霉素的能力，同时，在突变株的发酵液中，中间产物羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸([M+H]/Z 318)得到了大量积累，这表明了MilG可能是以羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸为底物，同时，在整个米多霉素生物合成基因簇中，milG是唯一一个可能编码参与氧化反应的基因，因此推断MilG负责催化羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的糖上碳4位羟基氧化成羰基，milG是米多霉素生物合成所必须的基因，在米多霉素生物合成途径中它所负责的功能如图7B所示。
(7)米多霉素生物合成基因簇中各种基因的作用
根据前面对蛋白MilA、MilB和MilC的功能研究，已经能够明确了从CMP出发至合成出(羟甲基)CGA的步骤。而米多霉素生物合成基因簇边界的确定、各个基因的敲除和生物信息学的利用提供了米多霉素生物合成基因簇中各个基因的作用。
milG的功能：由羟甲基CGA出发合成米多霉素需要在碳4位上转入氨基，而转氨基之前的羟基必须被氧化成羰基。MilG是一类Radical SAM，它能够利用自由基来催化许多在化学上及其难以发生的反应。而MilG的中断突变株生裂链轮丝菌LL8的发酵产物中羟甲基CGA的大量积累则支持了我们的判断。同时，在其它的突变株中未能找到积累的中间产物的原因可能就是MilG作用后的中间产物的不稳定性。通过和杀稻瘟菌素的生物合成基因簇的对比，同样发现的一个Radical SAM-BlsE，考虑到米多霉素和杀稻瘟菌素的结构上相似性，MilG和BlsE可能就就负责(羟甲基)CGA的糖基的碳4为上羟基的氧化，转化为羰基。
milM和milN的功能：对于精氨酸侧链和葡萄糖醛酸的缩合反应，类似于MilN催化的二氢吡啶甲酸合成，即半醛和酮酸的缩合。而MilM这个氨基转移酶可以将精氨酸脱去氨基转化为α酮酸，而MilN催化α酮酸和脱羧的己糖的反应。milM和milN的基因中断突变株都失去了生产米多霉素的能力。
milE和milQ的功能：关于糖基部分2位碳与3位碳间双键的形成也是米多霉素生物合成途径中非常特殊的反应，尽管现在没有直接的证据显示哪个基因与此相关，但通过生物合成基因簇边界确定和基因中断实验，我们认为很可能是MilE和MilQ这两个磷酸转移酶负责这个双键的形成。milE和milQ的基因中断突变株都失去了生产米多霉素的能力。
milD，milI和milH的功能：对于丝氨酸残基侧链的形成，MilD是个degT/dnrJ/eryC/strS类型的氨基转移酶，它可以在被MilG氧化成羰基的4位碳上转入氨基。MilI包含一磷酸泛酰巯基乙胺结合位点，磷酸泛酰巯基乙胺是一些多酶复合体中的酰基载体蛋白的辅基，它作为一个结合活化的脂肪酸和氨基酸基团的摆臂，因此MilI可能参与的丝氨酸的活化。MilH作为一个具有ATP结合位点的连接酶可能催化丝氨酸残基和糖上碳4位的氨基之间的缩合反应，形成类似肽键的酰胺键。对比杀稻瘟菌素的生物合成，MilH的同源蛋白BlsK可能同样负责氨基酸残基和糖的结合，同样，在杀稻瘟菌素的生物合成以及嘌呤霉素的生物合成途径中，催化这一反应的都是连接酶，而并不是NRPS(ChemBioChem2003(4)：821-9)。
负责米多霉素生物合成的调节基因milO和milK，LuxR家族的调节蛋白MilO的突变株样丧失了米多霉素的生产能力，而主要易化家族蛋白MilK突变株的米多霉素产量降低。这说明了两个调节基因在米多霉素生物合成途径中的重要作用。米多霉素生物合成的抗性基因milP的突变株不能够生产米多霉素，所用它是合成的必不可少基因；milJ做为米多霉素生物合成基因簇中唯一的氧化还原酶基因负责精氨酸的羟化反应。敲除milF突变株丧失了米多霉素的生产能力，这说明了milF和米多霉素生物合成的相关性，证明了它是米多霉素生物合成基因簇的一部份。
根据体外酶活实验、体内突变实验和生物信息学分析整个基因簇的的功能，总结如图8所示。
实施例
步骤一，米多霉素产生菌生裂链轮丝菌ZJU5119总DNA的提取
接种链轮丝菌至TSBY(10.3％蔗糖)培养基于含有弹簧的三角瓶中30℃培养48h。离心收集菌体，重悬于5ml SET缓冲液中(75mM NaCl，25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl pH7.5)。加入100μl溶菌酶溶液(50mg/ml)，置37℃约60分钟。溶菌后然后加入140μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)混均匀，再加600μl 10％SDS，通过颠倒混匀，置55℃温浴2h，期间偶尔颠倒几次。再加入2ml 5M NaCl，彻底混匀，冷却置37℃后，加入5ml氯仿，于室温轻轻混匀。20℃、4500g离心15分钟。转移上清至新管中，加入0.6倍体积的异丙醇颠倒混匀，约3分钟后用玻棒挑取至含70％(v/v)乙醇的新管中洗涤，重复2次，空气中干燥，溶解在TE中。
步骤二，生裂链轮丝菌基因组文库的构建
(1)链轮丝菌总DNA的部分酶解和大片段DNA的回收
将提取的链轮丝菌总DNA用Sau3AI部分酶解，用1％低熔点琼脂糖凝胶，在装有0.5倍TBE电泳缓冲液的脉冲场电泳(Pulse Field Gel Electrophoresis，PFGE，Bio-Rad)中分离。回收约40kb大小的DNA片段。用热敏的碱性磷酸酶(APex
TMHeat-Labile Alkaline Phosphatase，EPICENTRE Biotechnologies公司)处理是末端去磷酸化，供载体的连接及包装转染用。
(2)柯斯质粒载体的构建和处理
为了方便在链霉菌中做异源表达，从pOJ446和pSET152质粒出发，构建了新的可整合在链霉菌染色体的穿梭柯斯质粒载体，pOJ446被XbaI和XhoI双酶切后，包含多柯斯位点的部分和来自pSET152的用同样酶切的包含整合酶和attP位点的片段连接。将提取的pJTU2554质粒用单酶切位点的HpaI酶切成线性片段，然后用CIAP(NEB公司)酶处理末端使其去磷酸化，然后再用BamHI酶切成两条片段。
(3)连接和包装
将处理好的链轮丝菌基因组DNA(大小约40kb)和柯斯质粒载体按照1∶1分子数比例用T4连接酶(NEB公司)连接。将在冰上溶解的噬菌体包装蛋白(MaxPlaxLambda Packing Extracts，EPICENTRE Biotechnologies公司)加入连接产物中，混匀，避免产生气泡，短暂离心，在30℃中温浴90分钟，再加入另一份包装蛋白，继续温浴90分钟后加入噬菌体稀释缓冲液(Phage Dilution Buffer，100mM NaCl，10mM MgCl，10mM Tris-HCl pH8.3)至1ml，并加入25μl氯仿，4℃保存。
(4)转染与保存
将大肠杆菌EPI300培养至OD
600＝0.8～1.0作为感受态菌，可在4℃保存72h。将包装产物与感受态菌混合，37℃温浴20分钟后涂含阿伯拉抗生素的LB平板。37℃培养过夜。挑取单克隆至含抗生素的LB培养基96孔板中继续培养18小时，加入灭菌的甘油至终浓度20％，于-70℃中保存。
步骤三，基因组文库的筛选
采用PCR的方法从基因组文库中筛选所需要的柯斯质粒。为筛选基因组文库，从每个板的96孔孔中取出等量菌液混合，接种培养，提取质粒为一个模板进行PCR筛选，在得到的阳性平板中，从每排的12个孔中取出等量菌液混合，接种培养，提取质粒为一个模板进行PCR筛选。然后在那些阳性的排中进行单个的PCR筛选，直至筛出所有阳性克隆。
步骤四，双交换基因置换质粒的构建(以pJTU412为载体，目的基因被壮观霉素抗性基因替换)
基因置换载体的构建采用PCR-Targeting方法。因为构建文库所用的柯斯质粒(pJTU2554)在链霉菌中属于整合型载体，会将整个质粒片段整合到染色体上的aatB位置，所以不适合用于基因置换。因此，首先要构建中间载体，本研究采用的是以pJTU412为载体，它是一种大肠杆菌链霉菌的穿梭质粒，具有在链霉菌中遗传不稳定的特点，在非抗性选择的条件下，质粒极容易丢失。将基因组文库中筛选到的负责米多霉素生物合成的柯斯质粒酶切，连接到经相应限制性内切酶酶切的pJTU412载体上，构建了中间载体。分别将各中间载体转化至含有pIJ790质粒的大肠杆菌BW25113中(E.coli BW25113/pIJ790)中制备成感受态细胞，以通过PCR扩增的pIJ779或pIJ778中含有的aadA基因(带有与目的替换基因两侧同源的尾端)DNA进行电转化，得到基因置换质粒，并转化到大肠杆菌ET12567中以消除DNA甲基化影响。
步骤五，融合蛋白的表达
(1)表达质粒构建
本实施例均以pET28a+(Novagen公司)为表达载体，将待表达的基因用高保真的KOD酶和带有限制性酶切位点的引物扩增出，酶切后连接至相应酶切处理的表达载体上，构建成融合表达质粒，并转化至大肠杆菌DH10B中，测序正确后，将质粒转化到含有pLysE质粒大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)。
(2)融合蛋白的表达
含有融合表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)接种到含氯霉素和卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜。然后将10ml的种子接种到1L的含相应抗生素的LB培养基中培养至OD
600＝0.6，将培养温度降至28℃，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养5小时。
(3)融合蛋白的纯化
12,000g离心5分钟收集菌体，然后重悬于25ml的裂解缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)，反复冻融两次，放置在冰浴中，用超声波仪破碎细胞和打断DNA分子(60s 10次，每次间隔60s)，然后在4℃，16,000g离心45分钟。
对可溶性融合蛋白，取上清过镍金属鳌合小柱(HisTrap HP column，GEHealthcare公司)，用
![]()
FPLC(GE Healthcare公司)纯化，采用线性方式用洗脱液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)洗脱，收集蛋白，用SDS-PAGE电泳来鉴定。纯化后的蛋白用脱盐柱(HisTrap Desalting column，GE Healthcare公司)进行缓冲液置换，置换为50mM的Tris-HCl(pH7.4)缓冲液，加入甘油至浓度20％，保存于-80℃。对不可溶蛋白，则收集细胞破碎后的沉淀物，按照蛋白复性试剂盒(Protein Refolding Kit，Novagen公司)的说明书进行蛋白复性，然后在按照上述对可溶的重组蛋白的纯化方法进行纯化。蛋白定量采用Bradford方法(Bradford Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)。
【序列表】
<110>上海交通大学
<120>米多霉素生物合成基因簇
<160>18
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>43561
<212>DNA
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>1
ccaagcttgg gctgcaggtc gactctagag atatcggatc accgtcagct tctcgcaggt 60
ctcgccctcg gcggcgatga cctgcccggc ctcgaaggcc accggctcga aggcgcccgc 120
gagttcggcc agtaaggcct cgtcggcctc gcgcaggaag ggcagttcgc gcaggtcctc 180
ggggacgacg cggtgcgcgc cgccctcgct gtagcagctg atgcggtcgt cgccgaggat 240
gaacgtccgg cggcggttga cgcggtagac accggactcg acgtcgaccc agggcagcgc 300
gcgcagcaga tagcgcggcg tgatcccgcg catctgcggg gtggtcttgg tggtcgtggc 360
caactgccgt gcggcatcgg gcgcgagact gagacgatcg ttcatgcggt cctcctcgaa 420
gagcccgcgc ggcagcccgc gcgggagcgc agaccgatcg tccggtcggt gggttcgtgt 480
cacaagacag gggattccga cacggtccgg aaatgatcga ctggcggagt gtgatgccgc 540
ggccctcgat ccggggcaag ggcttcaccg ccgcgcgccc gcttggtccg gaccgcgaga 600
tgaccggatt ccacccactg agacccgcct cccgggcgcg tcgcaccgac ggggcagcgc 660
aaaaccgccc tcgccgccgg ttcggtcccc cgaaaaccgg tcccgtcccc gaagcagaac 720
cgcccctacc gcccccggaa aacagaaccg ccccgatccg gtgatccgga tcggggcggt 780
tccacaagcg gtagcggtgg gatttgaacc cacggtggag ttgcccccac acacgctttc 840
gaggcgtgct ccttaggccg ctcggacacg ctaccgagag agagcttagc ggacggtggg 900
ccgtgctctg aaatccgttc cccggtgaca gggtgtggtg ctggtcaccg gtcgcggaag 960
aagcgggtga gtagctcggc gcagtcgtcg gcgaggacgc cggtgacgac ctcgggacgg 1020
tggttgagac ggcggtcgcg gacgacgtcc cagagggagc ccgccgcgcc ggccttctcg 1080
tcgacggcgc cgtagacgac gcggtccagg cgggagagga cgatcgcgcc cgcgcacatc 1140
gtgcagggct ccagggtgac gacgagcgtg cagcccgaca ggcgccactc gccgacggcc 1200
cgcgcggcct cgcggatggc gaggacctcc gcgtgaccgg tggggtcgcc ggtggcctcg 1260
cgctcgttgc ggccgcggcc gatgacggag ccgtccctgt ccagcacgac ggcacccacc 1320
ggcacgtcgc cggtggcggg ggccgccgcg gcctccgcca gggcggcccg catgggagcg 1380
acccaggggt cgcgcaccgg gtcggggacg gggacggctg cgtcgtggac ggcttcgttc 1440
atggcaccag tgtgagcgca cccgccctgg cggacgtcag cggacggcct ccaggacgtc 1500
ggtgcagccg agggcctcgg cgatcgagcc gagggcgtcc ccgtccagcg acaggatctc 1560
cttctcgctc accccgaggt cctccaggag cctgccgtcg cccagcgggc cgctgggcgc 1620
gacggaggcg cccgccccgt cgtcgctctc gtcctcctcc gtctcgggtt cgccgtcctc 1680
ggtgccgtcg aggtcgaggg tgtccagcgc gtcgtcctcg tcgtcgtcgc ggccgacgag 1740
ctcgtcgacg agcatcgccc cgtacgagct gcggttggcg acgacggcgt tcgagacgta 1800
gacccggggg tcgtcctcgc cgtccacccg gacgacgccg aaccaggcgt cctcctgctc 1860
gatgagcacc aggaccgtgt cgtcgtcgta cgaggcctcg cgggcgaggt cggcgatgtc 1920
ggacagggtc tccacgttgt cgagttctgt gtcgctcgct tcccacccgt cttcggtgcg 1980
cgcgagcatt gcggcgaagt acaccgtgac tctcccactg gtcataggcg gtgccgggtc 2040
ggacggggac caccccgccc actcggaatc gtggcagaaa cctgggcgtt gcgagaggtc 2100
ttccgcgctg cgtcgtgcag cagtccgaga gatgtcgctc acgtggggcc cgtgagggcg 2160
ccgtacgggc gtgacgcggc gcgacacggt gcggcatggt gcgacgcggc gccctgggcg 2220
tggcgcggac gggtccgccg ggacggtcac cagcggaagg tgcgcatccg catctgctga 2280
cgcatccggg ccgcccgggc ccggcgcggc tggacgcggt cgcgcagctc cttggcctcg 2340
ttcagctcac ggaggaactg ggcccggcgc cgtctgcggt cctcggcgct ctcggggctc 2400
tcgtccgggt cggcggcctc ccggggccgc cgggggtccg gccgctcgcc gccgggcgtc 2460
cggcgccggt cctcgcggcg tttcccggtg tctatggagt ccggttcccg ggtgtccgct 2520
tccgctgtct cccggggcgt ccgggcaccc gacccggatc cccgcctgtc atggccggcc 2580
atgggcagca ccacctcgtg ccgaggtcct cgcccggcga caggccgggc gtacgtgccc 2640
actttccccc taagtggtgg tttgatgcca gggctgcgac agaccgtcga agcctcgccg 2700
aagccccgcc gtggcgcctc ggcgggagcc cgggcattaa agctcggtta atgtcgatgt 2760
catgcggatc cacgtcgtcg accaccccct ggtggctcac aagctcacca cgctgcgcga 2820
caagcgcacc gattccccca ccttccggcg cctctgcgac gagctggtca ccctgctcgc 2880
gtacgaggcc acgcgcgacg tgcgcaccga gcaggtcagc atcgagtccc cggtgaccgc 2940
caccaccggc gtccggctct cccacccgcg tccgctggtg gtgccgatcc tccgggccgg 3000
cctgggcatg ctggacggca tggtccggct gctgccgacg gccgaggtcg gcttcctcgg 3060
catgatccgc aatgaggaga ccctcaaggc ggagacgtac gcgacgcgca tgccggagga 3120
cctctccggt cgccaggtct acgtcctgga cccgatgctc gccaccggtg gcacgctcgt 3180
cgccgcgatc aacgagctga tcgcccgtgg cgcggacgac gtcaccgcga tctgcctgct 3240
ggccgcgccg gagggcgtcg aggtcatgga gcgcgagctc gagggcgcgc cggtgaccgt 3300
cgtcaccgcg tccgtggacg agcggctcaa cgagcacggc tacatcgtcc cgggcctcgg 3360
cgacgccggc gaccggatgt acggcaccgc gggctgaccc ccgagccggt ttccctctcc 3420
tccgcccgcc gacctcggcg accgcccggc gccgtcctcg gcgaccgccc ggcggccgag 3480
ctcagcgtct gcccggccgc cggcccaggc gaccgcccgg cgccgtcctc agcgaccgcc 3540
cgccgccctc agcacttggc ggcgggcgag cccggtgcgg ccgacgccga cggcggggga 3600
gagcccgtgg cgccgggcga ggccgacacc gagggcgcgg gccggcccgt gaggccggtc 3660
agcgccttgt cggcctcctc ctggggcatg agcccctgaa aggccgcccc cagcacgagg 3720
tcgacgtcct gtccctcgcg ctggtcgctc ttgggctccg ccccggcgag ctgggtgccc 3780
agcacccgga gcgcgccctc cagggactcc tgggacccca gcagtatgcc ggtgccctcc 3840
accttcttgt cgtagtcggc ctgggcgttg cccaccttgc cgatcctgaa gccgcgcttc 3900
tccagctcgt ccgccgtgat cttggcgagc ccgccgcgcg gcgtggcgtt gtagacgttg 3960
acggtgatgt cgccgggccg gggcaggtcc ctgggcagct tccgggcggg gacccgggcc 4020
gcgtcggccc cgctcttgca gtcgccgctc cgctttcccg aagccgcggc ccgcgtcgga 4080
gcgggcccgc ccgagaagac gtcgacgagc tggaccgttc cccacccggc cagccccagc 4140
acgacggccg tggcggtgcc ggcgagcacg atcctgcggc ggttccgggt gcggcgcata 4200
tgcgggaacc gatggcccgt gatgcggtac ttaccaccca tgccaggagg ggtgagcatg 4260
ctcatgagcg cagcgtagtg ccgggcggag ccgctgccta ctagatgatc aatgggttgc 4320
ccggacccct acccaaaagg gccaataacc gcccatgcga ccgtttttcc ggagggcggt 4380
acgagcccgg aacgacggcc cggaaagcgc ccggtccgca tatcggtccg ggaatcgaca 4440
aaagtgccga acgaagcgcc gagacggcgg ccggacgggt gacggccccg gcggtcagtc 4500
cagttcgagc acgcgcgcgt gcagcacctg gcgctgctgc agcgcggccc gtacggcccg 4560
gtgcagcccg tcctccaggt agagatcgcc ccgccacttc acgacgtggg cgaagaggtc 4620
cccgtagaac gtcgagtcct ccgcgagcag cgtctcgagg tcgagctgct gcttggtggt 4680
caccagctgg tccaggcgta ccgggcgagg ggcaacatcc gcccactggc gggtgctttc 4740
ccggccgtgg tcggggtacg gccgcccgtt tccgatgcgc ttgaagatca cacggaaagc 4800
ctaccgggcg agcggctccc ggcgcagcca tggcgcggga gtgcgatggt gacaatcagc 4860
cgcataccgg gagtgatgca tggaactctt gagcgagaat tctttcgtca gagctccgga 4920
ttccggatgg ggtccaccgg aatccgctcg cccgggccgt tccccgccgc cgcgaccgcc 4980
cgctcactcg gcgatctcgg tccgctccca ccactcgtag acgggcagcc tgccctcggc 5040
ggtgtcctga tgccgcgagg tcttcttgaa gtgctcgtag ccgcccttga acgggatctt 5100
cagctcgacc ccgggagggg tgatcgtgac gacccgctcc ggaagatcgt ccggaccgcc 5160
ttcgaggaat gctttgggag cgctgctcat gggggacagt cttccggcgc tccccgccgt 5220
acgtgcggcg cgacgcgccg caggccgagg gggcgggcgt cacgccttct tgaccgccgt 5280
cttcttggcg gctcgtttca tttcctgctt gtaggcccgg accttgtcca gggactccgg 5340
cccggtgatg tcggccaccg agcggtacga ccccgcctcc ccgtaggagc cggccgcctc 5400
ccgccagccc tccggcgtca cccccagtcg cttgcccagc agcgccagga agatctgcgc 5460
cttctgcttg ccgaaccccg gcagcgcctg gagccgctcc agcagttcgc gccccgtcgc 5520
cgcgccggac cacaccgcgc tcgcgtcccc gtcgtacgtc tcgaccagat ggcggcacag 5580
ctgctgcacc cggcccgcca tggaccccgg atagcggtgc acggccggct tctccgcgca 5640
cagcgcggcg aacgcctcgg ggtcgtacgc cgcgatctcg tgcgcgtcca gatcgtctcg 5700
cccgagccgc cgggcgatgg tgtacgggcc ggtgaaggcc cactccatcg ggatctgctg 5760
gtccagcaac atgccgacca gggcagccag cgggctgcgc gagagcaggg cgtcggcgtc 5820
gggctgctgg gcgagccgga ggggacggtc catgggccga tggtccctcc gggagggcgg 5880
cggcgcatgc cgtcccggcc gttcggcggt gtcgggtggt ggtgcccggt cgtgtcgccc 5940
ggtcgtgtcg ctcggtggtg tccgccggtg ccccggggtg tccaccggtg ttctgtggtg 6000
tcagcaattg cggtctgcag ctagtggtca acgcggcggc attggtccgc ggcccggccc 6060
tgggcaggat ggcggacgcc gatcggcaag tcctgtggta cctcactatt acgggcgggc 6120
agtgatggaa acccatacgt tcgggacgtt ccaagacgct tatctgagcc agctgcgcga 6180
catctaccac tcaccggaat tccgtaacgc accgcgtgga caggcgagtc gcgaacggat 6240
cggcgccgga ttccggctgc tggatcccgt gcagcgccac atatccgtgc cggcccggcg 6300
cgccaacgtc gtgttcaact tcgccgaggc gctctggtac ctctccggct ccgaccgcct 6360
cgacttcatc cagtactacg cgcccggcat cgcggcctat tcggccgacg ggcggaccct 6420
gcggggcacc gcctacgggc cccgtatctt ccgccacccg gcgggcgggg tgaaccagtg 6480
ggagaacgtc gtcaagacgc tgacggacga ccccgacagc aaacgggccg tcatccagat 6540
cttcgacccc cgggaactgg ccgtcgccga caacatcgac gtcgcctgca ccctggccct 6600
gcaattcctg atccgcgacg ggctgctctg cggcatcggc tacatgcggg cgaacgacgc 6660
cttccggggc gccgtgagcg acgtcttctc cttcactttc ctgcaggaat tcacggcccg 6720
ctatctcggg ctcggtatcg gcacgtacca ccacgtcgtg gggtccgtgc acatctacga 6780
cagcgacgcc cggtgggcgg agcgggtgct ggacgccgcg acgccggacg gcggcccgcg 6840
gcccggcttc cccgccatgc cggacggcga caactggccg cacgtccgcc gtgtactgga 6900
gtgggaggaa cgcctccgca cgaacgcggc gcgcctctcg gcggacgccc tggacgccct 6960
ggacctgccc gcctactgga agcacgtcgt ggcgctgttc gaggcccacc gtcaggtccg 7020
gcacgaggac acgcccgacc gggcgctgct cgccgcgctg cccgaggtct accggcagtc 7080
gctggccgtc aaatggcccg gccacttcgg ctctccggcc ggctcctgac cccgatcggc 7140
tcctgacctc ggtccgttcc cgaccccggt ccgttcccga ccgttcgccg ggcacgcccg 7200
gacgacgcga ccccaccaga gacgcgaccc caccagaaag gaacaacccc ggtgaccacc 7260
acccccaagc cccgtaccgc ccccgcggtc ggctcggtct tcctcggcgg gccgttccgc 7320
cagctcgtcg acccccgcac cggtgtgatg agcagcggtg accagaacgt cttcagccgc 7380
ctcatcgagc acttcgagag ccgcggcacg acggtctaca acgcccaccg ccgcgaggcc 7440
tggggcgccg aattcctgtc gcccgccgag gcgacccggc tcgaccacga cgagatcaag 7500
gccgcggacg tcttcgtcgc cttccccggc gtcccggcct cccccggcac ccatgtggag 7560
atcggctggg cgagcggcat gggcaagccc atggtcctgc tgctggagcg cgacgaggac 7620
tacgcgttcc tggtcaccgg tctggagagc caggccaatg tggagatcct ccggttctcc 7680
ggcaccgagg agatcgtcga gcggctggac ggggccgtcg cccgggtgct gggccgggcg 7740
ggcgagccga cggtcatcgg ctgaggcgcg gcccgcatgg acctcttatc ggcggcccgg 7800
gcggaccggg cggatcggtc ggaccaggcg gatcggccga ctcggccgga cggagcggat 7860
cgggcggact ggacggctcg ggcggacgga cccgtgaccc tggcggtggc gggtgccgag 7920
ttcggctggg ggagcgcggg gaagctggcc gcgatcgtcg ccgcgttgcg cgaacggcac 7980
ggcgagcggg tccggttcgc cggcctgggc tccgggctcg ggcgccccgt gctgggcgcc 8040
ctggacgccc gcgactggac ggacgtgccg gagccgggcg acggcccggc gggcgaggcc 8100
gcgctggcgg cgctgctgcg cgagcggggc gtggacgcgg cggtcgtcgt cctcgacggc 8160
ctgctggcgg cccggctgga ggcggtgggg tgtcccgtcg tctacgtcga cagcctgccc 8220
ttcctgtgga ccgagcacga cttcgtcccg tccggagtcc acacctactg cgcgcagttg 8280
tgcccctcgc tgccccggca gagctggccc gtgctgcgcg ggatcgaggc actgcgctgg 8340
gtggaaccgg tggtgggcac gtacggggcc ggcggcctcg acccggtgcc ggggaaggcc 8400
gtgctcaacg tcggcggcct gcgctcgccg ttcaccgccg aggacgacga ctcctatgtg 8460
gagctcgtcc tgggccccgc cctgcgggcg ctgcgggcgg cgggcttcgg acaggtcgtg 8520
atcagcggca atgtggatcc cggcctggcc cgggtgccgc acgccggtac gcacgggctg 8580
accgtgacgg cggggcggct ggaccacggc gcgttcatcg aggaactgcg cacggcggag 8640
ctgctggtga cctcgccggg ccgcaccacc ctgctggagg cggcggcgct cggccagcgg 8700
gccgtcgtcc tgcccccgca gaacttcagc caggtcatga acgccgcgga cgtcgcggac 8760
ctggtggacc cggccgtcgt ggtcccctgg ccggccgccg tcctggacct ggccgagctg 8820
gcccgggtcc gcgaccaggg cgaggagggc gcggtgcggc tgatgtacgc ccgtatcgcc 8880
gcggcgcgcc gggagccggg gacggtggcc ggcccgctgg ccgacgcgct cggcgccgcc 8940
gtcgcccacg tccgccggca cgacgtccgc atggggccgt tcgccggcac ggacgggagc 9000
ggcgcgggaa cgcgaggcgc gggaggcgca agagatacag gaggcgcagg aggagcgcgg 9060
agtgtggcgg acgccgtcga cgagctgatc gggaagctga cggacggccc ggccgccggg 9120
aatcgcaggg acggatcacc actggcggcg ccggtccggg cgcgctgagg gagagaagga 9180
agcgatgcgg caccccaggg aactcaggca ggacacctcg ctcgcgatca acggggggac 9240
ccccacgttc gccgcgctcc cggaggagga caccgggatc gtggccgagg ccgccgacga 9300
ggtggcggag ctgatcagga ccaggcgcac cgtccactgg ggcggcggcc cccacacccg 9360
cgtcctggaa cgggacttcg cggccctcgt cggccgggag cgcgcgttct tccacaactc 9420
cggcacggcg gccctgcaga ccgccctctt cgccctggag gtcgaggagg gcacccccgt 9480
cgccctcagc gactccggtt tcgtcgccag tctcaacgcc ctctaccacc tccgggcgcg 9540
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ccacggcgcg cggctgcggg gccggccggt cggctccttc gggaccgtcg gctccttcgc 9780
gggctcgacg aagaagctgg tcaccgccgg gcagggcggg ctgaacgtcc acgacgacga 9840
gcacctggac tggcggatgc gcacctacgc gcaccacggc aagtccggga actacgaagg 9900
gacgttcccc ggctacaact tccggggcgg ggagatggag gcgatcctcg cccacgccgc 9960
cctgcggcgc ctggacgagc gcgtcgcggc ccgcaaccgc accgccgaca cgatgttccg 10020
gatcttcgac gaggccggga tccgcaccgc gcgcccggcg cccggactcg actgctcgcc 10080
cgcctggttc gacgtcgcgc tgatcctcga cgaggagtgg ctgggccacc gcgactggct 10140
ggtcgaggcg atggtcgccg acggcatccc cggctggcac tacccggcgc tgatcggcat 10200
gccctgggtc gagccgtgga tgcgatccaa gggctggtgg ggcgagcgcg aacaggagct 10260
gctcgcctcg gagaccgcgc tgtggggccg caccctcgtc ctcggcgccc agatgaacgc 10320
cgtggacgcc gagcggatcg cccacgccgt cgtggcgctg ctcaagggat gacacggcga 10380
tgacctgcgg cgagatctcc gaggtgcgcc gggtgctgcg ccggctcggc gacggcgggc 10440
cgcgttccgt ccgggtcagg gagaacggga actgcgcggt gtacgtgggg gaccggctcg 10500
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tcgcccggga tgcgggggtg cccgcccccg agcggatcga cgagggccgg ctgcccggcg 10620
ggcgtacgta cgtggcgtac gtgtacgtca tgggcacccc ggccgggacg cccgcctccc 10680
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ccgtggcgca caacctgccc cggcgcaggg accgttaccg cacggcggtg cggtgcgcgc 10800
gggccgccgg gctcgcgccc ggcggcctcg cccaccgctg tctgctgcgc gcggcggacg 10860
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tccggggccg gggggtgagg gccgtcctgg actggagcga cgcccgcgcc gccagccccg 10980
agagcgatct gggccagctc gggcccgggc agctgcgccc gctcctgcgg ggctatctgg 11040
accgtgcccg gcgcgccccg gacctggagc tggtggccgg gcacatgctg gcccggcatc 11100
tcgccctgga ggccgccggg gtgttcccgg cgggcacgtc ggcggcgctc gcccggaggt 11160
tcgggccggg gctgtcccgg gggaggtgga ccgttgcctg accggagtcc ggcggccgag 11220
ccgctgatcc tcgacgtcgg cagcgcgggc cagctcgcgg agctggccgg cgacctggtc 11280
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gggggcccgg gcgggacggt ggcccggccg ccgggcgcca cggtcgtgcg ccacggcggg 11460
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caccggcggc gagccgctga tgcacggcga ggtgctcgac ctgatccgcg agggcaccgc 11880
cgccggcatg cggatgtcgc tcatcaccaa cggcttccgg ctgccgcaga tggtcgacaa 11940
gctggcggag gcggggctgg cgcaggtcat cgtcagcctc gacggctcct ccggtgagac 12000
gcacgacgtc taccggcgca cccccgggat gttcgaccgc gggctggacg gactcgtacg 12060
cgcctcccgg gcgggcatgc tcacccgcgt caacacggtc gtcgggccgc acaacttcgc 12120
gcagatgccg gagctgcagc gggtcctgac cgaggcccgc gtggagcagt gggagatgtc 12180
cgcgctcaag ctggaacggc acatcgccta ccccccggcc gaggaggtgc tccacgcctg 12240
cgaacccgtc ttcctggccg acccgaagcg gtggctggtg cccctgggca agcgcttcta 12300
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acggccgctg tgccatgtga ccgacgacgt gatgtacctg gaccccaagc tgggccgcac 12420
cttcgcctgc agctgtctgc cccaccggga cggcccgggc gccgacatgc gcgacgagcg 12480
gggccgcgtc ttcctcaaca gcccttcgtt ccgcgcgcac gccgaggagt tcaagcagca 12540
ggggcccgtg atctgcagcg gctgctcgac cacggcggcc ggctacagcg acgacgtggc 12600
ccggctcggc tcggtgcccg cctggcacta ctgaccgggg cgccacgccc tttgctcgca 12660
cgccccgtcc gtacacccgt acgcctcctc caccgcccgc acgtcatcct ccgcccagga 12720
agccgaacat gatcctgcgt accgaccacg tggacgcgta tctgtccgcc gtgtccgcca 12780
tcctcgacga gcccggccgc gccggggccg gcgtccccgt gctgtgccgg ccgggctctc 12840
cgctggacgt gctggtgacc cgctggtccg ccctgctggg ccacgccggg ccgcgtgccc 12900
gctcggaccg gccgggccgg gccgtcgtcg cggtcggcga cgaccccgtc gtctccgcgg 12960
cggcacggct gctcgccgtg ctcacgggac ggaccgcgct ggccgtcgcc gacgtcaagg 13020
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ccgggttcga cgtcccgggc gtcgagccca gcgccttctg gcggctcgac gcgaccgacg 13140
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accggctggc ccatctgggc cggtccagcg agccggaggg catcgggcgg gtgccgcagt 13500
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cgcagtcgct gttcctgcac agctgcacca gttcgcacac cgaggcggac atgtacgaga 13620
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agcccgcgcc ctatctgctg ctcggcgacc cggagctgcc gttcgcggac gggccggtgg 13860
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tgcccaagga cctcacgggc aggctccagg agctgcggga cctcgccgca gccgtcggca 14280
ccgccgaccg ggacgcccgc ttcttccccg gccgcctggg cgcggtccgg cgcgcagcgg 14340
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cccagtacgg ccgccaggtg tgctggtgcg gccgggacgc ggtcgtcagc cggctgcggc 14520
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gaggcgagct ggagcactcc ttccggatcg ccaaccccct tccccacccg gtcaccgggg 14700
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cgaccttctc ggtggcgccg ggcggcacgt gccgggtggg cgtcacgatg cgcgccgccg 14820
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cctatcgcaa gttcgtgcag gtccgcccgg cgggacccgt cggcccgagc gacgaggacg 14940
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cgggcccacg accgggccca cggccgggcc cacggccggg cccacggccg gatcggcggt 15060
cgccgaggag gccgtggcgg agtgggccgc ggcctggctg gagcaggtgc acggggtgcg 15120
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cgaccacgtc cagggcatcc cctccgagct gacggcgggc cgcctcgggc acgcgggctg 15720
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gtacgagctg gtggaccggg agctgtcggc cctcggcccg ggcggctggc aggaggggcg 15960
ggacggcttc accccccggc atggaccgca agctcgaatg gctgctggaa ctcgacgctg 16020
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ggaggtgctg cgcgccttct ccgcgtactg cgggcgctac gaggacgccg cccggcggga 16860
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ctgatcctct cggcggcggc gatgccggcg ttcctgctcg gcgggatgtt ctggtacgcg 17460
ctggcgttcg tgttccaggg cgcgggctgg gccgcccagc gcggcgccga caccgcgctg 17520
ctgtacgagc tgctggaacg gaccggcggg accgatcgct acgcccgcat cctggggcgc 17580
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cagcggcacg tcagcctgcc gttctggctt caggcggccg tcaccctgct ggccgtcggg 17700
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gaacaccatg accaccaggg ctgactcccc gtctcccggg tccggcgggc ctgtcggacc 18540
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tcctgcccgg tacgtacttc tactggaacg agccgagccg cggcgagcgc tacgtccggg 20640
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ggcgcggtct cggaagcgtg cgtacgggcg caggtcgcgc gcgtccgccc gtacgtccgc 20820
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gccgtgaagg agtcgggccg cgagccgtcc gtcaccaacg acctcatcgc cgcggttccc 21240
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gaggctatcg gccaactcgg cagaagtgct accgtcgttc atgagagatc acagtagcgc 35220
ttctggttct gctcgggaag cacttcagct ggacgtcccc gccctgcggg ccgacacccc 35280
ggggtgccgc cgggtcatcc acttcaacaa cgcgggctgc ggactgatgg cggcgcccgt 35340
gacggacgcg atggtcggcc atctgaacct cgaggccagg atcggtggtt acgaggcgtc 35400
ggccgcccgg gccgccgagg tccgcgggtt ccacacggag atcgccgccc tcatcaacac 35460
cacacccgac aacatcgcct tcgccggcag cgccacccac gcctacgcca acgccctgtc 35520
ctcgataccg ttcgaggccg acgacgtcat cctcaccacc cgcgacgact tcgtctccca 35580
ccagatcgcc ttcctctccc tgcgcaaacg attcggcgta cgcgtcgtcc acgcgcccaa 35640
caccccggag ggcgggcccg atgtggaggc gatggccgcg ctgatgcgga cccaccgccc 35700
ccgcctggtc tccgtcaccc acgtcccgac caactcgggc ctcgtctcgc ccgtcgccgc 35760
gatcggccgc cactgccggg agctggacct gctctacctg gtcgacgcct gtcagtcggt 35820
gggccagctc gtcatcgacg tggaggagat cggctgcgac ctcctcaccg ccacctgccg 35880
caagttcctc cgcggcccgc gcggttccgg cttcctctac gtatccgatc gcgtcctgcg 35940
cgcgggttac gaaccgctgt tcatcgacat gcacggggcc cgctggaccg agccgggcgg 36000
ctacgagccc gtggggacgg cggcccgttt cgaggagtgg gagttcccgt acgccacggt 36060
gctcggcagc gccgccgcgg tgcgctacgc ccgcgaggtc ggtgtcgagg ccatcgagcg 36120
gcgcaccccg gcgctcgcgg cccggctccg cgaccggctc gcacccatcc cgggggtgcg 36180
cgtgctcgac cgcggcccgc gtctcgccgc gctcgtcacc ttcgaggtag cgggctggca 36240
gccgcagccg ttcaaggcgg ccatggacgc ccgaagcatc aactcggcgc tcagcttccg 36300
tgagttcgcg caattcgact tcggggacaa ggacgtcgac tggtgcctcc gcctgtcgcc 36360
gcactactac aacaccgagg aggaagtgga ccacgtcgcg gaggcggtcg cggccctcgc 36420
cggccagggg cggcgatgac cgacacccgg acacgcgcgg aggagccggc cggggaacgg 36480
cctgaggagc cgcccgggca acggtctgaa gggccgcccg gggaatcgca cgcggagccg 36540
tccgcggagc cacccggggg aagcctctgg cacaaccgcg acttcctcag gttctggttc 36600
ggcgagacgc tgtcgctcct cggtacccag gtcacgaacc tcgccctgcc gctgaccgcg 36660
atcaacgcct tccacgccac cgacgagcag gtcggtgtcc tgcggttcct gcagctcgtc 36720
ccgtacctcg gtctcgccct ggtcttcggg gtgtgggtgg accgggcccg tcggcggcgg 36780
atcatgctgg gcgccaacct cgtccggatg gtcctgctga ccctcgtacc cgtcctgtac 36840
tggtcggacg cgctcgacat ggtctccctg ctggtgatcg cctgtgccgt cggcgccgcc 36900
tcggtgctgt tcgacgtgag ctggatgtcg tacgtgccca cgctcgtgcg cgagcccgag 36960
cactacgtcg aagccggcgc caagatgggg atgagctcat cggcggccga tgtggcgggg 37020
cccgggctcg cgggcgtgct ggtgggcgcc ctgagtgccc cggtggcgct gatcgccgac 37080
gcgttctcct atctggtgtc cttgatctcg ctgctgctca tccgcacgcc cgagccccgc 37140
cccgaaccgg cggccgcgcg gaggcatctg ccgaccgaga tccgggacgg cctgcgctgg 37200
gtgctgaaga acccggtcct gcggtcgctg gccgtgatcg gcttctgctg caacttctcg 37260
atgatcaccg tctggacgat gttcctgctg tacggaacgc gcgacctgcg tctggactcg 37320
acgaccctcg gcgggatctt cgccaccgct tccgtgggcg gactgatcgg cgccgcgatc 37380
tcccgcaagg tcatccggcg cttcaggctc ggcctcgtct acctcgtcgc ccagtccgcc 37440
ctcctcgtcg gcccgacgct gatcgtcctg gcgaccggtc ccaggtgggt gatggtgggg 37500
atgttcgtcc tctccttctt caccacctac ctcgggctcg gcgtcgccgc cgtcgtcatc 37560
gtcagcctgc gccaggtcag taccccgccg tcgatgatgg gccggatgac ggcggtcttc 37620
cgcaccctgc tcttcggtgg cggcgccctc ggcggcctgt tcgcgggcct gctgtccggc 37680
cggatcggcg cccgaggggc attgaccgtg gcggcgaccg gatccgccgc cgtactgatc 37740
gcgctcgccc tgtccccggt gacccggcta cggggcctgc cgccggcaac ggaggaaccc 37800
gtcgcggcgg cgaactgagg tcgcggcgac gtactgaggt cgcggcggcg aactgaggtc 37860
gcggcggcga actgaggcgg agaacgtcga agggccccac cgcaagcggt ggggcccttc 37920
gagtcgtgcc cggtgaggca ctggcggagg atacgagatt cgaactcgtg aggggttgcc 37980
cccaacacgc tttccaagcg tgcgccctag gcctctaggc gaatcctccg ccgcaaacaa 38040
tacaagactc cgaggggtgc tcgcgaacac gtgctctcgg gagggcctcg gaaggacccg 38100
ggaggacccc gggagggggt ggagtgggtc gaggggtggc cgagcacccc cggcgatccg 38160
ctaggctggg ggcaagcccc tcacgtggcg ctatctcacc caactccccc agggccggaa 38220
ggcagcaagg gtaagtgggc tctggcgggt gcgtgagggg cccttgtgtt ttccggggga 38280
tcccgggggc tccgggagcc aggagcgggg cggggagcgg gctccgggat ctgtgacgga 38340
gaccacttgt cggtggggcc cgatatcgtc gtaggtgtgt cgtccctcgc gctctaccgc 38400
cgctaccgcc ccgagtcctt cgccgaggtc atcgggcagg agcatgtcac caccccgttg 38460
cagcaggctc tgcggaacaa ccgggtcaac cacgcgtacc tgttcagcgg cccgcgcggc 38520
tgcggcaaga cgaccagcgc gcgcatcctc gcccgctgtc tgaactgcga gcaggggccg 38580
acgcccactc cctgcggcga gtgccactcg tgcgtggacc tcgcgcgcaa cggtcgtgga 38640
tcgatcgacg tcatcgagat cgacgccgcg tcccacggtg gtgtcgacga cgcccgtgag 38700
ctgcgcgaaa aggccttctt cggccccgcc gccagccggt acaagatcta catcatcgac 38760
gaggcccaca tggtcacctc ggcgggcttc aacgccctgc tgaaggtcgt cgaggagccc 38820
ccggagcatc tgaagttcat cttcgcgacg accgagcccg agaaggtcat cggcacgatc 38880
cgttcgcgta cgcaccacta tccgttccgg ctcgtcccgc ccggcaccct ccgtgactat 38940
ctgggcgagg tctgcgagca ggagaagatc cccgtcgagg acggcgtcct gccgctggtc 39000
gtccgggccg gtgccggttc cgtgcgtgac tcgatgtccg tgatggacca gctgctggcc 39060
ggcgccgccg aggacggtgt gacatacgcc atggcgacgt ccctcctcgg ctacacggac 39120
ggctccctgc tggacgccgt ggtcgacgcc ttcgccgccg gcgacggcgc cgcggccttc 39180
gaggtcgtcg accgcgtcat cgagggcggc aacgaccccc gccgcttcgt cgccgacctg 39240
ctggagcggc tgcgcgacct ggtgatcctc gccgccgtgc cggacgccgc cgagaagggc 39300
ctcatcgacg ccccggtgga tgtcatcgag cgcatgcagg cccaggcgtc cgtcttcggc 39360
gccggcgagc tcagccgcgc cgccgacctc gtcaacgagg gcctgacgga gatgcgcggc 39420
gccacgtccc cgcgcctcca gctggagctc atctgcgcgc gcgtgctgct gcccgccgcc 39480
ttcgacgacg agcggtccgt acgggcccgc ctcgagcgtc tggagcgcgg cgccgcgagt 39540
gcggccgccg ccttcacgcc cgcgcccccc ggtacggcca tgggctacgt ccccggtccg 39600
gatgcccacg cccacgctcc cgccccggcc gccggtctct ccggcccggc ggcggcccgc 39660
gcggccgtga cgggggcggg gcccgcggca ggtcctgccc ctgttcctgc tgcccctgcc 39720
cctgctgctg ctcctgtcgc tgccgttccc gcgtcgggtc aggccgctcc cgctccggcg 39780
caggctccgg gcgcgcaggc cggtggcgcg tggccggcgg gcgccgcccc cgccgccccg 39840
gcccccgccg cctccgcgcc cgcatcgcag cccggcgcgt ggcctgcggc ctccggcgcc 39900
cccactcctg ccccggccgc cccgcaggcg ggtccccagc ccggcgcctg gccgaccgcc 39960
gcggcgcccg gctcgggccc cgcgcaggct ccggcccccg ccgcgagcgc cccgcaggcc 40020
ggttcctggc ccacgggcgc cgcccccgcc gccccggctc ccgccgcgcc cacgggcgcg 40080
cccatgggcg ccccgcaggg cgacgcaggc caggcgcgcc agctctggcc gaacatcctg 40140
gaggccgtga agaaccgccg ccgcttcacc tggatcctgc tcagccagaa cgcccaggtc 40200
tccggctgcg acggcatcac gctccaggtc ggcttcgcca ccgccggagc gcgcgacagc 40260
ttcgccaaca gcggtagcga ggacgtcctg cggcaggccc tcggcgacct cggcctgcag 40320
tggaagaccg agctgctcgt cgatccctcc ggcggcgcca acgcgcccgg cggcggctcg 40380
ggcggcttcg gcggcggctc aagcggtttc ggtggctccg gcggttccgg cggtggctac 40440
ggaggagggt tcggcggcgg cgcccctgcg gcctccccgg cccccgccta cgcccgcccg 40500
caggcccagg cccaggccca gagcccggct cccgccccgg ccgcctccgc cccgcagcag 40560
gccgcgtccg ccgccccgga gtcccgtccg gccccgtcgg cggccccggc cgccggcccg 40620
gcgcagcggt acggcggcga gcccgaggcc cccccggtcg cccccgagga cgacatcccc 40680
gccgaggacg atccggacct cgacgacacc gccctgaccg gccacgatct gatcgtgcgc 40740
gagctcggag cgaccgtcat cgaagagatc gccaacgaat aacgggcgaa caatcaccgc 40800
cgcgcagtcg aacgagtgcc cggatgtgta aagacgtcgc aggtcaggag cgcgggcggc 40860
gcgaagtgcg tcagtgcgcc cgttctcctt cctgcggcgt agggcgtacc gcgcggtgag 40920
cacgtaggct cgggctaccg aagcaatcag tcgtcgagag cccaggagcg aaaccgtgtt 40980
ccccggtggt ggtcagccca acatgcagca gctgctccag caggcccaga agatgcagca 41040
ggatctcgcc aaggcccagg aggagctggc gcgcaccctc gtcgacggca cggccggcgg 41100
cggcctggtc aaggccaccg tcaccggcgc gggcgagctc cagagcctgg tcatcgaccc 41160
caaggccgtg gacccggacg acaccgagac cctcgcggac ctcgtcgtgg ccgccgtgcg 41220
cgacgccaac gagaccgccc agaagatgca gcagcagaag ctcggcccgc tcgcccaggg 41280
cctgggtggc ggcggcagcg gcatcccggg tctcccgttc tgacggaccc gacggccgga 41340
gcggccgggt ccgtaaggtt ccggccgttc cgacagacgt agcactcctc cccgggccgg 41400
ccccgtggag acaaccgcag acgcagaagc cgaagaaacc gaagaaggag aacccgatcc 41460
gtgtatgaag gcgtggtcca ggacctcatc gacgagctgg gcaggctgcc cggcgtcggt 41520
cccaagagcg cgcagcggat cgccttccac atcctccagg ccgagcccgc cgacgtccgc 41580
cggctcgccc acgccctgac cgaagtgaag gccaaggtcc gcttctgcgc ggtctgcggc 41640
aacgtcgcgc aggaggagcg ctgccgggtc tgccaggacc cgcgccgcga ccccgcggtc 41700
atctgtgtcg tggaggagcc caaggacgtc gtcgccatcg agcggacgcg cgagttccgc 41760
ggccgctacc acgtgctcgg cggggccatc agccccatcg agggcgtcgg cccggacgac 41820
ctgcggatcc gtgagctgct ggcccggctc gcggacggca cggtcaccga gctgatcctg 41880
gccaccgacc ccaacctcga gggcgaggcc accgccacgt acctcgcgcg catggtgaag 41940
cccatggggc tgagggtcac ccggctggcc agcggtctgc ccgtgggtgg ggatcttgaa 42000
tacgccgacg aggtcacgct cggccgtgcc ttcgaaggga gaagacttct cgatgtctga 42060
cgcaacgctc cacgacgcca agcgcgatcc cgacgacttc gtcgtctcgc tcgcggactc 42120
gatcgagagt ttcatcgtgg ccgtcacgga ggtgtcccgc ggcgacgagc ccgacagcgc 42180
cgtgccgttc ctgctcctgg aggtctccca gctcctcctc acgggtggcc ggctcggcgc 42240
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cgacgagctc cgcgagcggt tcgccaccat gctcgacccc gtcgacgtct actccgaggt 42360
cttcgacccc tacgtcccgc gcagcgcgcc cgtcgcctcc cggatctccg acgacctcgc 42420
cgacatcatc accgacctcc gccacggcat ggcccactac cgcgacggcc gcgtcagcga 42480
ggccctctgg tggtggcagt tctcctacct ctccaactgg ggccccaccg cctccgcctg 42540
cctccgcgcc ctgcagtcgc tcgtcgccca cgtccgcctc gaccagcccc tggacgagct 42600
cgacggcctc gacaccgacg tcatcggccc ggaggaccag ctggccgagg aagccggccg 42660
cgtcatggcc gccgagatcg gcggcccgat gcggatgcga gcacgaggcg cctcccaggg 42720
cgcctgaggc ggcctgccgg gatctgcgcc cctaggggcg cagcccgccg agttgtcgtc 42780
tttcgggggc gccgcccgcc ggggtgccgg ccggggtggc cgtgccacgg ggccgccgcc 42840
ctgcgggatc gtcgcctccg ggaaggacgt ccctagaggc cgccgccctc cgagttctac 42900
gcccggcagt tggcgaccgt gccgcccgcg cggttgtcgg tacggcagat gttgtcgcca 42960
cgcccgccgt cgacggtccc gtattcgccg acgacgatcg cggtgccgcc cggtccctgg 43020
atgacgtcat cgtcgtcgtc cccggagacc gtgacgaatg cggcctgccc gatggagggc 43080
acctcgatga ggtcggcgtc ggcgccccca cggacgtgga cggggcgtgc cttgtcgtcg 43140
acgccgatcg ccccgacgcg gatgacgtcg tccccttcgt cgccgtcgat ggtgacgggg 43200
ttggggagac gggacgacag gcgggaggcc ctttccacgg tgatcttgtc cgcgccgggg 43260
ccgccacgga gcggtccgcc gagttccccg accgtgatgg tgtcgtcgcc gagtccgccg 43320
tcgaggctgc tcgacttgtc ccaggcgggt acgacgtagg cggcgatgcg gagggtgtcg 43380
tccccgtcgc cgccctcgat cctggtgctg aacacggcgc cggtggtgat cacgtcgttc 43440
ccggcggcgc cgtcgatgag cccccggtac gacacggcgc ccgtggtgat gatgtcgttg 43500
cccgcgccgc cgtagatggt gccctggacg ctccacgcgt ccttgtcggt cacggtgatc 43560
c 43561
<210>2
<211>334
<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>2
Met Glu Thr His Thr Phe Gly Thr Phe Gln Asp Ala Tyr Leu Ser Gln
1 5 10 15
Leu Arg Asp Ile Tyr His Ser Pro Glu Phe Arg Asn Ala Pro Arg Gly
20 25 30
Gln Ala Ser Arg Glu Arg Ile Gly Ala Gly Phe Arg Leu Leu Asp Pro
35 40 45
Val Gln Arg His Ile Ser Val Pro Ala Arg Arg Ala Asn Val Val Phe
50 55 60
Asn Phe Ala Glu Ala Leu Trp Tyr Leu Ser Gly Ser Asp Arg Leu Asp
65 70 75 80
Phe Ile Gln Tyr Tyr Ala Pro Gly Ile Ala Ala Tyr Ser Ala Asp Gly
85 90 95
Arg Thr Leu Arg Gly Thr Ala Tyr Gly Pro Arg Ile Phe Arg His Pro
100 105 110
Ala Gly Gly Val Asn Gln Trp Glu Asn Val Val Lys Thr Leu Thr Asp
115 120 125
Asp Pro Asp Ser Lys Arg Ala Val Ile Gln Ile Phe Asp Pro Arg Glu
130 135 140
Leu Ala Val Ala Asp Asn Ile Asp Val Ala Cys Thr Leu Ala Leu Gln
145 150 155 160
Phe Leu Ile Arg Asp Gly Leu Leu Cys Gly Ile Gly Tyr Met Arg Ala
165 170 175
Asn Asp Ala Phe Arg Gly Ala Val Ser Asp Val Phe Ser Phe Thr Phe
180 185 190
Leu Gln Glu Phe Thr Ala Arg Tyr Leu Gly Leu Gly Ile Gly Thr Tyr
195 200 205
His His Val Val Gly Ser Val His Ile Tyr Asp Ser Asp Ala Arg Trp
210 215 220
Ala Glu Arg Val Leu Asp Ala Ala Thr Pro Asp Gly Gly Pro Arg Pro
225 230 235 240
Gly Phe Pro Ala Met Pro Asp Gly Asp Asn Trp Pro His Val Arg Arg
245 250 255
Val Leu Glu Trp Glu Glu Arg Leu Arg Thr Asn Ala Ala Arg Leu Ser
260 265 270
Ala Asp Ala Leu Asp Ala Leu Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Lys His Val
275 280 285
Val Ala Leu Phe Glu Ala His Arg Gln Val Arg His Glu Asp Thr Pro
290 295 300
Asp Arg Ala Leu Leu Ala Ala Leu Pro Glu Val Tyr Arg Gln Ser Leu
305 310 315 320
Ala Val Lys Trp Pro Gly His Phe Gly Ser Pro Ala Gly Ser
325 330
<210>3
<211>170
<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>3
Val Thr Thr Thr Pro Lys Pro Arg Thr Ala Pro Ala Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Gly Gly Pro Phe Arg Gln Leu Val Asp Pro Arg Thr Gly Val
20 25 30
Met Ser Ser Gly Asp Gln Asn Val Phe Ser Arg Leu Ile Glu His Phe
35 40 45
Glu Ser Arg Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala His Arg Arg Glu Ala Trp
50 55 60
Gly Ala Glu Phe Leu Ser Pro Ala Glu Ala Thr Arg Leu Asp His Asp
65 70 75 80
Glu Ile Lys Ala Ala Asp Val Phe Val Ala Phe Pro Gly Val Pro Ala
85 90 95
Ser Pro Gly Thr His Val Glu Ile Gly Trp Ala Ser Gly Met Gly Lys
100 105 110
Pro Met Val Leu Leu Leu Glu Arg Asp Glu Asp Tyr Ala Phe Leu Val
115 120 125
Thr Gly Leu Glu Ser Gln Ala Asn Val Glu Ile Leu Arg Phe Ser Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Ile Val Glu Arg Leu Asp Gly Ala Val Ala Arg Val Leu
145 150 155 160
Gly Arg Ala Gly Glu Pro Thr Val Ile Gly
165 170
<210>4
<211>420
<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>4
Val Ala Gly Ala Glu Phe Gly Trp Gly Ser Ala Gly Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ile Val Ala Ala Leu Arg Glu Arg His Gly Glu Arg Val Arg Phe Ala
20 25 30
Gly Leu Gly Ser Gly Leu Gly Arg Pro Val Leu Gly Ala Leu Asp Ala
35 40 45
Arg Asp Trp Thr Asp Val Pro Glu Pro Gly Asp Gly Pro Ala Gly Glu
50 55 60
Ala Ala Leu Ala Ala Leu Leu Arg Glu Arg Gly Val Asp Ala Ala Val
65 70 75 80
Val Val Leu Asp Gly Leu Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Val Gly Cys
85 90 95
Pro Val Val Tyr Val Asp Ser Leu Pro Phe Leu Trp Thr Glu His Asp
100 105 110
Phe Val Pro Ser Gly Val His Thr Tyr Cys Ala Gln Leu Cys Pro Ser
115 120 125
Leu Pro Arg Gln Ser Trp Pro Val Leu Arg Gly Ile Glu Ala Leu Arg
130 135 140
Trp Val Glu Pro Val Val Gly Thr Tyr Gly Ala Gly Gly Leu Asp Pro
145 150 155 160
Val Pro Gly Lys Ala Val Leu Asn Val Gly Gly Leu Arg Ser Pro Phe
165 170 175
Thr Ala Glu Asp Asp Asp Ser Tyr Val Glu Leu Val Leu Gly Pro Ala
180 185 190
Leu Arg Ala Leu Arg Ala Ala Gly Phe Gly Gln Val Val Ile Ser Gly
195 200 205
Asn Val Asp Pro Gly Leu Ala Arg Val Pro His Ala Gly Thr His Gly
210 215 220
Leu Thr Val Thr Ala Gly Arg Leu Asp His Gly Ala Phe Ile Glu Glu
225 230 235 240
Leu Arg Thr Ala Glu Leu Leu Val Thr Ser Pro Gly Arg Thr Thr Leu
245 250 255
Leu Glu Ala Ala Ala Leu Gly Gln Arg Ala Val Val Leu Pro Pro Gln
260 265 270
Asn Phe Ser Gln Val Met Asn Ala Ala Asp Val Ala Asp Leu Val Asp
275 280 285
Pro Ala Val Val Val Pro Trp Pro Ala Ala Val Leu Asp Leu Ala Glu
290 295 300
Leu Ala Arg Val Arg Asp Gln Gly Glu Glu Gly Ala Val Arg Leu Met
305 310 315 320
Tyr Ala Arg Ile Ala Ala Ala Arg Arg Glu Pro Gly Thr Val Ala Gly
325 330 335
Pro Leu Ala Asp Ala Leu Gly Ala Ala Val Ala His Val Arg Arg His
340 345 350
Asp Val Arg Met Gly Pro Phe Ala Gly Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly
355 360 365
Thr Arg Gly Ala Gly Gly Ala Arg Asp Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala
370 375 380
Arg Ser Val Ala Asp Ala Val Asp Glu Leu Ile Gly Lys Leu Thr Asp
385 390 395 400
Gly Pro Ala Ala Gly Asn Arg Arg Asp Gly Ser Pro Leu Ala Ala Pro
405 410 415
Val Arg Ala Arg
420
<210>5
<211>395
<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>5
Met Arg His Pro Arg Glu Leu Arg Gln Asp Thr Ser Leu Ala Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gly Thr Pro Thr Phe Ala Ala Leu Pro Glu Glu Asp Thr Gly Ile
20 25 30
Val Ala Glu Ala Ala Asp Glu Val Ala Glu Leu IIe Arg Thr Arg Arg
35 40 45
Thr Val His Trp Gly Gly Gly Pro His Thr Arg Val Leu Glu Arg Asp
50 55 60
Phe Ala Ala Leu Val Gly Arg Glu Arg Ala Phe Phe His Asn Ser Gly
65 70 75 80
Thr Ala Ala Leu Gln Thr Ala Leu Phe Ala Leu Glu Val Glu Glu Gly
85 90 95
Thr Pro Val Ala Leu Ser Asp Ser Gly Phe Val Ala Ser Leu Asn Ala
100 105 110
Leu Tyr His Leu Arg Ala Arg Pro Val Phe Leu Pro Thr His Pro Ala
115 120 125
Thr Leu Gln Cys Val Asp Asp Val Ala Glu Trp Thr Ala Gly Thr Gly
130 135 140
Val His Thr Ala Leu Ile Thr His Phe Phe Gly Asn Val Ala Asp Val
145 150 155 160
Glu Ala Ile Trp Arg Thr Ser Gly Ala Arg His Leu Val Glu Asp Gly
165 170 175
Gly Gln Ala His Gly Ala Arg Leu Arg Gly Arg Pro Val Gly Ser Phe
180 185 190
Gly Thr Val Gly Ser Phe Ala Gly Ser Thr Lys Lys Leu Val Thr Ala
195 200 205
Gly Gln Gly Gly Leu Asn Val His Asp Asp Glu His Leu Asp Trp Arg
210 215 220
Met Arg Thr Tyr Ala His His Gly Lys Ser Gly Asn Tyr Glu Gly Thr
225 230 235 240
Phe Pro Gly Tyr Asn Phe Arg Gly Gly Glu Met Glu Ala Ile Leu Ala
245 250 255
His Ala Ala Leu Arg Arg Leu Asp Glu Arg Val Ala Ala Arg Asn Arg
260 265 270
Thr Ala Asp Thr Met Phe Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Ile Arg Thr
275 280 285
Ala Arg Pro Ala Pro Gly Leu Asp Cys Ser Pro Ala Trp Phe Asp Val
290 295 300
Ala Leu Ile Leu Asp Glu Glu Trp Leu Gly His Arg Asp Trp Leu Val
305 310 315 320
Glu Ala Met Val Ala Asp Gly Ile Pro Gly Trp His Tyr Pro Ala Leu
325 330 335
Ile Gly Met Pro Trp Val Glu Pro Trp Met Arg Ser Lys Gly Trp Trp
340 345 350
Gly Glu Arg Glu Gln Glu Leu Leu Ala Ser Glu Thr Ala Leu Trp Gly
355 360 365
Arg Thr Leu Val Leu Gly Ala Gln Met Asn Ala Val Asp Ala Glu Arg
370 375 380
Ile Ala His Ala Val Val Ala Leu Leu Lys Gly
385 390 395
<210>6
<211>273
<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
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Gly Asp Gly Gly Pro Arg Ser Val Arg Val Arg Glu Asn Gly Asn Cys
20 25 30
Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Leu Val Val Arg Val Gly His Ser Trp
35 40 45
Pro Leu Asp Ala Arg Gly Glu Leu His Cys Trp Ser Val Ala Arg Asp
50 55 60
Ala Gly Val Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asp Glu Gly Arg Leu Pro Gly
65 70 75 80
Gly Arg Thr Tyr Val Ala Tyr Val Tyr Val Met Gly Thr Pro Ala Gly
85 90 95
Thr Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ala Gly Ala Val Leu Ala Arg Leu His
100 105 110
Thr Val Pro Gly Glu His Phe Pro Ala Val Ala His Asn Leu Pro Arg
115 120 125
Arg Arg Asp Arg Tyr Arg Thr Ala Val Arg Cys Ala Arg Ala Ala Gly
130 135 140
Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ala His Arg Cys Leu Leu Arg Ala Ala Asp
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Asp Trp Arg Arg Ser Arg Glu Val Ala Ala His Gly Asp Phe Arg Thr
165 170 175
Pro Asn Leu Val Val Arg Gly Arg GIy Val Arg Ala Val Leu Asp Trp
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Ser Asp Ala Arg Ala Ala Ser Pro Glu Ser Asp Leu Gly Gln Leu Gly
195 200 205
Pro Gly Gln Leu Arg Pro Leu Leu Arg Gly Tyr Leu Asp Arg Ala Arg
210 215 220
Arg Ala Pro Asp Leu Glu Leu Val Ala Gly His Met Leu Ala Arg His
225 230 235 240
Leu Ala Leu Glu Ala Ala Gly Val Phe Pro Ala Gly Thr Ser Ala Ala
245 250 255
Leu Ala Arg Arg Phe Gly Pro Gly Leu Ser Arg Gly Arg Trp Thr Val
260 265 270
Ala
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<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>7
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1 5 10 15
Ser Ala Gly Gln Leu Ala Glu Leu Ala Gly Asp Leu Val Asp Leu Ala
20 25 30
Gly Pro Gly Gly Ala Thr Gly Pro Trp Val Leu Thr Trp Ala His Gly
35 40 45
Ala Gly Glu Pro Gly Gly Glu Pro Gly Glu Gly Gln Asn Arg Gly Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ala Thr Val Val Arg His Gly Gly Leu Glu Val Val Thr Val Pro
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Arg Pro Pro Arg Asp Leu Gly Gly Phe Leu Asp Ala Cys Cys Arg Thr
100 105 110
Gly Pro Val Ser Gly His Pro Asp Val Thr Arg Thr Ile Leu Ile Leu
115 120 125
Ala Asp Pro Thr Asp Arg Asp Arg Ser Ala Ser Pro Pro Glu Ala Pro
130 135 140
His Asp Ala Pro Arg Asp Gly Ala Arg Asp Gly Arg Pro
145 150 155
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<400>8
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1 5 10 15
Leu Phe Ile Arg Ile Leu Glu Ala Cys Asn Ala Asp Cys Phe Met Cys
20 25 30
Glu Phe Ala Leu Ser Arg Asp Thr Tyr Arg Phe Thr Leu Asp Asp Phe
35 40 45
Arg Glu Leu Leu Pro Gln Ala Gln Glu Ser Gly Val Arg Tyr Val Arg
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Met Phe Asp Arg Gly Leu Asp Gly Leu Val
130 135 140
Arg Ala Ser Arg Ala Gly Met Leu Thr Arg Val Asn Thr Val Val Gly
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Gln Gly Pro Val Ile Cys Ser Gly Cys Ser Thr Thr Ala Ala Gly Tyr
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Ser Asp Asp Val Ala Arg Leu Gly Ser Val Pro Ala Trp His Tyr
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<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
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Ala Ile Leu Asp Glu Pro Gly Arg Ala Gly Ala Gly Val Pro Val Leu
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Cys Arg Pro Gly Ser Pro Leu Asp Val Leu Val Thr Arg Trp Ser Ala
35 40 45
Leu Leu Gly His Ala Gly Pro Arg Ala Arg Ser Asp Arg Pro Gly Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Leu Ala Val Leu Thr Gly Arg Thr Ala Leu Ala Val Ala Asp Val
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Arg Asp Arg Glu Ser Leu Thr Trp Phe Val Ala Lys Ser Leu Leu
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Thr Ser Thr Val Pro Gly Asp Ala Gln Thr Leu Leu Leu Pro Asp Arg
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Ala Asp His Leu Gly Val Arg Asp Gly Ile Ile Cys Gly Asp Arg Leu
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Ala His Leu Gly Arg Ser Ser Glu Pro Glu Gly Ile Gly Arg Val Pro
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Thr Ala Gly Pro Thr Thr Gly Pro Thr Ala Gly Pro Thr Ala Gly Pro
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Thr Ala Gly Ser Ala Val Ala Glu Glu Ala Val Ala Glu Trp Ala Ala
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Gly Asp Ala Asp Leu Asp Arg Thr Ala Val Val Arg Val Ala Leu Gly
130 135 140
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Leu Pro Pro Glu Arg Glu Arg Leu Ser Leu Ala Arg Glu Ser Ser Thr
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Arg Pro Gly Ser Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Ala Ala Arg Ile Arg
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Gly Cys Leu Gln Leu Leu Ala Glu Leu Pro Ala Glu Arg Asp Val Val
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Gly Arg Asp Gly Phe Thr Pro Arg His Gly Pro Gln Ala Arg Met Ala
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<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>11
Met Asp Ala Ala Pro Gly Thr Ala Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ser Val
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Pro Pro Val Leu Pro Val Asp Ala Glu Arg Pro Ala Ala Arg Arg Thr
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Leu Ala Met Glu Glu Gly Thr Pro Arg Gln Trp Glu Gly Leu Gly Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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Leu Pro Val Ser Val Val Trp Glu Thr Gly Val Ala Leu Ala Ile Ala
100 105 110
Arg Ala Leu Asp Arg Pro Ala Val Ile Gly Leu Cys Val Tyr Glu Glu
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Ile Leu Gln Gln Pro His Arg Asp Ala Glu Phe Thr Ala Leu Gly Ala
130 135 140
Ala Val Ala Arg Thr Val Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Gly Val Ala
145 150 155 160
Val Thr Ala Arg Val Glu Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Glu Val Pro
165 170 175
Ala Arg Arg Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr Pro Phe Ser Glu Ser Thr Tyr
180 185 190
Pro Arg Gly Phe Pro Asn Glu Ala Glu Val Leu Arg Ala Phe Ser Ala
195 200 205
Tyr Cys Gly Arg Tyr Glu Asp Ala Ala Arg Arg Glu Ala Ser Leu Trp
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Val Thr Glu Gly Val His Leu Ala Lys Ala Ala Leu Leu Gly Leu Gly
225 230 235 240
Pro Gly Val Pro Phe Leu Ala Thr Thr Pro Leu Pro Asp Pro Ala His
245 250 255
Pro Gly Arg Leu Leu Gln Asp Ala Pro Ala Ala Thr Arg Val Thr Leu
260 265 270
Glu Arg Arg Ser Ala Leu Pro Ala Asp Trp Trp Pro Glu Gln Ala Leu
275 280 285
Glu Arg Ala Leu Gly Thr Gly Leu Arg Arg Leu Thr Glu Asp Phe His
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Ala Leu Ile Glu Asp Phe His Asp Pro Ala Gly Asp Arg
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<400>12
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Leu Pro Phe Val Ala Tyr Met Ala Leu Ser Asn Ala Gln Phe Thr Arg
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Gly Val Phe Val Leu Phe Leu Leu Arg Gly Asn Ile Ser Leu Ala Glu
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Val Gly Leu Leu Glu Ser Leu Phe His Leu Thr Arg Val Leu Cys Glu
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Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Asp Arg Trp Gly Arg Arg Arg Thr Ile
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Gln Ala Gly Leu Ile Leu Ser Ala Ala Ala Met Pro Ala Phe Leu Leu
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Gly Gly Met Phe Trp Tyr Ala Leu Ala Phe Val Phe Gln Gly Ala Gly
100 105 110
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Glu Arg Thr Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Ala Arg Ile Leu Gly Arg Ser
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His Ala Ala Ser Tyr Gly Thr Leu Ala Leu Thr Thr Ala Leu Gly Ala
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195 200 205
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210 215 220
Ala Arg Leu Val Val Gly His Pro Val Leu Arg Leu Phe Val Ala Phe
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Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Thr Thr Val Val Ser Ile Phe Ser Gln
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Leu Ala Leu Val Thr Ala Phe Ser Ala Ala Ala Ala Leu Gln Ser His
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Arg Leu Val Glu Arg Gly Pro Val Arg Val Leu Met Ala Ala Ser Ser
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Leu Tyr Leu Val Gly Leu Ala Gly Met Ala Ser Leu Gln Pro Gln Leu
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Ala Val Val Gly Tyr Tyr Leu Val Phe Leu Asn Leu Asp Leu Leu Ala
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Pro Val Leu Ser Ala Phe Phe His Arg Ser Val Asp Glu Glu Val Arg
340 345 350
Ala Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Asn Leu Ser Thr Ser Val Leu Thr Phe
355 360 365
Ala Ala Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Asp Ala Gly Gly Tyr Arg
370 375 380
Pro Leu Leu Ile Ile Thr Ala Leu Val Ser Leu Pro Leu Leu Val Phe
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Leu Val Gly Ala Ala Arg Arg Val Leu Ser Pro Pro Glu Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Gly Glu Asp Ala Gly Glu Arg Ala Gly Pro Lys Gly Pro Gly Ala
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Ala Ala Pro Asp Thr Thr Thr Thr Gly Val
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<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>13
Met Thr Thr Arg Ala Asp Ser Pro Ser Pro Gly Ser Gly Gly Pro Val
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Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Asp Asp Gly Arg Pro Val Ile Ala Leu
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145 150 155 160
Arg Ala Ala Leu Leu Leu Gly Gly Ala Gly Gly Pro Asp Gly Ser Gly
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Ala Ser Ala Gly Gly Glu Ala Leu Pro Gly Ala Leu Ala Arg Phe Ile
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195 200 205
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Gly Arg Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Ala Gln Ile Ala Arg Gln Val
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<400>14
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165 170 175
Gly Phe Glu Glu Val Val Arg Phe Cys Arg Glu Arg Gly Thr Val Leu
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Val Leu Asp Leu Cys Phe Ala Ala Phe Ala Leu Gly Ser Gly Gly Pro
195 200 205
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260 265 270
Leu Thr Arg Tyr Ile Glu Asp Ser Arg Arg Asp Gly Phe Ala Ser Val
275 280 285
Thr Asp Val Leu Glu Arg Asn Arg Lys Ser Leu Arg Ala Ala Thr Glu
290 295 300
Gly Thr Val Leu Arg Ala His Glu Pro Asp Val Pro Val Ser Val Ala
305 310 315 320
Trp Phe Thr Ile Asp Asp Arg Gly Pro Asp Ala Thr Gln Leu Gln Arg
325 330 335
Asp Leu Ser Gly His Gly Ile His Val Leu Pro Gly Thr Tyr Phe Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Leu Ala Arg Tyr Ala
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<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>15
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Leu Cys Ala Glu Leu Val Ala Gly Val Gly Gly Val Gln Gly Val Val
210 215 220
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225 230 235 240
Arg Thr Lys Arg Glu Leu Cys Arg Leu Gly Val Leu Ala His Ala Val
245 250 255
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<210>16
<211>356
<212>PRT
<213>生裂链轮丝菌ZJU5119(Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119)
<400>16
Val Cys Pro Leu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Gly Arg Ala Arg Ala Val
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