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1、(10)申请公布号 CN 102216469 A (43)申请公布日 2011.10.12 CN 102216469 A *CN102216469A* (21)申请号 200980142454.X (22)申请日 2009.10.21 61/107046 2008.10.21 US C12Q 1/37(2006.01) C07K 14/81(2006.01) C07K 7/06(2006.01) C07K 7/08(2006.01) (71)申请人 强生医药研究及开发有限责任公司 地址 美国新泽西州 (72)发明人 M奥尔森 M托德 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 720。
2、01 代理人 李进 艾尼瓦尔 (54) 发明名称 评估二肽基肽酶 I 活性的高通量测定法 (57) 摘要 一种筛选调节二肽基肽酶 I(DPPI) 活性的化 合物的方法， 包括以下步骤 ： 将 DPPI 的肽底物加 入含有DPPI和化合物的反应混合物内， 其中DPPI 的肽底物具有至少 3 个氨基酸， 与除了 S1-S2位点 之外的 DPPI 结合位点结合 ； 测量底物的分子量， 其中底物分子量的变化提示 DPPI 活性的存在。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.04.21 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/061509 2009.10.21 (8。
3、7)PCT申请的公布数据 WO2010/048306 EN 2010.04.29 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 CN 102216480 A1/1 页 2 1. 一种筛选调节二肽基肽酶 I(DPPI) 活性的化合物的方法， 所述方法包括以下步骤 ： a.将DPPI的底物加入包含DPPI和所述化合物的反应混合物内， 其中所述DPPI底物包 含至少 3 个氨基酸并与除了 S1-S2位点之外的 DPPI 结合位点结合 ； 和 b. 测量所述底物和产物的分子量和 / 或质量比的变化， 其中所述底物的。
4、分子量下降提示所述 DPPI 活性的存在。 2. 权利要求 1 的方法， 其中所述底物无标记。 3. 权利要求 1 的方法， 其中所述底物具有 3-100 个氨基酸。 4. 权利要求 1 的方法， 其中所述底物具有约 10- 约 50 个氨基酸。 5. 权利要求 1 的方法， 其中所述底物选自 SEQ ID NOs ： 1-7。 6. 权利要求 1 的方法， 其中所述底物是 SEQ ID NO ： 1。 7. 权利要求 1 的方法， 其中所述化合物是 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯酚。 8. 权利要求 1 的方法， 其中所述化合物是 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯胺。 9. 一种 。
5、DPPI 底物， 所述底物选自 SEQ ID NOs ： 1-7。 10.SEQ ID NO ： 1 的 DPPI 底物。 权 利 要 求 书 CN 102216469 A CN 102216480 A1/8 页 3 评估二肽基肽酶 I 活性的高通量测定法 0001 相关申请的交叉参考 0002 本申请要求 2008 年 10 月 21 日提交的美国临时专利申请号 61/107,046 的权益， 其内容通过引用整体结合到本文中。 0003 发明背景 1. 发明领域 0004 提供用于以高通量形式鉴定二肽基肽酶 I 的激动剂和拮抗剂的方法。该方法使用 无标记并与二肽基肽酶 I 多个底物结合位点结。
6、合的肽底物。 0005 2. 相关技术的说明 0006 二肽基肽酶 I(DPPI) 或组织蛋白酶 C 是溶酶体木瓜蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶家 族的成员， 该家族还包括组织蛋白酶 B、 K、 H、 L、 O 和 S(Bouma and Gruber， 1996， Biochem. Biophys.Acta 113 ： 350-358 ； Turk et al， 2000， Biochem.Biophys.Acta 1477 ： 98-111)。 这 种蛋白酶家族激活免疫和炎症细胞中的丝氨酸蛋白酶。 0007 DPPI 的生理学作用是通过脱除免疫和炎症细胞中酶原 N- 端的两个氨基酸作为 二肽单元将。
7、无活性酶原转化为活性酶 (Caughey， G.H. 评述， 2002， MolecularImmunology 38 ： 1353-1357 ； Wolters et al.， 2001， J.Biol.Chem.276 ： 18551-18556 ； McGuire et al.， 1993， J.Biol.Chem.268 ： 2458-2467 ； Pham and Ley， 1999， Proc.Natl.Acad.Sci.96 ： 8627-8632 ； Pham et al.， 2004， J.Immunol.173 ： 7277-7281)。DPPI 激活许多丝氨酸蛋白 酶包括。
8、糜蛋白酶、 类胰蛋白酶、 组织蛋白酶 G、 弹性蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶、 来自 T 淋巴细胞和自然杀伤细胞的粒酶 A 和 B ； 和类风湿性关节炎蛋白酶 (Adkison et al.， 2002， J.Clin.Invest.109 ： 363-371)。由 DPPI 激活的酶或丝氨酸蛋白酶为防御反应所 需。此外， 已显示未调节的 DPPI 导致与蛋白酶过度活化有关的疾病包括慢性阻塞性肺病、 Papillon-Lefevre 综合征、 脓毒症、 关节炎及其它炎性疾病。因此， DPPI 是用于治疗性治疗 的潜在靶。 0008 据提议 DPPI 由四种相同的单体组成。各单体由前体多肽产生，。
9、 其裂解为 N- 端排 阻区、 激活肽和木瓜蛋白酶样区。木瓜蛋白酶样区进一步裂解为重链和轻链。接着， N- 端 排阻区、 重链和轻链折叠成单体， 其四体化成约 200kDa 的成熟 DPPI(Turk et al， 2001EMBO J.， 20 ： 6570-6582)。 0009 DPPI 的最新结晶确认一些结构， 包括活性位点裂口和底物结合位点， 涉及二肽基 蛋白水解活性。底物结合位点位于木瓜蛋白酶样结构的外部， 与底物形成氢键。在底物断 裂键 N- 端侧与第一氨基酸结合的位点称为 S1结合位点， 在 N- 端侧与第二氨基酸结合的位 点称为S2结合位点。 而且， 在底物断裂键C-端侧与第。
10、一氨基酸结合的位点称为S1结合位 点， 在C-端侧与第二氨基酸结合的位点称为S2结合位点等(Turk et al.， 2001， EMBO J.， 20 ： 6570-6582 ； Molgaard et al.， 2007， Biochem.J.， 401 ： 645-650)。在 DPPI 底物中的相 应位点称为 P1、 P2、 P1、 P2等， 其中底物的 P1与 DPPI 的 S1位点结合， 底物的 P2与 DPPI 的 S2结合， 底物的 P1与 DPPI 的 S1位点结合等。根据 DPPI 与 6 种氨基酸底物的结合复合 物的结晶学结果， Molgaard et al. 提出其中 。
11、DPPI 包含 S2-S1和 S1 -S4底物结合位点的 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A2/8 页 4 模型。因为 DPPI 在体内与较大的底物例如 228 个氨基酸的人前类糜蛋白酶 (prochymase) 结合 ； DPPI 的底物结合位点可包含超过 S2-S1-S1 -S4， 甚至至 S2-S1-S1 -S18 0010 因为 DPPI 是潜在的治疗靶， 通常已使用几种测定法分析 DPPI 活性 (Gelman et al.， J.Clin.Invest.1980， 65 ： 1398-1406 ； (Tran et al.， Arch.Bioch。
12、em.Biophys.2002， 403 ： 160-170)。Gelman et al. 使用 Gly-Phe- 萘基酰胺的标记二肽作为底物， 通过用 荧光分光光度计测量游离 - 萘基酰胺的浓度确定 DPPI 活性。同样， Tran et al. 使用几 种用 7- 氨基 -4- 甲基香豆素标记的二肽作为 DPPI 底物， 通过用荧光分光光度计测量游离 甲基香豆素的浓度确定 DPPI 活性。Tran et al. 显示 Ala-Hph-7- 氨基 -4- 甲基香豆素的 二肽底物是 DPPI 的最佳底物， 即使底物包含非生理学残基 Hph( 同型苯丙氨酸 )。 0011 这些具有荧光标记的常用。
13、二肽底物有几个问题。首先， 二肽底物只与 S1和 S2位点 结合。同与除了 S1和 S2位点之外的结合位点结合的体内生物学底物相比， 这是部分或不完 全的。不完全或部分结合可能非特异性， 从而导致鉴定假阳性或阴性化合物。而且， 需要附 加荧光检测步骤检测 DPPI 活性。这种附加步骤使该测定法难以适合用于高通量形式。 0012 因此， 仍然需要发展使用无标记和生物学相关底物的测定法用于分析 DPPI 活性。 而且， 有需要发展适合用于高通量形式的 DPPI 测定法以能够有效筛选大量化合物或试剂 用于药物开发。 0013 已将无标记技术与质谱系统联合以分析酶促反应。Quercia et al.(。
14、J.Biomol. Screen.12 ： 473-480， 2007) 在多反应监测中用质谱鉴定激酶 AKT1/PKB 抑制剂。同样， Forbes et al.(J.Biomol.Screen.11 ： 628-634， 2007) 在多反应监测中用质谱在 96 孔板中 评估磷脂酰基丝氨酸脱羧酶。高通量形式的质谱检测系统尚未用于分析 DPPI 活性。 0014 本申请提供测定 DPPI 活性的方法。该方法利用包含生物学相关氨基酸序列和结 合特异性的无标记肽底物。 该测定法可用质谱系统检测， 可以高通量形式操作， 减少加工时 间和增加筛选化合物所需的通量。该方法还可用于片段基化合物的差异追踪。
15、用于药物开 发， 评估其它二肽基蛋白水解反应用于功能研究。 0015 概述 0016 本申请的一个目的是提供筛选调节 DPPI 活性的化合物的方法。该方法包括以下 步骤 ： 将DPPI的底物加入含有DPPI和化合物的反应混合物内， 其中底物具有3-100个氨基 酸， 与除了S1-S2位点之外的DPPI结合位点结合， 测量底物分子量的变化和/或底物与产物 质量比的变化， 其中底物分子量或质量比的变化提示 DPPI 活性的存在。 0017 根据本发明一个实施方案， 化合物可以是 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯酚或 2-( 哌 啶 -1- 基羰基 ) 苯胺。 0018 另一个目的是提供可用于筛。
16、选调节 DPPI 活性的化合物的无标记 DPPI 底物。例示 性 DPPI 底物可选自 SEQ ID NOs ： 1-7。DPPI 底物可优选包含具有 20 个氨基酸的肽。DPPI 底物优选无标记。 0019 根据以下详细描述， 并结合附图考虑， 本发明的其它目的和特征将变得显而易见。 但是， 应理解设计附图只用于示例性目的， 并非限制本发明的定义， 本发明的定义应参考所 附的权利要求。 还应理解附图不一定按比例绘制， 除非另外说明， 它们只用于在概念上举例 说明本文描述的结构和方法。 0020 附图简述 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A3/8 页 5 0。
17、021 在图中 ： 0022 图 1. 在与 20-mer 底物 (A) 和二肽底物 (B) 的反应中对 DPPI 动力学常数的初始 速度分析。(A) 约 2nM DPPI 用于与 GEIIGGTECKPHSRPYMAYL 的 20-mer 底物反应， 用质谱系 统监测反应。(B) 约 0.4nM DPPI 用于与 GR- 甲基香豆素的二肽底物反应， 在 EM 460nm 和 EX 380nm 用速率基形式监测荧光监测反应。当达到小于 7的底物转换时从动力学数 据中采集初始速率。 0023 图 2. 用二肽底物 (A) 和用 20-mer 肽底物 (B) 评估两种测试化合物的 DPPI 调 节。
18、活性。(A) 约 0.4nM DPPI 和约 10M 二肽底物 GR- 甲基香豆素用于速率基形式， 在 EM 460nm 和 EX 380nm 用 荧 光 监 测。(B) 约 2nM DPPI 和 20M 20-mer 肽 底 物 GEIIGGTECKPHSRPYMAYL 用于反应， 用质谱系统监测。将 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯酚用实心 方形表示， 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯胺用实心圆形表示。R2- 值 0.95。 0024 本发明优选实施方案的详细描述 0025 为了检测在 DPPI 激动剂或拮抗剂的存在下二肽基肽酶 I(DPPI) 的活性， 将用作 DPPI 底物的肽。
19、加入反应混合物内， 以便反应混合物包含反应缓冲液、 DPPI 的激动剂或拮抗 剂、 DPPI 和底物。PIPES、 HEPES、 磷酸钠缓冲液系统或其中 pKa 为约 7.0 的任何缓冲系统 都可用于 DPPI 测定。优选 HEPES 缓冲液系统。例如， 10 反应缓冲液是 pH 7.0 的 500mM HEPES， 1M NaCl， 和 0.05 Tween-20。也可使用本领域技术人员通常已知的其它缓冲液系 统。在反应之前， 将 DTT 或谷胱甘肽加入 1 反应缓冲液中至终浓度为 2mM。 0026 DPPI 可市售获得， 通过重组 DNA 技术制备， 或者通过本领域技术人员通常已知的 方。
20、法从细胞分离或纯化。 0027 与超过 DPPI S1-S2底物结合位点的位点结合的至少 3 个氨基酸、 优选 5-100 个氨 基酸、 最优选 10-50 个氨基酸的任何肽可作为底物用于检测 DPPI 的蛋白水解活性。肽底物 的底物结合位点数可以是3-100， 优选5-50， 最优选6-20。 因此， 肽底物在S1-S2底物结合位 点和 S1 -S98、 优选 S1 -S48、 最优选 S1 -S4的至少一个附加底物结合位点与 DPPI 结合。 0028 本申请的肽底物不用任何荧光剂或显色剂标记或修饰。肽底物可以化学合成， 用 重组 DNA 技术表达， 或者通过本领域技术人员通常已知的方法从。
21、细胞分离或纯化。 0029 用于本文时， 术语多肽指通过肽键或修饰的肽键即肽等排体相互连接的三个或更 多个氨基酸。多肽指短链， 通常称为肽、 低聚肽或低聚物， 和长链， 通常称为蛋白质。多肽可 包含不同于 20 种天然存在的氨基酸的氨基酸。多肽包括通过天然过程如翻译后加工， 或者 通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰充分的描述于研究文献中。 修饰可发生在多肽中的任何地方， 包括肽主链、 氨基酸侧链和氨基或羧基端。 0030 将 5-50l、 优选 10 或 20l 反应体积等份分入常用于实验室的试管或板内， 通 过测量底物转换测定 DPPI 活性。用于本文时， 底物转换指底物。
22、量的减小和随后产物量的增 加。 可通过监测底物和产物的分子质量测量底物转换。 优选质谱系统。 例如， 可用本领域技 术人员已知的具备 Agilent Chemstation 软件等的 Agilent MSD 通过单离子监测 (SIM) 技 术确定底物和产物的浓度。用 Agilent Chemstation 和 BioTrove Rapidfire Integrator 分析数据。将测定法设计为默认小于 10的底物转换用于化合物测试。 0031 通用酶促反应的平衡如下所示 ： 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A4/8 页 6 0032 0033 其中 E 是酶。
23、， S 是酶的底物， P 是反应的产物。 0034 调节平衡以举例说明用本申请的肽底物在 DPPI 测定中的二肽基蛋白水解反应 ： 0035 0036 当开始时， DPPI裂解并从具有20个氨基酸G-E-I-I-G-G-T-E-C-K-P-H-S-R-P-Y-M -A-Y-L的肽底物的N-端脱除2个氨基酸G-E或Gly-Glu。 这导致肽底物的分子量或质量从 2,224Da 变为 2,037， 相差 187Da。可用单离子监测通过质谱检测反应中肽底物的分子量或 质量。通过 SIM 检测肽底物的变化或差异是从 1,112amu( 原子质量单位 ) 至 1,018.5amu。 这可用于确定底物转换。
24、的数值。 0037 一旦底物转换的速率在初始速度状态， 用下式(I)计算DPPI和肽底物的动力学常 数 ： 0038 Y VMAX(X+Et+KM)-(Et+X+KM)2)-(4XEt)0.5)/(2Et) 0039 其中 0040 Y 是底物转换的浓度 0041 X 是底物浓度 0042 Et 是 DPPI 浓度 0043 KM是在 1/2VMAX时的底物浓度 0044 VMax是在底物饱和时的底物转换 0045 为了筛选调节 DPPI 活性的测试化合物， 可用下式计算 DPPI 活性的抑制 ： 0046 在阳性对照中底物转换的量 ： 0047 0048 在含有测试化合物的样品中底物转换的量。
25、 ： 0049 0050 0051 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A5/8 页 7 0052 0053 0054 其中 0055 S 是底物的浓度 (M) 0056 SIMS是在样品中底物的 SIM(amu 曲线下面积 ) 0057 SIMSPC是在阳性对照样品中底物的 SIM(amu 曲线下面积 ) 0058 SIMP是在样品中产物的 SIM(amu 曲线下面积 ) 0059 SIMPC是阳性对照的产物的 SIM(amu 曲线下面积 ) 0060 SIMSPC是在阳性对照样品中底物的 SIM(amu 曲线下面积 ) 0061 SIMNC是阴性对照的产物的。
26、 SIM(amu 曲线下面积 ) 0062 SIMSNC是阴性对照的底物的 SIM(amu 曲线下面积 ) 0063 其中阳性对照是无任何测试化合物的反应物， 阴性对照是无 DPPI 或底物的反应 物， 样品是含有测试化合物的反应物。 0064 当鉴定候选化合物时， 用式 (II) 计算候选化合物对 DPPI 抑制的 IC50： 0065 0066 其中 0067 Si是样品的净底物转换信号 0068 So是阳性对照的净底物转换信号 0069 Smin是阴性对照的净 SIM 信号 0070 I 是候选化合物的浓度 0071 其中阳性对照是无任何测试化合物的反应物， 阴性对照是无 DPPI 或底。
27、物的反应 物。 0072 上文描述的测定法可用于以高通量形式筛选测试化合物， 鉴定调节 DPPI 活性的 候选化合物。在这样的情况下， 首先将反应混合物等份分入含有多个孔的微量滴定板例如 96- 或 386- 孔板内， 然后将板装入检测系统例如质谱仪等， 读取各板各孔中的反应物以产 生数字数据。 0073 至此， 虽然在应用于其优选的实施方案时， 已显示、 描述和指出了本发明的基本新 的特征， 但是应理解， 可在不脱离本发明精神的情况下， 由本领域技术人员对示例化合物、 方法和装置的形式和细节及其操作进行各种省略和取代和改变。例如， 明确指出以基本相 同的方式发挥基本相同的功能以获得相同结果的。
28、那些因素和 / 或方法步骤的所有组合在 本发明范围内。此外， 应认识到， 作为设计选择的一般情况， 与本发明的任何公开形式或实 施方案相关显示和 / 或描述的结构和 / 或因素和 / 或方法步骤可以任何其它公开或描述或 提示的形式或实施方案进行结合。因此， 本发明将只由本文所附权利要求的范围所示来限 定。 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A6/8 页 8 0074 实施例 1 0075 10HEPES 缓冲液系统和二肽基蛋白酶 I 的制备 0076 制备 pH 7.0 的 500mM HEPES， 1M NaCl 和 0.05 Tween-20 的 10 反。
29、应缓冲液。 在反应之前， 将 DTT 或其它合适还原剂加入 pH 7 的 50mM HEPES， 100mM NaCl 和 0.005 Tween-20的1反应缓冲液中， 至终浓度为2mM。 将10或20l反应体积等份分入384-孔 聚丙烯板内用于 DDP-I 活性测定。 0077 在 Hi5 昆虫细胞中用杆状病毒系统使 DPPI 过度表达和纯化， 根据 Lauritzen et al.(1998， Protein Expr.Purif 14， 434-442)， 其内容通过引用整体结合到本文中。根据 杆状病毒表达系统 (Invitrogen， Carlsbad， CA) 说明书制备编码 DP。
30、PI 前体的重组杆状病 毒。简言之， 将含有人和小鼠 DPP 前体的 cDNA 的重组杆状病毒转染入 Hi5 昆虫细胞内。在 转染后约 4-5 天， 收集培养基， 在 pH 4.5 用丁基 -Sepharose(GE Healthcare) 层析纯化 DPPI 前体。将含 DPPI 流份汇集， 在 pH 7.0 透析 2 天以完成激活。在分泌和激活过程中， 信号序列和活性肽分开， 产生完全活化的酶。将透析的异源三聚体和活性 DPPI 进一步在 Q-Sepharose(GE Healthcare) 上纯化， 超滤 (Amicon， Ultra-15， 10000MWCO， Millipore) 。
31、浓 缩， 在 20mM Bis-Tris/HCl， pH 7.0， 0.1M NaCl， 2mM DTT， 和 2mM EDTA 终缓冲液中透析。所 有纯化和透析步骤都在 4进行。将 DPPI 分等份， 在液氮中快速冷冻， 贮存于 -80。通过 N- 端测序确认三种链的正确 N- 端。 0078 实施例 2 0079 与 DPPI 多底物结合位点结合的肽底物的设计 0080 人糜蛋白酶、 组织蛋白酶 G、 弹性蛋白酶和类胰蛋白酶的 N- 端肽序列排列如下 ： 0081 0082 选 择 肽 GEIIGGTECKPHSRPYMAYL(SEQ ID NO ： 1)、 NH2-GEIIGGTECKP。
32、HSRPYMAYK-CO OH(SEQ ID NO ： 2)， NH2-GEIIGG-COOH(SEQ ID NO ： 3) 和 NH2-GEIIGGTE-COOH(SEQ ID NO ： 4) 作为 DPPI 底物。将底物和相应的产物肽 NH2-IIGGTECKPHSRPYMAYL-COOH(SEQ ID NO ： 8)、 NH2-IIGGTECKPHSRPYMAYK-COOH(SEQ ID NO ： 9)、 NH2-IIGG-COOH(SEQ ID NO ： 10) 和 NH2-IIGGTE-COOH(SEQ ID NO ： 11) 合成 (AnaSpec， San Jose， CA)， 。
33、溶于 Milli-Q 水中。肽底 物及其产物的单离子监测 (SIM) 描述于表 1。 0083 表 1. 底物和产物肽的 SIM 0084 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A7/8 页 9 0085 本领域技术人员将认识到可用作本文所述方法的底物的其它肽序列， 例如 NH2-GEIIGGTECK-COOH(SEQ ID NO ： 5)、 NH2-GEIIGGTECKPH-COOH(SEQ ID NO ： 6) 和肽 NH2-GE IIGGXEAKPHSRPYMV-YL-COOH(SEQ ID NO ： 7)， 其中 X 是任何天然或修饰的氨基酸。 0086 。
34、实施例 3 0087 用肽底物的 DPPI 测定 0088 用单离子监测检测通过质谱系统产生 NH2-GEIIGGTECKPHSRPY-MAYL-COOH(SEQ ID NO ： 1) 的 20-mer 底物肽和 18-mer 产物肽 (NH2-IIGGTECKPHSRPYMAYL-COOH(SEQ ID NO ： 8) 的标准曲线。 0089 将约 2nM DPPI 与约 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 90、 128、 150M 20-mer 底物温育在 50mM HEPES(pH 7.0)， 100mM NaCl， 0.005Tween-20， 和2mM DTT。
35、或GSH反应缓冲液中。 将 反应物温育在约 27， 在 0、 2、 5、 10、 20、 30、 45、 60、 75、 90 和 120 分钟多个时间点用约 1/10 体积的 2三氟乙酸终止。用具备 C4柱的 RapidFire(BioTrove， Woburn， MA) 将约 10l 等 份试样的猝灭反应物用于检测底物转换。将反应物装在柱上， 用 0.1甲酸 +0.02 TFA 固 定相平衡， 以每分钟约 1ml 用 90 MeCN+0.1甲酸 +0.02 TFA 流动相展开。以正离子模 式监测用 Agilent 1100 系列 LCMSD(Santa Clara， CA) 监测 SIM 。
36、1112amu( 原子质量单位 ) 的 20-mer 底物和 SIM 1019 的相应的 18-mer 产物。 0090 当达到小于 7的底物转换时， 从动力学数据得到初始反应速率。结果， 如图 1 显 示， 表明底物转换可用双曲线表示。计算 KM、 Kcat和二级速率常数的数值分别为约 62M、 1.15sec-1和 1.95104M-1sec-1( 表 2)。这些数值是在 DPPI 测定中用于评估测试化合物的 设定条件。 0091 实施例 4 0092 利用二肽和肽底物的速率基 DPPI 测定 0093 用二肽底物 Gly-Arg， 用 - 甲基香豆素 (AMC) 标记， 或 SEQ ID。
37、 NO ： 1 的 20-mer 肽底物， 分析 DPPI 活性。对于二肽底物， 将约 0.4nM DPPI 与约 1、 2、 5、 10、 25、 50、 100、 150、 300、 600M二肽底物温育在10ul 50mM Hepes(pH 7.0)， 100mM NaCl， 0.005Tween-20， 和 2mM DTT 或 GSH 的反应缓冲液中。连续监测荧光 (Ex 380nm， EM 460nm) 约 0-10 分钟， 用 Safire II(Tecan， Switzerland) 确定 DPPI 活性。20-mer 肽底物的条件与上文描述的 相同。 0094 用任一种底物进行。
38、 DPPI 测定的动力学常数如表 2 显示。与包含标记二肽的那些 反应相比， 包含 20-mer 底物肽的反应的 kcat和二级速率常数数值都降低。结果显示 20-mer 底物具有不同的动力学机制， 可能是因为产物解离是限速步骤。与 20-mer 底物的反应产物 包括 N- 端 2-mer 肽和 C- 端 18-mer 肽。18-mer 产物肽与不能用二肽底物检验的 DPPI 结合 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A8/8 页 10 位点结合。这提示用二肽底物进行 DPPI 测定可能无法提供关于测试化合物效力的足够信 息。 0095 表 2 ： 用 GEII。
39、GGTECKPHSRPYMAYL 的 20-mer 底物和 GR 的二肽底物进行 DPPI 测定 的动力学常数概要 . 0096 KM(M) Kcat(Mmin-1) 二级速率常数 (M-1sec-1) 0097 20-mer 62 69 1.95104 0098 二肽 64 5667 1.48106 0099 实施例 5 0100 筛选调节 DPPI 活性的测试化合物 0101 评估两种片段化合物 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯酚和 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯胺调 节 DPPI 的活性。在 100 DMSO 中制备约 0.1mM- 约 100mM 化合物的系列稀释液。将约 1。
40、l 测试化合物和约 8l 约 3.75nM DDP-I 加入 384- 孔聚丙烯板 (Greiner Bio-One North America Inc.， Monroe， North Carolina) 内。通过加入约 1l 200M 底物开始蛋白水解 反应。将反应物在 27温育 60 分钟， 加入约 25l 0.1甲酸 +0.02 TFA 终止。按照实 施例 3 和 4 描述用 RapidFireTM分析约 10l 等份试样的猝灭反应物。 0102 实验 5 的结果在图 2 概述。在与二肽底物的反应中， 即使在 10mM 高浓度， 也没有 一种化合物影响 DPPI 活性。但是， 在与 20。
41、-mer 底物的反应中， 两种化合物都以浓度依赖的 方式调节 DPPI 活性。半对数图分析显示 2-( 哌啶 -1- 基羰基 ) 苯酚和 2-( 哌啶 -1- 基羰 基 ) 苯胺的 IC50值分别为约 0.1mM 和约 1mM。以前， 这些化合物尚未显示可调节 DPPI 活性。 0103 本申请提供测定DPPI活性的方法， 优选用无标记的肽作为DPPI底物。 与常用的标 记二肽底物相比， 该方法具有几个优点。例如， 无标记底物可直接检测未修饰的化合物， 排 除因标记和第二检测系统引起的局限性。而且， 无标记底物很容易适用于高通量形式。此 外， 肽底物具有与细胞中那些生理学靶相似的对 DPPI 活性位点的结合特异性。而且， 增加 的结合特异性允许评估或鉴定在活性位点S1-S2区外结合的化合物。 化合物与除了S1-S2之 外的活性位点例如 S1 -S4结合， 呈对数增加并具有特异性。 说 明 书 CN 102216469 A CN 102216480 A1/2 页 11 图 1A 图 1B 说 明 书 附 图 CN 102216469 A CN 102216480 A2/2 页 12 图 2A 图 2B 说 明 书 附 图 CN 102216469 A 。