技术领域
本发明涉及辅助亚基KChIP4与Kv4钾通道相互作用的结构和功能位点的应用。
背景技术
离子通道是大分子膜蛋白在细胞膜上围成的含水分子孔道。K+通道存在于所有 的真核细胞中并发挥着多种重要的生物学功能。简单地讲，反应细胞生死、存亡的 一个客观指标就是判断该细胞是否还存在着细胞膜负电位，而K+通道的正常功能活 动不仅负责建立细胞膜的静息负电位，同时也参与调节动作电位的频率、幅度，是 维持各种细胞电活动和生命过程的基础。
K+通道的结构与功能研究起始于1988年Jan研究组对果蝇Shaker K+通道基因 的发现。根据Shaker通道的同源性比较，哺乳类电压门控K+通道(Kv)超大家族主要 由四种功能独立的亚家族，即Kv1(Shaker)、Kv2(Shab)、Kv3(Shaw)和Kv4(Shal)组 成(Pak，M.D.，et al.，mShal，a subfamily of A-type K+ channel cloned from mammalian brain.Proc Natl Acad Sci USA，1991.88(10)：p.4386-90.)。Kv钾通道的α蛋白亚基 结构相似，均含有六个跨膜(6TM)的α螺旋(S1至S6)、胞浆内的N-末端和C-末端 以及位于S5和S6之间的K+通道孔道区(pore domain)。K+孔道区含有由氨基酸TxGYG (其中x表示任一氨基酸)组成的K+过滤器，它是钾通道必需的保守序列，亦称指 纹序列(signature sequence)(Heginbotham，L.，et al.，Mutations in the K+ channel signature sequence.Biophys J，1994.66(4)：p.1061-7.)。1998年MacKinnon研究组 运用X射线衍射技术，解析了原核细胞细菌钾离子通道KcsA的结晶结构，这一突 破性成果在原子层次上首次揭示了钾离子通道的工作原理(Doyle，D.A.，et al.，The structure of the potassium channel：molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science，1998.280(5360)：p.69-77.)。
Kv4(Shal)亚家族由三个基因成员组成：Kv4.1、Kv4.2和Kv4.3，由这三个基因 编码的通道蛋白在跨膜区部分有极高的同源性，它们之间的主要差别在于通道的N- 末端和C-末端。Kv4.1、Kv4.2和Kv4.3基因的组织学分布也很相似，主要在脑、 心脏和骨骼肌有高度表达。受膜电位的刺激，Kv4钾通道的基本生物学功能是在瞬 间激活后便快速关闭失活，通道的开放激活(activation)和关闭失活(inactivation)过 程称为门控(gating)，是Kv4钾通道重要的生理和生物物理学特征。与其它电压门 控Kv钾通道相比，三种Kv4钾通道都具有被低阈值膜电压快速激活、激活后能快 速地自身失活以及失活后恢复的生理特点，属于快速失活(rapidly inactivating)型电 压门控钾通道。Kv4在神经元和心肌细胞分别编码瞬间低阈值A型K+电流ISA(transient subthreshold A-type K+ current)和瞬间外向K+电流ITO(transient outward K+ current) (Serodio，P.，C.Kentros，and B.Rudy，Identification of molecular components of A-type channels activating at subthreshold potentials.J Neurophysiol，1994.72(4)：p. 1516-29.Wickenden，A.D.，et al.，Regional contributions of Kv1.4，Kv4.2，and Kv4.3 to transient outward K+ current in rat ventricle.Am J Physiol，1999.276(5 Pt 2)：p. H1599-607.)，对各自的动作电位发挥重要的调节作用。例如，神经元A型Kv4 K+电流通常在静息细胞膜电位在-50到-60mV时已经失活，但Kv4钾通道在动作电位 后的瞬间后超级化(after-hyperpolarization)过程中从失活中迅速恢复。当细胞膜继续 去极化时，Kv4 K+电流被低阈值电压再次激活，从而对细胞的兴奋性起到负反馈调 节的抑制作用。电压依赖的Kv4 K+电流的失活时间和失活动力学过程对神经元或心 肌细胞动作电位的幅度、时程和放电频率发挥着重要的精细调节作用(Suzuki，T.and K.Takimoto，Difierential expression of Kv4 pore-forming and KChIP auxiliary subunits in rat uterus during pregnancy.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005.288(2)：p. E335-41.Shibata，R.，et al.，A-type K+ current mediated by the Kv4 channel regulates the generation of action potential in developing cerebellar granule cells.J Neurosci， 2000.20(11)：p.4145-55.)。
快速失活型电压门控Kv4 K+通道的自身失活动力学以及失活过程的精细调节是 Kv4通道发挥其生理功能的核心，其失活功能发挥的结构基础主要依赖于通道的N- 末端。近十几年来对Shaker K+通道的研究结果表明，电压门控Kv1(Shaker)K+通道 存在两种不同的失活动力学，即数十毫秒的快速失活和数百毫秒的慢速失活。两种 失活的分子机制也大不相同。第一种失活即快速失活是普遍接受的N-型或“球- 链”失活机制。N-型失活是由Kv1(Shaker)K+通道α亚基氨基末端(“链”)的前 20-30个氨基酸所形成的“球”状结构在通道开放时将通道的内侧孔道入口处堵塞 而造成的快速失活。实验证明，删除N-端的“球-链”部分，Shaker通道的失活功 能便丧失。如果将N-端短肽再放回细胞中，通道的失活功能便可恢复(Zagotta，W.N.， T.Hoshi，and R.W.Aldrich，Restoration of inactivation in mutants of Shaker potassium channels by a peptide derived from ShB.Science，1990.250(4980)：p.568-71.)。第二种 失活形式是由孔道区外部的C-末端氨基酸的构象改变而导致通道的缓慢关闭的C- 型失活。
Kv4钾通道亦有快速和慢速两种失活。然而，Kv4的失活机制尚不清楚，目前 存在各种解释和不同的学说(Jerng，H.H.，M.Shahidullah，and M.Covarrubias， Inactivation gating of Kv4 potassium channels：molecular interactions involving the inner vestibule of the pore.J Gen Physiol，1999.113(5)：p.641-60.)。一种观点认为， Kv4钾通道的失活与经典的Kv1(Shaker)通道N-型失活机制相似。删除Kv4.2 N-端 的第2-40位氨基酸，Kv4.2钾通道的快速失活功能丧失。这一结果提示，Kv4通道 的N-端是其失活的结构基础(Bahring，R.，et al.，Conserved Kv4 N-terminal domain critical for effects of Kv channel-interacting protein 2.2 on channel expression and gating.J Biol Chem，2001.276(26)：p.23888-94.)。另一种观点则认为，Kv4通道的 失活既不属于N-型失活也不属于C-型失活，而是由N-端和C-端共同参与、协调完 成的一种特殊失活。因此，关于Kv4通道的确切失活机制和失活的结构基础仍不清 楚，尚需进一步的研究和阐明。
在Kv4亚家族各成员之间，电压门控K+通道α亚基通过形成四聚体而组成功能 性的通道。通道四聚体(tetramerization)形成的结构基础是由保守的胞浆N-端亲水的 部分T1结构域(T1domain)即四聚体结构域(tetramerization domain)介导完成(Li， M.，Y.N.Jan，and L.Y.Jan，Specification of subunit assembly by the hydrophilic amino-terminal domain of the Shaker potassium channel.Science，1992.257(5074)：p. 1225-30.Scannevin，R.H.，et al.，Two N-terminal domains of Kv4 K(+)channels regulate binding to and modulation by KChIP1.Neuron，2004.41(4)：p.587-98.)。T1结构域由 位于N-末端的第一跨膜α螺旋S1之前的130个氨基酸组成，T1在胞浆内进行特异 的组装形成稳定的四聚体结构。Kv1通道的T1晶体结构显示，T1结构域极性氨基 酸之间的相互作用，以对称的形式围绕着中心的空腔呈四聚体排列。最近所解析的 Kv4.3 T1晶体结构亦显示，T1结构域除以四聚体折叠形式存在外，亦含有四个Zn2+原子(每个T1的C-端含有一个Zn2+原子结合位点)起着稳定T1四聚体的作用。Zn2+原子结合位点突变会影响四聚体的稳定性，导致Kv4通道电流表达显著降低。因此， Kv通道T1的主要功能是促进通道的四聚体化，它是形成功能性钾离子通道的重要 结构基础。同时，T1也可能参与通道的门控，影响通道的激活和失活的动力学过程 (Scannevin，R.H.，et al.，Two N-terminal domains of Kv4 K(+)channels regulate binding to and modulation by KChIP1.Neuron，2004.41(4)：p.587-98.Wang，H.，et al.， Structural basis for modulation of Kv4 K+ channels by auxiliary KChIP subunits.Nat Neurosci，2007.10(1)：p.32-9.Choe，S.，et al.，Excitability is mediated by the T1 domain of the voltage-gated potassium channel.Novartis Found Symp，2002.245：p.169-75； discussion 175-7，261-4.Zhou，W.，et al.，Structural insights into the functional interaction of KChIP1 with Shal-type K(+)channels.Neuron，2004.41(4)：p.573-86.)。
辅助β亚基对电压门控K+通道在细胞膜上的表达、通道的生物物理学和药理学 特征等也有重要的调节作用。已知的离子通道的β亚基有膜蛋白和胞浆蛋白两种。 利用酵母双杂交(yeast two-hybrid，YTH)系统和免疫共沉淀方法以Kv4 N-端为诱饵， 2000年发现了三种与Kv4钾通道特异结合的胞浆蛋白KChIPs(Kv4 channel interacting proteins)，即KChIP1、KChIP2和KChIP3(An，W.F.，et al.，Modulation of A-type potassium channels by a family of calcium sensors.Nature，2000.403(6769)：p. 553-6.)。随后，KChIP4作为早老素(presenilin)的分子伴侣也被克隆(Morohashi，Y.， et al.，Molecular cloning and characterization of CALP/KChIP4，a novel EF-hand protein interacting with presenilin 2 and voltage-gated potassium channel subunit Kv4.J Biol Chem，2002.277(17)：p.14965-75.)。到目前为止，共发现四种KChIP蛋白(分别含 有216至259个氨基酸)。其中，KChIP4由229个氨基酸组成，其氨基酸序列如序 列表中的序列1所示。
免疫双染色实验还证明，Kv4通道与KChIPs在细胞内共定位形成Kv4-KChIPs 通道自然复合体。KChIPs影响Kv4电流的密度、失活动力学和失活后的恢复。KChIPs 属于钙结合蛋白恢复蛋白-神经元钙感受器超大家族(recoverin-neuronal calcium sensor superfamily)的成员，与神经元钙感受器1(neuronal calcium sensor 1，NCS-1) 蛋白序列有同源性。KChIP3与钙衰蛋白(calsenilin)和DREAM(downstream regulatory element antagonist modulator)是同一蛋白的不同命名。
四种胞内可溶性KChIP蛋白的核心区和C-末端部分相对保守，但它们的N-末 端却大不相同。KChIP蛋白含有四个类似EF-hand样钙结合模体(EF-hand-like calcium-binding motif)。每个EF-hand样钙结合模体由约12个氨基酸形成的环状结 构和两个α螺旋侧翼序列构成。理论上每个EF-hand可以结合一个Ca2+，但是DREAM 和NCS家族其它成员共有的CPXG(半胱氨酸-脯氨酸-X-甘氨酸)序列阻止了 EF-hand1与Ca2+的结合。最近解析的KChIP1晶体结构显示，EF-hand 3和EF-hand 4 对Ca2+的亲和力较高，可以与Ca2+结合，而EF-hand1和EF-hand2对Ca2+的亲和力较 低，不能与Ca2+结合。异源表达系统和在体形态学研究证明，KChIPs与Kv4通道相 互作用，在细胞内以复合体形式共存(Shibata，R.，et al.，A fundamental role for KChIPs in determining the molecular properties and trafficking of Kv4.2 potassium channels.J Biol Chem，2003.278(38)：p.36445-54.)。
KChIP1、KChIP2和KChIP3对Kv4通道有相似的生理学和生物物理学调节作用， 表现在增加Kv4.2的电流密度(即通道蛋白的表达增加)、通道激活-电压曲线向超 极化方向左移、减慢通道的失活速率和加速通道从失活中的快速恢复等方面。
KChIP1对Kv4.2的作用效果在很大程度上与神经细胞所记录的Kv4电流的生物 物理学特性相吻合。免疫荧光实验证实，COS-1细胞中Kv4.2的表达主要出现在细 胞核周围，即典型的蛋白滞留在内质网(ER)的分布形式。KChIP1-3与Kv4的共表达 明显地改变了Kv4.2通道蛋白在细胞内的分布，使Kv4离开内质网到达高尔基体并 向细胞膜转运的过程加速，最终Kv4.2在细胞膜的表达显著增加。研究还表明， KChIP1-3还可增加Kv4的磷酸化，改变其溶解性和稳定性等，此作用机制可能与 KChIPs遮蔽Kv4 N-末端疏水性结构域有关(Shibata，R.，et al.，A fundamental role for KChIPs in determining the molecular properties and trafficking of Kv4.2 potassium channels.J Biol Chem，2003.278(38)：p.36445-54.)。
与其它KChIPs相比，KChIP4对Kv4的作用明显不同。KChIP4不能促进Kv4.2 在细胞膜上的表达，对Kv4通道的电流密度和失活中的恢复均无影响，但却能完全 消除Kv4通道的失活，使快速失活型Kv4通道变成非失活的延迟整流型 (delayed-rectifier)Kv4通道。KChIP4与其它KChIPs之间相互竞争与Kv4通道结合。 初步研究表明，KChIP4对Kv4失活的影响可能与其N-端的KIS(K-channel inactivation suppressor)结构域有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种使KChIP4功能转换成KChIP1的方法。
本发明所提供的使KChIP4功能转换成KChIP1的方法，是将KChIP4的下述1) 和2)这两组中的至少一组氨基酸残基同时进行突变：
1)KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15位的异亮 氨酸(Val11、Val14、Ile15)；
2)KChIP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯 丙氨酸(Phe18、Leu21、Phe25)；
本发明的第二个目的是提供一种使KChIP4诱导的Kv4通道电流失活变快的方 法。
本发明所提供的使KChIP4诱导的Kv4通道电流失活变快的方法，是将KChIP4 的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸(Phe61和Ile68)同时进 行突变。
本发明的第三个目的是提供一种筛选改变神经元兴奋性的药物的方法。
本发明所提供的筛选改变神经元兴奋性的药物的方法，是基于Kv4和KChIP4 相互作用的下述1)、2)和3)这三组中的至少一组氨基酸残基进行药物设计，筛 选能够减弱或增强Kv4和KChIP4蛋白间相互作用的化学小分子或生物大分子：
1)KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15位的异亮 氨酸；
2)KChIP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯 丙氨酸；
3)KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸。
所述KChIP4来源于人或动物，如猴、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等。
本发明通过X-射线晶体衍射手段解析KChIP4晶体的原子结构，通过与近期解 析出的Kv4-N-KChIP1复合结晶中KChIP1晶体原子结构的比较(Wang，H.，et al.， Structural basis for modulation of Kv4 K+channels by auxiliary KChIP subunits.Nat Neurosci，2007.10(1)：p.32-9.)，并结合生化、分子生物学、电生理学和生物物理 学等交叉学科的研究方法，解析了KChIP4晶体的原子结构，发现KChIP4与Kv4相 互作用并引起Kv4各项生物物理学以及细胞生物学指标发生变化的关键氨基酸作用 位点，为基于KChIP4和Kv4相互作用的接触界面结构进行药物设计，以改变KChIP4 蛋白对Kv4的特异调节作用提供了基础。
附图说明
图1为KChIP4的晶体结构
图2为突变KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15 位的异亮氨酸(Val11、Val14、Ile15)，对Kv4.3和KChIP4在卵母细胞的共表达 电流幅度和失活动力学的影响
图3为突变KChIP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第 25位的苯丙氨酸(Phe18、Leu21、Phe25)，对Kv4.3和KChIP4在卵母细胞的共表 达电流幅度和失活动力学的影响
图4为突变KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸 (Phe61和Ile68)，KChIP4对Kv4.3的调节功能丧失。
图5为分别突变KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和 第15位的异亮氨酸(Val11、Val14、Ile15)、突变KChIP4的自氨基末端第18位 的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸(Phe18、Leu21、Phe25)和 突变KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸(Phe61和 Ile68)，KChIP4对Kv4.3转运的影响。
具体实施方式
实施例1、KChIP4蛋白的表达和纯化
一、重组表达载体的构建
1、KChIP4蛋白的重组表达载体pET28a-KChIP4的构建
提取小鼠全脑组织的RNA，反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，利用上游引 物5’-6CACATATGAACTTGGAGGGGCTTGAAAT-3’和下游引物5’ -AGCTCCTCGAGCTAGATCACATTTTCAAAGAGCTGCATG-3’进行PCR扩增，得到KChIP4基 因全长cDNA片段。将得到的KChIP4基因全长cDNA片段与pET28a质粒(Novagen 公司)用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切后连接，将得到的重组表达载体命名为 pET28a-KChIP4。pET28a质粒中多克隆位点的上游和下游都含有六个组氨酸标签 (His-tag)便于后续实验中的纯化工作。
2、KChIP4蛋白突变体表达载体的构建
(1)重组表达表达载体pET28a-KChIP4-V11E-V14E-I15E的获得
重组表达载体pET28a-KChIP4-V11E-V14E-I15E的特异性点突变、氨基酸置换 等均采用PCR方法。以上述步骤1构建的重组表达载体pET28a-KChIP4为模板， 设计上游引物
5’-CGCGGATCCATGAACTTGGAGGGGCTTGAAATGATAGCAGAACTGATCGAAGAGGTGCT-3’和下游 引物5’-CCGCTCGAGTCAGATCACATTTTCAAAGAG-3’，经过一轮PCR扩增，将PCR扩增产 物回收、酶切，再与用同样酶切的载体pET28a连接后转化大肠杆菌感受态细胞， 将筛选得到的单克隆小提质粒后进行测序，测序结果表明，所构建的重组表达质粒 上KChIP4氨基酸序列中，除第11位变为谷氨酸、第14位变为谷氨酸和第15位变 为谷氨酸外，其余氨基酸序列与序列1相同，将得到重组表达载体命名为 pET28a-KChIP4-V11E-V14E-I15E。
(2)重组表达表达载体pET28a-KChIP4-F18E-L21E-F25E的获得
重组表达载体pET28a-KChIP4-F18E-L21E-F25E的特异性点突变、氨基酸置换 等均采用PCR方法，经过两轮PCR反应，得到最终的PCR产物。具体步骤为：第一 轮PCR反应分别扩增产物全长序列的前后两部分，以上述步骤1构建的重组表达载 体pET28a-KChIP4为模板，扩增产物全长序列前一部分的上游引物序列为 5’-CGCGGATCCATGAACTTGGAGGGGCTTGAA-3’，下游引物序列为 5’-CAGCCCCTCCTGTTCCAATTCTTTAACCTCAAGCACAAT-3’，经过PCR反应得到近3’末端 含有三个氨基酸突变的长度为84bp的片段；以上述步骤1构建的重组表达载体 pET28a-KChIP4为模板，扩增产物全长序列后一部分的上游引物序列为 5’-ATTGTGCTTGAGGTTAAAGAATTGGAACAGGAGGGGCTGA-3’，下游引物序列为 5’-CCGCTCGAGTCAGATCACATTTTCAAAGAG-3’，经过PCR反应得到近5’末端含有三个氨 基酸突变的长度为628bp的片段；第二轮PCR反应以第一轮PCR扩增得到的两段产 物为模板，以第一轮PCR反应扩增前一部分片段的上游引物为第二轮PCR反应的上 游引物，以第一轮PCR反应扩增后一部分片段的下游引物为第二轮PCR反应的下游 引物，由此扩增出全长产物，经回收、酶切、凝胶回收等步骤，再与经同样酶切的 载体pET28a连接后转化大肠杆菌感受态细胞，将筛选得到的单克隆小提质粒后进 行测序，测序结果表明，所构建的重组表达质粒上KChIP4氨基酸序列中，除第18 位变为谷氨酸、第21位变为谷氨酸和第25位变为谷氨酸外，其余的氨基酸序列与 序列1相同，将得到重组表达表达载体命名为pET28a-KChIP4-F18E-L21E-F25E。
(3)重组表达表达载体pET28a-KChIP4-F61E-I68E的获得
重组表达载体pET28a-KChIP4-F61E-I68E的特异性点突变、氨基酸置换等均采 用PCR方法，经过两轮PCR反应，得到最终的PCR产物。具体步骤为：第一轮PCR 反应分别扩增产物全长序列的前后两部分，以上述步骤1构建的重组表达载体 pET28a-KChIP4为模板，扩增产物全长序列前一部分的上游引物序列为 5’-CGCGGATCCATGAACTTGGAGGGGCTTGAA-3’，下游引物序列为 5’-AAGCTCCTGAAGCTCTTTCTTGGTCTCTTT-3’，经过PCR反应得到近3’末端含有两个氨 基酸突变的长度为208bp的片段；以上述步骤1构建的重组表达载体pET28a-KChIP4 为模板，扩增产物全长序列后一部分的上游引物序列为5’-AAAGAGACCAAGAAAGAGCTT CAGGAGCTT-3’，下游引物序列为5’-CCGCTCGAGTCAGATCACATTTTCAAAGAG-3’，经过 PCR反应得到近5’末端含有两个氨基酸突变的长度为493bp的片段；第二轮PCR反 应以第一轮PCR扩增得到两段产物为模板，以第一轮PCR反应扩增前一部分片段的 上游引物为第二轮PCR反应的上游引物，以第一轮PCR反应扩增后一部分片段的下 游引物为第二轮PCR反应的下游引物，由此扩增出全长产物，经回收、酶切、凝胶 回收等步骤，再与经同样酶切的载体pET28a连接后转化大肠杆菌感受态细胞，将 筛选得到的单克隆小提质粒后进行测序，测序结果表明，所构建的重组表达质粒上 KChIP4氨基酸序列中，除第61位变为谷氨酸、第68位变为谷氨酸，其余的氨基酸 序列与序列1相同，将得到重组表达表达载体命名为pET28a-KChIP4-F61E-I68E。
以上过程的引物合成和DNA测序均委托北京奥科生物技术有限责任公司完成。
二、蛋白的表达
将步骤一得到的重组表达载体pET28a-KChIP4-V11E-V14E-I15E、 pET28a-KChIP4-F18E-L21E-F25E、pET28a-KChIP4-F61E-I68E、pET28a-KChIP4分别 转化大肠杆菌BL21(DE3)，并在其中表达相应蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白 的表达情况。将蛋白样品上清液和Ni+resin(树脂)(Novagen公司)混合后，用清 洗缓冲液清洗。然后用咪唑洗脱液进行His-tag融合蛋白的洗脱，得到纯化的KChIP4 蛋白、KChIP4蛋白突变体KChIP4-V11E-V14E-I15E、KChIP4-F18E-L21E-F25E、 KChIP4-F61E-I68E。
实施例2、解析KChIP4的晶体结构，阐明Kv4通道和KChIP4蛋白相互作用的 结构基础
1、晶体的生长
将1μl实施例1的浓度为6mg/ml的KChIP4蛋白溶液与平衡缓冲液(25mM Tris，pH7.4，100mM NaCl，10mM DTT和1mM ZnCl2)等体积混合，采用悬滴扩散法筛选 初始结晶条件。初始结晶条件的筛选使用Hampton的晶体筛选试剂盒(Hampton Research公司)。最后的晶体在4℃的母液(2.0M NaH2PO4、2.0M K2HPO4、0.2M Li2SO4和0.1M 3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)，pH 10.5)中生长，得到KChIP4单晶体。
2、晶体的数据收集
将蛋白晶体转入含有30％(体积百分含量)甘油的上述母液中，并在液氮中瞬 间冷却。在-160℃条件下，KChIP4单晶体的数据收集使用Quantum 4CCD探测器 以及Beamline5.0.2的X射线光源(Comnel，NY)。所有的数据分别用DENZO指标化 和SCALEPACK合并。
3、晶体结构的解析
使用分子置换法解析晶体结构(CCP4中的AMORE程序)，采用KChIP1的结构 模型(PDB1s1g和1s1e)作为初始模型来解析KChIP4的晶体结构，结构的修正使用 CNS程序完成。
4、KChIP4蛋白的晶体结构揭示KChIP4功能转换的关键氨基酸位点
通过KChIP4单晶体与Kv4.3N-KChIP1复合晶体中结合态的KChIP1晶体的三维 结构特点的比较，分析KChIP4和KChIP1对Kv4通道失活功能调节的生物物理学差 异。
Kv4.3N-KChIP1复合体结构的两个显著特点在于：第一，每个KChIP1分子分别 与临近的两个Kv4N-末端结合并相互作用。KChIP1 N-端的一个α螺旋和C-端的三 个α螺旋形成的口袋将Kv4.3 N-端的最前端紧密包围的同时，同一个KChIP1的N- 端的α螺旋与临近的Kv4.3 N-端突出襻相互作用。第二，KChIP1的口袋在与Kv4.3 N- 端的最前端结合的同时，构象发生了解螺旋的变化。KChIP4的晶体结构如图1所示。 该晶体与Kv4.3N-KChIP1复合晶体中KChIP1晶体的结构差异体现在该晶体N端较 KChIP1多出两个α螺旋，形成一个交叉的形态位于“疏水口袋”的前端，成为影响 Kv4失活的关键部分。通过晶体结构找到可能改变KChIP4N端两个α螺旋位置的关 键位点。
实施例3、基于KChIP4的结构特点，将野生型KChIP4和基于结构产生的三个 突变体KChIP4-V11E-V14E-I15E、KChIP4-F18E-L21E-F25E和KChIP4-F61E-I68E利 用凝胶过滤柱层析方法检测KChIP4蛋白的聚集状态
通过读取凝胶过滤最高吸收峰值对应的毫升数，与蛋白标准品标定出的蛋白分 子量的标准曲线进行比较，确定野生型KChIP4及其三个突变体蛋白的聚集状态为 单聚体、二聚体以及四聚体。结果表明，三个突变体KChIP4-V11E-V14E-I15E、 KChIP4-F18E-L21E-F25E和KChIP4-F61E-I68E可以改变KChIP4蛋白的聚集形式， 由多聚体向单体转变，说明KChIP4-V11-V14-I15、KChIP4-F18-L21-F25和 KChIP4-F61-I68这些氨基酸位点是KChIP4发挥功能的重要部位。
实施例4、基于KChIP4与Kv4相互作用的结构特点，利用电生理学记录方法记 录野生型Kv4.3钾通道和KChIP4以及它们的突变体在爪蟾卵母细胞中的表达，鉴 别KChIP4转变成KChIP1的关键氨基酸位点
一、重组表达载体的构建
电生理功能检测使用的载体均为pBluescript KSM(以下用KSM表示)(Stratagene) 爪蟾卵母细胞表达载体。分别以上述构建在pET28a载体里的重组表达载体 pET-KChIP4、pET28a-KChIP4-V11E-V14E-I15E、pET28a-KChIP4-F18E-L21E-F25E 和pET28a-KChIP4-F61E-I68E为模板，利用上游引物5’- GAAAGTCGACATGAACTTGGAGGGGCTTGAAAT-3’和下游引物5’ -GCTTAGGAATTCCTAGATCACATTTTCAAAGAGCTGCATG-3’进行PCR扩增，将PCR扩增产 物分别用Sal I和EcoRI双酶切后，与用相同酶酶切的上述KSM载体连接，得到重 组表达载体KSM-KChIP4、KSM-KChIP4-V11E-V14E-I15E、 KSM-KChIP4-F18E-L21E-F25E和KSM-KChIP4-F61E-I68E。
以hKv4.3cDNA clone(Open Biosystems)为模板，以上游引物5’- GAAAGTCGACATGGCGGCCGGAGTTGC-3’及下游引物5’ -GCTTAGGAATTCTTACAAGACAGAGACCTTGACAACATTGCT-3’进行PCR扩增，将PCR扩增 产物分别用Sal I和EcoRI双酶切后，与用相同酶酶切的上述KSM载体连接，得到 重组表达载体KSM-Kv4.3。
以rKChIP1 cDNA clone(Open Biosystems)为模板，以上游引物5’- GAAAGTCGACATGGGTGCAGTTATGGGT-3’和下游引物5’- GCTTAGGAATTCCTACATGACATTTTGGAACAGC-3’进行PCR扩增，将PCR扩增产物分别用 Sal I和EcoR I双酶切后，与用相同酶酶切的上述KSM载体连接，得到重组表达载 体KSM-KChIP1。
二、体外转录生成cRNA
取5-10μg上述步骤一构建的重组表达载体KSM-KChIP4、 KSM-KChIP4-V11-V14-I15、KSM-KChIP4-F18E-L21E-F25E、KSM-KChIP4-F61E-I68E 和KSM-Kv4.3，分别加入10U NotI限制性内切酶，在双链DNA的下游单酶切使上述 DNA线性化。进行DNA纯化，具体过程如下：在100ul酶切反应体系中加入100ul蒸 馏水，再加入200μl按照下述体积比例混合的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)溶液， 充分混合，13000rpm离心1min，小心吸出上层水相，转移至另一EP管中，并在剩 余有机相溶液中加入200μl蒸馏水，13000rpm离心1min，取上层水相与前一步离心 得到的水相合并。加入400μl氯仿，充分混合，13000rpm离心1min，吸取水相至 另一EP管中，加入3M醋酸钠，至终浓度为0.3M(40μl)，并加入2倍体积的无 水乙醇(880μl)，-20℃放置2小时以上。4℃ 13000rpm离心30min，弃上清。 加入500μl 70％的乙醇，13000rpm离心2min，弃上清，自然条件下晾干10min，沉 淀用适量蒸馏水溶解。
分别取上述提纯后的DNA约1μg进行体外转录，得到Kv4.3、KChIP4以及KChIP4 蛋白突变体KChIP4-V11E-V14E-I15E、KChIP4-F18E-L21E-F25E和 KChIP4-F61E-I68E的cRNA。转录采用mMESSAGE mMACHINE T7体外转录试剂盒 (Ambion，USA)，用无RNA酶的去离子水将得到的Kv4.3、KChIP4以及KChIP4突变 体的cRNA稀释到100ng/μl。
三、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus Oocytes)的获得
雌性非洲爪蟾冰浴麻醉后通过外科手术取出成熟爪蟾卵细胞(stage V-VI)，经 过collagenase I酶消化去除卵细胞外层硬膜，再将卵母细胞置于含10万U/I青霉 素和链霉素的ND-91溶液中，17℃培养，每天换液1次。卵母细胞培养液ND-91(1L) 中各物质的浓度为(mM)：NaCl 91.0，HEPES 5.0，KCl 2.0，MgCl2 1.0，CaCl2 0.3， 丙酮酸钠550mg，茶碱90mg，pH7.6。
注射cRNA采用纳升注射器Drummond Nanojector I(Drummond Scientific，USA) 和其专用的玻璃电极。该玻璃电极采用电极拉制器P-97(Sutter Instrument，USA)拉制 而成。注射时，先在电极中充入矿物油密封隔离，向上述非洲爪蟾卵母细胞中分别 注射：46nl WT Kv4.3、WT Kv4.3和WT KChIP4、WT Kv4.3和WT KChIP4的各突变 体cRNA(WT是指野生型表达的上述蛋白的cRNA)，每种处理注射20个爪蟾卵母细 胞。为了保证cRNA在卵母细胞中适量表达以及WT Kv4.3的cRNA与WT KChIP4的 cRNA摩尔比为1∶1，各组中WT Kv4.3的cRNA浓度为20ng/μl，WT KChIP4及其各突 变体的cRNA浓度为50-100ng/μl，对照组注射等体积的无菌去离子水。注射后的爪 蟾卵母细胞在17℃温箱孵育1-2天后，记录通道的功能表达。
四、记录爪蟾卵母细胞的全细胞电流
将注射了WT Kv4.3、WT Kv4.3和WT KChIP4、WT Kv4.3和WT KChIP4各突变 体cRNAs且表达1-2天后的爪蟾卵母细胞置于容积为0.2ml的浴槽内，以ND-96溶 液连续灌流(2.0ml/min)。采用双电极电压钳(TEVC，two-electrode voltage clamp)方 法以爪蟾卵全细胞方式记录表达的Kv4钾电流的幅度、失活动力学和失活恢复的速 率，记录的钳制电压为-80mV，刺激方波为10mV，刺激时间为1s。放大器为 GeneClamp500(Axon，USA)，数据采集软件为Pulse(HEKA，德国)。用于记录的玻璃 电极采用电极拉制器P-97(Sutter Instrument，USA)拉制的硼硅玻璃微电极，灌注3M KCl后的电阻在0.5-1.0MΩ。电压钳指令电位由0-725C卵母细胞电压钳放大器产 生并连接计算机进行数据采集。pH7.6的ND-96记录溶液中各物质的浓度为(mM)： NaCl 96.0，HEPES 5.0，KCl 2.0，MgCl21.0和CaCl2 1.0。
五、数据分析并确定KChIP4的N端在与Kv4.3相互作用时的关键氨基酸位点 的功能
通道失活、失活后恢复等电流曲线采用双指数函数I(t)＝A0+A1e-(t- t0)/τ1+A2e-(t-t0)/τ2拟合进行通道的动力学分析。式中A0、A1、A2分别表 示去激活电流成分、快速失活电流成分和慢速失活电流成分的幅度，t代表时间， t0为拟合的起始时间，τ1和τ2代表时间常数，各电流成分所占的比率用A0、A1、 A2对最大电流的归一化表示。通过拟合函数外推计算的方法得到峰值电流。
实验结果为5组爪蟾卵母细胞上记录的电流对各自最大瞬间电流的归一化平均 值。实验结果采用平均值±标准差表示。数据分析和作图采用Igor Pro和Origin6.0。
结果如图2-4所示，其中，图2为突变KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、 第14位的缬氨酸和第15位的异亮氨酸(Val11、Val14、Ile15)，对Kv4.3-KChIP4 复合体在卵母细胞的共表达电流幅度和失活动力学的影响。其中图2-a、2-b分别 为Kv4.3与突变KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15 位的异亮氨酸所得到的氨基酸共表达的I-V曲线以及失活后的恢复曲线；图2-c为 Kv4.3、Kv4.3和KChIP1、Kv4.3和WT KChIP4以及Kv4.3和突变KChIP4的自氨基 末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15位的异亮氨酸所得到的氨基酸标 准化后电流失活速度的比较。从图2中可以看出，注射Kv4.3和突变KChIP4的自 氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15位的异亮氨酸的cRNA组的失 活速度较注射Kv4.3和WT KChIP4的cRNA组的速度明显加快，且与注射Kv4.3和 KChIP1的cRNA组的速度相似。表明KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14 位的缬氨酸和第15位的异亮氨酸为KChIP4与Kv4.3作用时的关键氨基酸位点。由 于不同的辅助亚基(KChIP1与KChIP4)与α亚基(Kv4.3)相互作用时表现出不同 的失活表型(Phenotype)，而离子通道的失活特征直接与细胞的兴奋性相关，Kv4 与KChIPs在神经系统中广泛存在且存在共定位，因而通过改变Kv4.3钾通道的失 活表型可达到改变神经元动作电位的形状、发放时间和发放频率，近而改变神经元 的兴奋性。KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨酸、第14位的缬氨酸和第15位的 异亮氨酸位于KChIP4的N-端第一个α螺旋上，KChIP4的自氨基末端第11位的缬 氨酸、第14位的缬氨酸和第15位的异亮氨酸的突变体在与Kv4.3相互作用时可实 现由KChIP4向KChIP1转变，是KChIP4与Kv4.3相互作用的关键氨基酸位点。
图3为突变KChIP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第 25位的苯丙氨酸(Phe18、Leu21、Phe25)，对Kv4.3-KChIP4复合体在卵母细胞的 共表达电流幅度和失活动力学的影响。其中图3-a、3-b分别为Kv4.3与突变KChIP4 的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸所得到 的氨基酸共表达时的I-V曲线以及失活后的恢复曲线；图3-c为Kv4.3、Kv4.3和 KChIP1、Kv4.3和WT KChIP4以及Kv4.3和突变KChIP4的自氨基末端第18位的苯 丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸所得到的氨基酸标准化后电流失活 速度的比较。从图3中可以看出，注射Kv4.3和突变KChIP4的自氨基末端第18位 的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸的cRNA组的失活速度较注射 Kv4.3和WT KChIP4的cRNA组的速度明显加快，且与注射Kv4.3和KChIP1的cRNA 组相似的速度相似。表明KChIP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮 氨酸和第25位的苯丙氨酸为KChIP4与Kv4.3作用时的关键氨基酸位点。由于不同 的辅助亚基(KChIP1与KChIP4)与α亚基(Kv4.3)相互作用时表现出不同的失活 表型(Phenotype)，而离子通道的失活特征直接与细胞的兴奋性相关，Kv4与KChIPs 在神经系统中广泛存在且存在共定位，因而通过改变Kv4.3钾通道的失活表型可达 到改变神经元动作电位的形状、发放时间和发放频率，近而改变神经元的兴奋性。 KChIP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸 位于KChIP4的N-端第一个α螺旋上，位置较KChIP4的自氨基末端第11位的缬氨 酸、第14位的缬氨酸和第15位的异亮氨酸稍靠后，KChIP4的自氨基末端第18位 的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸的突变体在与Kv4.3相互作用 时可实现由KChIP4向KChIP1转变，是KChIP4与Kv4.3相互作用的关键氨基酸位 点。
图4为突变KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸 (Phe61和Ile68)，KChIP4对Kv4.3的调节功能丧失。其中图4-a、4-b分别为 Kv4.3与突变KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸共表达 时的I-V曲线以及失活后的恢复曲线；4-c为Kv4.3、Kv4.3和KChIP1、Kv4.3和 WT KChIP4以及Kv4.3和突变KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的 异亮氨酸所得到的氨基酸标准化后电流失活速度的比较。从图4中可以看出，注射 Kv4.3和突变KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸的cRNA 组的失活速度较Kv4.3和WT KChIP4的cRNA组的速度明显加快，且与注射Kv4.3 和KChIP1的cRNA组速度相似。表明KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第 68位的异亮氨酸为KChIP4与Kv4.3作用时的关键氨基酸位点。由于不同的辅助亚 基(KChIP1与KChIP4)与α亚基(Kv4.3)相互作用时表现出不同的失活表型 (Phenotype)，而离子通道的失活特征直接与细胞的兴奋性相关，Kv4与KChIPs 在神经系统中广泛存在且存在共定位，因而通过改变Kv4.3钾通道的失活表型可达 到改变神经元动作电位的形状、发放时间和发放频率，近而改变神经元的兴奋性。 KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸位于KChIP4的N-端 第二个α螺旋上，KChIP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的异亮氨酸突 变体在与Kv4.3相互作用时可调节通道特性，使由KChIP4诱导的Kv4.3通道失活 变快，是KChIP4与Kv4.3相互作用的关键氨基酸位点。
KChIP4改变Kv4.3电流的失活速率并加速Kv4.3失活后的恢复，与报道的结果 相一致。上述结果表明，将主要氨基酸突变，KChIP4对Kv4的调节功能消失，进一 步证明了这几个氨基酸位点的重要性。
实施例5、细胞免疫荧光实验
通道电流的大小不仅与通道的各种特性相关，还与通道在膜表面表达量的多少 有关。KChIP1能够很明显地增加Kv4通道的电流，与它能明显增加细胞膜表面蛋白 表达量的多少有关，细胞免疫荧光实验旨在确认KChIP4以及其突变体在改变通道 在膜表面表达量的作用，从而实现其向KChIP1的转变。
1、COS-7细胞培养
将COS-7细胞(ATCC)培养于含有10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基中，37℃条件下于5％的CO2孵箱中培 养。在转染前一天传代至盖玻片上。
2、细胞免疫荧光实验
(1)重组表达载体的构建
将上述实施例3构建的各重组表达载体KSM-KChIP4、 KSM-KChIP4-V11E-V14E-I15E、KSM-KChIP4-F18E-L21E-F25E和 KSM-KChIP4-F61E-I68E用Xho I和BamH I双酶切，将酶切产物插入用相同酶切的载 体pcDNA3.1(Invitrogen公司)中，得到重组表达载体pcDNA3.1-KChIP4、 pcDNA3.1-KChIP4-V11E-V14E-I15E、pcDNA3.1-KChIP4-F18E-L21E-F25E和 pcDNA3.1-KChIP4-F61E-I68E；以KSM-KChIP4为模板，分别以上游引物 5’-GCCGGCAAGCTTATGAGCGTGGAAGATGAGCTGGAGAT-3’和下游引物5’ -GCTTAGGAATTCCTAGATCACATTTTCAAAGAGCTGCATG-3’进行PCR扩增，PCR扩增产物用 HindIII和EcoR I双酶切，将酶切产物插入用相同酶切的载体pcDNA3.1(Invitrogen 公司)中，得到删除了2-34个氨基酸的重组表达载体pcDNA3.1-KChIP4del(2-34)。
以实例3构建的重组表达载体KSM-KChIP1为模板，利用上游引物 5’-GCCGGCAAGCTTATGGGTGCAGTTATGGGT-3’和下游引物5’ -GCTTAGGAATTCCTACATGACATTTTGGAACAGC-3’进行PCR扩增，将该PCR产物酶切后 插入用相同酶切的载体pcDNA3.1中，得到重组表达载体pcDNA3.1-KChIP1。
以实例3构建的重组表达载体KSM-Kv4.3为模板，用上游引物 5’-ATTTAGAAGCTTGCCACCATGGCGGCCGGAGTTGC-3’和下游引物 5’-GTCAGGCTGCAGCAAGACAGAGACCTTGACAACATTGCT-3’进行PCR扩增，PCR扩增产物 用HindIII和Pst I酶切，然后将酶切产物插入用相同酶切的载体pEGFP-N1(clontech 公司)中，得到重组表达载体pEGFP-Kv4.3。
(2)细胞免疫荧光实验
将重组表达载体pEGFP-Kv4.3分别和以下蛋白共转染COS-7细胞： pcDNA3.1-KChIP1和pcDNA3.1-KChIP4，转染24小时后，PBS洗三遍，4％多聚甲醛 固定20分钟。PBS再洗三遍后，用含0.2％(体积百分含量)Triton-X100的PBS处 理20分钟。含3％(质量百分含量)BSA(Roche)及0.1％(体积百分含量)Triton-X100 的PBS封闭1小时后，加入山羊多克隆一抗KChIP1或KChIP4(Santa Cruz Biotechnology)，4℃过夜，用PBS洗三遍，加入二抗即TRITC标记的驴抗羊IgG(Santa Cruz Biotechnology)，室温处理1小时，PBS洗三遍后，用抗荧光淬灭封片剂(普 利莱)封片。
3、细胞荧光图像的获取
图像的获取采用a Zeiss LSM 510 META激光共聚焦扫描系统，后期图像处理采 用LSM图像浏览器。
细胞免疫荧光结果如图5所示。KChIP4不像KChIP1一样能明显增加Kv4通道 在膜表面的表达量，而是使大多数Kv4通道滞留在胞浆内，但是删除了KChIP4前 34个氨基酸(对应晶体结构上的前两个α螺旋)后，能使KChIP4转变成KChIP1， 进而增加通道在膜表面的表达量。但其他关键氨基酸位点的突变对于增加细胞膜表 面通道蛋白表达的作用不如直接删除前34个氨基酸的作用明显。结果表明删除 KChIP4前34个氨基酸能使KChIP4转变成KChIP1，其它关键氨基酸位点的突变能 使其电生理特性向KChIP1转变，而对于增加膜表面通道蛋白的表达量的作用并不 明显。
序列表