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1、(10)授权公告号 CN 102220324 B (45)授权公告日 2012.06.27 CN 102220324 B *CN102220324B* (21)申请号 201110107036.6 (22)申请日 2011.04.27 C12N 15/113(2010.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (73)专利权人 山西医科大学 地址 030001 山西省太原市新建南路 56 号 (72)发明人 张勤丽 牛侨 教霞 李娜 吉俊伟 (74)专利代理机构 太原华弈知识产权代理事务 所 14108 代理人 李毅 CN 101792765 A,。
2、2010.08.04, 全文 . WO 2007033475 A,2007.03.29, 全文 . CN 101220360 A,2008.07.16, 全文 . Contreras et al.Caspase-8 and caspase-3 small interfering RNA decreasesischemia/ reperfusion injury to the liver in mice. surgery .2004, 第 136 卷 ( 第 2 期 ), 全文 . (54) 发明名称 一种抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA (57) 摘要 一种抑制 caspase。
3、-3 基因表达的 siRNA, 其序 列为 : 正义链 : 5 GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA 3 反义链 : 5 TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC 3 。 本发明所提供的 siRNA 进入到神经细胞时, 可以 显著提高神经细胞的细胞活力、 明显减少神经细 胞凋亡相关基因 caspase-3 基因的表达、 降低神 经细胞的凋亡坏死率, 同时也可以显著降低阿尔 茨海默标志蛋白APP和Tau蛋白的表达。 该siRNA 可以高效、 特异的抑制疾病相关基因 caspase-3 的表达, 使有关疾病基因发生沉默, 能对靶基因的 表达进行有效敲除, 达到治疗目的, 可用于制备抑 制神。
4、经细胞凋亡或治疗神经退行性疾病的药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张彬 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA, 其序列为 : 正义链 : 5 GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA 3 反义链 : 5 TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC 3 。 2. 权利要求 1 的 siRNA 在制备抑制神经细胞凋亡药物中的应用。 权 利 要 求 书。
5、 CN 102220324 B 2 1/7 页 3 一种抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA 技术领域 0001 本发明涉及一种 siRNA, 特别是一种抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA。 背景技术 0002 RNA 干扰 (RNA interference, RNAi) 现象是一种在进化上保守的抵御转基因或 外来病毒侵犯的防御机制, 是一种序列特异性的转录后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)。它已在许多不同种属的生物体中被发现, 并在生物体细胞之间进 行传递, 具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用。R。
6、NAi 技术不仅能大大推进人类后基 因组计划的发展, 还能高通量地筛选药物靶基因, 促进基因治疗、 新药开发等, 为治疗癌症、 遗传病等疾病开辟新的途径。RNAi 的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义, 将对医 学生物学的发展产生深远的影响。 0003 虽然 RNA 干扰技术的研究历程较短, 但其发展速度却超乎人们的想象。在过去的 几年时间里, RNAi 作为一种新基因疗法, 被广泛的应用于病毒感染、 癌症、 显性遗传病等医 学研究中, 开辟了 “基因治疗(gene-specific therapeutics)” 的新理念, 小干扰RNA(small interfering RNA, si。
7、RNA) 甚至被称为 “治病药物” 。目前, 人们已经开始利用 RNAi 技术从 基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能, 可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因, 使我们可以更好地研究生物体内基因调控的网络系统。现在 RNAi 技术已经能够成功治愈 哺乳动物细胞、 器官及活体的病变, 预示着不久的将来, RNAi 会成功用于人类疾病的治疗, 使得 siRNA 的 “治病药物” 称号名副其实。 0004 公知人体内的细胞注定是要死亡的, 有些死亡是生理性的, 有些死亡则是病理性 的, 有关细胞死亡过程的研究, 近年来已成为生物学、 医学研究的一个热点。 到目前为此, 人 们已经知道细胞的死亡起码。
8、有两种方式, 即细胞坏死与细胞凋亡。 目前的研究认为, 细胞坏 死是细胞接受刺激后的一种被动的细胞死亡方式, 而细胞凋亡则是一种主动的程序性的细 胞死亡方式, 它是细胞的一种基本生物学现象。细胞凋亡是多基因严格控制的过程, 这些 基因在种属之间非常保守, 如 Bcl-2 基因家族、 caspase 基因家族、 癌基因等。随着分子生 物学技术的发展, 对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识, 但是迄今为止凋亡过程确切机 制尚不完全清楚, 而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系, 如神经 退行性疾病、 肿瘤、 自身免疫性疾病等。如果能应用 RNA 干扰技术特异性地阻抑凋亡相关基 因的表。
9、达及其蛋白质水平, 将可以有效沉默凋亡相关基因, 帮助细胞减少凋亡, 增进细胞活 力。因此, 对凋亡相关基因的 RNA 干扰研究与应用具有极其重要的理论和实际意义, 能有效 地筛选药物靶基因, 促进基因治疗、 新药开发等, 为治疗神经退行性疾病等与细胞凋亡相关 的疾病开辟新的途径。 0005 使用 RNAi 治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发 生相关的基因序列, 设计和制备与这些基因序列具有同源性的小干扰 RNA(siRNA) , 然后通 过某种方式将 siRNA 转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默, 从而达到治疗的目的。其 优势在于只抑制疾病相关蛋白的表达, 而不。
10、损伤正常细胞功能, 其序列特异性及基因抑制 说 明 书 CN 102220324 B 3 2/7 页 4 作用的强大性是其他药物难以匹敌的。siRNA 可用于治疗任何由于基因发生突变或过度表 达所引起的疾病, 只要确定了与疾病相关的靶点, 即靶基因, 就可以通过 siRNA 特异性地使 靶基因保持沉默。所以, 寻找最适宜的 siRNA, 对于 RNA 干扰的广泛应用至关重要。 0006 caspase 基因家族是一类基因结构相似并参与细胞凋亡的基因。根据它们对细 胞凋亡结果的不同分为两类, 一类是抑制细胞凋亡的基因, 另一类是促进细胞凋亡基因。 caspase-3 基因是其中促进细胞凋亡的基因。
11、, 其过度表达能够加速与该凋亡基因相关的疾 病的细胞凋亡, 因此对 caspase-3 RNAi 的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义。但 是作用于 caspase-3 基因, 即靶基因不同位点的 siRNA 的作用效果差异很大, 可能与 siRNA 的碱基分布、 两端自由能大小等有关。 因此, 在siRNA沉默特定基因的实验中, 有效的siRNA 序列是该技术的关键点。然而到目前为止, 还没有最适宜的抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA。 发明内容 0007 本发明的目的是为了解决现有技术中还没有最适宜的抑制 caspase-3 基因表达 的 siRNA 的问题, 提供一种抑。
12、制 caspase-3 基因表达的 siRNA。 0008 为达到上述目的, 本发明是采用如下技术方案实现的 : 一种抑制 caspase-3 基因 表达的 siRNA 序列, 该序列为 : 0009 正义链 : 5 GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA 3 0010 反义链 : 5 TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC 3 。 0011 本发明所提供的抑制caspase-3基因表达的siRNA由 21个核苷酸组成, 序列的方 向从左至右为 5 端至 3 端, 自 5 端的第 1 至第 19 位核苷酸为核糖核苷酸, 第 20 至第 21 位核苷酸为脱氧核糖核苷酸。 0012 本发明。
13、针对 caspase-3 基因序列设计合成出一个 siRNA 序列, 经 QRT-PCR 及免疫 组织化学法检测, 可以有效抑制原代培养神经细胞的 caspase-3 基因表达, 从而显著降低 神经细胞的凋亡和坏死, 并在原代培养神经细胞上验证了设计合成出的 caspase-3 siRNA 对神经细胞凋亡的抑制作用。本发明所提供的 caspase-3 siRNA 不但可以用于体外培养细 胞的 RNAi, 也可以用于阿尔茨海默病动物模型的体内实验。 0013 本发明所提供的 siRNA 可用于制备与 caspase-3 基因相关疾病的治疗药物, 如 细胞凋亡相关疾病或退行性疾病的药物。该 siR。
14、NA 或由此得到的药物通过某种方式进入 到动物体或人体内时, 可以比以往任何手段更高效、 特异、 方便的抑制疾病相关蛋白的表 达, 使有关疾病基因发生沉默, 从而达到治疗的目的。其优势在于不损伤正常细胞功能, 其 序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。本发明筛选出能高效抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA, 能对靶基因的表达进行有效敲除。 附图说明 0014 图 1 为 caspase-3 RNAi 正常对照组神经细胞的光镜照片 (200) 。 0015 图 2 为 caspase-3 RNAi 染铝组神经细胞的光镜照片 (200) 。 0016 图 3 为 cas。
15、pase-3 RNAi 病毒载体组神经细胞的光镜照片 (200) 。 0017 图4为caspase-3 RNAi组转染原代培养神经细胞DAPI染色的荧光照片 (200) 。 说 明 书 CN 102220324 B 4 3/7 页 5 0018 图 5 为 caspase-3 RNAi 组转染原代培养神经细胞 GFP 标记的荧光照片 (200) 。 0019 图 6 为 caspase-3 RNAi 组转染原代培养神经细胞并经 GFP 荧光标记后转染成功 的细胞的荧光照片 (200) 。 0020 图 7 为 caspase-3 RNAi 正常对照组神经细胞的荧光照片 (200) 。 002。
16、1 图 8 为 caspase-3 RNAi 染铝组神经细胞的荧光照片 (200) 。 0022 图 9 为 caspase-3 RNAi 病毒载体组神经细胞的荧光照片 (200) 。 具体实施方式 0023 实施例 1 : 抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA 的合成。 0024 制定抑制 caspase-3 基因表达的一条 siRNA 序列, 同时选用一条随机序列作为阴 性对照。caspase-3 siRNA 序列中的 A、 G、 C、 U 表示腺嘌呤核糖核苷酸、 鸟嘌呤核糖核苷酸、 胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸, T 表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。 0025 合成的 si。
17、RNA 序列如下 : 0026 正义链 : 5 GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA 3 0027 反义链 : 5 TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC 3 。 0028 实施例 2 : 神经细胞原代培养。 0029 选用新生13d的SD小乳鼠, 将其置于75%冰酒精中浸泡2min, 无菌条件下取脑, 除去脑膜及白质, 收集大脑皮质并制成匀浆, 将其置于加入 5mL 37预热的 0.25%(w/v) 胰 蛋白酶的离心管中, 轻轻吹打, 使成为单细胞悬液。静置, 将上层细胞悬液移入含 2mL 全细 胞培养液的离心管中终止消化, 220nm 滤网过滤, 1000r/min 离心 10m。
18、in, 弃上清, 加入无血 清细胞培养液, 吹打均匀, 1000r/min 离心 5min, 弃上清, 加入全细胞培养液, 吹打均匀, 用 细胞计数板调整细胞浓度为 1105个 /mL, 接种于事先铺有多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿 上, 于 37、 5%CO2培养, 培养后 24h, 加入 0.5mg/mL 阿糖胞苷 (终浓度 10M) 培养液以抑制 胶质细胞增殖, 每 3 天换液 1 次。 0030 实施例 3 : 神经细胞感染。 0031 将浓度 1105个 /mL 的神经细胞悬液接种于 96 孔板中, 每孔加培养基 100L。 在细胞培养第 4 天左右, 选取生长良好的同批次神经细胞, 分。
19、为正常活细胞组、 1mM 染铝组、 1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组, 观察细胞的生长状况和形态学改变。具体情况如下 : 正 常活细胞组只加入培养液 90L ; 1mM 染铝组加入含有铝的培养液 90L 至染铝终浓度为 1mM ; 1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组加入含有铝的培养液90L至染铝终浓度为1mM, 同 时加入病毒载体及caspase-3 siRNA干扰试剂。 把细胞培养板放回培养箱孵育, 812h以 后观察各组细胞的生长状态, 24h 后更换新鲜培养基培养, 感染 3 天后分别在光镜下和荧光 显微镜下观察神经细胞的生存状态及荧光转染效率。 0032。
20、 光学显微镜观察神经细胞可见, 正常活细胞组神经细胞细胞核大而清晰, 核仁明 显, 轴突长且比较均一, 有较多从胞体开始向末梢逐渐变细的树突, 且长短不一有分支, 细 胞与突触间、 胞体与胞体间连接丰富 (图 1) 。1mM 染铝组 (图 2) 细胞数量明显减少, 细胞体 积缩小, 轴突变短, 且树突的数量减少, 细胞与突触间、 胞体与胞体间连接明显减少, 部分神 经元的大多数树突消失融解, 细胞轴突也严重受损, 胞体变圆、 收缩。1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组 (图 3) 细胞从形态和数量上接近于正常活细胞组。 说 明 书 CN 102220324 B 5 4/7 页 。
21、6 0033 图 4 6 显示了 caspase-3 siRNA 转染组 DAPI 荧光染色的神经细胞 (图 4) 、 GFP 荧光标记的神经细胞 (图 5) , GFP 荧光标记转染成功的神经细胞 (图 6) 。计数 GFP 荧光标 记的转染细胞数量与 DAPI 荧光染色的所有转染细胞, 并计算转染效率, 转染效率计算公式 为 : 转染效率 =GFP 荧光标记的细胞数量 / 相同视野下 DAPI 染色的细胞数量 100%。结果 表明, 转染细胞数多于细胞总数的 90%。说明 caspase-3 siRNA 序列的转染效率大于 90%。 0034 实施例 4 : 神经细胞的细胞活力检测。 00。
22、35 将浓度为 1105个 /mL 的神经细胞悬液接种于 96 孔板中, 4 天后按照前述分组情 况处理, 在各组细胞中每孔加入5L CCK-8试剂, 放入37, 5CO2培养箱中培养1.5h后, 在 450nm 条件下用酶标仪测定其吸光度值 A。细胞活力检测结果显示 : 同正常活细胞 组比较, 仅有 1mM 染铝组细胞活力有显著性差异 (P 0.01) , 细胞活力明显下降 ; 同 1mM 染 铝组相比较, 1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组有显著性差异 (P 0.01) , 细胞活力远远高 于 1mM 染铝组, 且与正常活细胞组相近, 见表 1。 0036 0037 实施。
23、例 5 : siRNA 的抑制效率检测。 0038 1) 总 RNA 的提取 0039 用 Trizol 法抽提细胞中的 mRNA, 具体步骤为 : 直接在培养板中加入 Trizol 试剂 裂解细胞 (每 10cm2面积加入 1mL Trizol 试剂) , 用取样器吹打几次, 将液体转移至 1.5mL EP 管中放置 5 分钟, 使得核酸蛋白复合物完全分离, 以上所有操作均在冰上完成。于 4, 12000rpm 离心 15min, 取上清, 加入 0.12mL 氯仿, 充分振摇 15s 至乳白色。室温静置 3min, 4, 12000rpm 离心 15min。取上清, 在得到的水相溶液中加入。
24、等体积异丙醇, 混匀, 室温静 置 20 30min。4, 12000rpm 离心 10min。去上清, 加入 1mL75% 乙醇 (DEPC 处理过的水配 制) 洗涤沉淀, 4, 7500rpm 离心 5min, 倒出液体, 再加入 1mL 无水乙醇洗涤, 倒出液体, 注意 不要倒出沉淀, 剩余的少量液体用枪尖吸出, 注意不要吸弃沉淀。室温放置晾干, 根据实验 需要加入 RNAase-free 无菌水 20L, 反复吹打、 混匀, 溶解 RNA。以 1:1000 稀释, 于 260nm 及280nm处测定其吸光度值, 计算mRNA的纯度及含量。 计算公式为 : mRNA纯度=A260/(A2。
25、80 本底 ), mRNA 含量 (g/mL)=A26040100。如 mRNA 纯度在 1.8 2.0 之间, 则进一步进行 反转录。 0040 2) 反转录 0041 按反转录试剂盒说明书操作, 具体如下 : 总 RNA 5L 加入 OligodT 2L, ddH2O 水 5L, dNTP 2L 离心混匀, 70 5min, 迅速冰上冷却 2min, 加入 5 缓冲液 4L, RNasin 0.5L, DTT 1L, M-MLV 1L 组成 20L 反应体系, 离心混匀, 反转录参数 : 25 10min, 说 明 书 CN 102220324 B 6 5/7 页 7 42 50min, 。
26、95 5min。 0042 3) 引物序列以及实时荧光定量 PCR 反应条件 0043 caspase-3 检测条件 : 94 5min, 94 50s, 61 50s, 72 1min, 40 个循环, 然后 94 1min, 55 30s, 95 30s 收集荧光信号。反应结束后确认 real-time quantitative PCR 的扩增曲线, 基因的表达强度 CT 值、 内参基因 (GADPH) 标化后, 按 2- CT方法计算。引 物序列见表 2, 实时荧光定量 PCR 反应体系见表 3。 0044 0045 实时荧光定量 PCR 检测 siRNA 转染抑制 caspase-3 。
27、基因表达抑制率的具体结果见 表 4。结果显示 : 同正常活细胞组相比较, 1mM 染铝组细胞 caspase-3 基因表达有显著升高 (P 0.01) ; 同 1mM 染铝组比较, 各 siRNA 组均有显著性下降 (P 0.01) 。caspase-3 基因 表达量测定结果表明, siRNA的抑制率为66.47%。 根据siRNA对caspase-3基因的抑制率可 知, 参考转染后的神经细胞活力检测结果, 该 siRNA 为 caspase-3 基因干扰的有效 siRNA 序列。 0046 0047 实施例 6 : 用 siRNA 感染神经细胞后细胞的凋亡现象观察。 0048 将浓度为 11。
28、05个 /mL 的神经细胞悬液接种于 96 孔板中, 4 天后分为三组 : 正常 活细胞组、 1mM 染铝组、 1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组。D-Hanks 液清洗贴壁神经细胞 2 次, 加入荧光显色剂吖啶橙 (AO)- 溴化乙锭 (EB), 放置 30s, 515 565nm 处用蓝光激发在 说 明 书 CN 102220324 B 7 6/7 页 8 荧光显微镜下观察细胞的凋亡形态学。在荧光显微镜下, 正常活细胞组神经细胞呈绿色的 均匀荧光 (图 7) , 1mM 染铝组 (图 8) 神经细胞的细胞核较小、 固缩呈较浓的黄绿色, 或呈半月 形, 甚至为黄绿色碎块, 。
29、有些神经细胞的胞核染成鲜红色或桔红色 (凋亡细胞) , 并且胞浆也 呈染成淡红色, 部分细胞结构不清或溶解。1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组 (图 9) 绝大部 分细胞表现为均匀绿染的活细胞, 有个别细胞呈黄绿色或红色。各组计数 200 个细胞, 计算 凋亡率。正常活细胞组细胞凋亡率很低, 1mM 染铝组细胞凋亡率明显高于正常活细胞组 (P 0.01) ; 同正常活细胞组相比较, 1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组细胞凋亡率没有统计 学意义 (P0.05) 。正常活细胞组和 1mM 染铝 +caspase-3 RNAi 病毒组细胞凋亡率显著低于 1mM 染。
30、铝组 (P 0.01) , 具体数据见表 5。 0049 0050 实施例 7 : 用 siRNA 感染神经细胞后 APP、 Tau 蛋白表达 (蛋白印迹 Western blot 法) 。 0051 1) 配制 12% 的分离胶和 5% 的积层胶, 根据浓度确定上样体积。每孔上样 25g, 以 80V 电压恒压跑胶, 当蛋白跑过积层胶时加压为 120V, 恒压直至蛋白跑至胶的底部 ; 2) 将跑好的胶取下, 400mA 电流作用 38min 转移蛋白至 0.45m PVDF 膜上 ; 3) 用丽春红染色 观察移至 PVDF 膜上的蛋白条带。0.02mol/L PBST 洗膜, 5min2 次。
31、 ; 4) 用封闭液 37封 闭 120 分钟 ; 5) 加入抗体稀释液稀释的一抗 (浓度均为 1:10000) , 4过夜, 0.02mol/L PBST 洗膜, 15min4 次 ; 6) 加入抗体稀释液稀释的生物素化二抗 (浓度均为 1:1000) , 37 2h, 0.02mol/L PBST 洗膜, 15min4 次 ; 7) 加入 0.02mol/L PBST 稀释的辣根酶标记链亲和素 (1:1000) , 37 2h, 0.02mol/L PBST 洗膜, 15min4 次 ; 8) 用 ECL 进行化学发光, 在使用前 等量混合 A 液和 B 液, 混合后尽快使用 ; 9) 用。
32、镊子取出膜, 打在滤纸上沥干洗液但勿使膜完 全干燥, 将膜完全浸入并与发光工作液 (0.125mL发光工作液/cm2) 充分接触, 根据室温孵育 15min, 准备立即压片曝光 ; 10) 用镊子夹起膜, 搭在滤纸上沥干工作液, 但勿洗去发光液 ; 11) 在 X 光胶片盒内铺一张面积大于膜的保鲜膜, 将杂交膜贴在保鲜膜上, 将保鲜膜折起来 完全包裹杂交膜, 去除气泡和褶皱, 用胶带将其固定在暗盒内 ; 12) 在黑暗中放入 X 光胶片, 分别曝光不同的时间如数秒到数分钟, 然后显影冲洗 ; 13) 扫描仪扫描, 采用捷达 801 系列 凝胶电泳图像分析系统对 Western-blot 结果进。
33、行分析, 然后计算待测蛋白与 -actin 光 密度 (IOD) 的比值, 比较各组间 IOD 样本 /IOD -actin 的大小。具体结果见表 6。 0052 结果显示 : 同正常活细胞组相比较, 1mM 染铝组细胞 APP、 Tau 蛋白的表达有显著升 高 (P0.01) ; 同1mM染铝组相比较, 各siRNA组均有显著性下降 (P0.01) 。 APP、 Tau表达 量测定结果表明, siRNA 可以显著抑制阿尔茨海默相关标志蛋白 APP、 Tau 蛋白的表达, 参考 转染后的神经细胞活力检测结果, 该 siRNA 为抑制阿尔茨海默相关标志蛋白的有效 siRNA 说 明 书 CN 1。
34、02220324 B 8 7/7 页 9 序列。 0053 说 明 书 CN 102220324 B 9 1/1 页 10 SEQUENCE LISTING 山西医科大学 一种抑制 caspase-3 基因表达的 siRNA 2 Patentin version 3.2 1 21 DNA Artificial sequence 以 caspase-3 基因为靶标的 siRNA 序列的正义链 1 gagtctgact ggaaagccga a 21 2 21 DNA Artificial sequence 以 caspase-3 基因为靶标的 siRNA 序列的反义链 2 ttcggctttc cagtcagact c 21 序 列 表 CN 102220324 B 10 1/2 页 11 图 1图 2 图 3 图 4 图 5图 6 说 明 书 附 图 CN 102220324 B 11 2/2 页 12 图 7图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102220324 B 12 。