利用萌发种子胚芽鞘转化外源基因的方法 【技术领域】
本发明涉及一种基因转化的技术。 它是以萌发种子的胚芽鞘作为胚芽生长点生 长发育的生理形态指标，采用注射或切割方法使农杆菌侵染转化胚芽生长点细胞，实现 将外源基因导入受体细胞，获得转基因植株，为此本发明属于植物基因工程技术领域。背景技术
植物基因工程技术是利用现代基因分子生物学理论进行遗传育种的重要途径。 然而，基因转化率低，重复性差，效率不高，一直是影响其产业化推广应用的瓶颈，也 是世界各国研究的热点。 本发明为解决此难题提供一项新的技术。
迄今植物基因转化建立三大技术体系，二十多种转化方法 ( 植物基因工程 2004 年科学出版社北京 )。 自 Zambrysk 等 1983 年 (EMBO J2，2143-2150) 采用农杆菌转化 系统获得世界上第一株转基因植株以来，大量的研究表明，根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)Ti 质粒转化系统是机理最清楚，技术最成熟的基因转化技术。 其缺点是转 化率低，重复性差，要在无菌操作的植物组织培养基础上进行，难以实现规模化和产业 化。 如何使农杆菌转化技术扬长避短，融合各转化技术的优点，研究出一种新的转化技 术，促进其产业化进程，是世界各国关注的问题。
通过生物自身的种质细胞为媒体，进行基因转化的体系称之为种质转化系统。 在种质细胞中种子胚芽生长点细胞生命力最强，分裂最快，最能实现细胞全能性的转化 受体细胞。 Hess 早在 1969 年 (Z.Pflanzenphysiol，98 ：321-327) 用外源 DNA 浸泡矮牵 牛种子获得了转基因植株证实了这一结论，推动了该领域内的研究进展。
禾本科植物种子萌发时，胚芽鞘是最早萌动的封闭性结构，把胚芽生长点包裹 在胚芽鞘腔内起保护作用。 胚芽鞘生长迅速，首先突出地面，随着胚芽的生长发育突破 胚芽鞘长成幼苗。 胚芽鞘的长短标志着胚芽生长发育的生理形态阶段。 胚芽鞘的无菌腔 是胚芽生长发育的内环境。 因此，充分利用胚芽鞘的结构功能对基因转化的操作是十分 有利的。
本发明充分利用种子萌发时胚芽鞘的结构特点，以胚芽鞘的长度作为胚芽发育 的生理形态指标，以胚芽鞘腔作为转化的内环境，同时以胚芽鞘内的胚芽生长点作为转 化受体细胞，并与农杆菌转化机理有机的结合起来，建立一种新的基因转化方法，故而 称之为 “胚芽鞘基因转化法”。 发明内容
本发明的目的是提出一种新的基因转化方法。 该方法基本内容是应用农杆菌基 因转化机理，以胚芽生长点细胞为侵染转化的受体细胞，采用胚芽鞘萌发长度作为胚芽 生长发育阶段的生理形态指标及采用注射或切割方法损伤暴露生长点，使农杆菌侵染转 化胚芽生长点细胞，获得转基因植株，从而建立一种简便、高效的基因转化方法，简称 为 “胚芽鞘基因转化法”。本发明的基因转化技术内容有以下几个方面 ：
1. 在种子萌发时以胚芽鞘作为胚芽生长发育阶段的生理形态指标。 当胚芽生长 点发育到第 1-3 个新叶原基形成期时，胚芽鞘长度约 1-3cm，此时为基因转适宜期。 以 胚芽鞘腔或胚芽鞘池作为农杆菌转化共培养的内外环境。
2. 采用胚芽鞘微针注射方法，用微量注射器吸取已活化培养好的农杆菌菌液 0.1ml，将直径 0.1-0.25mm 的针头垂直从胚芽鞘顶部穿透胚芽鞘刺入胚芽生长点，使其造 成生长点 1 处或多处细胞损伤，同时将菌液注入生长点和胚芽鞘腔内，进行基因转化共 培养。
3. 也可以不采用注射法，而采用双面刀在胚芽鞘基部胚芽生长点上 1-3mm 处横 切断胚芽鞘，使其暴露并用微量注射器针头刺伤生长点的细胞，然后将微量注射器中的 农杆菌菌液滴在生长点上。 由于切割处略高于生长点及胚芽鞘迅速生长，包围菌液形成 胚芽鞘池，以利于农杆菌共培养转化。
4. 采用 2 或 3 操作通过农杆菌与胚芽生长点受体细胞共培养转化后，损伤种质细 胞迅速分裂和分化，使胚芽继续生长发育穿破胚芽鞘，生长成幼苗。 实验表明由于滴入 农杆菌量甚少，不需要脱菌处理，会自行死亡。 5. 由于在表达载体构建时已将目的基因与抗除草剂基因连锁，并作为筛选基 因，因此当幼苗长到 3-5 叶期，只要向幼苗叶片喷洒除草剂，能抗除草剂的植株为初选 转基因植株。 把初选转基因植株种植田间，收获的种子进行基因水平的检测，鉴定出转 基因植株。
本发明的主要创新技术特征如下 ：
①本发明巧妙地利用胚芽鞘作为胚芽生长发育阶段的生理形态指标，胚芽鞘腔 和胚芽鞘池作为农杆菌转化共培养的内环境，有利于提高基因转化率。
②发明采用胚芽鞘微针注射或横切胚芽鞘损伤生长点细胞，并把农杆菌菌液注 入损伤的生长点，在胚芽鞘腔和胚芽鞘池中进行转化共培养，提高转化机率，因此把此 方法称之为 “胚芽鞘基因转化法”。
③发明采用基因转化机理最清楚，转化能力最强的农杆菌为转化系统及以生命 力最强的萌发种子胚芽生长点的种质细胞为受体细胞，并使两者的最大基因转化潜力有 机结合，将具有极大的基因转化能力。
禾本科植物的种子在胚芽外具有胚芽鞘的特殊结构，种子萌发时其生长迅速对 胚芽起先导和保护作用。 因此，本发明不仅应用于玉米基因转化，也可应用于有胚芽鞘 特殊结构的其他禾本科植物基因转化，如小麦、水稻等。
本发明的有益效果
本发明采用种子为材料，分子育种与常规育种方法结合，使该方法具有取材方 便，不需无菌条件的植物组织培养，无需昂贵设备仪器，无需受季节时间限制，获得的 转基因植株遵循遗传规律，稳定性好，遗传变异少等优点，是一种简便，高效，可实施 规模化育种的转化技术。
具体实施方式
下面以玉米种子基因转化为例阐明具体实施方式 I 和 II，并对本发明进一步说明： 实施例 I
1、玉米种子萌发 ：
把玉米种子水洗后用 2 倍体积得清水在 25℃ -28℃水温下浸洗 5-10 小时，待种 子吸足水分后放在玻璃平皿中发芽培养，平皿底部放 3-5 层湿纱布，种子放在纱布上盖 上平皿常温下发芽，保持温度和湿度。
2、农杆菌活化培养 ：
将带有目的基因和抗除草剂筛选基因的农杆菌工程菌在 YEB 培养基中常规悬浮 培养，待 OD600 值为 0.5-1.0 时将菌液离心，倒掉 YEB 培养液用 N6 培养液重悬活化培 养，如加入 100-500mol/L 乙酰丁香酮 (3，5methoxy-4-hydroxyacetophenone， AS) 有促 进 vir 基因活化的作用，当达到对数生长期时将菌液在 4℃保存待用。
3、胚芽鞘注射转化 ：
当种子萌发至胚芽鞘长度 1-3cm 时，用针头直径 0.1-0.25 的微注射器吸取农杆菌 悬浮液 0.1ml，并从胚芽鞘顶端的圆心垂直沿胚芽鞘轴心穿过胚芽鞘腔刺入胚芽生长点， 刺伤生长点细胞，并把 0.1-0.2ml 的农杆菌液注入胚芽生长点和胚芽鞘腔内，拔出针头， 把种子放回培养皿中继续种子萌发培养。
4、转基因植株筛选获得 ：
经步骤 3 转化共培养后的生长点的细胞能迅速分裂和分化，胚芽继续生长发育 成幼苗。 由于在表达载体构建时已将目的基因与抗除草剂基因连锁并作为筛选基因。 因 此当幼苗长到 3-5 片叶时只要向幼苗叶片喷洒除草剂，如能抗除草剂的植株为初选转基 因的植株，反之植株死亡。 初筛选出的转基因植株移入田间种植，收获的种子进行分子 水平的目的基因检测鉴定，从而获得转基因植株。
实施例 II
实施例 II 的具体实施方式与实施例 I 基本相似 ：
1、实施例 II 的具体实施方式与实施例 I 的步骤 1 相同。
2、实施例 II 的具体实施方式与实施例 I 的步骤 2 相同。
3、在上述实施例 II 的具体实施方式步骤 1 和 2 的基础上，进行胚芽鞘切割转 化：
当种子萌发至胚芽鞘长度 1-3cm 时，用双面刀在胚芽鞘基部胚芽生长点上方 1-3mm 处横切断胚芽鞘，暴露生长点并用微量注射器针头刺伤生长点的细胞，然后将微 量注射器中 0.1-0.2ml 的农杆菌菌液滴在生长点上及胚芽鞘池中。 由于切割处略高于生长 点及胚芽鞘迅速生长，包围菌液形成胚芽鞘池，以利农杆菌共培养侵染转化。
4、具体实施方式与实施例 I 的步骤 4 相同。
实施例 III
实施例 III 以小麦种子基因转化为例阐明具体实施方式，并对本发明进一步说 明：
1、施例 III 以小麦种子替代玉米种子。 小麦种子萌发时的胚芽鞘长度一般为 2-8cm，因此胚芽鞘转化具体实施方式与实施例 I 的步骤 1 相同。
2、施例 III 的具体实施方式与实施例 I 的步骤 2 相同。
3、在上述实施例 III 的具体实施方式步骤 1 和 2 的基础上，进行胚芽鞘基因转化 时可采用 ：
实施例 I 的步骤 3 的胚芽鞘注射转化方法进行或采用实施例 II 的步骤 3 的胚芽鞘 切割转化方法进行，具体实施方式与实施例 I 的步骤 3 或实施例 II 的步骤 3 相同。
4、具体实施方式与实施例 I 的步骤 4 相同。
实施例 IV
实施例 IV 以水稻种子基因转化为例阐明具体实施方式，并对本发明进一步说 明：
1、实施例 VI 以水稻种子替代玉米种子。 水稻种子萌发时的胚芽鞘长度一般为 0.8-1.5cm，因此胚芽鞘转化具体实施方式与实施例 I 的步骤 1 相同。
2、实施例 VI 的具体实施方式与实施例 I 的步骤 2 相同。
3、在上述实施例 VI 的具体实施方式 1 和 2 的基础上，进行胚芽鞘基因转化时可 采用 ：实施例 I 的步骤 3 的胚芽鞘注射转化方法进行或采用实施例 II 的步骤 3 的胚芽鞘切 割转化方法进行，具体实施方式与实施例 I 的步骤 3 或实施例 II 的步骤 3 相同。
4、具体实施方式与实施例 I 的步骤 4 相同。6