基于生物小RNA的分子标记的方法.pdf

本发明涉及植物基因工程领域，旨在提供一种基于生物小RNA的分子标记的方法。该方法包括步骤：(1)小RNA序列数据的获得；(2)小RNA序列基因组定位；(3)PCR引物设计；(4)PCR扩增及其遗传多态性检测。本发明是一种新的生物分子标记技术，可应用于动植物和微生物；该标记基于实际表达的小RNA序列直接设计引物，为功能标记；该标记为PCR技术为基础的标记技术，同时该技术会产生几十条PCR产物带，因此也是一种高通量的分子标记技术。本发明可以用于：分子标记辅助选择育种、遗传图谱的构建、重要功能基因的定位和发现、特定性状或疾病的早期诊断早期筛选、亲缘关系判断(如农作物品种混杂、亲子鉴定等)。

1.  一种基于生物小RNA的分子标记的方法，包括以下步骤：
(1)小RNA序列数据的获得
提取生物总RNA，然后根据序列长度进行分离，对其中序列长度小于35nt的RNA样品进行测序，得到长度在15～35nt之间小RNA序列；
(2)小RNA序列基因组定位
将前述小RNA定位到相应基因组上，获得每个特异小RNA在基因组定位位点的数量和与其两端相连序列的数据；
(3)PCR引物设计
根据在基因组中特异定位位点数量超过1000个的一批小RNA及其两端相连序列设计PCR引物，并通过组合获得引物对，然后通过ePCR进行引物对的筛选；
(4)PCR扩增及其遗传多态性检测
根据上步获得的引物对，进行遗传作图群体或遗传多态性群体PCR扩增和多态性条带的确定，PCR产物的检测通过普通变性胶或非变性胶检测，或者通过同位素标记技术标记方式进行检测，以提供检测精度和该标记开发的效率。

2.  根据权利要求1所述的基于生物小RNA的分子标记的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的测序是高通量测序。

3.  根据权利要求1所述的基于生物小RNA的分子标记的方法，其特征在于，针对扩增条带过多的情况，在引物设计中增加1～2个随机碱基接头。

基于生物小RNA的分子标记的方法
技术领域
本发明属生物技术与基因工程领域，涉及一种基于生物小RNA序列的分子标记新技术。该技术适用于动植物、微生物等生物标记开发，且是一种基于PCR和基因表达序列的高通量功能标记。
背景技术
自从Botsein等人在1980年为构建人类遗传图谱首次使用分子标记技术，即限制性片段长度多态性(RFLP)以来，人们已经开发出了各种不同的分子标记来进行DNA多态性的检测。分子标记技术主要可分为两大类：基于PCR技术和非基于PCR技术(如RFLP)。基于PCR技术的分子标记又可进一步分为两类，即基于随机引物技术(如扩增性片段长度多态性，AFLP和随机扩增多态性DNA，RAPD)和基于目标序列的PCR技术(Agarwal et al.Plant CellRep 2008，27：617-631)。在目标序列这一类型中，除了基于微卫星技术(如简单序列重复，SSR)和单核苷酸多态性(SNP)技术，基于转座元件的分子标记也得到了很好的开发。这种标记是根据那些大量且广泛分布于基因组中的一小段保守序列(如LTR)来进行引物设计的。例如，逆转录转座子间长度多态性(IRAP)(Waugh et al.Mol Gen Genet 1997，253：687-694；Kalendar et al.Theo Appl Genet 1999，98：704-711)和MITE间长度多态性(IMP)(Chang et al.Theo Appl Genet 2001，102：773-781)。利用MITE(微反向重复转座因子)中逆转录转座子的长末端重复(LTR)和末端反向重复(TIR)来进行引物设计，在几种作物(如大麦)中都得到了很好的应用。
内源性非编码小RNA(通常21-24个核苷酸)在植物基因转录后调控方面发挥重要作用。总体上，基于小RNA合成机理和功能(Bartel Cell 2004，116(2)：281-297)来说，小RNA主要可分为两种，即微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。最近研究(Taft etal.Nature Genetics 2009，41：572-578)发现一种新类型的RNA，即转录起始RNA(tiRNA)，是位于转录起始点上游60个核苷酸和下游120个核苷酸片段上的长度大多为18个核苷酸的一种RNA，具有调控功能。通过高通量测序途径可以获得18-35个核苷酸长度的小RNA序列。小RNA序列通常是保守的，例如miRNA，但小RNA两翼序列多态性是很高的，很多结构性差异(如插入或缺失)(如在水稻上，Wang et al.BMC Evol Biol，2010，in press)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种基于生物小RNA的分子标记的方法。为解决该技术问题，本发明中的基于生物小RNA的分子标记的方法，包括以下步骤：
(1)小RNA序列数据的获得
提取生物总RNA，然后根据序列长度进行分离，对其中序列长度小于35nt的RNA样品进行测序，以得到长度在15～35nt之间小RNA序列；
(2)小RNA序列基因组定位
将前述小RNA定位到相应基因组上，获得每个特异小RNA在基因组定位位点的数量和与其两端相连序列的数据；
(3)PCR引物设计
根据在基因组中特异定位位点数量超过1000个的一批小RNA及其两端相连序列设计PCR引物，并通过组合获得引物对，然后通过ePCR进行引物对的筛选；
(4)PCR扩增及其遗传多态性检测
根据上步获得的引物对，进行遗传作图群体或遗传多态性群体PCR扩增和多态性条带的确定，PCR产物的检测通过普通变性胶或非变性胶检测，或者通过同位素标记技术标记方式进行检测，以提供检测精度和该标记开发的效率。
本发明中，步骤(1)中所述的测序是高通量测序。
本发明中，针对扩增条带过多的情况，在引物设计中增加l～2个随机碱基接头。
本发明的有益效果是：
本发明是一种新的生物分子标记技术，可应用于动植物和微生物；该标记基于实际表达的小RNA序列直接设计引物，为功能标记；该标记为PCR技术为基础的标记技术，同时该技术会产生几十条PCR产物带，因此也是一种高通量的分子标记技术。本发明标记可以利用领域主要包括：(1)分子标记辅助选择育种。也就是用于作物品种的选育；(2)遗传图谱的构建；(3)重要功能基因的定位和发现；(4)特定性状或疾病的早期诊断、早期筛选；(5)亲缘关系判断(如农作物品种混杂、亲子鉴定等)。
附图说明
图1为本发明的一个烟草iSNAP标记(11F/6R)在不同烟草品种中扩增情况。
其中箭头所指的位置为该标记在不同品种间表现为多态；最左列为标样(Marker)扩增情况。
具体实施方式
本发明的基于生物小RNA的分子标记的方法，包括以下步骤：
第一步：小RNA序列数据的获得
提取生物总RNA，然后根据序列长度进行分离，获得的长度小于35nt的RNA样品进行高通量测序或其他途径测序。具体方法见Zhu et al.Genome Res，2008，18：1456-1465。
第二步：小RNA序列基因组定位
将获得的长度在15～35nt之间小RNA序列，通过相应基因组序列和生物信息学方法将这些小RNA定位到基因组上，获得每个特异小RNA在基因组定位的数量和其相连序列数据；
第三步：PCR引物设计
根据在基因组中特异定位位点数量多的小RNA及其两端相连序列设计PCR引物，并通过组合获得引物对；通过ePCR进行引物对的筛选；
第四步：PCR扩增及其遗传多态性检测
根据上步获得的引物对进行遗传作图群体或遗传多态性群体进行PCR扩增和多态性条带的确定。PCR产物的检测可以通过普通变性胶或非变性胶检测，也可以通过同位素标记技术标记方式进行检测以提供检测精度和该标记开发的效率。
具体应用的实例：烟草小RNA分子标记开发
第一步：小RNA序列数据的获得
提取烟草根部总RNA，然后根据序列长度进行分离，获得的长度短的RNA样品进行高通量Solexia测序。具体方法见Zhu et al.Genome Res，2008，18：1456-1465。由此获得超过500万条烟草小RNA读序，长度分布18～35nt。
第二步：小RNA序列基因组定位
将获得的长度在15～35nt之间小RNA序列，通过相应基因组序列(来自NCBI的GENBANK数据库的烟草基因组调查序列GSS)和生物信息学方法将这些小RNA定位到GSS上，获得每个特异小RNA在GSS定位的数量和其相连序列数据；
第三步：PCR引物设计
根据在GSS中特异定位位点数量多的小RNA及其两端相连序列设计PCR引物并通过组合获得引物对。通过ePCR进行引物对的筛选；
第四步：PCR扩增及其遗传多态性检测
根据上步获得的引物对进行7个烟草栽培品种进行PCR扩增和多态性条带的确定。PCR产物的检测通过普通变性胶或非变性胶检测。
图1中候选多态性条带用箭头标出。
本实例中，在烟草上基于包含以下小RNA序列设计的引物：