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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710597123.1 (22)申请日 2017.07.20 (71)申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究 所 地址 266071 山东省青岛市市南区南京路 106号 (72)发明人 王芳徐甲坤陈怡炫惠彦行 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 汤东凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) G06F 19/24(2011.01) (54)发明名称 南极磷虾贮藏过程中。
2、导致其品质劣化的优 势菌群确定方法 (57)摘要 本发明提供一种南极磷虾贮藏过程中导致 其品质劣化的优势菌群确定方法， 属于食品领 域。 所述方法使用高通量测序法从不同温度贮藏 条件下分析南极磷虾中微生物多样性， 确定导致 其品质劣化的优势菌群。 为南极磷虾相关的食品 加工条件提供参考依据。 本发明方法检测南极磷 虾样品中的微生物多样性和丰度均显著高于平 板培养方法。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图11页 CN 107338296 A 2017.11.10 CN 107338296 A 1.一种南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法， 其特征在于所述方 法包括如下步骤。
3、： 从-80取出南极磷虾样品， 解冻后用无菌水冲洗磷虾表面， 然后分别置于0、 4、 16 和25培养箱； 24h后进行高通量测序； 首先提取样品总DNA， 分别用细菌引物V3/V4和真菌引物ITS1/ITS2扩增， 获得条带后上 机测序； Miseq测序序列中含有barcode序列， 以及测序时加入的引物和接头序列； 首先需要 去除引物接头序列， 再根据PE reads之间的overlap关系， 将成对的reads拼接成一条序列， 然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据， 最后对各样本数据的质量进 行质控过滤， 得到各样本有效数据； 在OTU聚类结果的基础上， 获取每一个。
4、OTU聚类中的代表 性序列； 计算ACE/Chao/Shannon/Simpson/Coverage等物种多样性指数， 并制作所有样品 ACE/Chao/Shannon/Simpson/Richness指数的箱形图； 基于物种分类分析， 绘制物种分类条 形图， 物种丰度饼图， 物种丰度热图； 根据对已有测序微生物基因组的基因功能的构成分析 结果和测序获得的物种构成， 推测样本中的功能分类的构成； 根据功能分类丰度， 绘制功能 分类条形图、 丰度热图、 丰度柱状图、 丰度聚类树图， 最终确定南极磷虾中的微生物多样性、 群落结构组成及丰度。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于所述的细菌引物。
5、V3-V4为 序列F： CCTACGGGNGGCWGCAG； 序列R： GACTACHVGGGTATCTAATCC。 所述的真菌引物ITS1- ITS2序列F： CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA； 序列R： GCTGCGTTCTTCATCGATGC。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107338296 A 2 南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法 技术领域 0001 本发明属于食品领域， 具体地涉及一种南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优 势菌群确定方法 背景技术 0002 南极磷虾因其巨大的生物量、 潜在的渔业资源以及在南极生态系统中的特殊地位 而日益受到人们的关。
6、注。 南极磷虾含有营养价值极其丰富的蛋白质、 磷脂、 不饱和脂肪酸等 成分， 在水产加工领域有着广泛的应用前景。 受船舶条件、 装备以及加工技术等的限制， 目 前中国作业船捕捞的南极磷虾原料， 很大一部分在船上进行冻结、 保藏， 之后运输到陆地进 行二次加工。 在此过程中， 南极磷虾在微生物和自身蛋白酶的作用下容易发生自溶， 黑化， 严重影响了南极磷虾的品质。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题在于提供一种南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的 优势菌群的确定方法， 所述方法考察了南极磷虾在不同温度(A： 0； B： 4； C： 16； D： 25 )贮藏条件下的微生物多样性， 确定了导致。
7、其品质劣化的优势菌群， 为南极磷虾加工的质 量控制及后期的保鲜技术奠定了基础。 0004 本发明是通过如下技术方案来实现的 0005 一种南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法， 所述方法包括如 下步骤： 0006 从-80取出南极磷虾样品， 解冻后用无菌水冲洗磷虾表面， 然后分别置于0、 4 、 16和25培养箱； 24h后进行高通量测序； 0007 首先提取样品总DNA， 分别用细菌引物V3/V4和真菌引物ITS1/ITS2扩增， 获得条带 后上机测序； Miseq测序序列中含有barcode序列， 以及测序时加入的引物和接头序列； 首先 需要去除引物接头序列， 再根据PE r。
8、eads之间的overlap关系， 将成对的reads拼接成一条 序列， 然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据， 最后对各样本数据的质 量进行质控过滤， 得到各样本有效数据。 在OTU聚类结果的基础上， 获取每一个OTU聚类中的 代表性序列； 计算ACE/Chao/Shannon/Simpson/Coverage等物种多样性指数， 并制作所有样 品ACE/Chao/Shannon/Simpson/Richness指数的箱形图； 基于物种分类分析， 绘制物种分类 条形图， 物种丰度饼图， 物种丰度热图； 根据对已有测序微生物基因组的基因功能的构成分 析结果和测序获得的物种构。
9、成， 推测样本中的功能分类的构成； 根据功能分类丰度， 绘制功 能分类条形图、 丰度热图、 丰度柱状图、 丰度聚类树图。 0008 进一步， 所述的细菌引物V3-V4 0009 序列F： CCTACGGGNGGCWGCAG； 序列R： GACTACHVGGGTATCTAATCC。 所述的真菌引物 ITS1-ITS2序列F： CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA； 序列R： GCTGCGTTCTTCATCGATGC。 0010 本发明与现有技术相比的有益效果 说明书 1/6 页 3 CN 107338296 A 3 0011 本发明从不同温度(A： 0； B： 4； C： 16； D： 。
10、25)贮藏条件下分析南极磷虾中微 生物多样性， 确定导致其品质劣化的优势菌群。 为南极磷虾相关的食品加工条件提供参考 依据。 0012 本发明使用高通量测序的检测南极磷虾样品中的微生物多样性和丰度均显著高 于平板培养方法。 附图说明 0013 图1是细菌多样性chao指数箱形图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25 (24h)； 0014 图2是细菌多样性Simpson指数箱形图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0015 图3是不同贮存条件下细菌群落结构组成分布柱状图A： 0(24h)； B： 4。
11、(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0016 图4是不同贮存条件下细菌样本与物种关系图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16 (24h)； D： 25(24h)； 0017 图5是不同贮存条件下细菌物种丰度热图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0018 图6是不同贮存条件下细菌代谢通路差异蛋白丰度热图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0019 图7是真菌多样性Chao指数箱形图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h。
12、)； D： 25 (24h)； 0020 图8是真菌多样性Simpson指数箱形图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0021 图9是不同贮存条件下真菌群落结构组成分布柱状图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0022 图10是不同贮存条件下真菌样本与物种关系图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16 (24h)； D： 25(24h)； 0023 图11是不同贮存条件下真菌物种丰度热图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16 (24h)； D： 25(2。
13、4h)； 0024 图12是不同贮存条件下微生物平板培养群落结构组成分布柱状图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16(24h)； D： 25(24h)； 0025 图13是不同贮存条件下微生物总菌落数柱状图A： 0(24h)； B： 4(24h)； C： 16 (24h)； D： 25(24h)； 0026 图14是优势菌群的蛋白酶活性平板示意图。 具体实施方式 0027 下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释， 但本发明的保护 范围不受实施例任何形式上的限制。 0028 实施例 说明书 2/6 页 4 CN 107338296 A 4 0029 实施例1 00。
14、30 一种南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法， 所述方法包括如 下步骤： 0031 南极磷虾由辽渔集团提供， 为2015年10月在南极海域捕获， 并在-80条件下冷冻 保存。 0032 从-80取出南极磷虾样品， 解冻后用无菌水冲洗磷虾表面， 各取数只分别置于0 、 4、 16和25培养箱； 24h后各取样品进行高通量测序。 首先提取样品总DNA， 分别用 细菌引物V3/V4和真菌引物ITS1/ITS2扩增， 获得条带后上机测序； Miseq测序序列中含有 barcode序列， 以及测序时加入的引物和接头序列； 首先需要去除引物接头序列， 再根据PE reads之间的overl。
15、ap关系， 将成对的reads拼接成一条序列， 然后按照barcode标签序列识 别并区分样品得到各样本数据， 最后对各样本数据的质量进行质控过滤， 得到各样本有效 数据。 在OTU聚类结果的基础上， 获取每一个OTU聚类中的代表性序列； 计算ACE/Chao/ Shannon/Simpson/Coverage等物种多样性指数， 并制作所有样品ACE/Chao/Shannon/ Simpson/Richness指数的箱形图； 基于物种分类分析， 绘制物种分类条形图， 物种丰度饼 图， 物种丰度热图； 根据对已有测序微生物基因组的基因功能的构成分析结果和测序获得 的物种构成， 推测样本中的功能分。
16、类的构成； 根据功能分类丰度， 绘制功能分类条形图、 丰 度热图、 丰度柱状图、 丰度聚类树图。 0033 所述的细菌引物V3-V4序列为 0034 序列F： CCTACGGGNGGCWGCAG； 0035 序列R： GACTACHVGGGTATCTAATCC。 0036 所述的真菌引物ITS1-ITS2序列为 0037 ITS1F序列F： CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA； 0038 ITS2R序列R： GCTGCGTTCTTCATCGATGC。 0039 结果如下： 0040 1、 16SrDNA(细菌)高通量测序结果分析 0041 1.1细菌多样性指数分析 0042 群落生态。
17、学中研究微生物多样性， 通过单样品的多样性分析， 可以反映微生物群 落的丰度和多样性， 包括一系列统计学分析指数(Chao、 Ace、 Simpson、 Coverage)估计环境 群落的物种丰度和多样性。 0043 在细菌多样性的指数分析中， chao指数常用来估计物种总数， 数值越大， 数量越 多。 由图1结果可知， 南极磷虾样品在4贮存24h时， 细菌总数最多， 0次之。 这应该与南极 磷虾的生存环境有关， 低温微生物数量较多。 Simpson指数通常用来定量描述一个区域的生 物多样性， Simpson指数值越大， 说明群落多样性越低。 由图2结果可知， 南极磷虾样品在4 贮存24h时，。
18、 细菌多样性最低， 0时细菌多样性最高。 结合chao指数结果， 我们可推断， 由于 南极的低温环境， 南极磷虾体内和体外细菌的数量和多样性都更适于0-4生长和分布。 0044 1.2.细菌结构组成分析。 0045 根据分类学分析结果， 可以得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情 况。 在结果中， 包含了两个信息:(1).样品中含有何种微生物； (2).样品中各微生物的序列 数， 即各微生物的相对丰度。 因此， 可以使用统计学的分析方法， 观测样品在不同分类水平 说明书 3/6 页 5 CN 107338296 A 5 上的群落结构。 将多个样品的群落结构分析放在一起对比时， 还可以观。
19、测其变化情况。 根据 研究对象是单个或多个样品， 结果可能会以不同方式展示， 通常使用较直观的柱状图呈现。 0046 由图3结果可知， 南极磷虾在0贮存24h后， 细菌中丰度较低的其它细菌(other) 含量最高。 表明在此条件下， 虽然细菌多样性比较高， 但每种细菌的数量都很低， 少量存在， 但难以大量繁殖。 除此之外， 在0条件下， Enterococcus(肠球菌)为第二大细菌组成， Bacillus(芽孢杆菌)为第三大细菌组成； 南极磷虾在4贮存24h后， 细菌组成发生了变化。 Bacillus(芽孢杆菌)成为含量最多的细菌， Lactococcus(乳球菌)和Enterococcus。
20、(肠球 菌)次之； 当南极磷虾的贮存温度升至16和25时， 优势菌群均为Psychrobacter(嗜冷杆 菌)， 次优势菌分别为Bacillus(芽孢杆菌)和Enterococcus(肠球菌)。 0047 上述不同贮存条件下南极磷虾的细菌结构组成结果表明， 在0-4的低温贮存 环境中， Enterococcus(肠球菌)和Bacillus(芽孢杆菌)为优势菌群； 当贮存温度上升至16 -25时， Psychrobacter(嗜冷杆菌)为优势菌群。 0048 图4更直观地描述了样本A、 B、 C、 D与其对应的优势菌群的共线性关系。 右边半圆表 示样本的物种丰度组成情况， 左边半圆表示在该分类。
21、水平下物种在不同样本中的分布比例 情况。 0049 1.3细菌丰度热图。 0050 细菌丰度热图， 是用细菌丰度矩阵绘制， 图中每一列代表一个样本， 行代表群落结 构， 颜色块代表相对物种丰度值， 颜色越红表示相对丰度越高， 颜色越蓝反之。 另外热图对 样本做了聚类， 样本菌群分布越类似则样本距离越近， 在图上方聚类树中的位置越靠近。 为 了展示效果， 只显示丰度最高的前50个物种分类信息， 剩余的物种分类合并成other， 在图 上的上方。 有颜色块， 来自同一组的样本颜色相同。 0051 由图5可知， 南极磷虾样品在16和25贮存时的样本距离最近， 说明在此条件下 细菌菌群分布更相似。 热。
22、图最上方， Psychrobacter(嗜冷杆菌)、 Bacillus(芽孢杆菌)和 Enterococcus(肠球菌)的颜色最红， 说明这几种细菌在南极磷虾样本中丰度最高。 0052 1.4.细菌功能预测。 0053 通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后， 我们可以通过16s 测序获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成， 从而分析不同样本和分组之间在功能 上的差异。 0054 由图6的KEGG(代谢通路)数据库比对结果可知， 贮存在0的南极磷虾样品中与代 谢功能正相关的基因最多， 25贮存条件下， 与代谢功能负相关的基因最多。 在所有的代谢 功能中， 氨基酸代谢是四个样品中。
23、相关基因含量最高的， 其次是碳水化合物的代谢， 说明南 极磷虾在贮存过程中发生的自溶及腐败与其体内及体外细菌的作用正相关。 0055 2.ITS(真菌)高通量测序结果分析 0056 2.1真菌多样性指数分析 0057 由图7、 图8结果可知， 与细菌的Chao指数相似， 南极磷虾样品在4贮存24h时， 细 菌总数最多， 0、 16、 25差异不显著。 由Simpson指数值表征的最高的真菌多样性样品 也与细菌一致， 0贮存的南极磷虾样品真菌多样性最高， 而其他温度的样品的多样性差异 也不显著。 表明受南极低温环境的影响， 细菌和真菌都趋向于低温生长繁殖。 0058 2.2.真菌结构组成分析 说。
24、明书 4/6 页 6 CN 107338296 A 6 0059 由图9结果可知， 南极磷虾在0贮存24h后， 与细菌相似， 真菌中丰度较低的其它 真菌(other)含量最高。 表明在此条件下， 虽然真菌多样性比较高， 但每种细菌的数量都很 低， 少量存在， 但难以大量繁殖。 除此之外， 在0条件下， Unclassified(未知真菌)为第二 大细菌组成， Unclassified Saccharomycete(未知酵母菌)为第三大细菌组成； 而其他三种 贮存条件(4、 16、 25)下， 南极磷虾的优势真菌群均为Unclassified Saccharomycete (未知酵母菌)， 次优。
25、势菌为Unclassified(未知真菌)。 此结果表明， 由于南极的特殊生境， 南极磷虾中仍存在大量的有待开发的未知真菌资源。 0060 图10更直观地描述了样本A、 B、 C、 D与其对应的优势菌群的共线性关系。 右边半圆 表示样本的物种丰度组成情况， 左边半圆表示在该分类水平下物种在不同样本中的分布比 例情况。 0061 2.3.真菌丰度热图。 0062 由图11可知， 南极磷虾样品在4和25贮存时的样本距离最近， 说明在此条件下 真菌菌群分布更相似。 热图最上方， Unclassified Saccharomycete(未知酵母菌)和 Unclassified(未知真菌)颜色最红， 说。
26、明这两种细菌在南极磷虾样本中丰度最高， 与真菌 结构组成图结果一致。 0063 由于目前针对真菌的保守序列所对应的功能数据库还没有建立， 因此我们尚不能 通过ITS序列来预测样品中真菌的功能基因。 0064 实施例2 0065 南极磷虾由辽渔集团提供， 为2015年10月在南极海域捕获， 并在-80条件下冷冻 保存。 0066 从-80冰箱取出小块南极磷虾样品， 解冻后用无菌水冲洗磷虾表面， 各取数只分 别置于0、 4、 16和25培养箱。 24h后各取三只用匀浆器研磨， 无菌水稀释， 涂布， 分别 用1.3中的6种培养基在0、 4、 16和25培养。 0067 所述的6种培养基： Zobel。
27、l 2216E细菌培养基， Penssay Broth细菌培养基， LB细菌 培养基， SC放线菌培养基， Emerson真菌培养基， Sabouraud真菌培养基， Invitrogen基因组 DNA提取试剂盒， 2Taq PCR Mastermix,酪素(国药)。 0068 收集不同培养条件下不同培养基的平板， 统计可培养菌落数量。 提取菌落基因组 DNA， 分别用细菌和真菌的保守引物扩增， 将PCR产物送测序公司测序。 0069 采用酪素平板法检测优势菌群的蛋白酶活性。 将酪素溶于pH8.0Tris-Hcl缓冲液 中， 加入2琼脂， 高温高压灭菌， 配制酪素平板。 取可培养菌株的液体发酵。
28、液50ul加入已打 孔的酪素平板， 16培养48h。 0070 在设置了不同的贮存条件将南极磷虾样品进行高通量测序的同时， 我们将平行样 品在不同的培养基中进行了平板培养， 实验结果及分析如下。 0071 从-80超低温冰箱取出的磷虾样品呈粉红的新鲜状态， 在0 0072 贮存24h后， 虾头轻微变绿； 在4贮存24h后， 虾头由绿色变微黑状态； 当温度升至 16和25时， 不止虾头已完全黑化， 虾体的颜色也逐渐加深。 表明随着贮存温度的升高， 南极磷虾的品质逐渐劣化。 追朔其原因， 其一是南极磷虾自身蛋白质含量高， 组织内存在大 量的高活性的蛋白酶， 自溶迅速， 因此易于腐败变质。 其二， 。
29、南极磷虾体表和体内存在着来 自南极海域的微生物， 微生物的繁殖及产生的代谢产物均容易导致磷虾的品质发生改变。 说明书 5/6 页 7 CN 107338296 A 7 0073 分别采用了LB、 Zobell 2216E及Penssay Broth三种细菌培养基， PDA、 Eerson和 Sabouraud三种真菌培养基以及SC放线菌培养基对上述南极磷虾样品的匀浆液进行平板涂 布， 分别置于4、 16和25培养。 实验结果如下： 0074 由图12和图13可知， 不同贮存条件的南极磷虾样品在不同的培养基和培养条件 下， 随着温度升高， 微生物的丰度和多样性都逐渐增多， 且Psychrobac。
30、ter(嗜冷杆菌)均为 优势菌群， 说明南极磷虾的腐败与嗜冷杆菌相关。 0075 由图14显示优势菌群Psychrobacter(嗜冷杆菌)有明显的蛋白酶活性， 另外 Planococcus(动球菌属)亦有蛋白酶活性。 0076 由两个实施例可以看出： 0077 1.本发明方法通过高通量测序检测南极磷虾样品中的微生物多样性和丰度均显 著高于平板培养方法。 0078 2.南极磷虾体内和体外微生物的数量和多样性都更适于0-4生长和分布， 因 此在南极磷虾食品加工过程中避免在0-4长期保存。 0079 3 .本发明方法16SrDNA高通量测序结果显示， 0-4的低温贮存环境中， Enterococc。
31、us(肠球菌)和Bacillus(芽孢杆菌)为优势菌群； 当贮存温度上升至16-25 时， Psychrobacter(嗜冷杆菌)为优势菌群， 与平板培养法的结果相同， 说明南极磷虾的腐 败与嗜冷杆菌相关。 0080 4.本发明方法ITS高通量测序结果显示， 南极磷虾的优势真菌群为Unclassified Saccharomycete(未知酵母菌)此结果表明， 由于南极的特殊生境， 南极磷虾中仍存在大量 的有待开发的未知真菌资源。 0081 5.各种贮存条件的南极磷虾样品中， 与氨基酸代谢和碳水化合物代谢的功能基因 最多， 说明南极磷虾在贮存过程中发生的自溶及腐败与其体内及体外细菌的作用正相关。
32、。 0082 7.优势菌群具有蛋白酶活性， 说明南极磷虾的微生物与其贮存过程中的腐败过程 相关。 说明书 6/6 页 8 CN 107338296 A 8 SEQUENCE LISTING 中国水产科学研究院黄海水产研究所 南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法 无 4 PatentIn version 3.3 1 17 DNA Artificial 细菌引物V3-V4 序列F misc_feature (9).(9) n is a, c, g, or t 1 cctacgggng gcwgcag 17 2 21 DNA Artificial 细菌引物V3-V4R 2 gactac。
33、hvgg gtatctaatc c 21 3 22 DNA Artificial 真菌引物ITS1-ITS2 序列F 3 cttggtcatt tagaggaagt aa 22 4 20 DNA Artificial 序列表 1/2 页 9 CN 107338296 A 9 真菌引物ITS1-ITS2 序列R 4 gctgcgttct tcatcgatgc 20 序列表 2/2 页 10 CN 107338296 A 10 图1 图2 说明书附图 1/11 页 11 CN 107338296 A 11 图3 说明书附图 2/11 页 12 CN 107338296 A 12 图4 说明书附图 。
34、3/11 页 13 CN 107338296 A 13 图5 说明书附图 4/11 页 14 CN 107338296 A 14 图6 说明书附图 5/11 页 15 CN 107338296 A 15 图7 图8 说明书附图 6/11 页 16 CN 107338296 A 16 图9 说明书附图 7/11 页 17 CN 107338296 A 17 图10 说明书附图 8/11 页 18 CN 107338296 A 18 图11 说明书附图 9/11 页 19 CN 107338296 A 19 图12 图13 说明书附图 10/11 页 20 CN 107338296 A 20 图14 说明书附图 11/11 页 21 CN 107338296 A 21 。