一种快速检测转基因油菜GT73的方法.pdf

本发明公开了一种转基因油菜GT73的快速检测方法。其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增出大量产物。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便等优点。

1、  用于检测转基因油菜GT73的特异性引物，其特征在于，包括外引物正向序列：5’-GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC-3’，外引物反向序列：5’-GTGGAATGTTCAATACCTTGA-3’；内引物正向序列：5’-GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC-3’，内引物反向序列5’-GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC-3’，环引物序列：5‘-AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG-3’。

2、  一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因油菜GT73方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将引物混合溶液及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；
其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/LMgSO4 0.25μL，引物混合液1μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L BstDNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混匀，离心4000-8000rpm，5-10秒后上机；
(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入荧光染料SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。

3、  如权利要求2所述的检测方法，其中所述的引物混合溶液指的是将权利要求1所述的5条特异引物粉末分别配成浓度为100μmol/L的母液，然后取外引物各1μL，内引物各8μL，加灭菌去离子水2μL，充分混合，制得引物混合溶液。

4、  如权利要求2所述的检测方法，其中荧光染料SYBR Green浓度为1000倍，加入量为1-2μL。

5、  如权利要求2所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL。

一种快速检测转基因油菜GT73的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体说是一种快速检测转基因油菜GT73的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观察加入1000×SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情况。
背景技术
近年来，我国生产的油菜籽供不应求，平均每年进口菜籽100万吨以上，最多的年份达300多万吨，主要进口国为加拿大。加拿大油菜籽已成为我国菜籽消费的一个重要组成部分。加拿大是世界第二大油菜生产国和第一大油菜产品出口国，还是世界上第一个大面积商业化种植转基因油菜的国家，油菜生产主要采用抗除草剂转基因油菜品种，种植面积最大的品种是孟山都公司培育的抗农达(草甘膦)品种GT73/RT73及其衍生品种，约占加拿大油菜播种面积的46％，其次是拜耳公司培育的转基因抗草胺膦杂交油菜Ms8Rf3系统及其衍生组合，约占加拿大油菜面积的31％。另外还有Pioneer Hi-bred公司采用诱变育种方法获得的抗咪唑啉酮除草剂品种，约占15％。加拿大目前抗除草剂品种种植面积达95％以上。该国从事油菜生产的农户约6万户，采取大面积机械化作业，年产油菜籽500-800万吨。加拿大的油菜生产主要分布在加拿大西部草原三个省，春播夏收，生产的油菜籽50％在国内压榨，50％通过沿海口岸出口到美国、日本、中国和墨西哥等地区。
我国目前还没有转基因油菜产业化种植，但转基因油菜研究十分活跃，有的已经接近产业化阶段。为了推进转基因油菜的产业化和安全管理进程，国家转基因油菜的检测和监测体系正在紧锣密鼓的进行。目前，除美国有少量转基因油菜种植以外，加拿大是唯一大面积产业化种植转基因油菜的国家，迄今已有十年的历史，其经验与教训值得我国借鉴。
随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转基因作物进行安全性评估仍然很有必要。
欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。
我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。
目前，PCR检测方法是主要的转基因作物检测方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法。PCR扩增技术的一般检测程序是：提取基因组DNA→PCR扩增→酶切试验→检测目的基因→检测报告。检测仪器设备主要是PCR仪、电泳仪、冷冻离心机、紫外观察(或凝胶成像)仪等，所需的技术条件较高，仪器设备较为昂贵，且检测成本和费用较高，一般检测单位难以达到。
发明内容
本发明的目的在于公开一种快速检测转基因油菜GT73的方法及根据外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测转基因油菜GT73的特异性引物，其中外引物正向序列：5’-GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC-3’，外引物反向序列：5’-GTGGAATGTTCAATACCTTGA-3’；内引物正向序列：5’-GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC-3’，内引物反向序列5’-GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC-3’，环引物序列：5‘-AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG-3’。
每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的母液，取外引物各1μL，内引物各8μL，灭菌去离子水2μL，充分混合，为引物混合溶液。
本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因油菜GT73的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将引物混合溶液及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；
其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/LMgSO4 0.25μL，引物混合液1μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L BstDNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混匀离心(4000-8000rpm，5-10秒)后上机；
(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入荧光染料SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
本发明所述的引物混合溶液指的是将上述的5条特异引物粉末分别配成浓度为100μmol/L的母液，然后取外引物各1μL，内引物各8μL，加灭菌去离子水2μL，充分混合，制得引物混合溶液。
本发明所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL。
本发明所述的荧光染料SYBR Green加入量为1-2μL，浓度为1000倍。
本发明所述的检测方法，模板DNA指的是从待测样品提取的基因组DNA。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63℃-65℃对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。
2、引物设计
本研究依据转基因油菜GT73外源基因与内源基因结合处序列设计了4条引物。引物由上海生物工程公司合成。
表1 引物序列表如下：

3、反应条件
反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、转基因油菜GT73特异性引物、甜菜碱、MgSO₄和反应缓冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据引物的效率和模板DNA质量变化，一般为1h或更少。加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃，持续2min而终止。
这项技术的优点就是不需要热循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度。
材料与方法：
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物；甜菜碱溶液；MgSO₄溶液；dNTPs；
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/LMgSO₄ 0.25μL，引物混合液1μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L BstDNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混匀、离心(4000-8000rpm，5-10秒)后上机；
(3)扩增反应过程：在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；
(4)扩增反应结束，取体系液3-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。
4、扩增结果观察
有三种观察方法，适合不同情况下进行：
1)使用2％琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。结果见图1。
2)由于反应形成大量双链DNA产物，所以可直接向扩增管中加入荧光染料SYBR Green，通过肉眼观察，无扩增反应的反应管呈橙色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图2。
3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。
本发明用于转基因油菜GT73检测的扩增方法，具有以下优点：
(1)操作简便：不需要复杂的仪器，只需一恒定温度就能反应。
(2)高特异性：该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高度特异性。
(3)快速高效：整个扩增不到1h即可完成，产量可达到10⁹-10¹⁰个拷贝；
(4)鉴定简便：可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过SYBR Green颜色变化判断扩增与否。
附图说明：
图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、空白对照、阴性对照、阴性样品、阳性对照和阳性样品。
图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。左为阳性对照，右为阴性对照。
图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阴性对照、阳性对照、待测样品。
图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为阴性对照、阳性对照、待测样品1和待测样品2。
图5为扩增产物的电泳分析图谱。由左至右：DL2000 DNA Marker、阴性对照、待测样品1、待测样品2、待测样品3、待测样品4、阳性对照。
图6为实施例4，采用本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果，其中1，10％；2，5％；3，1％；4，0.5％；5，0.1％；6，0.05％；7，0.01％；8，0.005％；9，0.001％；10，阴性对照；M，DL2000 DNA，Marker。
图7为实施例4，常规定性PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。其中1，10％；2，5％；3，1％；4，0.5％；5，0.1％；6，0.05％；7，0.01％；8，0.005％；9，0.001％；10，阴性对照；M，DL2000 DNA，Marker。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。
实施例1
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；0.2mol/L MgSO₄溶液。
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/L MgSO₄0.25μL，混合引物1μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心(4000rpm，5秒)上机。
(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存。
(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入荧光染料1μL 1000×SYBR Green，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的反应管呈橙黄色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图3，由图可见，待测样品为阳性样品，含有转基因油菜GT73成份。
实施例2
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；0.2mol/L MgSO₄溶液。
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/L MgSO₄，混合引物0.25μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心(8000rpm，10秒)上机。
(3)扩增反应程序：在65℃进行45min，并且在80℃保温2min，4℃，保存。
(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入荧光染料2μL 1000×SYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的反应管呈橙黄色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图4，由图可以看出，待测样品1为阳性样品，不含有转基因油菜GT73成分，样品2不含有转基因油菜GT73成分。
实施例3
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；0.2mol/L MgSO₄溶液。
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/L MgSO₄，混合引物0.25μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心(5000rpm，5秒)上机。
(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存。
(4)扩增反应结束，取体系液3μL经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应的反应管出现阶梯状条带。结果见图5，4个样品中样品1、2不含有转基因油菜GT73成分，样品3、4含有转基因油菜GT73成分。
实施例4
对比实验：
转基因油菜GT73的定性PCR测定方法与本发明的测定方法的对比：
(1)本发明方法试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；0.2mol/L MgSO4溶液；DNA模板包括含有转基因油菜GT73成份10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0％的样品。
(2)本发明扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，4mol/L甜菜碱6.25μL，0.2mol/LMgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μmol/L dNTPs 3.5μL，8000U/L BstDNA聚合酶大片段2μL，模板DNA5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后充分混匀、离心(8000rpm，8秒)上机；
(3)本发明扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；
(4)本发明扩增反应结束，取反应产物4μL，经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应的反应管出现阶梯状条带。结果见图6：其中1，10％；2，5％；3，1％；4，0.5％；5，0.1％；6，0.05％；7，0.01％；8，0.005％；9，0.001％；10，阴性对照；M，DL2000DNA，Marker。
(5)PCR方法：反应引物采用本发明反应中一对外引物扩增目标基因。PCR反应为25μL体系，10×PCR buffer(Promega)2.5μL，10mM dNTPs(Promega)0.5μL，上游和下游引物(10mM)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，Promega)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水19.5μL。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物取10μL于2％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察，结果见图7：其中1，10％；2，5％；3，1％；4，0.5％；5，0.1％；6，0.05％；7，0.01％；8，0.005％；9，0.001％；10，阴性对照；M，DL2000DNA，Marker。
由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出转基因油菜GT73含量更低的样品。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
序列表
<110>天津市农业科学院中心实验室
<120>一种快速检测转基因油菜GT73的方法
<160>4
<210>1
<211>24bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1

<210>2
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2

<210>3
<211>49bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3

<210>4
<211>48bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4

<210>5
<211>25bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5