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1、10申请公布号CN101942386A43申请公布日20110112CN101942386ACN101942386A21申请号200910040930922申请日20090708C12M1/34200601C12N15/10200601C12Q1/6820060171申请人中国科学院广州生物医药与健康研究院地址510663广东省广州市广州科学城国际企业孵化器D栋10楼72发明人曾令文刘国东顿博影74专利代理机构广州三环专利代理有限公司44202代理人刘宇峰54发明名称核酸纳米金生物传感器及其制备方法57摘要本发明涉及一种核酸纳米金生物传感器及其制备方法。本发明所述的核酸纳米金生物传感器，包括从。
2、左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线。本发明的优点在于本发明所述的核酸纳米金生物传感器制备简便、检测迅速，约10分钟后即可通过观察检测线及质控线来判断结果，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页CN1。
3、01942391A1/1页21一种核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线。2根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述质控线与检测线相距310MM。3根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤。
4、维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠15MM。4根据权利要求3所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述的相邻部分彼此重叠2MM。5根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述胶体金的粒径为8100NM。6根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述寡核苷酸为单链DNA或者RNA。7根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述的寡核苷酸探针是针对目的基因片段设计合成的寡核苷酸探针；其中，涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针与目的基因特异性互补，固定在硝酸纤维素膜上的两种寡核苷酸探针中，固定于检测线的探针与目的基因特异性互补，固定于质控线的探针与涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探。
5、针特异性互补。8根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的纳米金标记寡核苷酸探针的制备方法包括以下步骤1纳米金的制备选用粒径为8100NM的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸还原法制备，通过控制还原剂的量在001005以及搅拌速度在100050000转之间来控制颗粒粒径；2寡核苷酸探针分子设计及修饰合成针对目的基因片段设计合成三条寡核苷酸探针，三条寡核苷酸探针与模板DNA的关系及三者之间的关系为DNA探针1和DNA探针2分别与所测样品中模板DNA特异性互补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补，该DNA探针2的5端或3端采用巯基修饰合成；3纳米金与寡核苷酸探针的偶联与封闭。
6、老化将上述巯基修饰的寡核苷酸探针加入到5倍体积浓缩的纳米金溶液中，混合，在437反应1024小时，用10牛血清白蛋白封闭多余的活性位点，30分钟后加入NACL和SDS使其终浓度分别至015M和001，老化1020小时后，1000016000转/分钟离心2060分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标记寡核苷酸探针，将此纳米金标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4保存。9根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的样品垫是经过以下处理的采用含025TRITONX100、005MTRISHCL、015M氯化钠的混合液浸泡玻璃纤维4个小时后，37烘干。权利要求书CN101942386A。
7、CN101942391A1/5页3核酸纳米金生物传感器及其制备方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸快速检测产品的制备方法。背景技术0002基因检测不仅对生物学研究至关重要，而且对临床医学、药学、环境监测、法医鉴定等领域具有极其重要的意义。传统的基因检测技术有NORTHERN杂交法、SOUTHERN杂交法WESTERNBLOTTING法、PCR等，但是这些检测方法不仅费时费力，而且特异性差。在过去的十几年中，实时荧光定量PCR已经发展成为一种重要的基因检测技术，具有高灵敏度和特异性，但是需要昂贵的仪器及专业人员的操作。近年来兴起的DNA纳米技术是以DNA碱基严格互补配对的特性。
8、为原理，主要应用于分子的组装，产生有功能的组装聚集物。DNA纳米技术除了用于基因芯片，还应用于将DNA结合到纳米颗粒上构成纳米颗粒基因探针，通过与靶DNA之间的互补实现纳米颗粒的组装，这已成为一种新型的DNA检测系统。MIRKIN等运用金纳米颗粒基因探针与合成靶杂交，形成透射电镜下明显的聚集体，可判断合成靶存在与否CHADAMIRKIN，RLL，ROBERTCMUCICJAMESJSTORHOFFNATURE1996，382，607609。WANG等制备金纳米颗粒乙型肝炎病毒HBVDNA基因探针，在玻片上目视化检测HBVDNA的多聚酶链反应产物WANGYF，PANGDW，ZHANGZL，ETA。
9、LVISUALGENEDIAGNOSISOFHBVANDHCVBASEDONNANOPARTICLEPROBEAMPLIFICATIONANDSILVERSTAININGENHANCEMENTJMEDVIROL，2003，702052211。习东等应用FE3O4核/AU壳纳米颗粒HBVDNA基因探针，通过尼龙膜上斑点杂交或液相中杂交研究其在检测HBVDNA中的应用DONGXIA，XL，QINNINGA，QIANGHUALUD，KAILUNYAO，ZULILIUDJOURNALOFNANJINGMEDICALUNIVERSITY2007，21，207212。但上述检测技术都存在各自的缺点，例如，。
10、MIRKIN的技术需要复杂昂贵的透射电镜，WANG的技术需要昂贵的进口玻片，且需要长时间的预杂交、杂交洗涤过程，习东的技术在检测时需要长时间的复杂的预杂交、杂交、洗膜银染过程，耗时费力。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的核酸检测工具。发明内容0003本发明的目的是克服现有基因检测技术存在的问题和不足，提供一种用于核酸快速检测的新的检测工具，即核酸纳米金生物传感器，并提供该核酸纳米金生物传感器的制备方法。0004本发明所述的一种核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由。
11、巯基修饰并与胶体金偶联形成的；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线。说明书CN101942386ACN101942391A2/5页40005根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述质控线与检测线相距310MM。0006根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠15MM。0007根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的相邻部分彼此重叠2。
12、MM。0008根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述胶体金的粒径为8100NM。0009根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述寡核苷酸为单链DNA或者RNA。0010根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的寡核苷酸探针是针对目的基因片段设计合成的寡核苷酸探针；其中，涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针与目的基因特异性互补，固定在硝酸纤维素膜上的两种寡核苷酸探针中，固定于检测线的探针与目的基因特异性互补，固定于质控线的探针与涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针特异性互补。0011根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的纳米金标记寡核苷酸探针的制备方。
13、法包括以下步骤00121纳米金的制备选用粒径为8100NM的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸还原法制备，通过控制还原剂的量在001005以及搅拌速度在100050000转之间来控制颗粒粒径；00132寡核苷酸探针分子设计及修饰合成针对目的基因片段设计合成三条寡核苷酸探针，三条寡核苷酸探针与模板DNA的关系及三者之间的关系为DNA探针1和DNA探针2分别与所测样品中模板DNA特异性互补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补，该DNA探针2的5端或3端采用巯基修饰合成；00143纳米金与寡核苷酸探针的偶联与封闭老化将上述巯基修饰的寡核苷酸探针加入到5倍体积浓缩的纳米金溶液中，混合，在437反。
14、应1024小时，用10牛血清白蛋白封闭多余的活性位点，30分钟后加入NACL和SDS使其终浓度分别至015M和001，老化1020小时后，1000016000转/分钟离心2060分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标记寡核苷酸探针，将此纳米金标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4保存。0015根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的样品垫是经过以下处理的采用含025TRITONX100、005MTRISHCL、015M氯化钠的混合液浸泡玻璃纤维4个小时后，37烘干。0016本发明将表面合成化学、生物化学及物理化学有机结合起来，解决目视化基因检测技术设计与制造中的关键技术，具体构。
15、思如下0017胶体金是一种带负电的胶体溶液，能与巯基共价结合形成AUS键，通过寡核苷酸修饰巯基与胶体金偶联从而形成金标DNA探针；链霉亲合素SA是与亲合素A有类似生物学特性的一种蛋白质，是由STREPTOMYCESAVIDIN菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物。SA是一种四聚体蛋白，其每个单体通过亲水键和范德华力与一个生物素结合后两者形成稳定且难断裂的键，因此利用生物素与链霉亲和素间的亲和力，用一个用生物素标记的说明书CN101942386ACN101942391A3/5页5探针与链霉亲和素偶联，固定于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；将硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水纸固定于胶板上，组装成。
16、纳米金生物传感器。0018本发明的技术原理是核酸纳米金生物传感器以夹心DNA杂交为基础，其基本原理为设计3条DNA探针，DNA探针1和DNA探针2分别与所测样品中模板DNA特异性互补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补图1。DNA探针1和DNA探针3分别固定在硝酸纤维素膜的检测线TESTLINE和质控线CONTROLLINE上，DNA探针2与胶体金相连，涂布在金标垫上。当在样品垫上滴加样品含模板DNA时，由于毛细作用，模板DNA随样品液一起向前运动，当到达金标垫时，模板DNA与金标垫上的DNA探针2特异性杂交。杂交的DNA继续向前移动，当到达检测区域时模板DNA与DNA探针1再次特异性杂交而。
17、固定在检测线上。由于胶体金的光学性质，在检测线上聚集的胶体金颗粒显现出红色的条带，过剩的胶体金DNA探针2由于毛细作用继续向前移动，与质控线上的DNA探针3杂交，而在质控线上出现红色的线。如果样品中没有模板DNA时，检测区域不出现红线，而质控线上出现红线。因此，质控线出现红色线说明试纸条可用，而检测线出现与否是样品阴性和阳性的标准。整个检测过程只需要10分钟左右。0019本发明的优点在于本发明所述的核酸纳米金生物传感器制备简便、检测迅速，将目标DNA滴于样品垫上，约10分钟后即可通过观察检测线及质控线来判断结果，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备。附图说明0020图1显示DNA探针1、DNA。
18、探针2和DNA探针3之间的关系。0021图2显示纳米金生物传感器检测模板DNA的结果；图2A为不含模板DNA的检测结果，图2B为含有05NMOL/L模板DNA的检测结果。具体实施方式0022实施例一本发明所述的核酸纳米金生物传感器的制备00231、探针的设计及模板的合成0024选择DNA模板为流感病毒CDNAGI|227809835|GB|FJ9660851|INFLUENZAAVIRUSA/CALIFORNIA/04/2009H1N1SEGMENT7MATRIXPROTEIN2M2ANDMATRIXPROTEIN1M1GENES，PARTIALCDS中的一个基因片段，具体序列为SEQIDNO。
19、1，如下0025ACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGC0026CCTAAATG0027根据该DNA模板设计以下3个探针0028探针15CCTCGCTCACTGGGCACGGT生物素3SEQIDNO20029探针25SHCATTTAGGGCATTTTGGA3SEQIDNO30030探针35生物素TCCAAAATGCCCTAAATG3SEQIDNO400312纳米金胶体金的制备0032在500ML的圆底烧瓶中加入100ML001的HAUCL4溶液，边搅拌边加热至沸腾；向上述溶液中加入2ML1枸橼酸钠，溶液20秒内变为蓝色，60秒后变为酒。
20、红色，继续煮沸说明书CN101942386ACN101942391A4/5页610分钟，停止加热继续搅拌15分钟；胶体金溶液4避光保存，纳米金通过520NM最大吸光度值鉴定。00333金标寡核苷酸探针的制备用100L去离子水溶解1ODDNA探针2，加入到5倍体积浓缩的胶体金溶液中，424小时；10的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NACL和1的SDS，分别至终浓度01M和001，4过夜，12000转/分钟离心30分钟，弃上清，沉淀用100UL含20MMNA3PO4，5BSA，025TWEEN，和10蔗糖重新悬浮，制成悬浮液。00344金标垫的制备0035将本发明制备的金标寡核苷酸探针涂于玻璃纤。
21、维上，37干燥2个小时，制成金标垫，备用。00365生物素标记探针与链霉亲和素的偶联及偶联物的固定0037链霉亲和素可以与生物素通过亲水键和范德华力相结合并形成稳定且难断裂的键，因此本发明采用生物素标记的DNA探针与链霉亲和素混合反应，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜上。0038例如，用10L去离子水溶解1OD生物素标记的DNA探针1，加入5L2MG/ML链和亲霉素，室温下反应1小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37干燥两个小时。0039DNA探针3采用同样方法固定于质控线上。00406样品垫的处理0041玻璃纤维浸泡025TRITONX100、005MTRISHCL、015M氯化。
22、钠中4个小时后，37烘干备用。00427核酸纳米金生物传感器的组装0043将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠15MM最好是2MM，经切割成宽4MM后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。0044实施例二本发明所述的核酸纳米金生物传感器的质量控制与检测效果0045采用实施例一所制成的核酸纳米金生物传感器，进行以下实验，验证其检测效果。0046将上述合成的模板DNA用PBS稀释一系列梯度10NMOL/L、5NMOL/L、1NMOL/L、05NMOL/L、01NMOL/L后，取100L滴于上述纳米金生物传感器。
23、的样品垫上，随着液体的向前移动，带动金标垫上的金标寡核苷酸探针向前移动，约10分钟即可判断结果。0047质量控制标准00481C线质控线出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。00492T线检测线出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。0050结果判定标准00511C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；00522C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；00533C线没有出现红色的线，说明纳米生物传感器失效。0054实验结果表明，当模板DNA浓度为10NMOL/L、5NMOL/L、1NMOL/L、05NMOL/L时在T线和C线均能能稳定出现清晰的红线见。
24、图2A，当浓度低于01NMOL/L时检测线上出现红线不稳定，当溶液中不含模板DNA时，只有C线显色T线不显色见图2B。因此，本发明所说明书CN101942386ACN101942391A5/5页7述方法所制备的核酸纳米金生物传感器的检测灵敏度约为05NMOL/L。0055序列表SEQUENCELISTING0056中国科学院广州生物医药与健康研究院0057核酸纳米金生物传感器及其制备方法0058005940060PATENTINVERSION34006110062580063DNA0064流感病毒006510066ACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATG58006720068200069DNA0070人工合成007120072CCTCGCTCACTGGGCACGGT20007330074180075DNA0076人工合成007730078CATTTAGGGCATTTTGGA18007940080180081DNA0082人工合成008340084TCCAAAATGCCCTAAATG18说明书CN101942386ACN101942391A1/1页8图1图2A图2B说明书附图CN101942386A。