人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒.pdf

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1、10申请公布号CN101942525A43申请公布日20110112CN101942525ACN101942525A21申请号201010171355922申请日20100506C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人广州市华南医学病毒学研究所地址510663广东省广州市高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化A1211房申请人广州呼吸疾病研究所72发明人周荣刘文宽高文娟苏晓波54发明名称人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒57摘要本发明提供了一种人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的一管多重荧光P。

2、CR检测方法，该方法采用了序列如SEQIDNO16所示的引物，还采用了序列如SEQIDNO79所示的探针。本发明还提供了一种人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述引物和探针。本发明采用INFA/INFB/AH1N1特异引物及TAQMAN探针，使用FAM/JOE/TAMRA多重荧光素标记，实现对人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的多重检测，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等优点，可作为多重检测试剂，用于科研及临床应用。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附。

3、图0页CN101942531A1/1页21人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法，包括样品核酸的制备和多重PCR扩增步骤，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中采用了序列如SEQIDNO16所示的引物。2根据权利要求1所述的多检方法，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中还采用了序列如SEQIDNO79所示的探针。3根据权利要求1所述的多检方法，其特征在于，所述多重PCR扩增步骤中还采用了如下荧光标记的探针IFATAMRATAMRACATCAGGCCCCCTCAAAGCCGBHQ2；IFBFAMFAMCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGABHQ1；AH1JOEJOETTCATG。

4、GCCCAATCATGACTCGAACABHQ1。4用于人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检的引物，其特征在于，所述引物序列选自与如SEQIDNO16序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。5用于人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检的探针，其特征在于，所述探针能与用权利要求4所述的引物扩增的核酸序列杂交的序列。6根据权利要求5所述的探针，其特征在于，所述探针选自与如SEQIDNO79序列中的至少一种相同、相似或互补的序列。7一种人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物。8根据权利要求7所述的多检试剂盒，其特征在于。

5、，所述试剂盒还包含如权利要求3所述的荧光标记探针。权利要求书CN101942525ACN101942531A1/6页3人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒技术领域0001本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体是人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒。背景技术0002人流感病毒是一种造成人类患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。0003人流感病毒以其核蛋白的抗原性分为A型、B型和C型流感病毒又称甲、乙和丙型流感病毒。在感染人类的三种流感病毒中，。

6、甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。所以造成大规模流行的一般都为前两种。0004流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或儿童及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等。从流行病学的角度来说，流感引起世界性大流行是流感病毒抗原变异与人群免疫屏障相互作用的结果。20世纪全球共出现四次流感大流行，都是由变异的甲型流感病毒引起，造成重大的人员和财产损失。2009年最先由墨西哥发现的新甲型H1N1流感病毒就含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段，在全球迅速传播开来，造成大规模的流行。目前全世界各国为防控新甲流H1N1，都在做积极的努力，同时取得了。

7、显著的效果。0005鉴于甲乙型流感病毒及目前甲型流感中的新甲型H1N1流感病毒对人类所造成的严重呼吸道疾病，特别是在儿童中，为诊治及防控需要，这就需要医疗机构提供准确快速灵敏的检测方法，快速诊断，快速治疗。就目前情况，对甲乙型及新甲型H1N1流感病毒的诊断主要以下几种方法1病毒的培养分离；2血清学检测特异IGG及IGM；3RTPCR方法及荧光定量PCR方法。相比较几种方法，前两种方法都是早期开发的经典方法，PCR方法是针对病原体核酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特别是荧光定量PCR方法的引进，解决了PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的发展，该方法具。

8、有高特异性、高灵敏度、周期短、操作简单、成本较低等多种优点。0006但目前开发的流感病毒分型试剂基本都为单重荧光定量PCR检测试剂，不能对这三种流感病毒进行同时检测；如要同时检测，则需要分别在三管中进行，其操作繁琐、费时耗力。发明内容0007为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测方法，以改进目前现有方法，从而使检测达到灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。0008本发明的人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测方说明书CN101942525ACN101942531A2/6页4法包括样品核酸的。

9、制备和多重PCR扩增步骤，其中，多重PCR扩增步骤中采用了序列如下所示的引物见序列表SEQIDNO160009IFAFGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC；0010IFARTCTTCAAGTCTCTGCGCGATT；0011IFBFCCCTGCTTGCTCGTAGTATGG；0012IFBRGCTTATGGGAAGCACCACTTTG；0013AH1FGGTTTGAGATATTCCCCAAGACA；0014AH1RGAGGACATGCTGCCGTTACA。0015其中，引物IFAF和IFAR用来检测人甲型流感病毒，我们称之为INFA组引物；引物IFBF和IFBR用来检测乙型流。

10、感病毒，本发明中称之为INFB组引物；引物AH1F和AH1R用来检测新甲型H1N1流感病毒，我们称之为AH1N1组引物。0016上述方法中，还采用了序列如下所示的探针见序列表SEQIDNO7100017IFAPCATCAGGCCCCCTCAAAGCCG；0018IFBPCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA；0019AH1PTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA。0020优选的，采用TAQMAN探针检测的荧光定量PCR的反应模式，上述探针的荧光标记具体如下0021IFATAMRATAMRACATCAGGCCCCCTCAAAGCCGBHQ2；0022IFBFAMFAMCGT。

11、TGTTAGGCCCTCTGTGGCGABHQ1；0023AH1JOEJOETTCATGGCCCAATCATGACTCGAACABHQ1。0024其中，IFATAMRA是用来检测甲型流感病毒的探针，IFBFAM是用来检测乙型流感病毒的探针，AH1JOE是用来检测新甲型H1N1流感病毒的探针。上述三种荧光标记的探针在本发明中被称之为FAM/JOE/TAMRA多重荧光素标记探针。0025本发明采用一管多重方式检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型H1N1流感病毒时，将上述INFA、INFB和AH1N1三组引物和三条TAQMAN探针混合在一个反应管中，使用PRIMESCRIPT一步法RTPCR试剂盒。

12、VER2TAKARAPRIMESCRIPTONESTEPRTPCRKITVER2的RTPCR缓冲液进行试剂配制，其中引物使用量为715PMOL，探针使用量为055PMOL。反应总体积为25L；配制试剂体积18L/反应预留2L用于添加酶混合物；预留5L用于模板，该方法的反应条件为5030分钟，942分钟，热循环为9410秒，5535秒，共40个循环。需要说明的是，本发明所说的一管多重方式包括在同一反应管内同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型H1N1流感病毒中的任意两种病毒或三种病毒。0026本发明的目的之二是提供了用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型H1N1流感病毒的引物和探针。引物。

13、序列选自与如下序列中的至少一种相同、相似或互补的序列见序列表SEQIDNO160027IFAFGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC；0028IFARTCTTCAAGTCTCTGCGCGATT；0029IFBFCCCTGCTTGCTCGTAGTATGG；0030IFBRGCTTATGGGAAGCACCACTTTG；说明书CN101942525ACN101942531A3/6页50031AH1FGGTTTGAGATATTCCCCAAGACA；0032AH1RGAGGACATGCTGCCGTTACA。0033本发明所提供的用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型H1N1流感病毒的。

14、探针是能与用上述引物扩增得到的核酸序列杂交的序列。0034优选的，所述探针选自与如序列SEQIDNO710中的至少一种相同、相似或互补的序列。所述相似序列是指与上述序列存在个别不同的碱基，比如15个碱基，只要不影响扩增效果；不同的碱基表现可以为在原有序列基础上插入、缺失、替换等方式。0035本发明还提供了一种人甲型流感，乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含序列如SEQIDNO16所示的引物。0036该试剂盒还包含如下的荧光标记探针0037RSVFAMFAMTATGAATGCCTATGGTGCAGGGCAAGBHQ；0038ADVTAMRATAMRAAAGA。

15、GGCCACTCTTGAGTGCCAGCGBHQ2；0039HMP1JOEJOEAGAGATGTAGGCACCACAACMGB；0040HMP2JOEJOETGGCCAATTGCCCCAATTTTGCBHQ1；0041HMP3JOEJOECTAGCCAACTGTCCCAACTTTGCABHQ1。0042与现有技术相比，本方法采用自身设计的INFA/INFB/AH1N1特异引物及TAQMAN探针，使用FAM/JOE/TAMRA多重荧光素标记，实现对INFA、INFB、AH1N1简称为MABH1的多重检测，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点，可作为人甲型流感，乙型流感及。

16、新甲型H1N1流感病毒检测的试剂，用于科研及临床应用。具体实施方式0043为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。0044实施例1引物、探针的特异性实验0045运用生物信息学和设计引物探针的生物软件对甲、乙型流感病毒及新甲型H1N1流感病毒序列资料，分别对甲、乙型流感病毒的保守区进行引物探针设计，对新甲型H1N1流感病毒的H1基因的保守区进行引物探针设计，其中探针分别采用TAMRA、FAM、JOE标记。详细序列见表1所示，表1为人甲型流感、乙型流感及新甲。

17、型H1N1流感病毒引物及探针序列。0046表10047说明书CN101942525ACN101942531A4/6页60048为验证所设计的引物和探针的特异性，首先设计单重荧光PCR反应，对引物和探针进行评估，即分别检测INFA、INFB和AH1N1三组引物及相应探针单独反应的特异性。实验采用培养分离的阳性株进行，阳性株来源于广州呼吸疾病研究所、呼吸疾病国家重点实验，分别选择流感A、流感B，另外用副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、OC43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP作为阴性对照。实验分别取100L培养物标本，通。

18、过常规RNA/DNA提取方法提取，得到50L核酸产物，使用DEPC水对核酸提取产物100倍稀释后作为模板其中H5N1不进行稀释，冠状病毒及偏肺病毒产物稀释10倍。使用PRIMESCRIPT一步法RTPCR试剂盒VER2TAKARAPRIMESCRIPTONESTEPRTPCRKITVER2中的RTPCR缓冲液进行试剂配制，其中引物使用量为715PMOL，探针使用量为055PMOL。反应总体积为25L；配制试剂体积18L/反应预留2L用于添加酶混合物；预留5L用于添加模板，在八排管中分别加入18L流感A、流感B、新甲流H1N1的单重反应液，最后放置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件如下5030分。

19、钟，942分钟，热循环为9410秒，5535秒，共40个循环，表2为单重INFA、INFB、AH1N1试剂检测80株阳性病毒株的情况，其中流感AH3N213株、普通H1N110株、新甲流H1N111株、H5N1灭活标本1株、H9亚型株1株、流感B20株，另外有副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、OC43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP各2株作为阴性对照。0049表20050单重试剂检测结果INFAINFBAH1N1阳性362011阴性446069总计8080800051实验结果中，阳性结果与预期完全符合，与其他常见呼。

20、吸道病原体副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、OC43、肺炎支原体MP、肺炎衣原体CP等无交叉反应，INFAINFB、AH1N1INFB之间亦无交叉反应，INFAAH1N1在普通流感A时无交叉反应，特异性高。说明书CN101942525ACN101942531A5/6页70052实施例2MABH1多重检测试剂的特异性实验0053多重检测试剂使用TAKARAPRIMESCRIPT一步法RTPCR试剂盒VER2TAKARAPRIMESCRIPTONESTEPRTPCRKITVER2的RTPCR缓冲液进行试剂配制，其中引物。

21、的使用量为715PMOL，探针的使用量为055PMOL。将表1中的INFA/INFB/AH1N1引物及各条探针配制为一管反应液MABH1。反应总体积为25L/反应，配制试剂体积18L/反应，预留2L用于添加酶混合物；预留5L用于添加模板。分别使用单阳性模板普通流感A；流感B或新甲流H1N1；双阳性模板普通流感A流感B；普通流感A新甲流H1N1；流感B新甲流H1N1；三阳性模板普通流感A流感B新甲流H1N1对多重检测试剂进行实验，同时使用单重荧光PCR试剂进行对比。实验结果见表3，表3是各种模板情况下多重MABH1流感病毒检测试剂与单重检测的对比。0054表300550056从表3的实验数据可看。

22、出，多重检测试剂的特异性与单重相比基本没有什么差异，同时从CT值的表现来看，多重MABH1流感病毒检测试剂与单重检测基本一致甚至优于单检试剂。0057实施例3MABH1多重检测试剂的灵敏性实验0058为进一步检验试剂的灵敏性，对人甲型流感选用H3N2型、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒阳性样品进行10倍梯度稀释，记为稀释度16，分别表示INFAH3N2、INFB、AH1N1病毒稀释10106倍，分别用多重流感病毒检测试剂与单重检测进行对比，同时进行病毒培养检测。定量PCR的实验结果见表4。病毒培养可鉴定的范围在稀释度4，稀释度5时用培养法检测为阴，灵敏度远低于单重或多重流感定量PCR检测。表4。

23、为多重及单重副流感定量PCR检测试剂对10倍梯度稀释的病毒的对比实验结果数据表。0059表40060说明书CN101942525ACN101942531A6/6页800610062从上面的实验结果，根据其稀释的倍数分别做标准曲线，可以看出标准曲线的线性相关系数R2都在099以上，线性较好，多重流感检测试剂和单重检测试剂检测灵敏度远高于病毒培养分离，适用于人甲型流感，乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的检测。同时多重副流感检测试剂可以替代单重检测，而不影响实验结果。0063实施例4MABH1多重检测试剂临床标本检测实验0064使用单重和多重流感定量PCR检测试剂对2009年7月10月427份咽拭子。

24、临床标本标本来源于广州医学院第一附属医院、广州呼吸疾病研究所、呼吸疾病国家重点实验室，同时进行病毒培养分离鉴定。结果见下表5。表5表示427份临床呼吸道咽拭子样品使用单重、多重和病毒培养分离检测的结果0065表500660067从上面的实验表明，本实验所研发的一管多重人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒检测试剂，灵敏度高于病毒培养鉴定亦可见实验例3，可以用于科研及临床工作，用一管反应检测人甲型流感，乙型流感及新甲型H1N1流感病毒，达到灵敏、快速、准确、节约的目的。0068最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了。

25、详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。说明书CN101942525ACN101942531A1/2页9序列表人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒9127人工序列IFAF1GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC27121人工序列IFAR2TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT21121人工序列IFBF3CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG21122人工序列IFBR4GCTTATGGGAAGCACCACTTTG22123人工序列AH1F5GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA23120人工序列AH1R6GAGGACATGCTGCCGTTACA20序列表CN101942525ACN101942531A2/2页10121人工序列IFAP7CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG21123人工序列IFBP8CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA23126人工序列AH1P9TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA26序列表CN101942525A。