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鉴别、 分离和利用来自成人胰腺的内分泌祖细胞的方法
    背景
     人类膜突结合蛋白 (prominin)1(PROM1) 基因编码带糖基化表位的基因产物，所 述糖基化表位被称为 CD133。 PROM1 基因产物是一个五跨膜 (pentaspan transmembrane) (5-TM) 糖蛋白，属于新的 5-TM 蛋白质分子家族。 该家族包括来自多个不同的物种、包 括人类、小鼠、大鼠、蝇和蠕虫的成员。 5-TM 结构包括细胞外 N- 末端、两个短细胞内 环、两个大细胞外环和细胞内 C- 末端。 PROM1 最初被证明表达在原始造血干细胞和祖 细胞以及成视网膜细胞瘤上，现已证明在成血管细胞和神经干细胞以及发育上皮的顶端 表面突起上也有 PROM1 表达。 人骨髓、脐带血和外周血的 CD133 阳性组分已被证明能 够在异种移植模型中有效地移植，并已被证明含有大多数粒细胞 / 巨噬细胞前体、 NOD/ SCID 种群恢复细胞和 CD34+ 树突状细胞前体。 表型上，血液和骨髓中的 CD133 阳性细 胞是 CD34 亮与 CD34 暗、 CD71 亮的 CD133 表达阴性细胞。 至今尚未发现 CD133 分子 的天然配体，其在造血组织中的功能也未知。 发明概述在一个实施方案中，提供了鉴别细胞样本或组织样本中人类胰腺内分泌祖细胞 的方法，其包括 ：将细胞样本或组织样本暴露于能标记表达膜突结合蛋白 1 基因产物糖 基化形式的细胞的至少一种可检测试剂，从而鉴别出胰腺内分泌祖细胞。 在另一实施方 案中，提供了鉴别细胞样本或组织样本中人类胰腺内分泌祖细胞的方法，其包括 ：将细 胞样本或组织样本暴露于至少一种可检测试剂，后者标记表达膜突结合蛋白 1 基因产物 糖基化表位 ( 被称为 CD133) 的细胞，从而鉴别出胰腺内分泌祖细胞。 在另一实施方案 中，所述至少一种检测标记是 ：与膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式结合且带检测标 记的第一结合配偶体 (binding partner) ；或与膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式结合的 未标记第一结合配偶体和与未标记第一结合配偶体结合且带检测标记的第二结合配偶体 的组合。 所述结合配偶体可以是 ( 作为非限制性实例 ) 抗体或凝集素 (lectin)。 在另一实 施方案中，所述至少一种可检测试剂是 ：与膜突结合蛋白 -1 基因糖基化表位 CD133/1 或 CD133/2 结合且带检测标记的第一抗体 ；或与膜突结合蛋白 -1 基因糖基化表位 CD133/1 或 CD133/2 结合的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合且带检测标记的第二抗体的 组合。 在另一实施方案中，第一抗体结合膜突结合蛋白 -1 基因产物的至少一种其它糖基 化表位。 在另一实施方案中，所述检测标记是荧光团。 在另一实施方案中，所述带检测 标记的第一抗体是藻红蛋白缀合抗 CD133/1 抗体或藻红蛋白缀合抗 CD133/2 抗体。 在另 一实施方案中，还检测至少一种其它标记。 在另一实施方案中，所述细胞样本是胰岛制 备物。 在另一实施方案中，所述细胞样本是人类胰腺组织。
     在又一实施方案中，提供了从细胞群中分离或富集人类胰腺内分泌皮祖细胞的 方法，其包括下列步骤 ：鉴别其中表达糖基化形式膜突结合蛋白 1 基因产物的细胞，然 后将这种细胞与所述细胞群分开，从而分离胰腺内分泌祖细胞或富集其群体。 在又一实 施方案中，提供了从细胞群中分离或富集人类胰腺内分泌皮祖细胞的方法，其包括下列
     步骤 ：鉴别其中表达 CD133 的细胞，然后将 CD133 表达细胞与所述细胞群分开，从而 分离胰腺内分泌祖细胞或富集其群体。 上面描述了鉴别表达糖基化膜突结合蛋白 1 基因 产物的细胞或 CD133 表达细胞的非限定性实施方案。 在一个实施方案中，所述分离通过 荧光激活细胞分选、利用抗体 ( 非限制性范例 )，包括如上所述的带检测标记的抗体来进 行。 在另一实施方案中，所述鉴别和分离通过利用结合了 CD133 结合部分的基质，从而 在基质上结合混合群体中的 CD133 表达细胞来进行。 所述 CD133 结合部分包括如上所述 的抗体、凝集素或任一其它 CD133 结合配偶体。 在一个这种实施方案中，磁珠结合表达 CD133 的细胞，分离结合了 CD133 表达细胞的磁珠，然后释放其上结合的 CD133 表达细 胞，从而分离出 CD133 表达细胞。 在另一实施方案中，还使用至少一种额外标记来进行 分离或富集。 在一个实施方案中，所述细胞群从胰岛制备物获得，所述制备物包括胰岛 和外分泌组织的混合物。 在另一实施方案中，所述细胞群从人类胰腺组织获得。 在另一 实施方案中，所分离或富集的人类胰腺内分泌祖细胞然后在体外被进一步扩增或培养。
     在另一实施方案中，如本文所述从胰岛中分离出的表达糖基化形式膜突结合蛋 白 1 基因产物的细胞用于细胞疗法 (cell basedtherapy)。 在另一实施方案中，将如本文所 述从胰岛中分离出的 CD133 表达细胞用于细胞疗法。 在另一实施方案中，将 CD133 表达 细胞用于离体 (ex vivo) 疗法。 在另一实施方案中，将 CD133 表达细胞用于制备移植用 组织。 在另一实施方案中，所述分离细胞在上述示例性而非限制性的体外或离体应用之 前经过体外培养或扩增。
     在进一步的实施方案中，提供了对于需要胰腺内分泌细胞替代疗法患者的治疗 方法，所述患者例如患胰岛素依赖型糖尿病患者或胰腺切除后的患者，所述方法包括 ： 从细胞群中分离表达糖基化形式膜突结合蛋白 1 基因产物的细胞，然后将所分离的胰腺 内分泌祖细胞施用于患者。 在另一实施方案中，在施用前，细胞经过体外培养或扩增。 在另一实施方案中，所述细胞群来自一个或多个个体的胰腺组织。 在进一步实施方案 中，所述细胞群得自在手术期间获得的得自同一患者的被切除的胰腺组织。
     在另一实施方案中，提供了从细胞样本中分离或富集胰腺内分泌祖细胞的系 统，该系统包括 ：用于检测其中表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞的方 法，和将表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞与细胞样本中其他细胞进行分 离的方法。 在进一步实施方案中，用于检测细胞的方法包括如上所述用于标记表达膜突 结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞的可检测试剂。 在另一实施方案中，提供了用于 分离所述表达细胞的方法，例如，通过如上所述荧光激活细胞分选或磁珠分选。
     在另一实施方案中，提供了分离的胰腺内分泌祖细胞，所述祖细胞通过包括以 下程序制备 ：获得包含胰腺细胞的细胞群，鉴别其中表达糖基化形式膜突结合蛋白 1 基 因产物的细胞，然后将所述细胞从细胞群中分离出来 ；由此提供分离的胰腺内分泌祖细 胞。 在另一实施方案中，所述分离的胰腺内分泌祖细胞随后在体外培养或扩增。 附图简述
     图 1 描述了在两个独立胰岛分离物的三个密度组分中，随着时间的推移 CD133+ 细胞百分比和总数的变化。 X 轴表示培养天数。 CD133+ 细胞的平均百分比 ( 黑色阴影 ) 和 CD133+ 细胞的平均总数 ( 无阴影 ) 以第 2 天平均基线水平的百分比在 Y 轴显示。 通过学生 t 检验确定显著性， ***， P ＜ 0.001， **， P ＜ 0.01。 每一组分对 CD133+ 细胞总 数变化的相对贡献在插图中指明。 组分 I( 胰岛纯度高，深灰色 )、组分 II( 中等灰色 ) 和 组分 III( 胰岛纯度低，浅灰色 )。 插图轴与大图的相同 ；图 2A-E 显示培养基组成和培养 温度对 CD133 表达的影响。 Y 轴，侧向散射，培养基组成和培养天数，X 轴，CD133 密 度和培养温度。 在每一通道的门内显示 CD133。 A，在 CMRL 1066 培养基 (CMRL) 中 第 3 天 ；B-C，CMRL 培养基，分别在 37℃和 25℃；D-E，Miami 培养基 1A(MM1A)， 分别在 37℃和 25℃ ；图 3A-D 描述随着培养时间和 DAPT 变化的 CD133+ 细胞百分比变 化。 A. 在 MM1A 和 CMRL 培养基中生长的两个独立胰岛制备物的结果，所述结果结合 在一起并于 Y 轴以基线的百分比来表示，其中基线为第 3 天的平均 CD133 百分比， X 轴 显示培养天数 (D3， D7) 和 DAPT 浓度，0 是仅 DMSO 载体。 通过学生 t 检验确定显著 性， **， P ＜ 0.01， **， P ＜ 0.05， *。 B-C， Y 轴表示标准化的 mRNA 水平，以基线的 百分比表示，其中基线为第 3 天的平均水平。 X 轴标明随培养 (D3， D7) 和 DAPT 浓 度变化的成人胰腺中的水平 (P)。 通过学生 t 检验确定显著性， ***， P ＜ 0.001， **， P ＜ 0.01。 Y 轴表示培养 4 天的组织 (D4) 中和 CD133 富集群体 (D4 CD133+) 中的 ：B， PTF1( 黑色阴影 ) 和 PDX1( 灰色阴影 ) ；C，NGN3 ；D，标准化 mRNA 水平，PTF1( 黑 色阴影 )、PDX1( 无阴影 )、NGN3( 灰色阴影 ) ；图 4 显示随时间和 N-[N-(3，5- 二氟苯 乙酰 -L- 丙氨酰基 )]-S- 苯甘氨酸叔丁基酯 (DAPT) 变化的细胞角蛋白 19(CK19) 和淀粉 酶 (AMY) 蛋白的表达。 Y 轴指示 CK19+( 黑色阴影 ) 和 AMY+( 灰色阴影 ) 的百分比。 在 MM1A 和 CMRL 培养基中生长的两个独立胰岛制备物的结果结合在一起。 X 轴指示 培养天数 (D3， D7) 和 DAPT 浓度，0 是仅 DMSO 载体。 通过学生 t 检验确定显著性， *** ，P ＜ 0.001，*，P ＜ 0.05，和图 5 显示随培养时间以及 DAPT 和 7- 氨基 -4- 氯 -3- 甲 氧基异香豆素 (JKL6) 变化的 CD133+ 细胞的百分比。 Y 轴指示 CD133 百分比。 X 轴指 示培养天数 (D3， D7) 以及 DAPT 和 JKL6 浓度，0 是仅 DMSO 载体。 实施方案详述
     人膜突结合蛋白 1(PROM1) 基因产物是五跨膜 (5-TM) 糖蛋白分子家族的成 员，在成人和胎儿组织有广泛表达。 CD133 是 PROM1 的糖基化表位 ；抗 CD133 抗体并 不识别大多数的组织或分化的细胞类型中的 PROM1。 然而，抗 CD133 抗体却识别人胎神 经、肾脏、肌肉、皮肤和造血干细胞中的 PROM1，并且 CD133 是祖细胞群的标记。 为 寻找潜在的能够分化成胰腺内分泌组织的祖细胞，特别是能分化成胰岛素生产细胞的祖 细胞，用于治疗胰岛素依赖型 (1 型，或青少年型 ) 糖尿病和其他胰腺疾病 ( 包括胰腺切 除术诱发性糖尿病 )，本发明人在成人胰腺和包含胰岛和外分泌组织的富集胰岛制备物中 发现了 CD133 表达细胞。
     在同种异体移植前，胰岛制备物往往要维持培养数小时至数天。 在一个实施方 案中，在每一制备物都有丰富的 CD133+ 细胞，在培养 48 小时或少于 48 小时后，含量从 约 3％至超过 30％，在培养 4 天后，含量超过 50％。
     因此，在一个实施方案中，在胰腺细胞混合群上 CD133 的表达可以作为从群体 中鉴别、定量、定位、分离或富集这些细胞的手段，后者为胰岛素依赖型糖尿病或其他 胰腺疾病的细胞疗法提供充足的材料。 在另一实施方案中，在胰腺细胞混合群上膜突结合蛋白 1 基因产物糖基化形式的表达可以作为从群体中鉴别、定量、定位、分离或富集 这些细胞的手段，后者为胰岛素依赖型糖尿病或其他胰腺疾病的细胞疗法提供充足的材 料。 在另一实施方案中，混合胰腺细胞群包含胰岛和外分泌组织。 在另一实施方案中， 所述细胞存在于胰腺外分泌组织中。
     如上所提及， CD133 包含膜突结合蛋白 1 基因产物糖基化形式的表位，本文 所述方法包括了所述膜突结合蛋白 1 基因产物糖基化形式和所述表位的所有类型和变异 体以作为祖细胞标记，所述类型和变体如等位基因变异体、剪接变异体、来自其它物种 的相应基因或蛋白、差异糖基化形式、突变或改变形式，例如，来自一个物种的变异氨 基酸残基在另一物种的多肽中被取代，以对应于类似基因或蛋白，就象是来自另一个物 种。 剪接变异体的非限定性例子在 Fargeas 等，J Cell Sci.2004 1 17 ：4301-11 中有描述。 祖细胞特征性的膜突结合蛋白 1 基因产物的替代糖基化模式也包括在本文内，其中，提 供了八个 N- 糖基化位点的变异体，如在 Fargeas 等，FutureLipidology 2006，1 ：213-225 中的讨论。 变异体是指包括保留亲代蛋白相同基本特征的修饰。 在一个实施方案中，与 膜突结合蛋白 1 基因产物具有大于 80％左右、优选至少 90％、特别优选至少 95％的同源 性的蛋白质被认为是变异体。 变异体可以包括在蛋白质序列中缺失、修饰或添加单个氨 基酸或氨基酸群。 因此，在一个实施方案中，在人胰腺细胞群体中细胞上表达的 CD133 的可检测 性，作为群体中胰腺内分泌祖细胞存在和 / 或定位的标记。 在另一实施方案中，在胰 腺内分泌祖细胞上 CD133 的存在提供了分离或富集这种细胞的手段，以供在其上进行研 究，包括提供细胞疗法。 在一个实施方案中，细胞疗法是治疗胰岛素依赖型糖尿病。 在 另一实施方案中，细胞疗法是治疗由于切除了胰腺 ( 例如治疗胰腺炎 ) 而成为胰岛素依赖 的患者。 检测方法可以是定性或定量的，并提供这些细胞在特定细胞群或组织中的具体 定位，或这类 CD133 表达细胞的相对或绝对数量。
     鉴定 CD133 表达细胞的方法可以基于任何数目的本领域已知的方法。 在各种用 于检测表达特定标记之细胞的方法中，有些方法中的细胞在检测后仍保持活力，则所述 方法通常用于进一步的体外研究或移植或植入到患者体内，而其它方法使经鉴别过的细 胞不大适于以其活状态的进一步应用，例如，对病理样本研究或在基于细胞的研究或体 内研究终止时的研究。 本文的方法并非那么限定性的，保持活细胞活力的应用以及保存 细胞的应用全都包括在本文中。
     鉴别 CD133 表达细胞的方法可以基于 ( 作为非限制性实例 ) 对细胞表面 CD133 表位的定位或定量，或对胞浆或其中亚细胞区室内 CD133 表位的定位或定量。 下面提供 了上述定位或检测的示例性方法，是非限制性的。
     在一个实施方案中，检测方法基于检测结合配偶体与表达糖基化形式膜突结合 蛋白 1 基因产物之细胞的结合。 结合配偶体可以带检测标记，或可以是未标记的，但可 进一步通过与其结合且具检测标记的另一结合配偶体而被检测。 结合配偶体如抗体、包 括带标记的第一抗体和带标记的凝集素的这种应用在本领域是已知的。 此外，未标记的 第一抗体和带标记的第二抗体的组合系统在本领域也是众所周知的。 这种双系统也可以 包括两种抗体、凝集素、抗生物素蛋白 - 生物素系统、抗标记抗体，和包括放大系统， 以增强检测信号。 如下面将叙述的，这类检测系统不仅在鉴别基因产物表达方面，而且
     在利用与基质如树脂或珠的选择性结合来分离表达这种基因产物的细胞方面，都是有用 的。 关于检测糖基化形式膜突结合蛋白 1 基因产物表达的方法，本发明并非如此限制性 的，其包括所有该类方法。
     基于抗体的检测法属于那些常用但不总是使用的方法，其用来识别细胞的蛋白 表达或表位表达，而不考虑在检测期间或之后细胞是否需要活力。 所述抗体可以是单 克隆抗体或多克隆抗体。 可以遵循文献中的现成指南来制备这类特异性结合 CD133 或 细胞表面膜突结合蛋白 1 基因产物其它表位的抗体，并可用于在活细胞上检测细胞表面 CD133，或在细胞或组织切片样本中检测表面 CD133。
     在一个实施方案中，术语 “抗体” 包括全抗体 ( 例如，二价 IgG，五价 IgM)， 或在其它实施方案中包括包含抗原结合位点的抗体片段。 在一个实施方案中，所述片段 包括 Fab、F(ab′ )2、Fv 和单链 Fv(scFv) 片段。 在一个实施方案中，所述片段可包括或 不包括抗体恒定区。 在另一实施方案中，F(ab)′片段缺乏补体结合所需的恒定区。 scFv 由通过柔性接头连接的抗体轻链可变区 (VL) 与重链可变区 (VH) 组成。 scFv 能够结合抗 原，并在细菌中快速产生。 本发明包括在细菌和哺乳动物细胞培养物中产生的抗体和抗 体片段。 从噬菌体文库获得的抗体可以是全抗体或抗体片段。 在一个实施方案中，在该 文库中存在的功能区是重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL)，它们一起构成 Fv 或 scFv， 在另一实施方案中，加入重链恒定功能区 (CH1) 和轻链恒定区 (VL)。该四个区 ( 即 VH-CH1 和 VL-CL) 构成了 Fab。 在一个实施方案中，一旦所需 VH-VL 组合已被鉴定，就可通过取 代缺失的恒定区从该文库中获得全抗体。
     此处所述的抗体在一个实施方案中可以是单克隆抗体 (Mab)，或者在另一实施 方案中可以是多克隆抗体。 可用于本文所述方法中的抗体可以来自任何来源，而且可以 是嵌合的。 在一个实施方案中，抗体的来源可以是鸡、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、马， 或在其它实施方案中来源于人。 第二抗体通常是结合另一抗体的抗体，通常用与第一抗 体的来源物种不同的物种来制备，因此，例如第二抗体可以是大鼠抗小鼠抗体，或山羊 抗大鼠抗体，或反之亦然，如小鼠抗大鼠抗体。 在某些情况下，第二抗体可以针对缀合 于第一抗体上的成分，如荧光部分。 在其它实施方案中，可以使用其它结合配偶体，如 抗生物素蛋白和生物素。 在一些实施方案中，在检测中使用可检测的第一抗体。 在其它 实施方案中，特别是需要放大指示 CD133 存在的可检测信号时，可以使用第二抗体或甚 至进一步的放大技术，以增强对第一抗体结合程度的可检测性。 这类放大系统在本领域 是众所周知的。
     此处所述检测试剂可以是被选定或设计用于特异性结合 CD133 聚糖结构的凝集 素或凝集素组合。 这些凝集素可在溶液中、具检测标记或通过第二检测抗体检测或回 收，或优选地附着在可用于回收细胞的固体基质如磁珠或其它表面。
     对抗体与细胞结合的检测通常需要检测标记，该标记或者直接结合到 CD133 结 合抗体 ( 第一抗体 ) 本身，或者检测标记可以存在于与第一抗体结合的第二抗体上。 此 处包括各种检测标记，其选择是非限制性的。 诸如荧光部分、放射性元素及化合物和蛋 白质或其它具酶活性的实体之类的标记已经在本领域中使用，而且是众所周知的，适用 于不同的检测方法。 在一个实施方案中，在有用的荧光标记中有藻红蛋白。 在另一实施 方案中，放射性标记包括 125I。如上所述，术语 “检测标记” 或 “带检测标记的” 在一个实施方案中是指可通 过光谱法、光化学、生化、免疫组织化学、电磁、放射、或化学工具 ( 如荧光、化学荧 光或化学发光 ) 或任何其它适当方法检测的组合物或部分。 在另一实施方案中，作为非 限制性范例，检测标记是荧光染料分子或荧光团，如荧光素、藻红蛋白、 CY3、 CY5、 别藻蓝蛋白、 Texas Red、 peridenin chlorophyll、花菁、 FAM、 JOE、 TAMRA、 TET 和 VIC。
     例如，Miltenyi Biotec(Auburn，California) 销售用于鉴别和分离 CD133 表达细胞 的基于抗体的试剂 ；抗体包括克隆 AC133( 小鼠 IgG1)、293C3( 小鼠 IgG2b) 和 AC141( 小 鼠 IgG1)。 这些抗体分别识别 CD133 分子上两种不同的抗原表位 CD133/1( 克隆 AC133) 和 CD133/2( 克隆 293C3 和克隆 AC141)。 在供替换的实施方案中，抗体可以针对膜突结 合蛋白 1 基因产物的其它糖基化抗原表位。
     因此，在一个实施方案中，与 CD133/1 或 CD133/2 结合的已标记第一抗体，或 与 CD133/1 或 CD133/2 结合的未标记第一抗体和结合未标记第一抗体的已标记第二抗体 的组合，可被用于识别 CD133 表达细胞。 在另一实施方案中，使用抗 CD133/1 的藻红 蛋白缀合 (conjugated) 抗体和抗 CD133/2 的藻红蛋白缀合抗体。 利用荧光标记，如藻红 蛋白 (PE)，可以用荧光显微镜鉴别 CD133 表达细胞。 在其它实施方案中，生物素标记 的第一抗体和与生物素缀合的检测试剂 ( 如荧光或酶缀合的链霉抗生物素蛋白或其它抗 生物素蛋白衍生物 ) 可用于光镜下的荧光定位、免疫组织化学定位或检测。 从下文可以 看出，使用藻红蛋白的优势是 ：它既可被检测 ( 荧光 )，又可产生针对其的抗体，抗藻红 蛋白抗体可用作亲和试剂来分离藻红蛋白结合的细胞，例如，采用上述的藻红蛋白缀合 CD133 抗体。 抗藻红蛋白抗体与抗 CD133 的第一抗体可以来自同一物种或不同物种。
     在又一实施方案中，可以采用免疫组织化学技术进行细胞样品或组织样品中 CD133 表达细胞的定位，其中例如用鉴别 CD133 表位的试剂对整个细胞或组织薄切片进 行染色，该试剂是如上所述的抗体，或者被直接标记或者通过带标记的第二抗体，所述 带标记的第二抗体例如通过酶促反应，在 CD133 位点产生可视产物。 这类免疫组织化学 定位方法在本领域是众所周知的，可以很容易地应用于 CD133。
     本文所述方法中胰腺细胞的来源包括胰岛制备物，即从人胰岛或其它物种胰腺 分离出的细胞，或从人胰腺组织制备的细胞。 本文包括成人以及胎儿来源的组织。 包含 胰岛和外分泌组织的胰岛细胞制备物可从若干学术的和 / 或临床的胰岛分离纯化服务机 构的任一处获得。 对于为例如治疗胰腺炎而经历胰腺切除的患者，患者自身的被切除的 胰腺组织可以提供细胞来源，用本文实施方案中的方法从中分离胰腺内分泌祖细胞，然 后施用于同一患者或需治疗例如糖尿病的另一个患者。 同样，可对一位胰腺切除患者施 用来自单一不相关个体或一群个体的自体胰腺内分泌祖细胞。
     在一个实施方案中，其中的胰腺内分泌祖细胞是来自成人胰腺中表达 CD133 的 细胞。 在另一实施方案中，其中的内分泌祖细胞是来自成人胰腺中表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞。 在另一实施方案中，其中的内分泌祖细胞是来自成人胰腺 外分泌组织中表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞。 在另一实施方案中，其 中的内分泌祖细胞是成人胰腺外分泌组织中发现的表达 CD133 的细胞。
     上述鉴别 CD133 表达细胞的示例性方法，特别是不会影响细胞活力的方法，容易适用于从混合细胞群体中分离表达 CD133 的方法。 因此，在另一实施方案中，利用各 种检测细胞表面 CD133 表达的方法，从混合细胞群体中分离或富集 CD133 表达细胞。 作 为非限定性实例，可使用荧光激活细胞分选技术。 上述可用于在胰腺组织中鉴别 CD133 表达细胞的各种试剂，也可用作用于从混合细胞群体中分离所述细胞、例如通过结合于 固体基体或使用磁珠技术分离所述细胞的试剂。 CD133 抗体仅仅是利用 CD133 结合配偶 体分离或分开 CD133 表达细胞的一个实例。
     因此，在一个实施方案中，荧光激活细胞分选 (FACS) 技术可被用于分离 CD133 表达细胞，所述分离或者使用结合荧光部分的 CD133 第一抗体，或者使用未标记或非荧 光标记的 CD133 第一抗体和与第一抗体结合的结合荧光部分或荧光试剂的第二抗体，或 使用识别 CD133 聚糖的凝集素。 也可使用其它结合对如生物素和抗生物素蛋白来对所需 细胞进行同样的标记。 FACS 方法学在本领域是众所周知的。
     在另一实施方案中，利用缀合了 CD133 抗体的基质或表面，使得 CD133 表达细 胞结合到该基质或表面，而非附着细胞被洗掉，再从基质或表面洗脱 CD133 表达细胞， 可以直接从混合群体中分离出 CD133 表达细胞。 在一个实施方案中，可将基质如珠状琼 脂糖或葡聚糖与 CD133 抗体缀合 (conjugate)。 通过使混合群体中的 CD133 表达细胞与 基质混合或通过有基质的层析柱，使细胞暴露于基质， CD133 表达细胞附着在基质上， 然后冲洗基质，用高盐或低 pH 洗脱缓冲液，或者用干扰抗体 - 表位相互作用的方法，或 者能够切断珠与所需细胞类型间连接的方法，将所述细胞从中洗脱出来。 这些方法和所 用试剂在本领域是众所周知的。 在另一实施方案中，使用缀合了 CD133 抗体的磁珠来结 合 CD133 表达细胞，然后基于其磁特性将这些磁珠分开，冲洗，并将 CD133 表达细胞从 中洗脱下来。 这些磁珠可以从 Miltenyi Biote 购买，其使用方法在生产商指南中有描述。 在又一实施方案中，附着了凝集素的琼脂糖或葡聚糖珠被用于结合 CD133 表达细胞。 通 过使混合群体中的 CD133 表达细胞与基质混合或通过有基质的层析柱而使细胞暴露于基 质， CD133 表达细胞附着在基质上，然后冲洗基质，用干扰 CD133- 凝集素相互作用的 非缀合聚糖，或者能够切断珠子与所需细胞类型间连接的方法，将所述细胞从中洗脱出 来。 这些方法和其中试剂在本领域是众所周知的。
     在其它实施方案中，可以利用缀合到基质或磁珠的第二抗体将基质或磁珠分 开，所述第二抗体针对结合 CD133 的第一抗体。 例如，在一个实施方案中，在应用用藻 红蛋白标记的能结合 CD133/1 或 CD133/2 的第一抗体后，可以用缀合了能结合藻红蛋白 的抗体的磁珠或基质来结合 CD133 表达细胞，然后，洗涤所述磁珠，并释放 CD133 表达 细胞。 例如，Miltenyi Biotec 销售缀合了抗藻红蛋白抗体的磁珠 ( 抗 -PE 微珠 )。 或者， 可使用抗第一抗体分子的第二抗体。 这些方法仅仅说明亲和程序，其变化在本领域是众 所周知的，并全部包括在本文中。
     在从细胞群体中分离或富集 CD133 表达细胞的方法的实施方案中，所述细胞群 体可以从胰岛制备物或人胰腺组织中获得。 如上所述，胰岛细胞制备物可从若干学术的 和 / 或临床的胰岛分离纯化服务机构的任一处获得。 此中包括成人组织以及胎儿组织。
     在本文叙述的任一实施方案中，所分离或富集的 CD133 表达细胞，在用于本文 所述的任一各种用途之前，可以在体外培养或扩增 ；其中作为非限定性实例，以便扩大 或增加细胞群体，或增加细胞群体上的 CD133 表达。 例如，依据本文的教导富集或分离的细胞，可以在下列培养基中培养 ：Miami Medium 1A，或 HuES 培养基 [KO-DMEM， 1× 青霉素 / 链霉素，1×glutamax，1×NEAA，10 ％ KO 血清替代物，0.1×2- 巯基乙 醇，1×N2 添加物 (Invitrogen)，10 ％ Plasmanate(Bayer)，成纤维细胞生长因子 2(20ng/ ml)，白血病抑制因子 (10ng/ml)，表皮生长因子 (20ng/ml)]，或 PS 培养基 [DMEM/ F12，1× 青霉素 / 链霉素，1×glutamax，1×N2 添加物 (Invitrogen)，成纤维细胞生长因 子 2(20ng/ml)，白血病抑制因子 (10ng/ml)，表皮生长因子 (20ng/ml)]，所述培养基已 经通过与人类胚状体来源的细胞系 SDEC 过夜培养而对其进行了调节 (Shamblott 等，Proc Natl Acad Sci USA.2001 ；98 ：113-8)。 在另一实施方案中，这些细胞的扩增通过在培养 液中加入血小板衍生生长因子 -BB(PDGF-BB) 而达到。 因此，在一个实施方案中，通过 如本文所述分离或富集 CD133 表达细胞，然后在培养中扩增所富集或分离的细胞，提供 胰腺内分泌祖细胞扩增群体。 上述培养基和条件的例子仅为范例，是非限制性的。
     在本发明的又一实施方案中，提供了治疗胰岛素依赖性糖尿病患者的方法，其 中，依据上述实施方案 ( 作为非限制性实例 ) 从细胞群体中分离 CD133 表达细胞，然后 将所分离的胰腺内分泌祖细胞施用至患者。 在一个实施方案中，在使用前，先培养或扩 增所述细胞，例如通过上述方法之一培养或扩增。 1 型糖尿病患者，也被称为青少年糖尿 病或胰岛素依赖性糖尿病 (IDDM) 患者，由于自身免疫或其它原因，胰岛中的胰岛素产 生细胞损耗，不再产生足量水平胰岛素。 通过根据饮食和血糖水平的其他波动定时施用 外源性胰岛素来恢复这类患者的血糖控制，防止急性高血糖危象和避免大血管和微血管 并发症的发生，但胰腺移植可恢复正常血糖量，且不需要注射胰岛素和经常监测血糖水 平。 不幸的是，没有足够的胰腺可供移植。 本文实施方案为胰岛素依赖型糖尿病的细胞 疗法提供了充足材料。
     例如，依据本文实施方案分离或富集的 CD133 表达细胞可被直接注射入患者的 肝管或相关血管系统。 在另一实施方案中，注射前，细胞可经过体外培养和扩增。 同 样，通过直接植入或注射入血管系统，可将细胞运送到胰腺。 细胞移植到肝脏或胰腺实 质中，分别执行正常情况下与胰腺细胞相关的功能。 此外，在植入或移植前，按本文所 述获得的细胞可经过基因操作以减少或消除负责移植排斥的细胞表面分子，以产生通用 的供体细胞。 例如，可以通过定向缺失或破坏 β- 微球蛋白基因，使小鼠 I 类组织相容性 (MHC) 的基因失去功能 ( 参见例如 Zijlstra，Nature 342 ：435-438，1989)。 这使鼠胰岛 同种异体移植物可以无限期存活 ( 参见例如 Markmann，Transplantation 54 ：1085-1089， 1992)。 使 II 类 MHC 基因缺失 ( 参见例如 Cosgrove， Cell 66 ：1051-1066，1991) 可进 一步改善移植成效。 TAP1 分子和 Ii 分子分别引导 MHC I 类分子和 II 类分子的胞内转运 ( 参见例如 Toume， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 ：1464-1469，1996) ；移除这两种转运蛋 白分子或其它 MHC 胞内转运系统也可提供减少或消除移植排斥的方法。 这种技术可应用 于人类细胞和相应的 HLA 抗原。 在另一实施方案中，从其 HLA 与受治疗者匹配的胰腺 获得细胞群体。
     在又一实施方案中，提供治疗慢性胰腺炎患者的方法，其中使用按照 ( 作为非 限制性实例 ) 上述实施方案从细胞群体分离的 CD133 表达细胞，然后将所分离的胰腺内 分泌祖细胞施用给患者。 在一个实施方案中，细胞在使用前经过体外培养或扩增。 慢 性胰腺炎患者需要去除其胰腺以减轻疼痛。 胰腺切除导致胰岛素依赖型糖尿病，除非将胰岛从切除组织中纯化出来并移植回患者体内。 由于胰腺炎，被切除的胰腺通常不含足 够的胰岛来使患者在移植后恢复正常血糖量，导致这类患者的血糖控制恢复需要通过根 据饮食和血糖水平的其他波动定时施用外源性胰岛素，以防止急性高血糖危象和避免大 血管和微血管并发症的发生。 例如，依据本文实施方案分离或富集的 CD133 表达细胞可 被直接注射入患者的肝管或相关血管系统。 在另一实施方案中，注射前，细胞可经过体 外培养和扩增。 细胞移植入肝脏或胰腺实质，分别执行正常情况下与胰腺细胞相关的功 能。 在慢性胰腺炎的情况下， CD133 表达细胞可以是自体的，因此移植前不需要额外的 修饰以与 HLA 匹配。 在其它实施方案中，移植物是同种异体的。
     在另一实施方案中，提供了从细胞样本中分离或富集胰腺内分泌祖细胞的系 统，其包括 ：a. 用于检测其中表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞的方法， 和 b. 用于将其中表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞与细胞样本中其它细胞 分离的方法。
     用于检测表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式的细胞的方法，可以按上述 任一方法来实施，如使用标记表达膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式之细胞的可检测 试剂。 这类试剂可以包括 ：与膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式结合的带标记的第一 抗体 ；或与膜突结合蛋白 -1 基因产物糖基化形式结合的未标记第一抗体和与未标记第一 抗体结合的带标记的第二抗体的组合。 一般来说，标记是荧光团。 一种可检测试剂可以 是 ：与 CD133/1 或 CD133/2 表位结合的带标记的第一抗体，或与 CD133/1 或 CD133/2 结合的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合的带标记的第二抗体的组合。 用于分离的方法可通过荧光激活细胞分选进行，或通过应用可结合 CD133 表达 细胞的磁珠，分离结合了 CD133 表达细胞的磁珠，然后释放结合在上面的 CD133 表达细 胞，从而分离出 CD133 表达细胞。 上文描述了用于实施所述方法的示例性方法和试剂， 是非限制性的。
     在另一实施方案中，描述了分离的胰腺内分泌祖细胞，所述细胞通过下述程序 制备 ：获得包含胰腺细胞的细胞群体，检测其中的 CD133 表达细胞，然后从该细胞群体 中分离所述检测到的 CD133 表达细胞 ；从而提供分离的胰腺内分泌祖细胞。 上文描述了 所述方法的示例性实施方案。 在一个实施方案中，检测包括将该细胞群体暴露于可标记 CD133 表达细胞的至少一种可检测试剂。 在另一实施方案中，所述至少一种可检测试剂 是 ：与 CD133/1 或 CD133/2 结合且带标记的第一抗体，或与 CD133/1 或 CD133/2 结合 的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合且带标记的第二抗体的组合。 在又一实施方 案中，通过荧光激活细胞分选或使用能结合 CD133 表达细胞的磁珠来进行分离。 在另一 实施方案中，带标记的第一抗体是藻红蛋白标记的抗 CD133/1 抗体、或藻红蛋白标记的 抗 CD133/2 抗体，和用抗藻红蛋白抗体包被的磁珠。 在另一实施方案中，所述细胞群体 从胰岛制备物或人类胰腺组织获得。 在另一实施方案中， CD133 表达细胞的分离基于凝 集素结合。 在任一实施方案中，分离的胰腺内分泌祖细胞可在体外培养以扩增群体。
     从人胰腺组织制备胰岛的方法在本领域是已知的，例如， Ricordi C， Pancreatic Islet Cell Transplantation( 胰岛细胞移植 )， Austin R.G.Landes Co.，1992 ：99-112。 这类 技术可应用于人类供体材料以提供移植用细胞。 已在通常分离的所有 3 个组分中鉴别出 CD133 阳性细胞。 在 Miami Media 1A 中培养约一个星期后， CD133+ 细胞的百分比增
     加，到培养两个星期时逐渐减少。 通常在胰岛移植指南的标准操作程序中描述了培养周 期和培养基。 因此，可以从临床级胰岛制备物中有效地分离出 CD133 免疫活性细胞。 实施例
     下列实施例用于说明但不限制本发明。 尽管它们是典型的可使用方法，但也可 使用本领域已知的其它程序。 实施例 1研究设计和方法
     胰岛培养。 将重悬浮在添加了 0.01g/L 谷胱甘肽的 MiamiMedia 1(Mediatech， Herndon，VA) 或添加了 10％胎牛血清的 CMRL-1066(Invitrogen) 培养基中的胰岛制备物 组织，于 37℃或 25℃铺板于低粘附盘中。 每 2-3 天更换一次培养基。 通过用 0.25mg/ ml 双硫腙染色评估胰岛纯度。 通过每日添加在 DMSO 中制备的 DAPT(N-[N-(3，5- 二 氟苯乙酰基 -L- 丙氨酰 )]-S- 苯甘氨酸叔丁酯 ) 或 JKL6(7- 氨基 -4- 氯 -3- 甲氧基异香豆 素 ) 来抑制 γ- 分泌酶。 每日添加溴脱氧尿苷 (BrdU) 至 10μM。
     逆 转 录 酶 聚 合 酶 链 反 应 (RTPCR)。 cDNA 的 合 成 通 过 在 标 准 的 逆 转 录 反 应 中 使 用 寡 脱 氧 胸 苷 酸 (oligo(dT)) 引 物 来 进 行。 分 别 利 用 基因表达 分 析 方 法 Hs00172878_m1、 Hs00603586_g1、 Hs00426216_m1、 Hs00360700_g1 和 Hs99999904_m1，确定 HES 1、 PTF1、 PDX1、 NGN3 和 CYCLOPHILLIN A 的水平。 以 CYCLOPHILLINA 的平均水平将感兴趣基因的平均水平 (3-6 次读数 / 样本 ) 标准化。 用 双尾异方差学生 t 检验确定显著性。 商业性制备了成人和胎儿胰腺 RNA。 免疫化学。 用含 1-4％甲醛的 Dulbecco 磷酸缓冲液盐溶液 (DPBS) 固定正常成人 胰腺 (2 个个体 ) 和胰岛制备物组织的 5 微米冰冻切片 5 分钟，用含 50mM 甘氨酸的 DPBS 淬灭 5 分钟，然后用含 5-10％血清、1％ BSA 的 DPBS 室温下封闭 30 分钟。 对于细胞 质和细胞核抗原，加入 0.2％ Triton-X100，除了 NGN3/CD133、PDX1/CD133 和 NGN3/ CA19.9 共染色外，所述共染色在没有 Triton-X100 时进行。 用封闭缓冲液稀释第一抗 体 ：非缀合的和缀合藻红蛋白的小鼠抗 CD133/1 和 CD133/2(Miltenyi Biotec， Aubern， CA，1 ∶ 10)、缀合异硫氰酸荧光素的小鼠抗人 CD31(BD Biosciences， SanJose， CA， 1 ∶ 10)、 小 鼠 抗 CK19(Chemicon， Temecula， CA，1 ∶ 300)、 小 鼠 抗 CA19.9(US Biological， Swampscott， MA，1 ∶ 300)、豚鼠抗猪胰岛素 (Dako， Capinteria， CA， 1 ∶ 500)、兔抗 PDX1(Chemicon 1 ∶ 250)、山羊抗 AMY(Santa Cruz，1 ∶ 300)、小鼠抗 小鼠 NGN3(DevelopmentalStudies Hybridoma Bank， Iowa City， IA，非浓缩杂交瘤条件培 养基，1 ∶ 10)。 用试剂盒 (BD Bioscience) 进行 BrdU 检测。 AMY 和 CK19 表达的定量
     分析通过对每个处理组超过 600 个细胞核进行成像来进行。 NGN3 表达定量分析通过对 每个处理组超过 800 个细胞核进行成像来进行。
     电子显微镜。 10％明胶中的甲醛固定组织在含 2.3M 蔗糖的 20％聚乙烯吡咯烷 酮中在 4℃过夜低温保护。 用含 10％胎牛血清的 DPBS 封闭超薄切片 30 分钟，然后在如 上稀释的缀合于磁珠 ( 直径约 50nm) 的抗 CA19.9 和抗 CD133/1 中温育。 使用 12nm 直径胶体金山羊抗小鼠 IgMμ 链 (Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA，1 ∶ 20) 温 育 1 小时来检测 CA19.9。 直接检测 CD133/1。 对照是在 2％甲基纤维素和 0.3％乙酸双 氧铀中 4℃温育 10 分钟。
     FACS、Cytospin 和磁珠分离。 用无钙 / 镁 DPBS 冲洗组织，并通过在 0.05％胰 蛋白酶 /EDTA 中 37℃温育 5 分钟进行解离。 中和胰蛋白酶，用在 0.1％ BSA、1mM 氯化 钙、0.5mM 氯化镁、0.6％柠檬酸钠溶液中制备的 120 单位 /ml DNA 酶在室温下温育 2 分 钟以清除 DNA，然后以 200×g 离心 5 分钟收集单细胞。将细胞重悬浮于在无钙 / 镁 DPBS 中制备的脱气 0.5％ BSA、2mM EDTA 中，并用 Nucleocounter(New Brunswick Scientific， Edison， NJ) 计数。 对于流式细胞仪分析，第一抗体是缀合了藻红蛋白的 CD133/1 和 CD133/2(IgG2b， Miltenyi Biotec)。 同种型阴性对照抗体是 IgG1-PE 和 IgG2b-PE(BD Bioscience)。 用缀合于磁珠 (Miltenyi Biotec) 的 CD133/1 纯化 CD133 表达细胞。 用缀 合了藻红蛋白的 CD133/2 染色来确定纯化效率。 用 Cytospin 以 8500rpm 旋转 4 分钟，使 未聚集细胞粘贴到载玻片。
     培养时间进程和计数。 对于每一时间点，从 10ml 培养物中取出 1.5ml 组织用 于 FACS 和组织学分析。 不改变体积，但加入培养基根据蒸发情况进行调整。 通过三 次重复从平行胰岛制备物取出和解离来确定细胞数量变化。 CD133 细胞数按照总细胞 数 ×CD133+ 百分比来计算。
     培养 CD133 富集细胞。 将组织打散，利用免疫磁珠分离出 CD133+ 细胞至超过 90 ％的纯度。 以 200×g 离心 5 分钟，将 1.5×104 CD133+ 细胞铺板于包被 50mcg/ml I 型牛胶原的 48 孔板中，在 DMEM/F12 培养基中生长，该培养基添加了 ：1％胎牛血清、 100U/ml 青霉素、100mcg/ml 链霉素、40ng/ml 人重组白血病抑制因子、50ng/ml 重组人 表皮生长因子和 50mcg/ml 硫酸 GeneticinTM。 每 3 天更换一次培养基。 根据超过 400 个 细胞总数的 4 个随机视野计算铺板效率。 通过对 10 个随机视野的分离集落中总共约 300 个 4，6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (DAPI) 染色的细胞核进行计数，计算细胞增殖。 实施例 2 CD133 在成人胰腺和纯化胰岛制备物中表达
     在成人胰腺中，主要由表达 CK19 的导管上皮细胞表达 CD133。 可鉴别共表达 CA19.9 的细胞，但这两种抗原有不同的表达模式。未检出 CD133 或 CD31( 血管内皮细胞 标记物 ) 和胰岛素的共表达，观察到极少量胰岛内 CD133 染色表达。 在大部分切片中明 显有其它斑点状 (punctuate) 免疫活性区，可能是由于腺泡细胞或胰腺间充质表达所致。
     含有胰岛和共纯化外分泌和胆管组织混合物的人胰岛制备物，根据最初器官消 化 ( 此处指定为第 0 天，D0) 后的培养时间以及用胰岛百分比表示的纯度，来进行分类。 在用于维持同种异体移植用胰岛的标准条件下培养制备物。 到第 4 天，胰岛制备物包含 CD133+、CA19.9+ 和 CD133+/CA19.9+ 细胞。 在第 7 天，用电子显微镜分析该胰岛制备 物 (50％胰岛 )，显示整个组织有零星低水平染色和导管腔内衬的上皮细胞强染色。 在管 腔内，CD133 只在微绒毛上表达，而 CA19.9 在微绒毛和顶部 (apical domain) 的平面区域 都有表达。 CD133 和 CA19.9 在表达这两种糖蛋白的细胞上有重叠的亚细胞定位。 在第7 天，约 45％的细胞是 CD133+(404/901 细胞核 )，约 57％的细胞是 CA19.9+(510/901 细 胞核 )，约 63％的 CA19.9+ 细胞是 CD133+(321/510 细胞核 )。 实施例 3 在培养物中 CD133+ 细胞的百分比和总数增加
     在第 2、7 和 14 天，检测了两个独立胰岛分离物的三个 Ficoll 密度组分中 CD133 的表达。 在第 2 天，第一胰岛制备物的 Ficoll 组分 I( 超过 95％胰岛 )、组分 II(65％胰 岛 ) 和组分 III(25％胰岛 ) 的 CD133 表达细胞的百分比分别为 2.9、13.2 和 12.6。 第二胰 岛制备物各组分分别有 90％胰岛、60％胰岛和 30％胰岛。 到第 7 天时，与第 2 天相比， CD133+ 细胞的平均百分比和平均总数显著增加，分别为 2.7 倍 (P ＜ 0.001) 和 3.3 倍 (P ＜ 0.01)( 图 1)。 虽然 CD133+ 细胞的总数在所有三个组分中都有增加，但组分 I 的百分 比增加最多 ( 约 5 倍 )，这是由于其在第 2 天时的水平低 ( 图 1 插图 )。 组分 I 的 CD133+ 细胞总数一直低于其它组分。 在第 7 天和第 14 天间， CD133 总数显著下降 (5.1 倍， P ＜ 0.01)。 在这段时间内， CD133 百分比没有显著下降。 实施例 4 CD133+ 细胞百分比的增加不是由于 CD133+ 细胞增殖 通过免疫组织化学检测的从第 2 天至第 7 天 CD133 表达的增加，与 FACS 的结果 一致，同时也揭示了 CD133 亚细胞定位的不同。 在第 2 天，CD133 的表达主要限于腔表 面，而在第 7 天有扩大的模式，其中包括在其它细胞膜表面和 / 或细胞质的表达。 在第 7 天检测到极少量 BrdU 的掺入，在 FR I、 II 和 III 的切片中，分别有 1％ (9/893)、1.7％ (14/800) 和 2.8％ (30/1049) 的细胞核染色阳性。 没有 CD133+ 细胞被 BrdU+ 标记。 与此 相反，在相同剂量的快速增殖人类细胞对照培养物中，几乎 100％的细胞被 BrdU 标记 ； 确保了不会因 BrdU 半衰期短而遗漏 CD133+ 细胞的任何增殖 ( 数据未显示 )。 与在完整 胰腺中胰岛内 CD133 表达不足相比，在第 7 天，在培养物 ( 开始时有超过 95％胰岛 ) 的 胰岛素表达区域内观察到许多 CD133 的表达实例。
     将胰岛制备物组织在 37℃常规地培养于无血清 MiamiMedia 1A(MM1A)。 移植 前，常用可供选择的条件使用添加血清的 CMRL 1066(CMRL) 和于 25℃培养。 在第 3 天 (65％胰岛 )，培养物有 24.6％ CD133+。 在所有条件下， CD133 表达细胞的组分增加至 1.5-1.8 倍 ( 图 2)。
     实施例 5 CD133+ 群体在 ADM 背景下增加且通过抑制 Notch 激活而得到增强
     在 MM1A 和 CMRL 培养基中培养第 3 至 7 天间的两个独立胰岛制备物 (70％和 85％胰岛 ) 中，研究了 CD133、CK19、腺泡细胞标记淀粉酶 (AMY) 和 Notch 调控基因的 表达。 在第 3 天，在这两个制备物中分别有 24.6％和 6.4％的细胞是 CD133+ 细胞。 当将在两种培养基类型的两个制备物的数据结合在一起时， CD133+ 细胞的百分比在第 7 天 增加到第 3 天值的 144±14.1％ ( 图 3A)。 在第 3 天，分别有 35.5±7.3％和 36.1±9.6％ 的细胞表达 AMY 和 CK 19。 到第 7 天， AMY+ 细胞显著下降到 3.9±6.9％ (9.1 倍， P ＜ 0.001)，而 CK19 表达细胞的百分比显著上升到 61.6±9.3 ％ (1.7 倍， P ＜ 0.001)( 图 4)。
     为了确定在这些培养物的 CD133+ 细胞累积中 Notch 信号是否有作用，我们 用 仅 DMSO 载 体、2μM 或 20μMγ- 分 泌 酶 抑 制 剂 DAPT(Dovey HF 等， Functional gamma-secretase inhibitors reducebeta-amyloid peptide levels in brain.( 功能性 γ- 分泌酶抑 制剂减少大脑中 β- 淀粉样肽水平 )J Neurochem 76 ：173-181，2001) 处理组织。 CD133+ 细胞的平均百分比，在 2μM DAPT 组 (1.3 倍， P ＜ 0.05) 和 20μMDAPT 组 (1.4 倍， P ＜ 0.01) 中显著高于仅载体组 ( 图 3A)。 AMY 表达从仅载体组的 2.9±3.8％到 20μM DAPT 组的 17.5±17.1 ％，有统计学显著性增加 (6.0 倍， P ＜ 0.05)。 在 DAPT 组中， CK19 表达细胞的百分比没有显著性差异 ( 图 4)。
     为了确认 Notch 信号有活性并且被 DAPT 特异性抑制，研究了 Notch 靶基因茸毛 和分裂增强子 1(Hairy and Enhancer of Split1，HES1) 的 mRNA 表达。 与仅载体组相比， HES1 mRNA 水平显著性下降，在 2μM DAPT 组和 20μM DAPT 组分别下降至 1/1.9(P ＜ 0.001) 和 1/2.0(P ＜ 0.01)。 HES 1 mRNA 表达在培养基类型间没有显著性差异。 为 了确定 CD133+ 细胞百分比的增加是由于 Notch 活性被抑制、而不是 γ- 分泌酶抑制的其 他非特异性影响所致，用在 MM1A 中培养的 75％胰岛纯度的制备物进行了独立的重复实 验。 除 DAPT 外，还使用了 JKL6，其是不抑制 Notch 途径的 γ- 分泌酶抑制剂 (Petit A 等，JLK isocoumarin inhibitors ：selective gamma-secretaseinhibitors that do not interfere with notch pathway in vitro or in vivo.(JLK 异香豆素抑制剂 ：在体外或体内不干扰 notch 途径的 选择性 γ- 分泌酶抑制剂 )J Neurosci Res 74 ：370-377，2003)。 在仅 MM1A 组，在第 3 至第 7 天间， CD133+ 细胞百分比从 23.1％增加到 39.4％ ( 图 5)。 随着 DAPT 浓度的增 加，CD133+ 细胞百分比从载体组的 40.8％增加到 10μM DAPT 组的最大值 54.8％。 在用 JKL6 处理的培养物中，没有观察到 CD133+ 百分比的增加 ( 图 5)，但是，与仅载体对照 组比较，标准化的 HES1 mRNA 水平值在 0.1μM JKL6 组有轻微增加 (1.1 倍 )，在 10μM JKL6 组有轻微下降 (1.1 倍 )。
     在超过 15 个独立培养物中已经观察到随时间和对 DAPT 应答， CD133+ 细胞增 加。 但是，在两个案例中，培养物没有 CD133+ 细胞的增加或应答 DAPT。 实施例 6 Notch 信号抑制 PTF1 和 NGN3 mRNA 水平
     胰腺特异性转录因子 1a(PTF1) 在鼠外分泌和内分泌胰腺的形成和空间组织结 构中起着关键作用 (Krapp A 等， The bHLHprotein PTF1-p48 is essential for the formation of the exocrine and thecorrect spatial organization of the endocrine pancreas.(bHLH 蛋 白 PTF1-p48 对胰腺外分泌的形成和胰腺内分泌的正确空间组织结构是必不可少的 )Genes Dev 12 ：3752-3763，1998)，并且标记产生所有外分泌细胞和大多数内分泌细胞的前体细胞 (Kawaguchi Y 等， The role of thetranscriptional regulator Pft1a in converting intestinal to pancreaticprogenitors.( 转录调节子 Pft1a 在将肠祖细胞转换为胰腺祖细胞中的作用 ) Nat Genet 32 ：128-134，2002)。 在 小 鼠 (Fukuda A 等， Ectopicpancreas formation in Hes1-knockout mice reveals plasticity ofendodermal progenitors of the gut， bile duct， and pancreas.( 在 Hes1- 基因敲除小鼠中异位胰腺形成显示肠道、胆管和胰腺的内胚层祖细胞 的可塑性 )J Clin Invest 116 ：1484-1493，2006) 和斑马鱼 (Esni F 等， Notchinhibits Ptf1 function and acinar cell differentiation in developing mouseand zebrafish pancreas.( 在发育的小 鼠和斑马鱼胰腺中 Notch 抑制 Ptf1 功能和腺泡细胞分化 )Development 131 ：4213-4224， 2004)， PTF 受 HES1 负调节。 在培养于 MM1A 和 CMRL 两种培养基的两个独立胰岛制 备物中，研究了培养和 Notch 信号抑制对人类 PTF1 mRNA 表达水平的影响。 第 3 天的胰 岛制备物材料中的 PTF1 mRNA 表达水平显著性高于完整成人胰腺中所述 mRNA 的表达水 平 (2.3 倍，P ＜ 0.001)。 到第 7 天，与第 3 天水平比较，PTF1 mRNA 水平显著下降 (3.3 倍，P ＜ 0.001)。 与载体组相比，PTF1 mRNA 水平在 2μM DAPT 组和 20μM DAPT 组 有显著增加，分别为 2.3 倍 (P ＜ 0.001) 和 3.0 倍 (P ＜ 0.001)。
     与 PTF1 相似，胰腺和十二指肠同源框 1(PDX1) 在胰腺发育中发挥早期的和必要 的作用，并且是维持功能所必需的，但不知道是否直接受 Notch 调节。 在这两个独立的 胰岛制备物中，在第 3 天和第 7 天间，PDX1 mRNA 表达显著增加 (2.3 倍，P ＜ 0.001)， 但不被 DAPT 显著影响 ( 图 3B)。
     神经发生蛋白 (neurogenin)3(NGN3) 定义了能产生内分泌细胞、在发育过程 中对驱动胰岛形成是必要和充分的祖细胞亚组 (LeeJC 等， Regulation of the pancreatic pro-endocrine gene neurogenin 3.( 胰腺前内分泌基因神经发生蛋白 3 的调节 )Diabetes 50 ： 928-936，2001)。 NGN3 受 HES1 负 调 节。 在 成 人 胰 腺 中 检 测 到 极 低 水 平 的 NGN3 mRNA( 第 3 天的 0.05％ )。 在第 3 天， NGN3 mRNA 水平是人胎胰腺阳性对照 RNA 的 约 1/2.7。 我们的培养物在第 3 天和第 7 天间， NGN3 mRNA 水平显著增加 (1.7 倍， P ＜ 0.001)。 与仅载体组相比， NGN3 mRNA 表达水平在 2μM DAPT 组和 20μM DAPT 组有增加，分别为 2.1 倍 (P ＜ 0.001) 和 5.2 倍 (P ＜ 0.001)。 在培养基间，NGN3mRNA 表达水平无显著性差异。 在仅载体组中， NGN3 mRNA 水平在 CMRL 培养基中高于在 MM1A 中 (2.1 倍， P ＜ 0.001)。 但是，在 2μM DAPT 和 20μM DAPT 存在下， NGN3 mRNA 水平在 MM1A 培养基中高于在 CMRL 中，分别为 1.7 倍 (P ＜ 0.05) 和 1.9 倍 (P ＜ 0.001)。 实施例 7 CD133+ 细胞表达 NGN3
     在用免疫磁珠在 D4 胰岛制备物 (40 ％胰岛纯度 ) 中富集 CD133 后，与非富 集群体 ( 约 25 ％ CD133+) 相比，在 CD133 富集群体 ( 超过 98 ％ CD133+) 中， NGN3 mRNA 水平显著升高 (7.5 倍， P ＜ 0.001)，而且是人胎胰腺中的 11.6 倍。 与非富集群 体相比，该 CD133 富集群体表达显著低水平的 PTF1 mRNA( ＜ 1/1500， P ＜ 0.001) 和 PDX1 mRNA(1/12.7， P ＜ 0.001)( 图 3D)。 对 D4 组织中 PDX1 的免疫组化染色表明，在 CD133+ 细胞中 PDX1 水平非常低，低至不可检出。 在 D7 组织中也是如此。 在培养 于或者 MM1A 或者 CMRL 培养基中的 D7 组织中，没有观察到明确的 CA19.9/NGN3 共 表达，然而，有 20μM DAPT 存在时，在两种培养基条件下都观察到 CA19.9/NGN3 共表 达。
     为了确定培养和 γ- 分泌酶的抑制对 NGN3 蛋白表达的影响，以及 CD133+ 细胞 表达 NGN3 蛋白的程度，用抗 CD133/2 和 NGN3 的抗体对来自所述两个独立胰岛分离物 的组织冰冻切片进行染色。 在完整成人胰腺对照或 D3 培养物中未检出 NGN3 蛋白表达。 D7 时，分别在 MM1A 和 CMRL 培养基中的 23.4±6.3％和 37.9±8.5％细胞的细胞核中检 测到 NGN3 蛋白。 有 20μM DAPT 存在时，在 MM1A 和 CMRL 培养基中，表达 NGN3 蛋白的细胞的百分比分别为 37.8±8.3 和 43.0±9.9。 在从 D3 至 D7 于 MM1A 中培养的 第 3 个独立胰岛分离物 (45％胰岛 ) 中，在无 DAPT 存在和有 20μM DAPT 存在时，分别 有 15.4±8.7％和 26.3+8.3％细胞核在 D7 时是 NGN3+。 虽然在 DAPT 存在时， NGN3+ 细胞平均百分比一直较高，但这种差异仅在来自第 1 个实验系列的 MM1A 培养基中有统 计学显著性 (P ＜ 0.01)。 在无 DAPT 存在和有 20μM DAPT 存在时，在 D7 鉴别到共表 达 NGN3 和 CD133 的细胞。 在所有处理条件下，都检测到 NGN3+/CD133- 和 NGN3-/ CD133+ 细胞。 同种型阴性对照未见高于背景的染色。
     为 了 评 价 所 分 离 CD133+ 细 胞 的 体 外 增 殖 能 力， 将 D3 胰 岛 制 备 物 (45 ％ 胰 岛 ) 打散，用免疫磁珠富集 CD133 表达细胞，并以低细胞密度铺板于用来支持来自 大鼠外分泌组织的 β 细胞体外新生的培养基制剂 (Baeyens L 等， In vitro generation of insulin-producing betacells from adult exocrine pancreatic cells.( 来自成人胰腺外分泌细胞的 产胰岛素 β 细胞的体外培养 )Diabetologia 48 ：49-57，2005) 中。 在这些培养条件下， 12 小时后有 38.8±5.9％细胞发生贴壁。 在接下来的 8 天，单细胞增殖形成平均细胞数 为 13.3±7.3(3.7 群体倍增 ) 的集落，然后停止分裂。 在这一刻，几乎所有的细胞都表达 NGN3。 未检出胰岛素和胰岛素 C- 肽的表达。
     此外，来自这些培养物的 CD133+ 细胞显示在体外形成球状的能力，这是其它 CD133 表达祖细胞群体的特征。 这些球状很容易在改良 HuES 培养基 [KO-DMEM，1× 青霉素 / 链霉素，1×glutamax，1×NEAA，10 ％ KO 血清替代物，0.1×2- 巯基乙醇， 1×N2 补充物 (Invitrogen)，10％ Plasmanate(Bayer)，成纤维细胞生长因子 2(20ng/ml)， 白血病抑制因子 (10ng/ml)，表皮生长因子 (20ng/ml)] 或在 PS 培养基 [DMEM/F12，1× 青霉素 / 链霉素，1×glutamax，1×N2 补充物 (Invitrogen)，成纤维细胞生长因子 2(20ng/ ml)，白血病抑制因子 (10ng/ml)，表皮生长因子 (20ng/ml)] 中形成，所述培养基已经通 过与人胚状体衍生细胞系 SDEC 过夜培养而对其进行了调节 (Shamblott 等，Proc Natl Acad Sci USA.2001 ；98 ：113-8)。在这些细胞的增殖中显示早期效应的额外生长因子是 20ng/ ml 的血小板衍生生长因子 -BB(PDGF-BB)。 因此， NGN3 的表达和对 DAPT 的应答进 一步证明了本文鉴别和利用的 CD133+ 细胞的内分泌祖细胞性质。 实施例 8 CD133+ 细胞的植入从接受急性胰腺炎手术治疗患者获得胰腺组织，将其用于制备再植用的胰腺内 分泌祖细胞。 用结合了抗 CD133 抗体的磁珠，从由人类胰腺组织解离出的胰腺细胞群体 中分离出 CD133+ 细胞，如实施例 1 和实施例 2 中所描述。 用 Miami Medium 1A 扩增这 些细胞。 经过 7 天的培养后，将所扩增的祖细胞群体通过静脉注射施用入患者血管内， 以提供胰腺内分泌细胞功能的替代物。
     虽然本文已说明和描述了本发明的某些特征，本领域普通技术人员可以想到许 多改进、替换、更改和等同方案。 因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明 精神实质内的所有这些改进和变化。