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1、(10)授权公告号 CN 102703540 B (45)授权公告日 2014.01.01 CN 102703540 B (21)申请号 201210165217.9 (22)申请日 2012.05.25 C12P 17/18(2006.01) C12R 1/47(2006.01) (73)专利权人 浙江升华拜克生物股份有限公司 地址 313220 浙江省湖州市德清县钟管镇工 业区浙江升华拜克生物股份有限公司 专利权人 内蒙古拜克生物有限公司 (72)发明人 储消和 沈建 杨小一 高圣君 蔡群芳 黄会鸽 (74)专利代理机构 湖州金卫知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 33232 代理人 。
2、裴金华 CN 101560535 A,2009.10.21, 全文 . 江苏省畜牧兽医学校 . 聚醚类抗生素 .饲 料添加剂及分析 .1998, 第 134-135 页 . 陈代杰 . 盐霉素生物合成的研究 .抗生 素 .1988, 第 13 卷 ( 第 3 期 ),208-213. 石永芝 . 盐霉素发酵补油工艺研究 .山 东大学学报 （理学版） .2005, 第 40 卷 ( 第 4 期 ),110-113. 蒋顺进 . 盐霉素发酵工艺的优化研究 .今 日药学 .2010, 第 20 卷 ( 第 10 期 ),23-25,29. 吴访其 . 沙利霉素产生菌 2612-45 株 在工业生产中。
3、的生理代谢 .中国抗生素杂 志 .1996,232-233. (54) 发明名称 一种基于代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉 素工艺 (57) 摘要 本发明公开了一种沙利霉素的发酵工艺优化 方法， 特别是涉及一种基于代谢参数 OUR 补糖发 酵生产沙利霉素工艺， 选择在糖油转化结束后 , 当发酵进入菌体代谢平稳期时， 即 OUR 稳定期， 流 加补糖， 减弱了 “葡萄糖效应” ， 使得产品效价提 高， 同时降低了生产成本。本发明的技术成熟， 适 合工业规模化生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 穆彬 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国。
4、国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102703540 B CN 102703540 B 1/1 页 2 1. 一种基于代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特征在于包括以下工艺步 骤 ： 发酵培养 ： 将经斜面培养和种子培养所得种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐， 发 酵过程实时监测OUR,当发酵进程糖油转换期结束后进入OUR稳定期时开始流加补糖 ； 发酵 进行 280-320h 放罐 ； 所述糖为蔗糖或葡萄糖的一种或两种。 2. 根据权利要求 1 所述的一种基于代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特 征在于。
5、发酵培养条件是 ： 接种量 8-12%， 培养温度 30-35 , 压力 0.04-0.06MPa， DO 控制在 30%-100%, 转速 250-500rpm。 3. 根据权利要求1所述的一种基于代谢参数OUR补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特征 在于所述的斜面培养是 ： 将菌株接种到斜面培养基上， 26-30下培养 6-8 天。 4. 根据权利要求1所述的一种基于代谢参数OUR补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特征 在于所述的种子培养是 ： 将经斜面培养所得孢子接入种子培养基， 在 30-35、 220-260 r/ min 的条件下培养 25-30h。 5. 根据权利要求 2 所述的一种基于。
6、代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其 特征在于斜面培养基的组成是 ： 可溶性淀粉 1-3 wt%， 硫酸镁 0.02-0.08 wt%， 氯化钠 0.02-0.08 wt%， 牛肉膏 0.05-0.2 wt%， 硝酸钾0.05-0.2 wt%， 磷酸氢二钾 0.02-0.08 wt%， 亚硫酸铁 0.0005-0.0015 wt%， 琼脂 1-3wt%， 余量的蒸馏水 ； 所述斜面培养基的 pH 值为 6.5-7.5。 6. 根据权利要求3所述的一种基于代谢参数OUR补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特征 在于种子培养基的组成是 ： 葡萄糖2-8 wt%， 黄豆粉2-4 wt%， 酵母。
7、粉 0.5-2wt%， 轻质碳酸钙 0.1-0.4 wt%， 余量为蒸馏水。 7. 根据权利要求 1 所述的一种基于代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特 征在于发酵罐的培养基的组成是 ： 葡萄糖2-6 wt%， 棕榈油 2-8wt%， 氯化钾 0.1-0.4wt%， 氯 化钠 0.05-0.2 wt%， 豆粕粉 0.1-0.8 wt%， 胚芽粉 0.2-1wt%， 磷酸氢二钾 0.01-0.02wt%， 硫酸镁 0.005-0.02 wt%， 乳化剂 0.02-0.08wt%， 硫酸铵 0.1-1wt%， 轻质碳酸钙 0.1-0.5 wt%， 余量为蒸馏水， 所述发酵培养基 pH。
8、 值为 6.5-7.0。 8. 根据权利要求1所述的一种基于代谢参数OUR补糖发酵生产沙利霉素工艺， 其特征 在于流加补糖的速率为 10-50ml/h， 糖的百分浓度为 20-60%。 权 利 要 求 书 CN 102703540 B 2 1/6 页 3 一种基于代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉素工艺 技术领域 0001 本发明涉及沙利霉素的发酵工艺优化方法， 特别是涉及一种基于代谢参数 OUR 补 糖发酵生产沙利霉素工艺。 背景技术 0002 沙利霉素是一种聚醚类一元羧酸抗生素， 具有特殊的环状结构， 是典型的离子载 体抗生素。沙利霉素是由白色链霉菌 (Streptomysis albu。
9、s) 产生的聚醚类离子载体型动 物专用抗生素 , 由于其广谱高效的抗球虫病性能而得到广大饲养者的认可。 0003 目前沙利霉素的生产主要通过生物发酵的方法进行， 主要以豆油作为其主要的发 酵碳源， 例如中国专利 CN1230596A 公开的， 但是随着近年来油的价格持续上升， 沙利霉素 的发酵成本相应有了很大的提高。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种提高沙利霉素效价同时降低生产成本的基于代谢参数 OUR 补糖发酵生产沙利霉素工艺。 0005 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的 ： 0006 发酵培养 ： 将经斜面培养和种子培养所得种子液接种至装有培养基的发酵罐， 发酵过。
10、程实时监测 OUR, 当糖油转换期结束后进入 OUR 稳定期， 开始流加补糖 ； 发酵进行 280-320h 放罐 ； 所述糖为蔗糖或葡萄糖的一种或两种。 0007 当发酵完成糖油转换阶段后， OUR 菌体摄氧率和 CER 二氧化碳 （CO2） 释放率逐步上 升， RQ 呼吸商 （RQ=CER/OUR） 基本稳定在 0.65， 这意味着菌体开始进入产素阶段。若此时在 糖油转换之后立即补糖虽然能够大幅度提高菌浓， 促进菌体的生长， 但对产素方面存在一 定的抑制作用， 这是由于葡萄糖或蔗糖作为速效碳源被菌体快速分解利用时， 往往对其他 代谢途径中的酶 （包括抗生素合成酶和其他酶系） 有阻遏或抑制作。
11、用， 即 “葡萄糖效应” 。 0008 OUR 是菌体代谢活力的表征， 在发酵初期 OUR 快速上升 ； 当培养基中的葡萄糖含量 已经不能满足菌体正常的生长所需， 发酵进入葡萄糖限制阶段， OUR 由升转降， 此时发酵进 入糖油转换期， OUR 会经历一段时间的低迷， 在该过程中菌体开始逐步诱导与产素相关的酶 系 ； 0009 当菌体完成了糖油转换， 进入了完全以棕榈油作为碳源的阶段时， OUR 逐步缓慢上 升， 这标志着菌体的活力开始恢复， 同时也表明菌体进入产素阶段。当表征菌体活力的 OUR 上升到某一数值后， OUR 便开始在该数值左右进行小幅度波动， 没有大幅度的增长或降低， 即 OU。
12、R 稳定期。 0010 菌体进入产素阶段后， 当在 OUR 上升到某一数值后 2-3h 内， OUR 值的波动均不超 过 15%， 表明进入 OUR 稳定期， 可开始流加糖， 对培养基进行补糖。 0011 当菌体活力降低时， 表现为 OUR 快速下降， 作为放罐信号， 表明可以放罐。 0012 本发明选择在糖油转化结束当发酵进入菌体代谢平稳期时， 即 OUR 稳定期， 流加 说 明 书 CN 102703540 B 3 2/6 页 4 补糖， 减弱了 “葡萄糖效应” ， 使得产品效价提高， 同时降低了生产成本。 本发明的技术成熟， 适合工业规模化生产。 0013 作为优选， 所述发酵培养条件是。
13、 ： 接种量 8-12%， 培养温度 30-35 , 压力 0.04-0.06MPa， DO 控制在 30%-100%, 转速 250-500rpm。 0014 作为优选， 所述的斜面培养是 ： 将菌株接种到斜面培养基上， 26-30下培养 6-8 天。 0015 作为优选， 所述的种子培养是 ： 将经斜面培养所得孢子接入种子培养基， 在 30-35、 220-260 r/min 的条件下培养 25-30h。 0016 作为优选， 所述斜面培养基的组成是 ： 可溶性淀粉 1-3 wt%， 硫酸镁 0.02-0.08 wt%， 氯化钠 0.02-0.08 wt%， 牛肉膏 0.05-0.2 wt。
14、%， 硝酸钾 0.05-0.2 wt%， 磷酸氢二钾 0.02-0.08 wt%， 亚硫酸铁 0.0005-0.0015 wt%， 琼脂 1-3wt%， 余量的蒸馏水 ； 所述斜面培 养基的 pH 值为 6.5-7.5。 0017 作为优选， 所述种子培养基的组成是 ： 葡萄糖 2-8 wt%， 黄豆粉 ;2-4 wt%， 酵母粉 0.5-2wt%， 轻质碳酸钙 0.1-0.4 wt%， 余量为蒸馏水。 0018 作为优选， 所述发酵罐的培养基的组成是 ： 葡萄糖 2-6 wt%， 棕榈油 2-8wt%， 氯化 钾 0.1-0.4wt%， 氯化钠 0.05-0.2 wt%， 豆粕粉 0.1-0。
15、.8 wt%， 胚芽粉 0.2-1wt%， 磷酸氢二 钾 0.01-0.02wt%， 硫酸镁 0.005-0.02 wt%， 乳化剂 0.02-0.08wt%， 硫酸铵 0.1-1wt%， 轻 质碳酸钙 0.1-0.5 wt%， 余量为蒸馏水 ； 所述发酵培养基 pH 值为 6.5-7.0。 0019 作为优选， 所述流加补糖的速率为 10-50ml/h， 糖的质量百分浓度为 20-60%。 0020 作为优选， 所述糖为葡萄糖。 0021 作为优选， 所述糖为蔗糖。 附图说明 0022 图 1 是本发明实施例 1 的发酵时间 -OUR 关系图。 具体实施方式 0023 以下结合附图对本发明作。
16、进一步详细说明。 0024 下面通过实施例来进一步说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0025 本发明中种子罐及发酵罐由上海国强生化工程装备有限公司生产， 尾气分析仪为 PS6000 型生物尾气分析系统分析 （重庆哈特曼测量仪器有限公司） ， 本发明中 DO 为溶解氧， OUR 为菌体摄氧率， CER 为二氧化碳 （CO2） 释放率， RQ 为呼吸商， RQ=CER/OUR。 0026 本发明实施例采用的沙利霉素生产菌种是为白色链霉菌 (Streptomyces albus) F2110， 来自申请人自主筛选菌种。 0027 培养基成分 1 ： 0028 配制斜面培养基 (wt%) ： 。
17、可溶性淀粉 1， 硫酸镁 0.08， 氯化钠 0.02， 牛肉膏 0.2， 硝酸钾 0.05， 磷酸氢二钾 0.08， 硫酸亚铁 0.0005， 琼脂 3， pH 6.5, 余量为蒸馏水 ； 并进行 灭菌 。 0029 配制种子培养基 (wt%) ： 葡萄糖 2， 黄豆粉 4， 酵母粉 0.5， 轻质碳酸钙 0.4， 余量 为蒸馏水 ； 说 明 书 CN 102703540 B 4 3/6 页 5 0030 配制发酵培养基 (wt%) ： 葡萄糖 2， 棕榈油 8， 氯化钾 0.1， 氯化钠 0.2， 豆粕粉 0.1， 胚芽粉 1， 磷酸氢二钾 0.01， 硫酸镁 0.02， 乳化剂 0.02。
18、， 硫酸铵 1， 轻质碳酸钙 0.1, 余量为蒸馏水 ； 所述发酵培养基的 pH 值为 7.0。 0031 培养基成分 2 ： 0032 斜面培养基 (wt%) ： 可溶性淀粉 3， 硫酸镁 0.02， 氯化钠 0.08， 牛肉膏 0.05， 硝酸 钾 0.2， 磷酸氢二钾 0.02， 硫酸亚铁 0.0015， 琼脂 1， 余量的蒸馏水 ； 所述斜面培养基的 pH 值为 7.5。 0033 种子培养基 (wt%) ： 葡萄糖 8， 黄豆粉 2， 酵母粉 2， 轻质碳酸钙 0.1， 余量为蒸馏 水。 0034 发酵罐的培养基 (wt%) ： 葡萄糖 6， 棕榈油 2， 氯化钾 0.4， 氯化钠 。
19、0.05， 豆粕粉 0.8， 胚芽粉 0.2， 磷酸氢二钾 0.02， 硫酸镁 0.005， 乳化剂 0.08， 硫酸铵 0.1， 轻质碳酸钙 0.5， 余量为蒸馏水 ； 所述发酵培养基的 pH 值为 6.5。 0035 培养基成分 3 ： 0036 斜面培养基 (wt%) ： 可溶性淀粉 2， 硫酸镁 0.06， 氯化钠 0.04， 牛肉膏 0.1， 硝酸 钾 0.1， 磷酸氢二钾 0.05， 硫酸亚铁 0.001， 琼脂 2， 余量为蒸馏水 ； 所述斜面培养基的 pH 值为 7.0。 0037 种子培养基 (wt%) ： 葡萄糖 5， 黄豆粉 3， 酵母粉 1， 轻质碳酸钙 0.3， 余量。
20、为蒸馏 水。 0038 发酵罐的培养基 (wt%) ： 葡萄糖 3， 棕榈油 5， 氯化钾 0.3， 氯化钠 0.15， 豆粕粉 0.5， 胚芽粉 0.8， 磷酸氢二钾 0.015， 硫酸镁 0.01， 乳化剂 0.05， 硫酸铵 0.5， 轻质碳酸钙 0.3， 余量为蒸馏水 ； 所述发酵培养基的 pH 值为 6.8。 0039 实施例 1 ： 0040 使用培养基成分 1 0041 （1） 斜面培养 ： 将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上， 26下培养 8 天 ； 0042 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所得孢子接入种子培养基， 在 30、 260 r/min 的条件下 培养 30h 。
21、； 0043 （3） 发酵培养 ： 将步骤 （2） 所得种子液接种至发酵罐 (15L 罐， 灭菌后大概 8 升种 子培养基 )， 接种量 10%， 培养温度 30-35 , 压力 0.05MPa， DO 控制在 30% 以上 , 转速 250-500rpm， 当 OUR 趋于平稳时， 开始以 10ml/h 流速流加质量百分浓度为 60% 葡萄糖。发 酵 280 小时后放罐， 效价 72457u/ml， 见表 1。 0044 如图 1 所示， 0-65h 为糖油转换期， OUR 上升 ； 65-110h， 糖油转换期结束， OUR 开始 回升， 此阶段称为糖油转换结束后的 OUR 上升期 ； 1。
22、10h 后， OUR 值保持在 35-40mol/l/h， 趋 于稳定， 此阶段称为糖油转换结束后的 OUR 稳定期。 0045 实施例 2 0046 使用培养基成分 1 0047 （1） 斜面培养 ： 将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上， 30下培养 6 天 ； 0048 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所得孢子接入种子培养基， 在 35、 220 r/min 的条件下 培养 30h ； 0049 （3） 发酵培养 ： 将步骤 （2） 所得种子液接种至发酵罐 (30L 罐， 灭菌后大概 16 升 说 明 书 CN 102703540 B 5 4/6 页 6 种子培养基 )， 接种量 10。
23、%， 培养温度 30-35 , 压力 0.05MPa， DO 控制在 30% 以上 , 转速 250-500rpm， 当 OUR 趋于平稳时， 开始以 25ml/h 流速流加质量百分浓度为 40% 蔗糖。发酵 300 小时后放罐。效价 65530u/ml。 0050 实施例 3 0051 使用培养基成分 2 0052 （1） 斜面培养 ： 将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上， 28下培养 7 天 ； 0053 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所得孢子接入种子培养基， 在 32、 240 r/min 的条件下 培养 30h ； 0054 （3） 发酵培养 ： 将步骤 （2） 所得种子液接种至。
24、发酵罐 (45L 罐， 灭菌后大概 24 升 种子培养基 )， 接种量 10%， 培养温度 30-35 , 压力 0.05MPa， DO 控制在 30% 以上 , 转速 250-500rpm， 当 OUR 趋于平稳时， 开始以 30ml/h 流速流加质量百分浓度为 50% 葡萄糖。发 酵 320 小时后放罐。效价 69875u/m。 0055 实施例 4 0056 使用培养基成分 2 0057 （1） 斜面培养 ： 将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上， 26下培养 8 天 ； 0058 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所得孢子接入种子培养基， 在 30、 260 r/min 的条件下 培养。
25、 30h ； 0059 （3） 发酵培养 ： 将步骤 （2） 所得种子液接种至发酵罐 (15L 罐， 灭菌后大概 8 升种 子培养基 )， 接种量 10%， 培养温度 30-35 , 压力 0.05MPa， DO 控制在 30% 以上 , 转速 250-500rpm， 当 OUR 趋于平稳时， 开始以 10ml/h 流速流加质量百分浓度为 50% 蔗糖。发酵 300 小时后放罐。效价 67138u/ml。 0060 实施例 5 0061 使用培养基成分 3 0062 （1） 斜面培养 ： 将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上， 30下培养 6 天 ； 0063 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1）。
26、 所得孢子接入种子培养基， 在 35、 220 r/min 的条件下 培养 30h ； 0064 （3） 发酵培养 ： 将步骤 （2） 所得种子液接种至发酵罐 (30L 罐， 灭菌后大概 16 升 种子培养基 )， 接种量 10%， 培养温度 30-35 , 压力 0.05MPa， DO 控制在 30% 以上 , 转速 250-500rpm， 当 OUR 趋于平稳时， 开始以 50ml/h 流速流加 20% 质量百分浓度为葡萄糖。发 酵 290 小时后放罐。效价 70246u/ml。 0065 实施例 6 0066 使用培养基成分 3 0067 （1） 斜面培养 ： 将白色链霉菌菌株接种到新鲜。
27、斜面上， 28下培养 7 天 ； 0068 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所得孢子接入种子培养基， 在 32、 240 r/min 的条件下 培养 30h ； 0069 （3） 发酵培养 ： 将步骤 （2） 所得种子液接种至发酵罐 (45L 罐， 灭菌后大概 24 升 种子培养基 )， 接种量 10%， 培养温度 30-35 , 压力 0.05MPa， DO 控制在 30% 以上 , 转速 250-500rpm， 当 OUR 趋于平稳时， 开始以 20ml/h 流速流加 30% 质量百分浓度为蔗糖， 同时以 20ml/h 流速流加质量百分浓度为 30% 葡萄糖。发酵 310 小时后放罐。
28、。效价 65487u/ml。 说 明 书 CN 102703540 B 6 5/6 页 7 0070 对比实施例 1 ： 0071 将实施例 1 中当糖油转换期结束后 OUR 开始回升时开始以 10ml/h 流速流加质量 百分浓度为 60% 葡萄糖， 其余条件不变， 经分析效价为 ： 62547u/ml。 0072 对比实施例 2 ： 0073 将实施例 2 中当糖油转换期结束后 OUR 开始回升时开始以 25ml/h 流速流加质量 百分浓度为 40% 蔗糖， 其余条件不变， 经分析效价为 ： 60987u/ml。 0074 对比实施例 3 ： 0075 将实施例 1 中当糖油转换期结束后 O。
29、UR 开始回升时开始以 30ml/h 流速流加质量 百分浓度为 50% 葡萄糖， 其余条件不变， 经分析效价为 ： 65467u/ml。 0076 对比实施例 4 ： 0077 将实施例 4 中当糖油转换期结束后 OUR 开始回升时开始以 10ml/h 流速流加质量 百分浓度为 50% 蔗糖， 其余条件不变， 小时后放罐， 经分析效价为 ： 63245/ml。 0078 对比实施例 5 ： 0079 将实施例 5 中当糖油转换期结束后 OUR 开始回升时开始以 50ml/h 流速流加质量 百分浓度为 20% 葡萄糖， 其余条件不变， 小时后放罐， 经分析效价为 ： 63897 u/ml。 00。
30、80 对比实施例 6 ： 0081 将实施例 6 当糖油转换期结束后 OUR 开始回升时开始以 20ml/h 流速流加质量百 分浓度为 30% 蔗糖， 同时以 20ml/h 流速流加质量百分浓度为 30% 葡萄糖， 其余条件不变， 小 时后放罐， 经分析效价为 ： 61314 u/ml。 0082 表 1 0083 0084 由以上实施例可以看出， 本发明实施例通过一种基于代谢参数 OUR 稳定期， 流加 补充葡萄糖， 使得产品效价提高， 同时降低了生产成本。 0085 本具体实施例仅仅是对本发明的解释， 其并不是对本发明的限制， 本领域技术人 说 明 书 CN 102703540 B 7 6/6 页 8 员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改， 但只要在本 发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。 说 明 书 CN 102703540 B 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102703540 B 9 。