《一种微流控芯片及其研究非接触式细胞共培养的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种微流控芯片及其研究非接触式细胞共培养的方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN102021116A43申请公布日20110420CN102021116ACN102021116A21申请号200910187561622申请日20090923C12M3/00200601C12Q1/0220060171申请人中国科学院大连化学物理研究所地址116023辽宁省大连市中山路457号72发明人秦建华马慧朋林炳承74专利代理机构沈阳晨创科技专利代理有限责任公司21001代理人张晨54发明名称一种微流控芯片及其研究非接触式细胞共培养的方法57摘要一种微流控芯片及其研究非接触式细胞共培养的方法，该微流控芯片由进样口、细胞培养室、细胞迁移区域及废液池组成；细胞培养室的上端。
2、与进样口相连，下端连接废液池，三个平行的细胞培养室通过细胞迁移区域相连；利用该微流控芯片可为非接触式细胞共培养提供良好的微环境，并在细胞迁移区域形成稳定的浓度梯度，能够实时观测细胞迁移过程，并进行转分化研究；本发明具有操作方便、制作简单和样品用量少等特点。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图6页CN102021130A1/1页21一种微流控芯片，其特征在于该微流控芯片由进样口1、细胞培养室2、细胞迁移区域3及废液池4组成；细胞培养室的上端与进样口相连，下端连接废液池，三个平行的细胞培养室通过细胞迁移区域相连。2按照权利要求1所述微流控芯片，。
3、其特征在于所述微流控芯片由上下两层可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。3按照权利要求1所述微流控芯片，其特征在于所述细胞培养室高度高于细胞迁移区域。4基于权利要求1所述微流控芯片研究非接触式细胞共培养的方法，其特征在于方法过程如下1浓度梯度表征将FITC标记的荧光染料包埋在BME中，通过进样口将其加入细胞培养室C，其余细胞培养室只加入等量MEM培养液；2细胞加样通过右侧进样口将第一种细胞加入细胞培养室C，放置于CO2培养箱内；待细胞贴壁624H后，通过中间进样口将第二种细胞加入细胞培养室B；作为空白对照左侧培养室A不加入细胞，细胞培养液每天更换一次；3活性考察用HOECHS。
4、T33342和碘化丙啶表征培养两天后细胞的生长状态及活性。5按照权利要求4所述非接触式细胞共培养的方法，其特征在于所述BME为基底膜样物质，低温时为液态，室温时凝固成胶态。6按照权利要求4所述非接触式细胞共培养的方法，其特征在于所述细胞迁移区域的浓度梯度用FIECDEXTRAN分子表征。7按照权利要求4所述非接触式细胞共培养的方法，其特征在于在加入细胞时，细胞不会串流到迁移区域；待细胞贴壁后才进入迁移区域。8按照权利要求6所述非接触式细胞共培养的方法，其特征在于所述FIECDEXTRAN分子的分子量为10000D。权利要求书CN102021116ACN102021130A1/3页3一种微流控芯。
5、片及其研究非接触式细胞共培养的方法技术领域0001本发明涉及将微流控芯片技术应用于生物医学研究领域，具体提供了一种微流控芯片及其研究非接触式细胞共培养的方法。背景技术0002细胞相互作用是当今医学和生物学界研究的研究热点。细胞并不是一个孤立的生命单位，细胞与细胞之间也不是简单的机械连接，而是存在各种形式的相互交流从而构成一个完整的个体并协调完成各种生命活动。探索细胞间相互作用及相应的信号通路，对疾病治疗等有着重要作用。0003目前，细胞共培养是最为常用的研究细胞相互作用的方法。传统上研究细胞共培养方法一般分为三类混合共培养、微载体共培养和TRANSWELL共培养。混合式共培养，无法将两种或多种。
6、细胞区分开；微载体共培养，细胞相互作用时间受限，一般小于4小时；而对于采用TRANSWELL这种套皿式的共培养方法，无法实时监测细胞响应，只能获得最终结果，有可能缺失大量的生物学信息。以上三种方法均存在试剂消耗量大，细胞用量多，无法实现流体控制等诸多缺点。0004微流控芯片实验室又称芯片实验室LABONACHIP或微流控芯片MICROFLUIDIC，指的是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米甚至更小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技。
7、术正逐步向生物医学领域渗透，并显示了广阔的应用前景。其特有的微尺寸特征与细胞大小相匹配，加之芯片灵活的设计和规模集成特征，非常适合进行细胞功能研究。发明内容0005本发明的目的是提供了一种微流控芯片及其研究非接触式细胞共培养的方法。利用该微流控芯片可为非接触式细胞共培养提供良好的微环境，并在细胞迁移区域形成稳定的浓度梯度，能够实时观测细胞迁移过程，并进行转分化研究。0006本发明提供了一种微流控芯片，该微流控芯片由进样口1、细胞培养室2、细胞迁移区域3及废液池4组成；细胞培养室的上端与进样口相连，下端连接废液池；三个平行的细胞培养室通过细胞迁移区域相连，细胞培养室高度高于细胞迁移区域。0007。
8、本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下两层可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。0008本发明还提供了基于所述微流控芯片研究非接触式细胞共培养的方法，方法过程如下00091浓度梯度表征将异硫氰酸荧光素FITC标记的荧光染料包埋在BME中，说明书CN102021116ACN102021130A2/3页4通过进样口将其加入细胞培养室C，其余细胞培养室只加入等量MEM培养液；00102细胞加样通过右侧进样口将第一种细胞加入细胞培养室C，放置于CO2培养箱内；待细胞贴壁624H后，通过中间进样口将第二种细胞加入细胞培养室B；作为空白对照左侧培养室A不加入细胞，细胞培养液每天更换。
9、一次；00113活性考察用HOECHST33342和碘化丙啶表征培养两天后细胞的生长状态及活性。0012本发明提供的非接触式细胞共培养的方法，所述BME为基底膜样物质，低温时为液态，室温时凝固成胶态；所述细胞迁移区域的浓度梯度用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖分子FITCDEXTRAN分子量为10000D表征。0013本发明提供的非接触式细胞共培养的方法，在加入细胞时，细胞不会串流到迁移区域；待细胞贴壁后才进入迁移区域。0014本发明提供的非接触式细胞共培养的方法，在芯片上可以同时进行两种细胞共培养的迁移和转分化检测；该微流控芯片具有三个细胞培养室，可以分别加入不同种类的细胞，进行三种细胞共培养的迁。
10、移和转分化检测。0015总之，本发明可在一块几平方厘米的芯片上，为非接触式细胞共培养研究提供良好的微环境，在细胞迁移区域生成稳定的浓度梯度，在一种细胞分泌的细胞因子的作用下，可诱导另一种细胞发生定向移动及转分化。本发明具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点。具有重要的生物医学研究价值和经济价值。附图说明0016图1本发明微流控芯片示意图，其中A芯片上层；B芯片下层，C芯片整体结构图；1进样口、2细胞培养室、3细胞迁移区域、4废液池；0017图2显示细胞培养迁移区域内的荧光信号；0018图3细胞迁移区域生成的稳定荧光浓度梯度；0019图4成纤维细胞HFLI，胃黏膜上皮细胞GES1，肝癌细胞HE。
11、PG2在微流控芯片上生长状态及活性检测；0020图5成纤维细胞HFLI在空白对照，胃黏膜上皮细胞GES1，肝癌细胞HEPG2诱导下发生迁移；0021图6成纤维细胞HFLI在胃黏膜上皮细胞GES1的诱导下发生的迁移面积；0022图7成纤维细胞HFLI在肝癌细胞HEPG2的诱导下发生的迁移面积；0023图8成纤维细胞HFLI在口腔癌细胞ACC2诱导下发生的迁移面积；0024图9成纤维细胞HFLI在口腔癌细胞ACCM的诱导下发生的迁移面积；0025图10成纤维细胞HFLI单独培养环境下SMA的表达；0026图11成纤维细胞HFLI在胃黏膜上皮细胞GES1的诱导下SMA的表达；0027图12成纤维细胞。
12、HFLI在肝癌细胞HEPG2的诱导下SMA的表达。具体实施方式0028下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。0029实施例1说明书CN102021116ACN102021130A3/3页50030所用微流控芯片为本实验室自行设计及制备。芯片由上下两层可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。如图1所示，三个平行的细胞培养室尺寸为长6MM，宽1MM，高50M，细胞迁移区域尺寸为长1MM，宽500M，高50M。通过右侧进样口将肝癌细胞HEPG2加入细胞培养室C，轻轻放置于37的CO2培养箱内；待细胞贴壁后，通过中间进样口将成纤维细胞HFLI加入细胞培养室B；。
13、作为空白对照左侧培养室A不加入细胞，加入与B，C等量的细胞培养液。0031采用HOECHST33342和PI联合检测三种细胞HEPG2、GES1、HFLI的活性，结果显示三种细胞在该芯片上的成活率均大于90图4。0032与空白对照侧HFLI细胞迁移相比，6H和48H时，HFLI细胞迁移更趋向于肝癌细胞HEPG2图5。而在正常细胞GES1诱导下实验侧的HFLI细胞迁移面积与对照侧没有显著差异图6。在肝癌细胞HEPG2诱导下实验侧的HFLI细胞迁移面积与对照侧存在显著差异。0033实施例20034将异硫氰酸荧光素FITC标记的荧光染料包埋在BME中，通过进样口将其加入细胞培养室C，其余细胞培养室加。
14、入等量MEM培养液，一段时间后，细胞迁移区域出现荧光信号图2，数据分析显示细胞迁移区域形成稳定的荧光浓度梯度图3。0035通过右侧进样口将正常细胞GES1加入细胞培养室C，轻轻放置于37的CO2培养箱内；待细胞贴壁后，通过中间进样口将成纤维细胞HFLI加入细胞培养室B；作为空白对照左侧培养室A不加入细胞，加入与B，C等量的细胞培养液。与空白对照侧HFLI细胞迁移相比，6H和48H时，HFLI细胞迁移数目及面积与空白对照下基本相同图5。在正常细胞GES1诱导下实验侧的HFLI细胞迁移面积与对照侧没有显著差异图7。0036实施例30037通过右侧进样口将口腔癌细胞ACC2/ACCM加入细胞培养室C。
15、，轻轻放置于37的CO2培养箱内；待细胞贴壁后，通过中间进样口将成纤维细胞HFLI加入细胞培养室B；作为空白对照左侧培养室A不加入细胞，加入与B，C等量的细胞培养液。与空白对照侧HFLI细胞迁移相比，在口腔癌细胞ACC2/ACCM诱导下实验侧的HFLI细胞迁移面积与对照侧没有显著差异图8，图9。0038实施例40039共培养一段时间后，揭掉上层PDMS芯片，对玻璃底片的细胞进行免疫荧光测定，检测HFLI细胞内平滑肌肌动蛋白SMA的表达。成纤维细胞HFLI单独培养环境下SMA的表达量很少图10，在胃黏膜上皮细胞GES1的诱导下表达量也较少图11，但是成纤维细胞HFLI在肝癌细胞HEPG2的诱导下SMA的表达量明显增多图12。说明书CN102021116ACN102021130A1/6页6图1图2说明书附图CN102021116ACN102021130A2/6页7图3图4说明书附图CN102021116ACN102021130A3/6页8图5图6说明书附图CN102021116ACN102021130A4/6页9图7图8说明书附图CN102021116ACN102021130A5/6页10图9图10说明书附图CN102021116ACN102021130A6/6页11图11图12说明书附图CN102021116A。