通过使用属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的细菌进行发酵来产生嘌呤核苷和核苷酸的方法.pdf

提供使用属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的细菌产生嘌呤核苷如肌苷和鸟苷的方法，和使用属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的细菌产生5’-嘌呤核苷酸如5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸的方法，其中通过增强由yeaS(leuE)基因编码的蛋白质的活性来增强所述细菌的嘌呤核苷生产力。

1.  一种具有产生嘌呤核苷的能力的埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌，其中将该细菌中选自下组的蛋白质的活性增强：
A)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质；和
B)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质，其中将一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位，并且当埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌中所述蛋白质的活性增强时，该蛋白质具有使所述细菌对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤具有抗性的活性。

2.  根据权利要求1的细菌，其中所述蛋白质由选自下组的DNA编码：
(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和
(b)能够在严紧条件下与SEQ ID NO：1的互补核苷酸序列或能够从SEQ ID NO：1的核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码下述蛋白质，当埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌中的所述蛋白质的活性增强时，该蛋白质具有使所述细菌对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤具有抗性的活性。

3.  根据权利要求2的细菌，其中所述严紧条件包括用1xSSC、0.1％ SDS在60℃洗涤。

4.  根据权利要求1-3中任一项的细菌，其中所述蛋白质的活性通过如下方式增强：用编码所述蛋白质的DNA转化该细菌，或修饰该细菌染色体上所述DNA的表达调控序列从而使DNA表达增强。

5.  根据权利要求4的细菌，其中所述DNA存在于多拷贝载体上。

6.  根据权利要求1-5中任一项的细菌，其中所述嘌呤核苷是肌苷和/或鸟苷。

7.  一种用于产生嘌呤核苷的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求1-6中任一项的细菌，和从培养基收集嘌呤核苷。

8.  根据权利要求7的方法，其中所述细菌经过修饰而具有嘌呤核苷生物合成中涉及的基因的增强表达。

9.  根据权利要求7或8的方法，其中所述嘌呤核苷是肌苷或鸟苷。

10.  一种用于产生5’-嘌呤核苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求1-6中任一项的细菌以产生嘌呤核苷，使嘌呤核苷磷酸化以生成嘌呤核苷酸，和收集5’-嘌呤核苷酸。

11.  根据权利要求10的方法，其中所述细菌经过修饰而具有嘌呤核苷生物合成中涉及的基因的增强表达。

12.  根据权利要求10或11的方法，其中所述嘌呤核苷是肌苷和/或鸟苷，并且所述5’-核苷酸是肌苷酸和/或鸟苷酸。

通过使用属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的细菌进行发酵来产生嘌呤核苷和核苷酸的方法
技术领域
本发明涉及用于产生嘌呤核苷的方法，嘌呤核苷在5′-嘌呤核苷酸如5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的合成中是重要原料；还涉及所述生产所使用的新的微生物。
背景技术
按照常规，嘌呤核苷如肌苷、鸟苷和黄苷在工业上通过利用腺嘌呤营养缺陷型菌株进行发酵而产生。可选的是，可以进一步赋予这些菌株针对多种药物如嘌呤类似物和磺胺胍的药物抗性。这些菌株包括属于芽孢杆菌属(genusBacillus)的那些菌株(日本专利公告第38-23039号(1963)、第54-17033号(1979)、第55-2956号(1980)和第55-45199号(1980)，日本专利申请公开第56-162998号(1981)，日本专利公告第57-14160号(1982)和第57-41915号(1982)，及日本专利申请公开第59-42895号(1984))，或属于短杆菌属(genus Brevibacterium)(棒杆菌属(Corynebacterium))的那些菌株(日本专利公告第51-5075号(1976)和第58-17592号(1972)，和Agric.Biol.Chem.，42，399(1978))，或属于埃希氏菌属(genus Escherichia)的那些菌株(WO9903988)，等等。
用于获得这样的突变菌株的典型方法包括，对微生物通过UV照射或通过用亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理它们来进行诱变，和通过使用合适的培养基来选择突变菌株。另一方面，对于以下菌株也已经实践过使用遗传工程技术培育这样的突变菌株：属于芽孢杆菌属的菌株(日本专利申请公开第58-158197号(1983)、第58-175493号(1983)、第59-28470号(1984)、第60-156388号(1985)、第1-27477号(1989)、第1-174385号(1989)、第3-58787号(1991)、第3-164185号(1991)、第5-84067号(1993)和第5-192164号(1993))，属于短杆菌属(棒杆菌属)的菌株(日本专利申请公开第63-248394号(1988))，或属于埃希氏菌属的菌株(WO9903988)。
能够通过增加嘌呤核苷分泌活性进一步改进产嘌呤核苷的菌株的生产力。普遍承认的是，代谢物通常由特定的流出转运蛋白(efflux transporterprotein)介导而穿过细胞质膜(Pao等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，62，1-34，(1998)；Paulsen等，J.Mol.Biol.，277，573-592(1998)；Saier等，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，257-279(1999))。本发明人先前已经证明，RhtA蛋白(由rhtA(ybiF)基因编码)活性增强的属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的产肌苷或黄苷菌株与亲本菌株相比产生了更多的肌苷或黄苷(俄罗斯专利第2239656号)。除此之外，YijE、YdeD或YicM蛋白(分别由yijF、ydeD或yicM基因编码)活性增强的属于埃希氏菌属的产肌苷菌株与亲本菌株相比产生了更多的肌苷(分别为俄罗斯专利第2244003、2244004、2271391号)。
本发明人先前已经发现大肠杆菌的yeaS(leuE)基因编码一种膜蛋白，该膜蛋白属于RhtB家族并且涉及氨基酸的流出(efflux)(Aleshin等，TIBS，1999)。具体而言，这种基因编码亮氨酸、组氨酸和甲硫氨酸的输出物(exporter)(Kutukova等，FEBS Letters，579，4629-4634，2005)。
发明内容
本发明的目的是增强产嘌呤核苷的菌株的嘌呤核苷生产力，和提供使用这些菌株产生嘌呤核苷的方法。
此目的通过鉴定yeaS基因达到。该基因编码推定的氨基酸输出物，当作为多拷贝载体上的野生型等位基因引入菌株时，该基因赋予对嘌呤碱基类似物，即8-氮杂腺嘌呤(8-azaadenine)、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)的抗性。此外，当将在组成型启动子调控下的yeaS基因引入属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的各种产嘌呤核苷菌株的细胞时，yeaS基因能够增强嘌呤核苷生产。由此完成了本发明。
因此，本发明提供属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的微生物，所述微生物具有产生嘌呤核苷的能力。
具体而言，本发明提供一种微生物，基于似乎涉及嘌呤核苷向微生物外转运的蛋白质活性的增加，该微生物具有改进的产生嘌呤核苷的能力。更具体而言，本发明提供一种微生物，基于编码嘌呤核苷分泌中所涉及蛋白质的基因表达的增加，该微生物具有改进的产生嘌呤核苷的能力。
本发明进一步提供通过发酵产生嘌呤核苷的方法，其包括在培养基中培养上述微生物，和从该培养基收集嘌呤核苷。
本发明进一步提供用于产生5’-嘌呤核苷酸如5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸的方法，其包括在培养基中培养本发明的细菌，使嘌呤核苷如肌苷或鸟苷磷酸化，和收集5’-嘌呤核苷酸。
本发明的目的是提供具有产生嘌呤核苷的能力的埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌，其中选自下组的蛋白质的活性增强：
(A)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质，其中将一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位，并且当埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌中所述蛋白质的活性增强时，该蛋白质具有使所述细菌对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤具有抗性的活性。
本发明进一步的目的是提供上述细菌，其中所述蛋白质由选自下组的DNA编码：
(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和
(b)能够在严紧条件下与SEQ ID NO：1的互补核苷酸序列或能够从SEQ ID NO：1的核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码下述蛋白质，当埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌中的所述蛋白质的活性增强时，该蛋白质具有使所述细菌对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤具有抗性的活性。
本发明进一步的目的是提供上述细菌，其中严紧条件包括用1x SSC、0.1％SDS在60℃洗涤。
本发明进一步的目的是提供上述细菌，其中如上所述的蛋白质的活性通过如下方式增强：用编码所述蛋白质的DNA转化该细菌，或修饰该细菌染色体上所述DNA的表达调控序列从而使DNA表达增强。
本发明进一步的目的是提供上述细菌，其中所述DNA存在于多拷贝载体上。
本发明进一步的目的是提供上述细菌，其中所述嘌呤核苷是肌苷和/或鸟苷。
本发明进一步的目的是提供用于产生嘌呤核苷的方法，该方法包括在培养基中培养上述细菌，和从该培养基收集嘌呤核苷。
本发明进一步的目的是提供上述方法，其中所述细菌经过修饰而具有嘌呤核苷生物合成中涉及的基因的增强表达。
本发明进一步的目的是提供上述方法，其中所述嘌呤核苷是肌苷或鸟苷。
本发明进一步的目的是提供用于产生5’-嘌呤核苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养上述细菌以产生嘌呤核苷，使嘌呤核苷磷酸化以生成嘌呤核苷酸，和收集5’-嘌呤核苷酸。
本发明进一步的目的是提供上述方法，其中所述细菌经过修饰而具有嘌呤核苷生物合成中涉及的基因的增强表达。
本发明进一步的目的是提供上述方法，其中所述嘌呤核苷是肌苷和/或鸟苷，并且所述5’-核苷酸是肌苷酸和/或鸟苷酸。
优选实施方案详述
在下文详细描述本发明。
1.本发明的细菌
本发明的细菌是属于埃希氏菌属或芽孢杆菌的细菌，其具有产生嘌呤核苷的能力，其中将蛋白质的活性增强。活性增强的蛋白质可以是具有SEQ IDNO：2中所示氨基酸序列的蛋白质，或是包含SEQ ID NO：2中所示序列的蛋白质，其中将一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有使细菌对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤具有抗性的活性。术语“属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的细菌”或“埃希氏菌属或芽孢杆菌属细菌”的意思是所述细菌根据微生物学领域技术人员已知的分类法归类为埃希氏菌属或芽孢杆菌属。属于埃希氏菌属的微生物的实例是大肠杆菌(E.coli)。属于芽孢杆菌属的微生物的实例包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。枯草芽孢杆菌的实例包括枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(ATCC6051)和枯草芽孢杆菌PY79菌株(Plasmid，1984，12，1-9)。解淀粉芽孢杆菌的实例包括解淀粉芽孢杆菌T菌株(ATCC 23842)和解淀粉芽孢杆菌N菌株(ATCC 23845)。枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(ATCC6051)、解淀粉芽孢杆菌T菌株(ATCC 23842)和解淀粉芽孢杆菌N菌株(ATCC 23845)可以从美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，VA.，20110-2209，U.S.A.)获得。
短语“产生嘌呤核苷的能力”意指产生并且在培养基中积累肌苷、鸟苷、黄苷或腺苷的能力。术语“具有产生嘌呤核苷的能力”意指属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的微生物能够以大于大肠杆菌野生型菌株(如大肠杆菌W3110和MG1655)或解淀粉芽孢杆菌野生型菌株(如解淀粉芽孢杆菌K)的量产生并且在培养基中积累肌苷、鸟苷、黄苷或腺苷。优选地，这意味着所述微生物能够产生并且在培养基中积累不少于10mg/L、更优选不少于50mg/L的嘌呤核苷如肌苷、鸟苷、黄苷或腺苷。
短语“蛋白质的活性增强”意指使细胞中蛋白质分子的数目增加，或使每蛋白质分子的活性增加。术语“活性”意指当与活性未增强的菌株相比细菌中的所述活性增强时，该细菌成为对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤有抗性的。
本发明的蛋白质包括如下定义的那些：
(A)具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质，和
(B)具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质，其中将一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有使细菌对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤具有抗性的活性。本发明的蛋白质可以称为YeaS蛋白。YeaS蛋白是一种高疏水性蛋白质，其通常由212个氨基酸组成，并且含有6个预测的跨膜区段，然而这种蛋白质的功能是未知的(http://ecocyc.org，http://www.tcdb.org)。YeaS蛋白由yeaS基因编码。yeaS基因(GenBank登录号NC_000913的序列中的编号1878145-1878783)位于大肠杆菌染色体上yeaR和yeaT基因之间。yeaS(现重新命名为leuE)基因可能编码一种涉及氨基酸输出的蛋白质(俄罗斯专利第2175351号；Aleshin等，TIBS，1999；Kutukova等，FEBS Letters，579，4629-4634，2005)。
缺失、取代、插入或添加的“几个”氨基酸的数目可以根据氨基酸在蛋白质三维结构中的位置或氨基酸的类型而不相同。对于SEQ ID NO：2中所示蛋白质，该数目可以是1-27，优选1-15，并且更优选1-5。
短语“对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的增强的抗性”意指细菌能够在含有野生型或亲本菌株无法生长的浓度的8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的基本培养基中生长。这个短语也可以意指细菌在含有8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的培养基中能够比该细菌的野生型或亲本菌株生长得更快。所述嘌呤碱基类似物的浓度通常是10-5000μg/ml，优选50-1000μg/ml。
用于增强本发明的蛋白质的活性的技术，特别是用于增加细胞中蛋白质分子数的技术，包括但不限于，改变编码本发明蛋白质的DNA的表达调节序列，和/或增加基因的拷贝数。
改变编码本发明蛋白质的DNA的表达调节序列能够通过将DNA置于强启动子的调控下来实现。例如，已知lac启动子、trp启动子、nlpD基因的启动子、trc启动子、λ噬菌体的P_L启动子、pLF22质粒上repA基因的启动子为强启动子。可选的是，启动子能够通过如下方式增强，例如将突变引入启动子，其致使位于该启动子下游的结构基因的转录水平增加。此外，mRNA的可译性(translatability)能够通过在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区引入突变来增强。例如，依赖于起始密码子之前三个核苷酸的性质，发现了在表达水平中20倍的变化范围(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等，EMBO J.，3，623-629，1984)。除此之外，编码本发明蛋白质的DNA在芽孢杆菌属细胞中的表达能够通过将所述DNA置于芽孢杆菌属特异性的RBS，例如，枯草芽孢杆菌purE基因的RBS之下来实现(见实施例4)。
此外，为了增加基因的转录水平，可以引入增强子。将含有基因或启动子的DNA引入染色体在例如日本专利申请公开第1-215280号(1989)中描述。
可选的是，基因的拷贝数可以通过将基因插入多拷贝载体，继而将该载体引入微生物来增加。能够使用的载体包括：大肠杆菌质粒载体如pMW118、pBR322、pUC19、pBluescript KS+、pACYC 177、pACYC184、pAYC32、pMW119、pET22b；大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体如pHY300PLK、pGK12、pLF14、pLF22等等；噬菌体载体如11059、1BF101、M13mp9、Mu噬菌体(日本专利申请公开第2-109985号)等等；和转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))，如Mu、Tn10、Tn5，等等。也有可能通过利用质粒、转座子等藉由同源重组将该基因整合入染色体来增加基因的拷贝数。
使用强启动子或增强子的技术可以与基于增加基因拷贝的技术组合。
用于制备染色体DNA、杂交、PCR、制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸等的方法可为本领域技术人员熟知的普通方法。这些方法在Sambrook，J.，和Russell D.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，Third Edition(分子克隆实验指南，第三版)”，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)等中描述。
为了培育编码本发明的蛋白质的基因的表达增加的、属于埃希氏菌属的微生物，可以基于有关大肠杆菌基因的可用信息通过PCR(聚合酶链式反应)获得基因的必要区域。例如，yeaS基因似乎编码一种转运物，可以使用PCR从大肠杆菌K12W3110或大肠杆菌MG1655的染色体DNA克隆该基因。染色体DNA可以源自或获得自任何其它大肠杆菌菌株。
本发明的蛋白质包括因天然多样性而存在的YeaS蛋白的突变体和变体，只要所述突变体和变体仍具有YeaS蛋白的功能特性，即，至少能够赋予对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的抗性。编码突变体和变体的DNA能够通过如下方式获得：分离在严紧条件下与yeaS基因(SEQ ID NO：1)的互补DNA或该基因的一部分的互补DNA杂交的DNA，并且该DNA编码增强嘌呤核苷产生的蛋白质。术语“严紧条件”意指形成所谓的特异性杂合体，并且不形成非特异性杂合体的条件。例如，严紧条件包括如下条件：在该条件下，具有高同源性的DNA，例如具有不少于70％、80％、90％或95％同源性的DNA相互杂交。或者，严紧条件的示例是Southern杂交中的常规洗涤条件，例如，60℃、1xSSC、0.1％SDS，优选0.1x SSC、0.1％SDS，更优选65℃、0.1x SSC、0.1％SDS。作为用于编码变体并且与yeaS基因杂交的DNA的探针，也可以使用SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列。这种探针可以通过PCR使用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列产生的寡核苷酸作为引物，并使用含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA片段作为模板来制备。当使用长度约300bp的DNA片段作为探针时，杂交用洗涤条件可以是，例如，50℃、2x SSC和0.1％SDS。
只要维持了YeaS蛋白的活性，YeaS可以具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在一个或多个位置取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸。在本文中，尽管术语“几个”依赖于氨基酸残基的类型和氨基酸残基在蛋白质三维结构内的位置，但是该术语意指1-27，优选1-15，并且更优选1-5。
SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的上述突变优选是不削弱蛋白质活性的保守突变。取代意指这样的突变，其中将氨基酸序列中的至少一个残基去除，并且在该位置插入一个或多个残基。保守取代包括：用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。
本发明的细菌能够通过在具有产生嘌呤核苷的天然能力的细菌中增强本发明的蛋白质的活性来获得。或者，本发明的细菌能够通过将产生嘌呤核苷的能力赋予已经增强了所述蛋白质的活性的细菌来获得。
产生嘌呤核苷并且有待增强本发明蛋白质的活性的亲本菌株可以是大肠杆菌菌株FADRaddedd(pMWKQ)(WO99/03988)。这种菌株是已知菌株W3110的衍生菌株，其具有在编码PRPP酰胺转移酶的purF基因、编码嘌呤阻抑物的purR基因、编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因、编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因、编码腺苷脱氨酶的add基因、编码6-磷酸葡糖酸脱水酶的edd基因中引入的突变(WO9903988)，并且其含有pMWKQ质粒，该质粒含有编码对GMP不敏感的PRPP酰胺转移酶的purFKQ基因(WO9903988)。
可以用于本发明的属于芽孢杆菌属的亲本菌株的实例是枯草芽孢杆菌菌株KMBS16-1。这种菌株是产肌苷菌株枯草芽孢杆菌KMBS16的衍生菌株(US2004-0166575)，其中将purA::erm突变变为purA::cat突变。而枯草芽孢杆菌KMBS16是已知枯草芽孢杆菌trpC2的衍生菌株，其具有在编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因中引入的突变(purA::erm)、在编码嘌呤阻抑物的purR基因中引入的突变(purR::spc)，和在编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因中引入的突变(deoD::kan)(俄罗斯专利第2239656号)。可以用于本发明的属于芽孢杆菌属的其它亲本菌株包括属于芽孢杆菌属的产肌苷的细菌菌株，如枯草芽孢杆菌菌株AJ12707(FERM P-12951)(日本专利申请JP6113876)、枯草芽孢杆菌菌株AJ3772(FERM-P 2555)(日本专利申请JP62014794)、短小芽孢杆菌NA-1102(FERM BP-289)、枯草芽孢杆菌NA-6011(FERM BP-291)、“枯草芽孢杆菌”G1136A(美国专利3,575,809)(其作为解淀粉芽孢杆菌AJ1991(VKPM B-8994，WO2005095627)在2005年3月10日保藏在VKPM(俄罗斯国家工业微生物保藏中心(the Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms)，Russia，117545Moscow，1Dorozhny proezd，1))、枯草芽孢杆菌NA-6012(FERM BP-292)(美国专利4,701,413)、短小芽孢杆菌Gottheil第3218号(ATCC No.21005)(美国专利3,616,206)、解淀粉芽孢杆菌菌株AS115-7(VKPM B-6134)(俄罗斯专利第2003678号)等等。
为了增加每个蛋白质分子的活性，也可以将突变引入本发明的蛋白质的结构基因以增加由该基因编码的蛋白质的比活性。为了将突变引入基因，可以使用定点诱变(Kramer，W.和Frits，H.J.，Methods in Enzymology，154，350(1987))、重组PCR(PCR Technology，Stockton Press(1989))、化学合成DNA的特定部分、用羟胺处理感兴趣的基因、通过UV照射或化学剂如亚硝基胍或亚硝酸处理具有感兴趣的基因的微生物菌株等。蛋白质活性增强的微生物可以通过如下方式筛选：将候选菌株培养在含有未经修饰的菌株或野生型菌株无法生长的量的8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的基本培养基中。或者，蛋白质活性增强的微生物可以通过如下方式筛选：鉴定在含有8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的培养基中与该微生物的未经修饰的菌株或野生型菌株相比生长得更快的菌株。
本发明的细菌可以通过增强嘌呤生物合成中涉及的一种或多种基因的表达来进一步改进。这些基因包括大肠杆菌的pur调节子(Escherichia coli andSalmonella，第二版，主编：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)或枯草芽孢杆菌的pur操纵子(Bacillus subtilis and other Gram-positivebacteria.主编：A.L.Sonenshein.ASM Press，Washington D.C.，1993)。已经描述了这样的产肌苷大肠杆菌菌株，该菌株具有编码不受GMP和AMP反馈抑制的PRPP酰胺转移酶的突变purF基因，和失活的编码嘌呤核苷酸生物合成系统中的阻抑物的purR基因(WO9903988)。
通过增强本发明的蛋白质的活性来增强细菌的嘌呤核苷产生的机制可能是靶嘌呤核苷分泌增加的结果。
2.用于产生嘌呤核苷如肌苷和/或鸟苷的方法
本发明的方法包括用于产生核苷如肌苷和/或鸟苷的方法，并且包括以下步骤，将本发明的细菌在培养基中培养以允许所述核苷产生并且继而在培养基中积累，和从培养基收集核苷。
在本发明中，培养、从培养基收集和纯化嘌呤核苷等可以按照类似于常规发酵的方式来进行，其中使用微生物来产生嘌呤核苷。用于嘌呤核苷产生的培养基可以是常规培养基，其包含碳源、氮源、无机离子和需要的其它有机组分。作为碳源，可以使用糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解物；醇，如甘油、甘露醇和山梨醇；有机酸，如葡糖酸、延胡索酸(fumaric acid)、柠檬酸和琥珀酸，等等。作为氮源，可以使用无机铵盐，如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵；有机氮，如大豆水解物；氨气；氨水，等等。理想的是维生素如维生素B1；所需物质，例如，有机营养物如核酸如腺嘌呤和RNA；或酵母提取物等可以以适当的量，或者甚至痕量存在。这些之外，如有必要，也可添加小量的磷酸钙、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养优选在需氧条件下进行16-72小时，培养过程中的培养温度优选控制在30-45℃，并且优选将pH控制在5-8。pH可以通过使用无机或有机的酸或碱物质以及氨气来调节。
培养之后，固体如细胞可以通过离心或膜过滤从液体培养基中去除，其后可以通过任何常规技术的组合(如通过使用离子交换树脂和沉淀法)从发酵液回收靶嘌呤核苷。
3.用于产生嘌呤核苷酸如5’-肌苷酸和/或5’-鸟苷酸的方法
本发明的方法包括用于产生嘌呤核苷酸的方法，其包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌以产生嘌呤核苷，并使嘌呤核苷磷酸化以生成5’-嘌呤核苷酸，并且收集5’-嘌呤核苷酸。
短语“5’-核苷酸”用于本文包括5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸、5′-黄苷酸和5’-腺苷酸，优选5’-肌苷酸和/或5’-鸟苷酸。肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷磷酸化生成5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸、5’-黄苷酸和5’-腺苷酸。
在本发明中，培养、从培养基收集和纯化嘌呤核苷如肌苷和/或鸟苷等，可以按照类似于常规发酵的方式进行，其中使用微生物产生肌苷和/或鸟苷。此外，在本发明中，磷酸化嘌呤核苷如肌苷和/或鸟苷，和收集5’-嘌呤核苷酸肌苷酸和/或5’-鸟苷酸，可以按照类似于常规方法的方式进行，其中嘌呤核苷酸如5’-肌苷酸和/或5’-鸟苷酸产自嘌呤核苷如肌苷和/或鸟苷。
嘌呤核苷的磷酸化可以使用不同的磷酸酶、核苷激酶或核苷磷酸转移酶以酶法进行，或者可以使用磷酸化剂如POCl₃以化学方法，或以其它方法进行。可以使用磷酸酶，其能够催化焦磷酸C-5’位的磷酰基选择性转移至核苷(Mihara等，Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatasefrom Morganella morganii.Appl.Environ.Microbiol.2000，66：2811-2816)。也可以使用利用多聚磷酸(盐)、苯基磷酸(盐)或氨甲酰磷酸(盐)作为磷酸供体的酸性磷酸酶(WO9637603A1)等。同样，也可使用能够利用对硝基苯基磷酸盐(Mitsugi，K.等，Agric.Biol.Chem.1964，28，586-600)、无机磷酸盐(JP 42-1186)或乙酰磷酸盐(JP 61-41555)作为底物催化磷酰基转移至核苷的C-2’、3’或5’-位的磷酸酶等。可使用来自大肠杆菌的鸟苷/肌苷激酶(Mori等.Cloning of aguanosine-inosin kinase gene of Escherichia coli and characterization of thepurified gene product.J.Bacteriol.1995.177：4921-4926；WO9108286)等。可使用Hammer-Jespersen，K.描述的核苷磷酸转移酶(Nucleoside catabolism，第203-258页.于A Munch-Petesen(编)，Metabolism of nucleotides，nucleosides，and nucleobases in microorganism.1980，Academic Press，New York)等。可以使用磷酸化剂如POCl₃(Yoshikawa等Studies of phosphorylation.III.Selectivephosphorylation of unprotected nucleosides.Bull.Chem.Soc.Jpn.1969，42：3505-3508)等来进行核苷的化学磷酸化。
在本发明的方法中，细菌也可以经修饰以具有嘌呤核苷生物合成中涉及的基因的增强表达。

附图简述
图1显示PnlpD-yeaS构建体的结构。
图2显示pLF-YeaS质粒的结构。
实施例
实施例1.将yeaS基因克隆至强组成型P_nlpD启动子下并且将克隆的构建体整合入染色体
已经报导了大肠杆菌菌株K-12的完整核苷酸序列(Science，277，1453-1474，1997)。PSI-BLAST搜索揭示了在大肠杆菌K-12基因组中存在至少4个rhtB平行同源物(paralogue)，包括yeaS基因。yeaS基因编码一种其功能未知的跨膜蛋白。
基于报导的核苷酸序列，合成了SEQ ID NO：3(引物1)和SEQ ID NO：4(引物2)中所示引物。通过常规方法制备了大肠杆菌菌株MG1655的染色体DNA。PCR在“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”上在以下条件下进行：95℃40秒，47℃40秒，72℃40秒，30个循环，使用Taq聚合酶(Fermentas)。将PCR片段用SalI和XbaI消化，再克隆入质粒pMIV-P_nlpD的SalI和XbaI位点并且置于大肠杆菌nlpD基因启动子的调控下。pMIV-P_nlpD通过将cat基因、启动子和编码预测的外膜脂蛋白的nlpD基因的RBS连续克隆至pM1的Mu噬菌体附着位点之间来获得(俄罗斯专利第2212447号，Kutukova等，FEBS Letters，579，4629-4634，2005)。这种cat-P_nlpD-yeaS表达盒(图1)向大肠杆菌TG1(K12，del(lac-pro)，supE，thi，hsdD5/F′traD36，proA+B+，lacIq，lacZdelM15)染色体中的整合以Mu整合系统使用辅助质粒pMH10进行，如俄罗斯专利第2212447号中所述。大肠杆菌TG1菌株可以获得自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganismsand Cell Cultures)，Inhoffenstrasse 7B，38124，Braunschweig，Germany)。
由此，获得了菌株TG1::P_nlpD-yeaS。
实施例2：yeaS基因过表达对大肠杆菌菌株TG1对嘌呤碱基类似物的抗性的作用
用于菌株TG1::P_nlpD-yeaS和亲本菌株TG1的嘌呤碱基类似物的最小抑制浓度(MIC)在含有逐级浓度(graded concentrations)的抑制剂的M9葡萄糖基本琼脂平板上测定。用来自在基本培养基中生长的过夜培养物的10⁵至10⁶个细胞点样所述平板。在37℃温育44小时之后评估生长。结果示于表1。
从表1可见，yeaS基因的过表达增加了细胞对8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤的抗性。已知yeaS(leuE)基因编码氨基酸流出中涉及的膜蛋白(俄罗斯专利第2175351号；Aleshin等，TIBS，1999；Kutukova等，FEBS Letters，579，4629-4634，2005)。因此，YeaS蛋白具有广泛特异性并且也涉及嘌呤衍生物的分泌。
表1.

实施例3.yeaS基因过表达对大肠杆菌产肌苷菌株的肌苷生产的作用
将产肌苷菌株大肠杆菌FADRaddedd(pMWKQ)(WO99/03988)通过在TG1::P_nlpD-yeaS菌株上生长的噬菌体P1转导。在含有10μg/ml氯霉素和75μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择转导子。由此，获得了菌株大肠杆菌FADRaddedd::_P_nlpD-yeaS(pMWKQ)。将这种菌株和亲本菌株大肠杆菌FADRaddedd(pMWKQ)各自在含75μg/ml卡那霉素的L-培养液(L-broth)中在37℃培养18小时，再将0.3ml培养物接种至20x200mm试管内3ml含75mg/l卡那霉素的发酵培养基中，并用回转式摇床在37℃培养72小时。
发酵培养基的组成(g/l)：
葡萄糖         40.0
(NH₄)₂SO₄      16.0
K₂HPO₄         1.0
MgSO₄·7H₂O    1.0
FeSO₄·7H₂O    0.01
MnSO₄·5H₂O    0.01
酵母提取物     8.0
CaCO₃          30.0
葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2小时。将pH调节至7.0。灭菌之后将抗生素加入培养基中。
培养之后，培养基中积累的肌苷量通过HPLC测定。将培养基样品(500μl)在15,000rpm离心5分钟，再将上清用H₂O稀释4倍并且通过HPLC分析。
HPLC分析用条件：柱：Luna C18(2)250x3mm，5u(Phenomenex，USA)。缓冲液：2％v/v C₂H₅OH；0.8％v/v三乙胺；0.5％v/v乙酸(冰醋酸)；pH 4.5。温度：30℃。流速(Flow rate)：0.3ml/min。注入体积(Injection volume)：5μl。检测：UV 250nm。
保留时间(分钟)：
黄苷 13.7
肌苷 9.6
鸟苷 11.4
腺苷 28.2
结果示于表2。
表2