一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用 单克隆抗体 【技术领域】
本发明涉及一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用单克隆抗体。 背景技术 相思子毒素 (Abrin) 和蓖麻毒素 (Ricin) 是从植物种子中分离的毒性很强的植物 毒素，其中相思子毒素分子量约为 62KD，pI6.9 ；蓖麻毒素分子量约为 65KD，pI7.3。 这 两种毒素具有相同的 AB 链结构和相同的致病机制，而且分子量大小也相似，具有较高的 同源性。
自美国遭受 9.11 恐怖袭击和炭疽芽孢事件发生后，世界各国开始高度关注生物 恐怖袭击。 由于这两种毒素天然资源比较丰富，制备比较容易，并且借助当今高度发达 的生物工程技术手段，还能够实现大批量生产。 毒素中毒后无特异症状，出现症状时已 经造成机体严重的器质损害，给中毒的治疗及预防带来极大的难度，具备生物毒素武器 典型特征，因此历来为外军所高度重视，相思子和蓖麻毒素均被美国疾病预防控制中心
(Centers for Disease Control，CDC) 列为最有可能作为生物恐怖袭击的生物战剂。 这两种 毒素具有极强的细胞毒性作用，相思子毒素为 IC504.8×10-11mol/L( 兔网织红细胞 )，小 鼠腹腔 LD50 达 0.04μg/kg ；而蓖麻毒素 IC50 为 1.8×10-10mol/L(Hela 细胞 ) ；小鼠腹腔 注射 LD503μg/kg。
因此，在当前国内外严峻的反恐形势下，寻求新的对相思子毒素和蓖麻毒素快 速、有效的鉴定方法，具有十分现实的军事和民防价值。 而对于相思子和蓖麻毒素的 检测和鉴定，传统的方法已不能满足当前反恐形势的要求。 因此，发展和建立多重、特 异、灵敏的相思子和蓖麻毒素检测方法是十分急需、重要的。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗相思子毒素的单克隆抗体。
本发明所提供的抗相思子毒素的单克隆抗体，是由保藏编号为 CGMCC No.4062 的 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株分泌的。
保藏编号为 CGMCC No.4062 的 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株也属于本发明的 保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测相思子毒素和 / 或蓖麻毒素的胶体金 试纸。
本发明所提供的用于检测相思子毒素和 / 或蓖麻毒素的胶体金试纸，包括样品 垫、胶金垫、反应垫和吸收垫，其依次连接 ；所述胶金垫包被有胶体金探针 ；所述反应 垫上设有检测位置 1、检测位置 2 和质控位置，检测位置 1 包被有抗相思子毒素的抗体， 检测位置 2 包被有抗蓖麻毒素的抗体，质控位置包被有抗抗体 ；所述胶体金探针为如下1) 和 2) 的混合物 ：1) 胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物 ；2) 胶体金与抗蓖麻毒素 的抗体的偶联物。
上述胶体金试纸中，检测位置 1 包被的抗相思子毒素的抗体和胶体金与抗相思 子毒素的抗体的偶联物中，抗相思子毒素的抗体可为单抗也可为多抗。
上述胶体金试纸中，检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体和胶体金与抗蓖麻毒 素的抗体的偶联物中，抗蓖麻毒素的抗体可为单抗也可为多抗。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 1 包被的抗相思子毒素的抗体中，所述抗相 思子毒素的抗体是由保藏编号为 CGMCC No.4062 的 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株分泌 的。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻 毒素的抗体为抗蓖麻毒素的多克隆抗体 ；所述胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中， 所述抗蓖麻毒素的抗体为抗蓖麻毒素的多克隆抗体。 该多克隆抗体具体可以是以脱毒的 蓖麻毒素为免疫原免疫兔得到的。 其中蓖麻毒素的氨基酸序列具体可如 SEQ ID NO ：2 所示。
上述胶体金试纸中，所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物中，所述抗相 思子毒素的抗体为抗相思子毒素的多克隆抗体。 该多克隆抗体具体可以是以脱毒的相思 子毒素为免疫原免疫兔得到的。 其中相思子毒素的氨基酸序列具体可如 SEQID NO ：1 所 示。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻 毒素的抗体为兔来源的抗蓖麻毒素的多克隆抗体 ；所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的 偶联物中，所述抗相思子毒素的抗体为兔来源的抗相思子毒素的多克隆抗体 ；所述胶体 金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中，所述抗蓖麻毒素的抗体为兔来源的抗蓖麻毒素的多 克隆抗体。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 1 包被的抗相思子毒素的抗体的浓度为 2mg/ mL，所述检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体的浓度为 1.5mg/mL。
上述胶体金试纸中，所述胶体金探针是按照包括如下步骤的方法制备得到的 ： 用 HAuCl4 水溶液和柠檬酸三钠水溶液制备得到胶体金溶液 ；
将所述胶体金溶液的 pH 值调至 8.0，再向胶体金溶液中加入抗蓖麻毒素的抗 体，混匀并放置 30min，再加入抗相思子毒素的抗体，混匀并放置 30min，再用牛血清白 蛋白进行封闭，离心，收集沉淀 ；重悬沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联 物与胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针 ；所述抗蓖 麻毒素的抗体与所述胶体金溶液的配比为 3mg ∶ 100ml，所述抗相思子毒素的抗体与所述 胶体金溶液的配比为 3mg ∶ 100ml ；
上述胶体金试纸中，所述样品垫的材质是玻璃纤维素膜，所述胶金垫的材质是 玻璃纤维素膜，所述反应垫的材质是硝酸纤维素膜，所述吸收垫的材质是吸水滤纸 ；
所述抗抗体为羊抗鼠抗体。
上述任一所述的单抗可以用细胞体外培养的方法制备得到。
胶体金试纸条中胶体金与抗体通过静电引力和疏水作用结合，因而不会影响抗 体活性。 胶体金本身具有肉眼可见的颜色，无需仪器即可判读结果，无需洗涤，不形成免疫复合物的标记抗体通过层析作用自动分离，既简化了操作步骤，又减少了影响实验 结果的干扰因素。 该法通常能在 15min 内完成检测，样品处理方法简便、操作灵活、运 输方便、不需要其他辅助仪器，结果可直观判断，而且试纸条自带质量控制线，实验结 果一目了然。 本发明的胶体金试纸具有敏感度高、特异性高、精密度高、准确度高、成 本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。 用本 发明试纸检测相思子毒素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易 推广应用。 附图说明
图 1 为试纸条灵敏度检测结果。
图 2 为试纸条特异性检测结果。
图 3 为试纸条稳定检测结果。
图 4 为试纸条对模拟样品的检测结果。 具体实施方式 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
硝酸纤维膜 (NC 膜 )，购于美国 Millipore 公司，产品目录号为 HFB 504 ；玻璃 纤维膜，购于美国 Millipore 公司 ；吸水滤纸购自 Minipore 公司。
实施例 1、相思子毒素单克隆抗体和多克隆抗体的制备
一、杂交瘤细胞的制备
( 一 ) 抗原制备
重 组 质 粒 pET-HisA 在 文 献 (Abrin-aA chain expressed as soluble form in Escherichiacoli from a PCR - synthesized gene is catalytically and functionally active Li - ChunWang a ， b ， Lin Kang a ， Ting - Mao Hu b ， Jing - LinWang a ， * Biochimie 86(2004)327-333) 中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所得到。 质粒 pET-HisA 中含有相思子毒素 A 链的编码基因。
1、相思子毒素 A 链重组基因工程菌表达抗原蛋白
将重组质粒 pET-HisA 转入 E.coli BL21 中， Amp 抗性筛选，测序鉴定，得到阳 性重组菌，记作 BL21-pET-HisA。 将重组工程菌 BL21-pET-HisA 按 1 ∶ 100 接入 Amp 抗性 LB 培养基中，130rpm，37℃过夜培养。 次日将过夜培养的菌体按 1 ∶ 100 接入 Amp 抗性 LB 培养基中，200rpm，37℃，5h 待 OD600 约 0.6 时分别保菌，并加入 IPTG 1mmol/ L，200rpm、37 ℃，4h 诱导表达。 将诱导表达后的菌体 6000rpm，4 ℃，离心 10min 后 弃上清，将菌体加入 PBS 重悬，6000rpm、4 ℃、离心 10min 弃上清。 将收集的菌体加 入无咪唑 Buffer 混匀，冰浴超声破碎，至液体清亮后离心分别收集上清和沉淀，收集的 上清即为可溶性目的蛋白溶液。 2×SDS，12％变性蛋白电泳分析。 结果蛋白分子量为 31.0kDa。
2、相思子毒素 A 链重组基因工程菌表达抗原蛋白纯化
亲和纯化标签是 6× 组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍金属离子，
在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低 pH 下用咪唑竞争洗 脱。
将 5mL 次氨基三乙酸 (NTA， Amersham 公司 ) 层析介质装入 2cm×10cm 玻璃 层析柱中，用去离子水洗数遍，直至介质中的乙醇被洗尽，然后缓慢加入 5 体积 0.1M 的 NiSO4，使 Ni2+ 与介质充分结合，以 5 体积去离子水洗柱，除去未与介质结合的 NiSO4， 用 5 体积的平衡液平衡柱，将收集的蛋白经 0.45μm 滤器过滤后装人镍柱，依次用含 30mM、40mM、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM 咪唑的平衡液洗脱，每个咪 唑浓度 5mL×5 次洗脱 ( 即 5 个柱体积 )，分步收集。 2×SDS，12％变性蛋白电泳分析。
以 Ni-NTA 亲和柱纯化来自 500mL 表达工程菌中的相思子重组蛋白 A，经咪唑 浓度梯度洗脱，结果目的蛋白均出现在 100mM 咪唑浓度第 2 柱体积开始洗脱下来的溶 液中，穿透液中无目的蛋白。 分别收集 100mM-2、3、4、5、6( 柱体积 )，150mM-1、 2( 柱体积 )，经 BandScan5.0 图像软件分析，重组蛋白 A 的纯度为 96.2％。 由于重组蛋 白液的体积稍变大，采用超滤法来浓缩蛋白，使蛋白浓度达到 4mg/mL。
( 二 ) 动物免疫
以实验 ( 一 ) 中制得的蛋白作为免疫原，取 50μg 免疫原与等体积的福氏完全佐 剂充分混匀，首免 BALB/c 健康小鼠，鼠龄在 6 ～ 8 周，0.5ml/ 只，腹腔注射。 两周后 用 100ug 蛋白和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；隔三周后再用 100ug 蛋白和等体积 福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；二免后每周断尾取血，间接 ELISA 测定效价。 细胞融合 前 3 天加强免疫一次。 ( 三 ) 细胞融合和克隆化
鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按 7 ∶ 1 比例 ( 数量配比 ) 与 SP2/0 骨髓 瘤细胞融合，采用间接竞争 ELISA 测定细胞上清液，筛选阳性孔。 利用有限稀释法对阳 性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌相思子毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细 胞株命名为 2 号 (1F8C5C3H1)，该细胞株已于 2010 年 8 月 17 日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC，地址 ：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏编号为 CGMCC No.4062，分类命名 为 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株。
二、单克隆抗体的制备
( 一 ) 由杂交瘤细胞制备单抗的方法 ：将已经建立的杂交瘤细胞株 CGMCC No.4062 接种于细胞培养基中，置于 37℃和 5％ CO2 孵箱中培养，每隔 2d 换一次细胞培 养基，待细胞浓度大于 105/ml 时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。 收集培养上清， 1500rpm，离心 10 分钟，取上清 ；上清含有高水平的单克隆抗体， -20℃保存备用。 所 述细胞培养基为无血清培养基 ( 购于美国 BioWhittaker 公司，产品目录号为 ：12-727F)， 所述细胞培养基的 pH 为 7.4。
( 二 ) 单抗纯化方法 ：
琼脂糖亲和层析柱购自 Amersham 公司，产品目录号为 17-5080-01。
用琼脂糖亲和层析柱进行纯化。 具体步骤如下 ：将亲和柱以平衡缓冲液 (1L 平衡缓冲液由 1000ml 20mM PB 缓冲液和 300mmol NaCl 组成， pH7.8) 平衡，待柱平衡 后，将步骤 ( 一 ) 得到的上清经 0.45μm 滤膜滤过后以 1mL/min 流速上柱，用平衡缓冲
液以 1mL/min 流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液 (0.1M 柠檬酸缓冲 液，pH4.0) 将抗体洗下。 收集洗下的抗体，收集试管事先已加适量的 1mol/L，pH 9.0 的 Tris-HCI，使 pH 恢复至 7.4 左右，以免失去活性。 纯化好的抗体以 PB(5mM，pH7.4) 工 作液 4℃透析，24h，每 8h 换一次液，再 10000r/min 离心 30min，收集上清， -70℃保存 备用。
( 三 ) 单抗鉴定方法 ：12％ SDS 变性电泳分析纯度达 95％。
三、单抗的性能验证
包被液按照如下方法配制 ：Na2CO31.59 克，， NaHCO32.93 克，用 NaOH 调 pH 至 9.6，定容至 1000ml 密封盖好，4℃存放备用 ；
封闭液按照如下方法配制 ：称取 3g BSA 溶于 100mlPBST 中备用 ；
洗涤液 (PBST) 按照如下方法配制 ：将 999.5ml PBS(0.01M、 pH7.2) 缓冲液和 0.5mlTween-20 混合，得到洗涤液。
( 一 ) 相对亲和力常数
脱毒的天然相思子毒素按照实验四中所述方法制备。
间接 ELISA 测定单抗相对亲和常数，将脱毒的天然相思子毒素用包被液稀释至 8μg/ml，加入酶联孔，100μl/ 孔，4℃过夜。 次日，吸出孔内液体，用洗涤液洗板三 遍，在加入封闭液，150μl/ 孔，37 ℃孵育 1h 后弃孔内液体，重复洗板步骤。 将纯化 好的单克隆抗体梯度稀释 100μg/ml ～ 0.0125μg/ml( 具体为 100μg/ml、50μg/ml、 25 μ g / ml 、 12 . 5 μ g / ml 、 6 . 25 μ g / ml 、 3 . 125 μ g / ml 、 1 . 6 μ g / ml 、 0 . 8 μ g / ml 、 0 . 4 μ g / ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml)，100μl/ 孔， 37℃孵育 1h。 洗板后加入稀释好的酶标二抗 ( 羊抗鼠 IgG)，100μl/ 孔，37℃孵育 1h 后 洗板显色，于波长 450nm 测定 A 值。 以 McAb 的不同浓度为横坐标，以其相应的 A 值为 纵坐标，绘制 McAb 的测定曲线。 以各曲线上部趋于平坦段的 A 值为 100％，找出 50％ A 值对应的 McAb 的浓度，其倒数即为本株 McAb 的相对亲和力常数，为 5.26×106。
( 二 ) 效价与特异性
应用间接 ELISA 法进行。将 BSA 蛋白 ( 阴性对照 )、蓖麻毒素、相思子毒素分别 用包被液稀释，包被酶联板，每孔 100μL( 浓度为 10μg/mL)，4℃过夜后，以 PBST 洗 3 次，用封闭液进行封闭，37℃放置 1h， PBST 洗 3 次，加入梯度稀释的抗体 ( 抗体的初 始浓度为 2mg/mL)1 ∶ 102，1 ∶ 103，1 ∶ 104，1 ∶ 105，1 ∶ 106，(100μL/ 孔 )，设置 空白对照，37℃作用 1h，用 PBST 洗 3 次，加入 PBST 稀释羊抗鼠 IgG(1 ∶ 60000 稀释， 100μL/ 孔 )，37℃作用 1h，用 PBST 洗 3 次，加显色液 OPD，显色 5min 后，用 2mol/L H2SO4 终止反应，测 A450 值，阴性均值的 2.1 倍判定为阳性。 抗体在 1 ∶ 105 时经肉眼 观察和测 A450 值均为阳性，故判定其抗体效价达 105。 抗体与蓖麻毒素包被的酶联孔经 肉眼观察和测 A450 值均为阴性，说明该抗体与蓖麻毒素无交叉反应，特异性良好。
四、相思子毒素多克隆抗体的制备
( 一 ) 脱毒的相思子毒素制备
相思豆在文献 ( 相思豆毒素研究及应用王利春，王景林生物技术通讯 .Vol15. No2， Mar，2004) 中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所获得。氨苯基 -β-D- 半乳糖苷琼脂糖亲和介质 (Sigma)、SephacrylTMS-100G75 凝胶预 装柱 (GE)、玻璃层析柱 5mL2cm×10cm(AKTA)。
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺 (TEMED)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、十二烷基硫酸钠 (SDS)、考马斯亮蓝 R250、二硫苏糖醇 (DTT) 等均为 Sigma 公 司产品 ；低分子量蛋白 marker(Amersham Biosciences)、硫酸铵 (Amresco0191) 其余缓冲 液试剂磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵等均为国产分析纯 ；实验用 水为亚沸蒸馏水、透析袋 (DM-10mm)。
提取 ：
将 相 思 豆 去 壳 后 称 取 100g， 浸 泡 于 PBS(0.01M， pH7.2) 中 24h， 至 种 子 肿 胀 ；浸 泡 后 的 种 子 以 dd H2O 反 复 冲 洗 去 除 种 子 上 外 膜 及 颜 色， 将 洗 净 的 种 子 置 于 500mLPBS(0.01M， pH7.2) 缓冲液中，于匀浆机中匀浆，并于 4 ℃条件下放置 24h ；次 日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣后，在 4 ℃下以 12000rpm 离心 20min，取上清液， 0.45μm 滤膜过滤，上清液调 pH7.2，为黄绿色液体 ；向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶 液 (pH7.4) 至饱和度为 30％，4℃磁力搅拌 1h 后静止 1 小时，12000rpm 离心 20min，弃沉 淀 ；将上清液继续加饱和硫酸铵液体至 90％饱和度，4℃磁力搅拌 1h，静止过夜 24h ；次 日混合液在 4℃条件下以 12000rpm 离心 20min，取沉淀为黄绿色 ；将沉淀用 PBS 缓冲液 (10mM，pH 7.4)50mL 溶解后，于 4℃条件下对 PBS 缓冲液透析 48h( 每 8h 换一次液 )，透 析后经 1200g 4℃离心 20min，取上清，即为相思子毒素粗提液，蛋白定量，12％变性、 非变性 SDS 电泳分析 ；-20℃冰冻保存。
亲和层析纯化 ：亲和层析介质为氨苯基 -β-D- 半乳糖苷琼脂糖亲和介质 ( 购自 sigma 公司，产品目录号为 A-0414)。 取 5mL 亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱，注 意避免产生气泡和断层，以至少 10 倍柱床体积的 PBS 进行清洗平衡。 将相思子毒素粗提 液经 0.45μm 的滤膜过滤后，以平衡液 10 倍体积稀释，以 1mL/min 流速加入层析柱内， 使相思子毒素和凝集素充分吸附在柱上。 待相思子毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脱杂蛋白，流速控制在 1mL/min 左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有 0 ～ 0.2M 半乳糖 的 PBS 缓冲液进行步进式梯度洗脱，整个过程分部收集，紫外检测其吸收值进行监控。 收集各吸收峰处组分，真空干燥离心浓缩后对 PBS 透析除去半乳糖，冰冻备用。 透析袋 应煮沸清洗后使用，透析时每隔 2h 更换一次透析液，随着透析时间的延长，更换透析液 的时间也可适当延长，时间总计 24h 以上。 平衡液为 0.01M， pH7.2 的 PBS 缓冲液。
凝 胶 过 滤 层 析 ：凝 胶 过 滤 柱 为 SephacrylTMS-100G75 凝 胶 预 装 柱， 购 自 Amersham 公司。 将亲和层析浓缩后的样品经 0.22μm 的滤膜过滤后上样，上样体积 为 3mL，浓度 10mg/mL 左右 ；以 PBS 为洗脱液进行洗脱，流速 0.5mL/min，分部收集 3mL/ 管，紫外测定后合并第二吸收峰各组分，12％变性、非变性 SDS 电泳分析为相思子 毒素蛋白 ；得到的相思子毒素透析、浓缩后 -20℃保存。
脱毒 ：用 PBS(0.1M， pH 7.4) 稀释凝胶过滤后的相思子毒素蛋白至 0.2-0.3mg/ ml，放置 PBS 缓冲液 (0.1M， pH 8.1) 中，35℃透析 7 天，然后再放入 PBS(0.01M， pH 7.4) 中透析 48h，12000rpm 离心 10min，取上清液分装， -20℃保存。
天然的相思子毒素蛋白和脱毒的相思子毒素蛋白的氨基酸序列均为 SEQ ID NO ：1.。2、相思子多克隆抗体制备
多克隆抗体可委托生物公司制备，也可自己制备。 自己制备的方法如下 ：
用脱毒的天然相思子毒素 200μg 与等体积的福氏完全佐剂充分混匀，免疫新西 兰纯种大耳白兔。 两周后用 0.5mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强 免疫 1 次 ；隔三周后再用 1mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；此后每周耳缘静脉采血，间接 ELISA 测定效价。 加强免疫后的第 7 天，血清的效 价最高，为 106( 多抗效价测定方法与单抗效价测定方法相同，包被抗原的浓度为 10μg/ ml) ；取此血清进行多抗纯化。
用琼脂糖亲和层析柱进行纯化。 具体步骤如下 ：将亲和柱以平衡缓冲液 (1L 平衡缓冲液由 1000ml 20mM PB 缓冲液和 300mmol NaCl 组成， pH7.8) 平衡，待柱平衡 后，将兔血清经 0.45μm 滤膜滤过后以平衡缓冲液 10 倍体积稀释后，再以 1mL/min 流速 上柱，用平衡缓冲液以 1mL/min 流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液 (0.1M 柠檬酸缓冲液， pH4.0) 将抗体洗下。 收集洗下的抗体，收集试管事先已加适量的 1mol/L， pH 9.0 的 Tris-HCI，使 pH 恢复至 7.4 左右，以免失去活性。 纯化好的抗体以 PB(5mM，pH7.4) 工作液 4℃透析，24h，每 8h 换一次液，再 10000r/min 离心 30min，收 集上清， -70℃保存备用。 实施例 2、蓖麻毒素的多抗制备
一、制备脱毒的蓖麻毒素
蓖麻种子购自北京秀禾种子有限公司，产品目录号为蓖麻 1 号。
粗提 ：将蓖麻种子去壳后称取 100g，浸泡于 PBS(0.01M， pH7.2) 中 24h，至种 子肿胀 ；去壳洗净，将洗净的种子置于 500mL PBS(0.01M， pH7.2) 缓冲液中，于匀浆机 中匀浆，并于 4℃条件下浸提过夜 24h( 放置 24h) ；次日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣 后，在 4℃下以 12000rpm 离心 20min，取上清液，0.45μm 滤膜过滤，上清液调 pH7.2 ； 向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液 (pH7.4) 至饱和度为 30％，4℃磁力搅拌 1h 后静止 1 小时，12000rpm 离心 20min，弃沉淀 ；将上清液继续加饱和硫酸铵液体至 90％饱和度， 4℃磁力搅拌 1h，静止过夜 24h ；次日混合液在 4℃条件下以 12000rpm 离心 20min，取沉 淀为白色 ；将沉淀用 PB(10mM， pH 7.4)50mL 溶解后，于 4℃条件下对 PBS 缓冲液透析 48h( 每 8h 换一次液 )，透析后经 1200g 4℃离心 20min，取上清，即为蓖麻毒素粗提液， 蛋白定量，12％变性、非变性 SDS 电泳分析 ；-20℃冰冻保存。
亲和层析纯化 ：亲和层析介质为氨苯基 -β-D- 半乳糖苷琼脂糖亲和介质 ( 购自 sigma 公司，产品目录号为 A-0414)。 取 5mL 亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱， 注意避免产生气泡和断层，以至少 10 倍柱床体积的 PBS 进行清洗平衡。 将蓖麻毒素粗 提液经 0.45μm 的滤膜过滤后，以平衡液 10 倍体积稀释，以 1mL/min 流速加入层析柱 内，使蓖麻毒素和凝集素充分吸附在柱上。 待蓖麻毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脱杂蛋白，流速控制在 1mL/min 左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有 0.1M 半乳糖的 PBS 缓冲液一步洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，12％变性、非变性 SDS 电泳分析。 平衡液 为 0.01M， pH7.2 的 PBS 缓冲液。
凝 胶 过 滤 层 析 ：凝 胶 过 滤 柱 为 SephacrylTMS-100G75 凝 胶 预 装 柱， 购 自 Amersham 公司。 将亲和层析浓缩后的样品经 0.22μm 的滤膜过滤后上样，上样体积为
5mL，浓度 2mg/mL ；以 PBS 为洗脱液进行洗脱，流速 0.5mL/min，紫外测定后合并第 二吸收峰各组分，12％变性、非变性 SDS 电泳分析为蓖麻毒素蛋白 ；得到的蓖麻毒素透 析、浓缩后 -20℃保存。
脱毒 ：用 PBS(0.1M， pH 7.4) 稀释凝胶过滤后的蓖麻毒素蛋白至 0.2-0.3mg/ ml，放置 PBS 缓冲液 (0.1M， pH 8.1) 中，35℃透析 7 天，然后再放入 PBS(0.01M， pH 7.4) 中透析 48h，12000rpm 离心 10min，取上清液分装， -20℃保存。
天然的蓖麻毒素蛋白的氨基酸序列均为 SEQ ID NO ：2。
二、蓖麻毒素多克隆抗体制备
多克隆抗体可委托生物公司制备，也可自己制备。 自己制备的具体方法如下 ：
用脱毒的蓖麻毒素 200μg 与等体积的福氏完全佐剂充分混匀，免疫新西兰纯种 大耳白兔。 两周后用 0.5mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；隔三周后再用 1mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ； 此后每周耳缘静脉采血，间接 ELISA 测定效价。 加强免疫后的第 7 天，血清的效价最 高，为 106( 多抗效价测定方法与相思子毒素单抗效价测定方法相同，不同的是包被原为 蓖麻毒素，包被原的浓度为 10μg/ml) ；取此血清进行多抗纯化。 多抗纯化 ：与相思子毒素的多抗纯化方法相同。
实施例 3、胶体金试纸的制备及性能检测
一、制备
( 一 ) 样品垫的制备
样品垫的材料为玻璃纤维膜 ；
将玻璃纤维膜进行如下处理，以有效去除胶体金试纸的非特异现象及增加其灵 敏度 ：将样品垫置于含鼠血清蛋白、 pH 为 9.9、0.1mol/L 碳酸盐缓冲液中浸泡 2h，37℃ 烘 2h 备用 ；鼠血清蛋白在缓冲液中的终浓度为 0.4％ ( 体积百分含量 )。 封闭剂可以封 闭过多的结合位点，提高 PH 值可以使样品中蛋白更易结合。
( 二 ) 胶金垫的制备
1、确定最低偶联抗体浓度的确定 ：
(1) 取 11 只洁净的试管，分别编号 1、2、3、 … 7，在已编号的 7 个试管内，分 别加入 pH 值为 8.0 的胶体金溶液 1mL。 将抗相思子毒素兔多抗和抗蓖麻毒素兔多抗分别 稀释至 0.2mg/mL，并分别进行如下步骤 (2) 和 (3)。
(2) 在 2 ～ 6 号 管 内 分 别 加 入 0.2mg/mL 单 抗 溶 液 250μl、200μl、150μl、 100μl、50μl，第 1、7 管不加作对照，混匀，放置 5min。
(3) 在 2 ～ 6 号管内分别加入 10％ ( 质量百分含量 )NaCL 水溶液 100μL，1 号 管不加作对照。 混匀后室温静置 20min，观察颜色变化。 未加抗体 (7 号对照管 ) 及抗体 加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化，而加入抗体量达到 或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。 与对照管 (1 号试管 ) 相比，颜色最接近、 含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为 1mL 胶体金所必须的抗体稳定剂量。
实验结果表明，1mL 胶体金溶液的抗相思子毒素兔多抗的最低稳定剂量为 30μg，1mL 胶体金溶液的抗蓖麻毒素兔多抗的最低稳定剂量为 30μg。
2、胶体金探针制备 ：将 0.01 ％ ( 质量百分含量 )HAuCl4 水溶液煮沸，再加
入 1 ％ ( 质量百分含量 ) 柠檬酸三钠水溶液，混匀并继续加热，直到液体颜色稳定成 葡萄酒红色，得到胶体金溶液 ；其中 HAuCl4 水溶液与柠檬酸三钠水溶液的体积比为 100ml ∶ 1.5ml ；( 混匀时持续加热，一般约 10min，但主要依据液体颜色而定。 )
调节胶体金溶液 pH 值至 8.0，向胶体金溶液中先加入抗蓖麻毒素兔多克隆抗 体，混匀，室温 (25℃ ) 放置 30min，再加入抗相思子毒素兔多克隆抗体 ( 抗蓖麻毒素兔 多克隆抗体与胶体金溶液的配比为 3mg ∶ 100ml，抗相思子毒素兔多克隆抗体与胶体金 溶液的配比为 3mg ∶ 100ml ；)，混匀并室温 (25℃ ) 放置 30min ；再加入牛血清白蛋白 (BSA)(BSA 在混合溶液中的质量百分浓度为 1％；目的是封闭 )，混匀并室温 (25℃ ) 静 置 10min，再 4℃静止 15min，以 12000rpm，4℃离心 30min，弃上清，收集沉淀 ；将沉底 以重悬液 (1L 重悬液组成 ：988ml 0.01M、 pH 8.0 的 Tris-HCL 缓冲液，50g BSA，10g 蔗 糖，12ml Tween-20) 溶解，以 12000rpm，4℃离心 30min，弃上清，留下管底暗红色疏松 状沉淀 ；用重悬液重新悬浮沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物与胶体金 与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针溶液，置 4℃保存。
胶体金颗粒与胶体金探针的电镜观察 ：用透射电镜分别对胶体金颗粒与胶体金 探针进行检测。 结果，透射电镜下，可见胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致， 计数 100 个金颗粒，颗粒直径约为 25nm ；胶体金偶联抗体后，可见金颗粒外围有明显的 低电子密度晕圈，表面吸附有蛋白。 结果表明，制备的胶体金颗粒和免疫金探针合格。 3、胶金垫的制备 ：用玻璃纤维膜作支撑物，在支撑物上加胶体金探针，37℃干 燥 2.5h。
( 三 ) 反应垫的制备
用硝酸纤维素膜 (NC 膜 ) 作为支撑物，向膜上喷涂相思子毒素单抗条带、抗蓖 麻毒素兔多抗条带、羊抗鼠抗体条带。
检测带 1(T1 带 ) ：喷涂相思子毒素单抗 ( 以 5mM PBS 缓冲液稀释成 2.0、1.5、 1.0mg/mL 的浓度 )。检测带 2(T2 带 ) ：喷涂蓖麻毒素的多抗 ( 以 5mM PBS 缓冲液稀释成 2.0、1.5、1.0mg/mL 的浓度 )。 质控带 (C 带 ) ：喷涂羊抗鼠抗体 1mg/mL。 用 CAMAG 公司的 Camag Linomat 5TLC 点样仪将样品喷到 2.5mm 宽的 NC 膜上 ( 点样速度为 50mm/ s)。 把划完线的 NC 膜置于 37℃干燥 2h，得到反应垫。
用相应天然毒素检测以确定最佳的抗体喷膜浓度。 分别将天然相思子毒素和蓖 麻毒素稀释成 50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、2μg/mL，以制备好的胶体金免疫层析 试纸条按照方法检测， PBS 溶液样品作为阴性对照。 当 T1 带喷膜浓度为 1.5 或 1.0mg/ mL 时，检测相思子浓度仅达 100ng/mL 以上 ；T2 带喷膜浓度为 2.0 或 1.5mg/mL 时，检 测灵敏度均可达 50ng/mL，而喷膜浓度为 1.0mg/mL 时，灵敏度下降至 100ng/mL 以上。 应选择阳性带显色，无交叉反应且所需抗体量最低的喷膜浓度。
实验设 3 次重复，结果一致。 结果表明，最佳喷膜浓度分别为 T1 带 ：2mg/ mL， T2 带 ：1.5mg/mL，无非特异反应。
( 四 ) 试纸的制备
免疫层析试纸由吸收垫、胶金垫、反应垫和样品垫四部分依次连接而成。
吸收垫的材质是吸水滤纸。
将样品垫、胶金垫、反应垫和吸收垫依次按顺序叠加粘到 PVC 板上 ；样品垫的
末端与胶金垫的始端相连，胶金垫的末端与反应垫的始端相连，反应垫的末端与吸水垫 的始端相连，得到胶体金试纸。 组装成完整的试纸条，然后切割成 4mm/ 条，干燥避光 保存。
检测带和质控带均为与试纸条的长相垂直的条带状。
二、胶体金试纸的使用方法
取稀释好的待检测样品 100μL 加入到胶体金试纸的样品垫始端 ( 或向胶体金试 纸的样品垫中滴加稀释好的待检测样品 80μL)，15min 后，用肉眼观察检测带和质控带 的显色情况，根据其显色情况，判定样品中是否含有相思子毒素和蓖麻毒素。
判定方法如下 ：
阴性 ：当质控带显示为红色条带，而检测带不显色时，判为阴性。
阳性 ：当质控带显示为红色条带，检测带 1 同时也显示为红色条带，判为相思 子毒素阳性 ；当质控带显示为红色条带，检测带 2 同时也显示为红色条带，判为蓖麻毒 素阳性 ；当质控带显示为红色条带，检测带 1、2 同时也显示为红色条带，判为相思子和 蓖麻毒素阳性 ；
无效 ：当质控带不显色时，则无论检测带显示为红色条带与否，该胶体金试纸 均判为无效。
该胶体金试纸的检测原理 ：当在试纸的样品垫端滴加待测样品溶液后，待检溶 液流向胶金垫并与胶金垫中的胶体金探针 ( 即金标抗体 ) 通过抗原 - 抗体相互作用而结 合，并继续向反应垫扩散，并最终渗入吸收垫中。 若待检测样品溶液中含有相思子毒 素，相思子毒素与胶金垫中的抗相思子毒素的兔多克隆抗体结合，形成抗原 - 多抗复合 物，当其扩散至反应垫时，抗原 - 多抗复合物中的抗原会与检测带 1 上的抗相思子毒素单 抗结合，进而检测带 1 显色。 若待检测样品溶液中含有蓖麻毒素，蓖麻毒素与胶金垫中 的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗体结合，形成抗原 - 多抗复合物，当其扩散至反应垫时，抗 原 - 多抗复合物中的抗原会与检测带 2 上的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗体结合，进而检测带 2 显色。
三、胶体金试纸的性能检测
下述实验中，样品处理液的组成 ：PBS(0.01M， pH7.2)+0.5％ Tween-20。
相思子毒素为实施例 1 中制备，蓖麻毒素为实施例 2 中制备。
( 一 ) 灵敏度检测
实 验 组 1 ：将 相 思 子 毒 素 用 样 品 处 理 液 稀 释 成 如 下 不 同 浓 度 ：2μg/mL、 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL ；
实验组 2 ：将蓖麻毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度 ：2μg/mL、200ng/ mL、100ng/mL、50ng/mL ；
实验组 3 ：将两种毒素以相同浓度等体积混合后，再梯度稀释成 400ng/mL、 200ng/mL、100ng/mL( 即混合液中，两种毒素的浓度分别依次为 400ng/mL、200ng/ mL、100ng/mL) ；
分别用实验一制备的胶体金试纸按照实验二中所述方法检测。 同时以 PBS 缓冲 液为对照。
实验设 3 次重复，结果均一致。 结果如图 1 所示。 图中，A 表示对相思子毒素的单独检测结果 ；B 表示对蓖麻毒素的单独检测结果 ；C 表示对两种毒素的同时检测结 果；
结果显示 ：该试纸条单独检测蓖麻或相思子毒素时灵敏度达 50ng/mL，同时检 测两种毒素时灵敏度达 100ng/mL。
( 二 ) 特异性评价
葡萄球菌肠毒素 B(SEB) 购自 SIGMA 公司，产品目录号为 S0812。
将相思子毒素、蓖麻毒素、葡萄球菌肠毒素 B(SEB)、牛血清白蛋白均用 PBS 分别配制成浓度为 100ng/mL 的溶液 ；将相思子毒素和蓖麻毒素以相同浓度等体积混合 后，再梯度稀释成 100ng/mL 的溶液 ( 即混合液中，两种毒素的浓度分别为 100ng/mL)。 分别用实验一制备的胶体金试纸按照实验二中所述方法检测。
实验设 3 次重复，结果一致。结果 ：试纸条特异性良好，与葡萄球菌肠毒素 B、 牛血清白蛋白均无交叉反应 ( 图 2)。
( 三 ) 稳定性试验
将新制备的胶体金试纸条于 37℃存放 2 天、3 天、4 天或 5 天 ；取存放 5 天的试 纸进行检测，以检测试纸条的敏感性。
实验组 1(Abrin) ：将相思子毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度 ：100ng/ mL、50ng/mL ；
实验组 2(Ricin) ：将蓖麻毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度 ：100ng/mL、 50ng/mL ；
实验组 3(Both) ：将两种毒素以相同浓度等体积混合后，再梯度稀释成 200ng/ mL、100ng/mL ；( 即混合液中，两种毒素的浓度分别依次为 200ng/mL、100ng/mL)
PBS 溶液样品作为阴性对照。
实验设 3 次重复，结果一致。 结果 ：存放 2 天、3 天、4 天、5 天的试纸条的灵 敏度无显著差异 ( 图 3)，和新制备的检测试纸条相比 ( 图 1)，灵敏度没有明显下降，且 特异性仍很好。 说明该试纸条可在室温存放 6 个月 ( 根据生物制品规程中快速稳定性试 验规定 37℃存放 20 天相当于室温存放 18 个月，根据此推算 5 天相当于 6 个月 )。
( 四 ) 模拟环境检测
检测样品的制备 ：
Both ：将两种毒素以相同浓度等体积混合后，分别用下述牛奶混合液、橙汁混 合液、土壤溶液或水进行梯度稀释至如下浓度 ：400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL( 即 混合液中，两种毒素的浓度分别依次为 400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL)，分别得到 的稀释液分别用于检测。
Ricin ：将蓖麻毒素分别用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水进行梯 度稀释至如下浓度 ：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，分别得到的稀释液分别用于检 测。
Abrin ：将相思子毒素分别用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水进行 梯度稀释至如下浓度 ：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，分别得到的稀释液分别用于 检测。
1、牛奶 ：将牛奶与 PBS 缓冲液以 1 ∶ 4 的体积比混合，得到牛奶混合液 ；2、果汁 ：将橙汁与 PBS 缓冲液以 1 ∶ 4 的体积比混合，0.1M K2CO3 水溶液调节 pH7.4，得到橙汁混合液 ；
3、自来水。
4、土壤 ：用 PBS 缓冲液溶解土壤 ( 土壤与 PBS 缓冲液的配比为 2g ∶ 10ml)， 得到土壤溶液。
本发明涉及一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用单克隆抗体。 背景技术 相思子毒素 (Abrin) 和蓖麻毒素 (Ricin) 是从植物种子中分离的毒性很强的植物 毒素，其中相思子毒素分子量约为 62KD，pI6.9 ；蓖麻毒素分子量约为 65KD，pI7.3。 这 两种毒素具有相同的 AB 链结构和相同的致病机制，而且分子量大小也相似，具有较高的 同源性。
自美国遭受 9.11 恐怖袭击和炭疽芽孢事件发生后，世界各国开始高度关注生物 恐怖袭击。 由于这两种毒素天然资源比较丰富，制备比较容易，并且借助当今高度发达 的生物工程技术手段，还能够实现大批量生产。 毒素中毒后无特异症状，出现症状时已 经造成机体严重的器质损害，给中毒的治疗及预防带来极大的难度，具备生物毒素武器 典型特征，因此历来为外军所高度重视，相思子和蓖麻毒素均被美国疾病预防控制中心
自美国遭受 9.11 恐怖袭击和炭疽芽孢事件发生后，世界各国开始高度关注生物 恐怖袭击。 由于这两种毒素天然资源比较丰富，制备比较容易，并且借助当今高度发达 的生物工程技术手段，还能够实现大批量生产。 毒素中毒后无特异症状，出现症状时已 经造成机体严重的器质损害，给中毒的治疗及预防带来极大的难度，具备生物毒素武器 典型特征，因此历来为外军所高度重视，相思子和蓖麻毒素均被美国疾病预防控制中心
(Centers for Disease Control，CDC) 列为最有可能作为生物恐怖袭击的生物战剂。 这两种 毒素具有极强的细胞毒性作用，相思子毒素为 IC504.8×10-11mol/L( 兔网织红细胞 )，小 鼠腹腔 LD50 达 0.04μg/kg ；而蓖麻毒素 IC50 为 1.8×10-10mol/L(Hela 细胞 ) ；小鼠腹腔 注射 LD503μg/kg。
因此，在当前国内外严峻的反恐形势下，寻求新的对相思子毒素和蓖麻毒素快 速、有效的鉴定方法，具有十分现实的军事和民防价值。 而对于相思子和蓖麻毒素的 检测和鉴定，传统的方法已不能满足当前反恐形势的要求。 因此，发展和建立多重、特 异、灵敏的相思子和蓖麻毒素检测方法是十分急需、重要的。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗相思子毒素的单克隆抗体。
本发明所提供的抗相思子毒素的单克隆抗体，是由保藏编号为 CGMCC No.4062 的 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株分泌的。
保藏编号为 CGMCC No.4062 的 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株也属于本发明的 保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测相思子毒素和 / 或蓖麻毒素的胶体金 试纸。
本发明所提供的用于检测相思子毒素和 / 或蓖麻毒素的胶体金试纸，包括样品 垫、胶金垫、反应垫和吸收垫，其依次连接 ；所述胶金垫包被有胶体金探针 ；所述反应 垫上设有检测位置 1、检测位置 2 和质控位置，检测位置 1 包被有抗相思子毒素的抗体， 检测位置 2 包被有抗蓖麻毒素的抗体，质控位置包被有抗抗体 ；所述胶体金探针为如下1) 和 2) 的混合物 ：1) 胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物 ；2) 胶体金与抗蓖麻毒素 的抗体的偶联物。
上述胶体金试纸中，检测位置 1 包被的抗相思子毒素的抗体和胶体金与抗相思 子毒素的抗体的偶联物中，抗相思子毒素的抗体可为单抗也可为多抗。
上述胶体金试纸中，检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体和胶体金与抗蓖麻毒 素的抗体的偶联物中，抗蓖麻毒素的抗体可为单抗也可为多抗。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 1 包被的抗相思子毒素的抗体中，所述抗相 思子毒素的抗体是由保藏编号为 CGMCC No.4062 的 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株分泌 的。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻 毒素的抗体为抗蓖麻毒素的多克隆抗体 ；所述胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中， 所述抗蓖麻毒素的抗体为抗蓖麻毒素的多克隆抗体。 该多克隆抗体具体可以是以脱毒的 蓖麻毒素为免疫原免疫兔得到的。 其中蓖麻毒素的氨基酸序列具体可如 SEQ ID NO ：2 所示。
上述胶体金试纸中，所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物中，所述抗相 思子毒素的抗体为抗相思子毒素的多克隆抗体。 该多克隆抗体具体可以是以脱毒的相思 子毒素为免疫原免疫兔得到的。 其中相思子毒素的氨基酸序列具体可如 SEQID NO ：1 所 示。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体中，所述抗蓖麻 毒素的抗体为兔来源的抗蓖麻毒素的多克隆抗体 ；所述胶体金与抗相思子毒素的抗体的 偶联物中，所述抗相思子毒素的抗体为兔来源的抗相思子毒素的多克隆抗体 ；所述胶体 金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物中，所述抗蓖麻毒素的抗体为兔来源的抗蓖麻毒素的多 克隆抗体。
上述胶体金试纸中，所述检测位置 1 包被的抗相思子毒素的抗体的浓度为 2mg/ mL，所述检测位置 2 包被的抗蓖麻毒素的抗体的浓度为 1.5mg/mL。
上述胶体金试纸中，所述胶体金探针是按照包括如下步骤的方法制备得到的 ： 用 HAuCl4 水溶液和柠檬酸三钠水溶液制备得到胶体金溶液 ；
将所述胶体金溶液的 pH 值调至 8.0，再向胶体金溶液中加入抗蓖麻毒素的抗 体，混匀并放置 30min，再加入抗相思子毒素的抗体，混匀并放置 30min，再用牛血清白 蛋白进行封闭，离心，收集沉淀 ；重悬沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联 物与胶体金与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针 ；所述抗蓖 麻毒素的抗体与所述胶体金溶液的配比为 3mg ∶ 100ml，所述抗相思子毒素的抗体与所述 胶体金溶液的配比为 3mg ∶ 100ml ；
上述胶体金试纸中，所述样品垫的材质是玻璃纤维素膜，所述胶金垫的材质是 玻璃纤维素膜，所述反应垫的材质是硝酸纤维素膜，所述吸收垫的材质是吸水滤纸 ；
所述抗抗体为羊抗鼠抗体。
上述任一所述的单抗可以用细胞体外培养的方法制备得到。
胶体金试纸条中胶体金与抗体通过静电引力和疏水作用结合，因而不会影响抗 体活性。 胶体金本身具有肉眼可见的颜色，无需仪器即可判读结果，无需洗涤，不形成免疫复合物的标记抗体通过层析作用自动分离，既简化了操作步骤，又减少了影响实验 结果的干扰因素。 该法通常能在 15min 内完成检测，样品处理方法简便、操作灵活、运 输方便、不需要其他辅助仪器，结果可直观判断，而且试纸条自带质量控制线，实验结 果一目了然。 本发明的胶体金试纸具有敏感度高、特异性高、精密度高、准确度高、成 本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。 用本 发明试纸检测相思子毒素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易 推广应用。 附图说明
图 1 为试纸条灵敏度检测结果。
图 2 为试纸条特异性检测结果。
图 3 为试纸条稳定检测结果。
图 4 为试纸条对模拟样品的检测结果。 具体实施方式 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
硝酸纤维膜 (NC 膜 )，购于美国 Millipore 公司，产品目录号为 HFB 504 ；玻璃 纤维膜，购于美国 Millipore 公司 ；吸水滤纸购自 Minipore 公司。
实施例 1、相思子毒素单克隆抗体和多克隆抗体的制备
一、杂交瘤细胞的制备
( 一 ) 抗原制备
重 组 质 粒 pET-HisA 在 文 献 (Abrin-aA chain expressed as soluble form in Escherichiacoli from a PCR - synthesized gene is catalytically and functionally active Li - ChunWang a ， b ， Lin Kang a ， Ting - Mao Hu b ， Jing - LinWang a ， * Biochimie 86(2004)327-333) 中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所得到。 质粒 pET-HisA 中含有相思子毒素 A 链的编码基因。
1、相思子毒素 A 链重组基因工程菌表达抗原蛋白
将重组质粒 pET-HisA 转入 E.coli BL21 中， Amp 抗性筛选，测序鉴定，得到阳 性重组菌，记作 BL21-pET-HisA。 将重组工程菌 BL21-pET-HisA 按 1 ∶ 100 接入 Amp 抗性 LB 培养基中，130rpm，37℃过夜培养。 次日将过夜培养的菌体按 1 ∶ 100 接入 Amp 抗性 LB 培养基中，200rpm，37℃，5h 待 OD600 约 0.6 时分别保菌，并加入 IPTG 1mmol/ L，200rpm、37 ℃，4h 诱导表达。 将诱导表达后的菌体 6000rpm，4 ℃，离心 10min 后 弃上清，将菌体加入 PBS 重悬，6000rpm、4 ℃、离心 10min 弃上清。 将收集的菌体加 入无咪唑 Buffer 混匀，冰浴超声破碎，至液体清亮后离心分别收集上清和沉淀，收集的 上清即为可溶性目的蛋白溶液。 2×SDS，12％变性蛋白电泳分析。 结果蛋白分子量为 31.0kDa。
2、相思子毒素 A 链重组基因工程菌表达抗原蛋白纯化
亲和纯化标签是 6× 组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍金属离子，
在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低 pH 下用咪唑竞争洗 脱。
将 5mL 次氨基三乙酸 (NTA， Amersham 公司 ) 层析介质装入 2cm×10cm 玻璃 层析柱中，用去离子水洗数遍，直至介质中的乙醇被洗尽，然后缓慢加入 5 体积 0.1M 的 NiSO4，使 Ni2+ 与介质充分结合，以 5 体积去离子水洗柱，除去未与介质结合的 NiSO4， 用 5 体积的平衡液平衡柱，将收集的蛋白经 0.45μm 滤器过滤后装人镍柱，依次用含 30mM、40mM、50mM、80mM、100mM、150mM、200mM 咪唑的平衡液洗脱，每个咪 唑浓度 5mL×5 次洗脱 ( 即 5 个柱体积 )，分步收集。 2×SDS，12％变性蛋白电泳分析。
以 Ni-NTA 亲和柱纯化来自 500mL 表达工程菌中的相思子重组蛋白 A，经咪唑 浓度梯度洗脱，结果目的蛋白均出现在 100mM 咪唑浓度第 2 柱体积开始洗脱下来的溶 液中，穿透液中无目的蛋白。 分别收集 100mM-2、3、4、5、6( 柱体积 )，150mM-1、 2( 柱体积 )，经 BandScan5.0 图像软件分析，重组蛋白 A 的纯度为 96.2％。 由于重组蛋 白液的体积稍变大，采用超滤法来浓缩蛋白，使蛋白浓度达到 4mg/mL。
( 二 ) 动物免疫
以实验 ( 一 ) 中制得的蛋白作为免疫原，取 50μg 免疫原与等体积的福氏完全佐 剂充分混匀，首免 BALB/c 健康小鼠，鼠龄在 6 ～ 8 周，0.5ml/ 只，腹腔注射。 两周后 用 100ug 蛋白和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；隔三周后再用 100ug 蛋白和等体积 福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；二免后每周断尾取血，间接 ELISA 测定效价。 细胞融合 前 3 天加强免疫一次。 ( 三 ) 细胞融合和克隆化
鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按 7 ∶ 1 比例 ( 数量配比 ) 与 SP2/0 骨髓 瘤细胞融合，采用间接竞争 ELISA 测定细胞上清液，筛选阳性孔。 利用有限稀释法对阳 性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌相思子毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细 胞株命名为 2 号 (1F8C5C3H1)，该细胞株已于 2010 年 8 月 17 日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC，地址 ：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏编号为 CGMCC No.4062，分类命名 为 Abrin-a A 链单克隆抗体细胞株。
二、单克隆抗体的制备
( 一 ) 由杂交瘤细胞制备单抗的方法 ：将已经建立的杂交瘤细胞株 CGMCC No.4062 接种于细胞培养基中，置于 37℃和 5％ CO2 孵箱中培养，每隔 2d 换一次细胞培 养基，待细胞浓度大于 105/ml 时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。 收集培养上清， 1500rpm，离心 10 分钟，取上清 ；上清含有高水平的单克隆抗体， -20℃保存备用。 所 述细胞培养基为无血清培养基 ( 购于美国 BioWhittaker 公司，产品目录号为 ：12-727F)， 所述细胞培养基的 pH 为 7.4。
( 二 ) 单抗纯化方法 ：
琼脂糖亲和层析柱购自 Amersham 公司，产品目录号为 17-5080-01。
用琼脂糖亲和层析柱进行纯化。 具体步骤如下 ：将亲和柱以平衡缓冲液 (1L 平衡缓冲液由 1000ml 20mM PB 缓冲液和 300mmol NaCl 组成， pH7.8) 平衡，待柱平衡 后，将步骤 ( 一 ) 得到的上清经 0.45μm 滤膜滤过后以 1mL/min 流速上柱，用平衡缓冲
液以 1mL/min 流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液 (0.1M 柠檬酸缓冲 液，pH4.0) 将抗体洗下。 收集洗下的抗体，收集试管事先已加适量的 1mol/L，pH 9.0 的 Tris-HCI，使 pH 恢复至 7.4 左右，以免失去活性。 纯化好的抗体以 PB(5mM，pH7.4) 工 作液 4℃透析，24h，每 8h 换一次液，再 10000r/min 离心 30min，收集上清， -70℃保存 备用。
( 三 ) 单抗鉴定方法 ：12％ SDS 变性电泳分析纯度达 95％。
三、单抗的性能验证
包被液按照如下方法配制 ：Na2CO31.59 克，， NaHCO32.93 克，用 NaOH 调 pH 至 9.6，定容至 1000ml 密封盖好，4℃存放备用 ；
封闭液按照如下方法配制 ：称取 3g BSA 溶于 100mlPBST 中备用 ；
洗涤液 (PBST) 按照如下方法配制 ：将 999.5ml PBS(0.01M、 pH7.2) 缓冲液和 0.5mlTween-20 混合，得到洗涤液。
( 一 ) 相对亲和力常数
脱毒的天然相思子毒素按照实验四中所述方法制备。
间接 ELISA 测定单抗相对亲和常数，将脱毒的天然相思子毒素用包被液稀释至 8μg/ml，加入酶联孔，100μl/ 孔，4℃过夜。 次日，吸出孔内液体，用洗涤液洗板三 遍，在加入封闭液，150μl/ 孔，37 ℃孵育 1h 后弃孔内液体，重复洗板步骤。 将纯化 好的单克隆抗体梯度稀释 100μg/ml ～ 0.0125μg/ml( 具体为 100μg/ml、50μg/ml、 25 μ g / ml 、 12 . 5 μ g / ml 、 6 . 25 μ g / ml 、 3 . 125 μ g / ml 、 1 . 6 μ g / ml 、 0 . 8 μ g / ml 、 0 . 4 μ g / ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml)，100μl/ 孔， 37℃孵育 1h。 洗板后加入稀释好的酶标二抗 ( 羊抗鼠 IgG)，100μl/ 孔，37℃孵育 1h 后 洗板显色，于波长 450nm 测定 A 值。 以 McAb 的不同浓度为横坐标，以其相应的 A 值为 纵坐标，绘制 McAb 的测定曲线。 以各曲线上部趋于平坦段的 A 值为 100％，找出 50％ A 值对应的 McAb 的浓度，其倒数即为本株 McAb 的相对亲和力常数，为 5.26×106。
( 二 ) 效价与特异性
应用间接 ELISA 法进行。将 BSA 蛋白 ( 阴性对照 )、蓖麻毒素、相思子毒素分别 用包被液稀释，包被酶联板，每孔 100μL( 浓度为 10μg/mL)，4℃过夜后，以 PBST 洗 3 次，用封闭液进行封闭，37℃放置 1h， PBST 洗 3 次，加入梯度稀释的抗体 ( 抗体的初 始浓度为 2mg/mL)1 ∶ 102，1 ∶ 103，1 ∶ 104，1 ∶ 105，1 ∶ 106，(100μL/ 孔 )，设置 空白对照，37℃作用 1h，用 PBST 洗 3 次，加入 PBST 稀释羊抗鼠 IgG(1 ∶ 60000 稀释， 100μL/ 孔 )，37℃作用 1h，用 PBST 洗 3 次，加显色液 OPD，显色 5min 后，用 2mol/L H2SO4 终止反应，测 A450 值，阴性均值的 2.1 倍判定为阳性。 抗体在 1 ∶ 105 时经肉眼 观察和测 A450 值均为阳性，故判定其抗体效价达 105。 抗体与蓖麻毒素包被的酶联孔经 肉眼观察和测 A450 值均为阴性，说明该抗体与蓖麻毒素无交叉反应，特异性良好。
四、相思子毒素多克隆抗体的制备
( 一 ) 脱毒的相思子毒素制备
相思豆在文献 ( 相思豆毒素研究及应用王利春，王景林生物技术通讯 .Vol15. No2， Mar，2004) 中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所获得。氨苯基 -β-D- 半乳糖苷琼脂糖亲和介质 (Sigma)、SephacrylTMS-100G75 凝胶预 装柱 (GE)、玻璃层析柱 5mL2cm×10cm(AKTA)。
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺 (TEMED)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、十二烷基硫酸钠 (SDS)、考马斯亮蓝 R250、二硫苏糖醇 (DTT) 等均为 Sigma 公 司产品 ；低分子量蛋白 marker(Amersham Biosciences)、硫酸铵 (Amresco0191) 其余缓冲 液试剂磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵等均为国产分析纯 ；实验用 水为亚沸蒸馏水、透析袋 (DM-10mm)。
提取 ：
将 相 思 豆 去 壳 后 称 取 100g， 浸 泡 于 PBS(0.01M， pH7.2) 中 24h， 至 种 子 肿 胀 ；浸 泡 后 的 种 子 以 dd H2O 反 复 冲 洗 去 除 种 子 上 外 膜 及 颜 色， 将 洗 净 的 种 子 置 于 500mLPBS(0.01M， pH7.2) 缓冲液中，于匀浆机中匀浆，并于 4 ℃条件下放置 24h ；次 日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣后，在 4 ℃下以 12000rpm 离心 20min，取上清液， 0.45μm 滤膜过滤，上清液调 pH7.2，为黄绿色液体 ；向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶 液 (pH7.4) 至饱和度为 30％，4℃磁力搅拌 1h 后静止 1 小时，12000rpm 离心 20min，弃沉 淀 ；将上清液继续加饱和硫酸铵液体至 90％饱和度，4℃磁力搅拌 1h，静止过夜 24h ；次 日混合液在 4℃条件下以 12000rpm 离心 20min，取沉淀为黄绿色 ；将沉淀用 PBS 缓冲液 (10mM，pH 7.4)50mL 溶解后，于 4℃条件下对 PBS 缓冲液透析 48h( 每 8h 换一次液 )，透 析后经 1200g 4℃离心 20min，取上清，即为相思子毒素粗提液，蛋白定量，12％变性、 非变性 SDS 电泳分析 ；-20℃冰冻保存。
亲和层析纯化 ：亲和层析介质为氨苯基 -β-D- 半乳糖苷琼脂糖亲和介质 ( 购自 sigma 公司，产品目录号为 A-0414)。 取 5mL 亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱，注 意避免产生气泡和断层，以至少 10 倍柱床体积的 PBS 进行清洗平衡。 将相思子毒素粗提 液经 0.45μm 的滤膜过滤后，以平衡液 10 倍体积稀释，以 1mL/min 流速加入层析柱内， 使相思子毒素和凝集素充分吸附在柱上。 待相思子毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脱杂蛋白，流速控制在 1mL/min 左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有 0 ～ 0.2M 半乳糖 的 PBS 缓冲液进行步进式梯度洗脱，整个过程分部收集，紫外检测其吸收值进行监控。 收集各吸收峰处组分，真空干燥离心浓缩后对 PBS 透析除去半乳糖，冰冻备用。 透析袋 应煮沸清洗后使用，透析时每隔 2h 更换一次透析液，随着透析时间的延长，更换透析液 的时间也可适当延长，时间总计 24h 以上。 平衡液为 0.01M， pH7.2 的 PBS 缓冲液。
凝 胶 过 滤 层 析 ：凝 胶 过 滤 柱 为 SephacrylTMS-100G75 凝 胶 预 装 柱， 购 自 Amersham 公司。 将亲和层析浓缩后的样品经 0.22μm 的滤膜过滤后上样，上样体积 为 3mL，浓度 10mg/mL 左右 ；以 PBS 为洗脱液进行洗脱，流速 0.5mL/min，分部收集 3mL/ 管，紫外测定后合并第二吸收峰各组分，12％变性、非变性 SDS 电泳分析为相思子 毒素蛋白 ；得到的相思子毒素透析、浓缩后 -20℃保存。
脱毒 ：用 PBS(0.1M， pH 7.4) 稀释凝胶过滤后的相思子毒素蛋白至 0.2-0.3mg/ ml，放置 PBS 缓冲液 (0.1M， pH 8.1) 中，35℃透析 7 天，然后再放入 PBS(0.01M， pH 7.4) 中透析 48h，12000rpm 离心 10min，取上清液分装， -20℃保存。
天然的相思子毒素蛋白和脱毒的相思子毒素蛋白的氨基酸序列均为 SEQ ID NO ：1.。2、相思子多克隆抗体制备
多克隆抗体可委托生物公司制备，也可自己制备。 自己制备的方法如下 ：
用脱毒的天然相思子毒素 200μg 与等体积的福氏完全佐剂充分混匀，免疫新西 兰纯种大耳白兔。 两周后用 0.5mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强 免疫 1 次 ；隔三周后再用 1mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；此后每周耳缘静脉采血，间接 ELISA 测定效价。 加强免疫后的第 7 天，血清的效 价最高，为 106( 多抗效价测定方法与单抗效价测定方法相同，包被抗原的浓度为 10μg/ ml) ；取此血清进行多抗纯化。
用琼脂糖亲和层析柱进行纯化。 具体步骤如下 ：将亲和柱以平衡缓冲液 (1L 平衡缓冲液由 1000ml 20mM PB 缓冲液和 300mmol NaCl 组成， pH7.8) 平衡，待柱平衡 后，将兔血清经 0.45μm 滤膜滤过后以平衡缓冲液 10 倍体积稀释后，再以 1mL/min 流速 上柱，用平衡缓冲液以 1mL/min 流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液 (0.1M 柠檬酸缓冲液， pH4.0) 将抗体洗下。 收集洗下的抗体，收集试管事先已加适量的 1mol/L， pH 9.0 的 Tris-HCI，使 pH 恢复至 7.4 左右，以免失去活性。 纯化好的抗体以 PB(5mM，pH7.4) 工作液 4℃透析，24h，每 8h 换一次液，再 10000r/min 离心 30min，收 集上清， -70℃保存备用。 实施例 2、蓖麻毒素的多抗制备
一、制备脱毒的蓖麻毒素
蓖麻种子购自北京秀禾种子有限公司，产品目录号为蓖麻 1 号。
粗提 ：将蓖麻种子去壳后称取 100g，浸泡于 PBS(0.01M， pH7.2) 中 24h，至种 子肿胀 ；去壳洗净，将洗净的种子置于 500mL PBS(0.01M， pH7.2) 缓冲液中，于匀浆机 中匀浆，并于 4℃条件下浸提过夜 24h( 放置 24h) ；次日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣 后，在 4℃下以 12000rpm 离心 20min，取上清液，0.45μm 滤膜过滤，上清液调 pH7.2 ； 向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液 (pH7.4) 至饱和度为 30％，4℃磁力搅拌 1h 后静止 1 小时，12000rpm 离心 20min，弃沉淀 ；将上清液继续加饱和硫酸铵液体至 90％饱和度， 4℃磁力搅拌 1h，静止过夜 24h ；次日混合液在 4℃条件下以 12000rpm 离心 20min，取沉 淀为白色 ；将沉淀用 PB(10mM， pH 7.4)50mL 溶解后，于 4℃条件下对 PBS 缓冲液透析 48h( 每 8h 换一次液 )，透析后经 1200g 4℃离心 20min，取上清，即为蓖麻毒素粗提液， 蛋白定量，12％变性、非变性 SDS 电泳分析 ；-20℃冰冻保存。
亲和层析纯化 ：亲和层析介质为氨苯基 -β-D- 半乳糖苷琼脂糖亲和介质 ( 购自 sigma 公司，产品目录号为 A-0414)。 取 5mL 亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱， 注意避免产生气泡和断层，以至少 10 倍柱床体积的 PBS 进行清洗平衡。 将蓖麻毒素粗 提液经 0.45μm 的滤膜过滤后，以平衡液 10 倍体积稀释，以 1mL/min 流速加入层析柱 内，使蓖麻毒素和凝集素充分吸附在柱上。 待蓖麻毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液 洗脱杂蛋白，流速控制在 1mL/min 左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有 0.1M 半乳糖的 PBS 缓冲液一步洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，12％变性、非变性 SDS 电泳分析。 平衡液 为 0.01M， pH7.2 的 PBS 缓冲液。
凝 胶 过 滤 层 析 ：凝 胶 过 滤 柱 为 SephacrylTMS-100G75 凝 胶 预 装 柱， 购 自 Amersham 公司。 将亲和层析浓缩后的样品经 0.22μm 的滤膜过滤后上样，上样体积为
5mL，浓度 2mg/mL ；以 PBS 为洗脱液进行洗脱，流速 0.5mL/min，紫外测定后合并第 二吸收峰各组分，12％变性、非变性 SDS 电泳分析为蓖麻毒素蛋白 ；得到的蓖麻毒素透 析、浓缩后 -20℃保存。
脱毒 ：用 PBS(0.1M， pH 7.4) 稀释凝胶过滤后的蓖麻毒素蛋白至 0.2-0.3mg/ ml，放置 PBS 缓冲液 (0.1M， pH 8.1) 中，35℃透析 7 天，然后再放入 PBS(0.01M， pH 7.4) 中透析 48h，12000rpm 离心 10min，取上清液分装， -20℃保存。
天然的蓖麻毒素蛋白的氨基酸序列均为 SEQ ID NO ：2。
二、蓖麻毒素多克隆抗体制备
多克隆抗体可委托生物公司制备，也可自己制备。 自己制备的具体方法如下 ：
用脱毒的蓖麻毒素 200μg 与等体积的福氏完全佐剂充分混匀，免疫新西兰纯种 大耳白兔。 两周后用 0.5mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ；隔三周后再用 1mg 脱毒的天然相思子毒素和等体积福氏不完全佐剂加强免疫 1 次 ； 此后每周耳缘静脉采血，间接 ELISA 测定效价。 加强免疫后的第 7 天，血清的效价最 高，为 106( 多抗效价测定方法与相思子毒素单抗效价测定方法相同，不同的是包被原为 蓖麻毒素，包被原的浓度为 10μg/ml) ；取此血清进行多抗纯化。 多抗纯化 ：与相思子毒素的多抗纯化方法相同。
实施例 3、胶体金试纸的制备及性能检测
一、制备
( 一 ) 样品垫的制备
样品垫的材料为玻璃纤维膜 ；
将玻璃纤维膜进行如下处理，以有效去除胶体金试纸的非特异现象及增加其灵 敏度 ：将样品垫置于含鼠血清蛋白、 pH 为 9.9、0.1mol/L 碳酸盐缓冲液中浸泡 2h，37℃ 烘 2h 备用 ；鼠血清蛋白在缓冲液中的终浓度为 0.4％ ( 体积百分含量 )。 封闭剂可以封 闭过多的结合位点，提高 PH 值可以使样品中蛋白更易结合。
( 二 ) 胶金垫的制备
1、确定最低偶联抗体浓度的确定 ：
(1) 取 11 只洁净的试管，分别编号 1、2、3、 … 7，在已编号的 7 个试管内，分 别加入 pH 值为 8.0 的胶体金溶液 1mL。 将抗相思子毒素兔多抗和抗蓖麻毒素兔多抗分别 稀释至 0.2mg/mL，并分别进行如下步骤 (2) 和 (3)。
(2) 在 2 ～ 6 号 管 内 分 别 加 入 0.2mg/mL 单 抗 溶 液 250μl、200μl、150μl、 100μl、50μl，第 1、7 管不加作对照，混匀，放置 5min。
(3) 在 2 ～ 6 号管内分别加入 10％ ( 质量百分含量 )NaCL 水溶液 100μL，1 号 管不加作对照。 混匀后室温静置 20min，观察颜色变化。 未加抗体 (7 号对照管 ) 及抗体 加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化，而加入抗体量达到 或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。 与对照管 (1 号试管 ) 相比，颜色最接近、 含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为 1mL 胶体金所必须的抗体稳定剂量。
实验结果表明，1mL 胶体金溶液的抗相思子毒素兔多抗的最低稳定剂量为 30μg，1mL 胶体金溶液的抗蓖麻毒素兔多抗的最低稳定剂量为 30μg。
2、胶体金探针制备 ：将 0.01 ％ ( 质量百分含量 )HAuCl4 水溶液煮沸，再加
入 1 ％ ( 质量百分含量 ) 柠檬酸三钠水溶液，混匀并继续加热，直到液体颜色稳定成 葡萄酒红色，得到胶体金溶液 ；其中 HAuCl4 水溶液与柠檬酸三钠水溶液的体积比为 100ml ∶ 1.5ml ；( 混匀时持续加热，一般约 10min，但主要依据液体颜色而定。 )
调节胶体金溶液 pH 值至 8.0，向胶体金溶液中先加入抗蓖麻毒素兔多克隆抗 体，混匀，室温 (25℃ ) 放置 30min，再加入抗相思子毒素兔多克隆抗体 ( 抗蓖麻毒素兔 多克隆抗体与胶体金溶液的配比为 3mg ∶ 100ml，抗相思子毒素兔多克隆抗体与胶体金 溶液的配比为 3mg ∶ 100ml ；)，混匀并室温 (25℃ ) 放置 30min ；再加入牛血清白蛋白 (BSA)(BSA 在混合溶液中的质量百分浓度为 1％；目的是封闭 )，混匀并室温 (25℃ ) 静 置 10min，再 4℃静止 15min，以 12000rpm，4℃离心 30min，弃上清，收集沉淀 ；将沉底 以重悬液 (1L 重悬液组成 ：988ml 0.01M、 pH 8.0 的 Tris-HCL 缓冲液，50g BSA，10g 蔗 糖，12ml Tween-20) 溶解，以 12000rpm，4℃离心 30min，弃上清，留下管底暗红色疏松 状沉淀 ；用重悬液重新悬浮沉淀，得到胶体金与抗相思子毒素的抗体的偶联物与胶体金 与抗蓖麻毒素的抗体的偶联物的混合物，即得到所述胶体金探针溶液，置 4℃保存。
胶体金颗粒与胶体金探针的电镜观察 ：用透射电镜分别对胶体金颗粒与胶体金 探针进行检测。 结果，透射电镜下，可见胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致， 计数 100 个金颗粒，颗粒直径约为 25nm ；胶体金偶联抗体后，可见金颗粒外围有明显的 低电子密度晕圈，表面吸附有蛋白。 结果表明，制备的胶体金颗粒和免疫金探针合格。 3、胶金垫的制备 ：用玻璃纤维膜作支撑物，在支撑物上加胶体金探针，37℃干 燥 2.5h。
( 三 ) 反应垫的制备
用硝酸纤维素膜 (NC 膜 ) 作为支撑物，向膜上喷涂相思子毒素单抗条带、抗蓖 麻毒素兔多抗条带、羊抗鼠抗体条带。
检测带 1(T1 带 ) ：喷涂相思子毒素单抗 ( 以 5mM PBS 缓冲液稀释成 2.0、1.5、 1.0mg/mL 的浓度 )。检测带 2(T2 带 ) ：喷涂蓖麻毒素的多抗 ( 以 5mM PBS 缓冲液稀释成 2.0、1.5、1.0mg/mL 的浓度 )。 质控带 (C 带 ) ：喷涂羊抗鼠抗体 1mg/mL。 用 CAMAG 公司的 Camag Linomat 5TLC 点样仪将样品喷到 2.5mm 宽的 NC 膜上 ( 点样速度为 50mm/ s)。 把划完线的 NC 膜置于 37℃干燥 2h，得到反应垫。
用相应天然毒素检测以确定最佳的抗体喷膜浓度。 分别将天然相思子毒素和蓖 麻毒素稀释成 50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、2μg/mL，以制备好的胶体金免疫层析 试纸条按照方法检测， PBS 溶液样品作为阴性对照。 当 T1 带喷膜浓度为 1.5 或 1.0mg/ mL 时，检测相思子浓度仅达 100ng/mL 以上 ；T2 带喷膜浓度为 2.0 或 1.5mg/mL 时，检 测灵敏度均可达 50ng/mL，而喷膜浓度为 1.0mg/mL 时，灵敏度下降至 100ng/mL 以上。 应选择阳性带显色，无交叉反应且所需抗体量最低的喷膜浓度。
实验设 3 次重复，结果一致。 结果表明，最佳喷膜浓度分别为 T1 带 ：2mg/ mL， T2 带 ：1.5mg/mL，无非特异反应。
( 四 ) 试纸的制备
免疫层析试纸由吸收垫、胶金垫、反应垫和样品垫四部分依次连接而成。
吸收垫的材质是吸水滤纸。
将样品垫、胶金垫、反应垫和吸收垫依次按顺序叠加粘到 PVC 板上 ；样品垫的
末端与胶金垫的始端相连，胶金垫的末端与反应垫的始端相连，反应垫的末端与吸水垫 的始端相连，得到胶体金试纸。 组装成完整的试纸条，然后切割成 4mm/ 条，干燥避光 保存。
检测带和质控带均为与试纸条的长相垂直的条带状。
二、胶体金试纸的使用方法
取稀释好的待检测样品 100μL 加入到胶体金试纸的样品垫始端 ( 或向胶体金试 纸的样品垫中滴加稀释好的待检测样品 80μL)，15min 后，用肉眼观察检测带和质控带 的显色情况，根据其显色情况，判定样品中是否含有相思子毒素和蓖麻毒素。
判定方法如下 ：
阴性 ：当质控带显示为红色条带，而检测带不显色时，判为阴性。
阳性 ：当质控带显示为红色条带，检测带 1 同时也显示为红色条带，判为相思 子毒素阳性 ；当质控带显示为红色条带，检测带 2 同时也显示为红色条带，判为蓖麻毒 素阳性 ；当质控带显示为红色条带，检测带 1、2 同时也显示为红色条带，判为相思子和 蓖麻毒素阳性 ；
无效 ：当质控带不显色时，则无论检测带显示为红色条带与否，该胶体金试纸 均判为无效。
该胶体金试纸的检测原理 ：当在试纸的样品垫端滴加待测样品溶液后，待检溶 液流向胶金垫并与胶金垫中的胶体金探针 ( 即金标抗体 ) 通过抗原 - 抗体相互作用而结 合，并继续向反应垫扩散，并最终渗入吸收垫中。 若待检测样品溶液中含有相思子毒 素，相思子毒素与胶金垫中的抗相思子毒素的兔多克隆抗体结合，形成抗原 - 多抗复合 物，当其扩散至反应垫时，抗原 - 多抗复合物中的抗原会与检测带 1 上的抗相思子毒素单 抗结合，进而检测带 1 显色。 若待检测样品溶液中含有蓖麻毒素，蓖麻毒素与胶金垫中 的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗体结合，形成抗原 - 多抗复合物，当其扩散至反应垫时，抗 原 - 多抗复合物中的抗原会与检测带 2 上的抗蓖麻毒素的兔多克隆抗体结合，进而检测带 2 显色。
三、胶体金试纸的性能检测
下述实验中，样品处理液的组成 ：PBS(0.01M， pH7.2)+0.5％ Tween-20。
相思子毒素为实施例 1 中制备，蓖麻毒素为实施例 2 中制备。
( 一 ) 灵敏度检测
实 验 组 1 ：将 相 思 子 毒 素 用 样 品 处 理 液 稀 释 成 如 下 不 同 浓 度 ：2μg/mL、 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL ；
实验组 2 ：将蓖麻毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度 ：2μg/mL、200ng/ mL、100ng/mL、50ng/mL ；
实验组 3 ：将两种毒素以相同浓度等体积混合后，再梯度稀释成 400ng/mL、 200ng/mL、100ng/mL( 即混合液中，两种毒素的浓度分别依次为 400ng/mL、200ng/ mL、100ng/mL) ；
分别用实验一制备的胶体金试纸按照实验二中所述方法检测。 同时以 PBS 缓冲 液为对照。
实验设 3 次重复，结果均一致。 结果如图 1 所示。 图中，A 表示对相思子毒素的单独检测结果 ；B 表示对蓖麻毒素的单独检测结果 ；C 表示对两种毒素的同时检测结 果；
结果显示 ：该试纸条单独检测蓖麻或相思子毒素时灵敏度达 50ng/mL，同时检 测两种毒素时灵敏度达 100ng/mL。
( 二 ) 特异性评价
葡萄球菌肠毒素 B(SEB) 购自 SIGMA 公司，产品目录号为 S0812。
将相思子毒素、蓖麻毒素、葡萄球菌肠毒素 B(SEB)、牛血清白蛋白均用 PBS 分别配制成浓度为 100ng/mL 的溶液 ；将相思子毒素和蓖麻毒素以相同浓度等体积混合 后，再梯度稀释成 100ng/mL 的溶液 ( 即混合液中，两种毒素的浓度分别为 100ng/mL)。 分别用实验一制备的胶体金试纸按照实验二中所述方法检测。
实验设 3 次重复，结果一致。结果 ：试纸条特异性良好，与葡萄球菌肠毒素 B、 牛血清白蛋白均无交叉反应 ( 图 2)。
( 三 ) 稳定性试验
将新制备的胶体金试纸条于 37℃存放 2 天、3 天、4 天或 5 天 ；取存放 5 天的试 纸进行检测，以检测试纸条的敏感性。
实验组 1(Abrin) ：将相思子毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度 ：100ng/ mL、50ng/mL ；
实验组 2(Ricin) ：将蓖麻毒素用样品处理液稀释成如下不同浓度 ：100ng/mL、 50ng/mL ；
实验组 3(Both) ：将两种毒素以相同浓度等体积混合后，再梯度稀释成 200ng/ mL、100ng/mL ；( 即混合液中，两种毒素的浓度分别依次为 200ng/mL、100ng/mL)
PBS 溶液样品作为阴性对照。
实验设 3 次重复，结果一致。 结果 ：存放 2 天、3 天、4 天、5 天的试纸条的灵 敏度无显著差异 ( 图 3)，和新制备的检测试纸条相比 ( 图 1)，灵敏度没有明显下降，且 特异性仍很好。 说明该试纸条可在室温存放 6 个月 ( 根据生物制品规程中快速稳定性试 验规定 37℃存放 20 天相当于室温存放 18 个月，根据此推算 5 天相当于 6 个月 )。
( 四 ) 模拟环境检测
检测样品的制备 ：
Both ：将两种毒素以相同浓度等体积混合后，分别用下述牛奶混合液、橙汁混 合液、土壤溶液或水进行梯度稀释至如下浓度 ：400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL( 即 混合液中，两种毒素的浓度分别依次为 400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL)，分别得到 的稀释液分别用于检测。
Ricin ：将蓖麻毒素分别用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水进行梯 度稀释至如下浓度 ：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，分别得到的稀释液分别用于检 测。
Abrin ：将相思子毒素分别用下述牛奶混合液、橙汁混合液、土壤溶液或水进行 梯度稀释至如下浓度 ：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，分别得到的稀释液分别用于 检测。
1、牛奶 ：将牛奶与 PBS 缓冲液以 1 ∶ 4 的体积比混合，得到牛奶混合液 ；2、果汁 ：将橙汁与 PBS 缓冲液以 1 ∶ 4 的体积比混合，0.1M K2CO3 水溶液调节 pH7.4，得到橙汁混合液 ；
3、自来水。
4、土壤 ：用 PBS 缓冲液溶解土壤 ( 土壤与 PBS 缓冲液的配比为 2g ∶ 10ml)， 得到土壤溶液。
实验设 3 次重复，结果一致。 结果如图 4 所示，该试验证明该试纸条在检测模拟 样本时，对相思子毒素的检测灵敏度为 50ng/ml，对蓖麻毒素的检测灵敏度为 50ng/ml， 对相思子毒素和的蓖麻毒素共同检测时灵敏度为 100ng/ml ；说明该试纸条可以检测模拟 环境样本。15CN 102020714 A CN 102020728 A
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