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DNA 甲基化测定方法
    技术领域 本发明涉及对生物来源标本所含的基因组 DNA 中目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 含量进行测定的方法。
     背景技術 作为用于评价生物来源标本所含基因组 DNA 中目标 DNA 区域中的 DNA 的甲基化状 态的方法， 例如， 有测定在基因组 DNA 中目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 的含量的方法 ( 例如， 参照 Nucleic Acids Res.1994 Aug 11 ； 22(15) ： 2990-7、 和 Proc Natl Acad Sci USA.1997 Mar18 ； 94(6) ： 2284-9)。在该测定方法中， 首先需要从基因组 DNA 来源的 DNA 试 样中提取含有目标 DNA 区域的 DNA， 提取操作十分繁杂。
     另外， 作为测定被提取的 DNA 的目标区域中的被甲基化了的 DNA 含量的方法， 已知 有以下的方法， 例如 (1) 使用亚硫酸盐等修饰该 DNA 之后， 将其供于 DNA 聚合酶引起的 DNA 合成的链反应 (Polymerase ChainReaction( 聚合酶链反应 ) ； 以下有时记为 PCR)， 从而将 目标区域扩增的方法 ； (2) 使用甲基化敏感性限制酶将该 DNA 消化后， 将其供于 PCR， 从而使 目标区域扩增的方法。这些方法的任一种中， 用于甲基化的检测的 DNA 的修饰以及其后的 生成物的精制、 用于 PCR 的反应系的制备、 DNA 扩增的确认等中均需要耗时。
     发明内容 本发明的目的在于， 提供一种简便测定生物来源标本所含的基因组 DNA 中目标 DNA 区域 ( 以下， 有时也记为目标区域 ) 中的被甲基化了的 DNA 含量的方法。
     即， 本发明提供了以下所述的发明。
     [ 发明 1]
     一种定量或检测方法， 其是对生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的目标 DNA 区 域中的被甲基化了的 DNA 进行定量或检测的方法， 其特征在于， 具有以下工序 ：
     第一工序， 其中， 将生物来源标本中所含具有目标 DNA 区域的基因组 DNA 来源的双 链 DNA 分离成单链 DNA ；
     第二工序， 其中， 将上述单链 DNA、 甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸混合， 形成该单 链 DNA 与该甲基化 DNA 抗体与该特定寡核苷酸的复合体， 该特定寡核苷酸不抑制该单链 DNA 中的被甲基化了的目标 DNA 区域与该甲基化 DNA 抗体结合， 且含有与以下所示任一种碱基 序列相互补的序列的一部分碱基序列 ；
     第三工序， 其中， 基于上述复合体所含甲基化 DNA 抗体所具有的能利用于检测的 识别功能而进行检测或定量， 从而对生物来源标本中所含目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 进行检测或定量 ；
     (1) 序列编号 1 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (2) 序列编号 2 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (3) 序列编号 3 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (4) 序列编号 4 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (5) 序列编号 5 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (6) 序列编号 6 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (7) 序列编号 7 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (8) 序列编号 8 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (9) 序列编号 9 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (10) 序列编号 10 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (11) 序列编号 11 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (12) 序列编号 12 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (13) 序列编号 1 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (14) 序列编号 2 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (15) 序列编号 3 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (16) 序列编号 4 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (17) 序列编号 5 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (18) 序列编号 6 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (19) 序列编号 7 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (20) 序列编号 8 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (21) 序列编号 9 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、 (22) 序列编号 10 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、
     (23) 序列编号 11 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、 以及
     (24) 序列编号 12 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列。
     [ 发明 2]
     根据发明 1 所述的方法， 其中， 特定寡核苷酸含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (5) 序列编号 17 所示的碱基序列、 (6) 序列编号 18 所示的碱基序列、 (7) 序列编号 19 所示的碱基序列、 (8) 序列编号 20 所示的碱基序列、 (9) 序列编号 21 所示的碱基序列、 (10) 序列编号 22 所示的碱基序列、 (11) 序列编号 23 所示的碱基序列、 (12) 序列编号 24 所示的碱基序列、 (13) 序列编号 13 所示碱基序列的互补序列、 (14) 序列编号 14 所示碱基序列的互补序列、 (15) 序列编号 15 所示碱基序列的互补序列、 (16) 序列编号 16 所示碱基序列的互补序列、 (17) 序列编号 17 所示碱基序列的互补序列、 (18) 序列编号 18 所示碱基序列的互补序列、 (19) 序列编号 19 所示碱基序列的互补序列、 (20) 序列编号 20 所示碱基序列的互补序列、 (21) 序列编号 21 所示碱基序列的互补序列、 (22) 序列编号 22 所示碱基序列的互补序列、 (23) 序列编号 23 所示碱基序列的互补序列、 以及 (24) 序列编号 24 所示碱基序列的互补序列。 [ 发明 3] 根据发明 1 或 2 所述的方法， 其中， 在第二工序中形成复合体时， 添加反向寡核苷酸。 [ 发明 4]
     根据发明 1 ～ 3 中任一项所述的方法， 其中， 第二工序中的复合体的形成在含有二 价阳离子的反应系中进行。
     [ 发明 5]
     根据发明 1 ～ 4 中任一项所述的方法， 其中， 在第三工序之前， 使由第二工序形成 的复合体中的甲基化 DNA 抗体结合到支撑体。
     [ 发明 6]
     根据发明 1 ～ 5 中任一项所述的方法， 其中， 在第一工序后至第三工序， 还具有利 用能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶将未甲基化的单链 DNA 消化的工序。
     [ 发明 7]
     根据发明 1 ～ 6 中任一项所述的方法， 其中， 在第一工序后至第三工序， 还具有在 含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中， 利用该甲基化敏感性限制酶将未甲基化的单链 DNA 消化的工序， 所述特定掩蔽用寡核苷酸中作为其一部分含有甲基化敏感性限制酶的识别序 列。
     [ 发明 8]
     根据发明 6 所述的方法， 其中， 能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶为 HhaI。
     [ 发明 9]
     根据发明 1 ～ 8 中任一项所述的方法， 其中， 甲基化 DNA 抗体为甲基胞嘧啶抗体。
     [ 发明 10]
     根据发明 1 ～ 9 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本为哺乳动物的血液、 血 清、 血浆、 体液、 细胞溶解液或组织溶解液。
     [ 发明 11]
     根据发明 1 ～ 10 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为事先被限制酶消化处理而成的 DNA 试样， 所述限制酶不以该基因组 DNA 具 有的目标 DNA 区域为识别剪切位点。
     [ 发明 12]
     根据发明 1 ～ 11 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为被甲基化敏感性限制酶消化处理而得的 DNA 试样。
     [ 发明 13]
     根据发明 1 ～ 12 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为在含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中被甲基化敏感性限制酶消化处理 而得的 DNA 试样。
     [ 发明 14]
     根据发明 7、 12 或 13 中任一项所述的方法， 其中， 甲基化敏感性限制酶为 HpaII 或 HhaI。
     [ 发明 15]
     根据发明 1 ～ 14 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本所含基因组 DNA 来源 的 DNA 试样为事先被精制而成的 DNA 试样。
     [ 发明 16]
     根据发明 1 ～ 15 中任一项所述的方法， 其中， 基因组 DNA 具有的目标 DNA 区域有 甲基化敏感性限制酶的识别剪切位点。
     [ 发明 17]
     一种 DNA， 其含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (5) 序列编号 17 所示的碱基序列、
     (6) 序列编号 18 所示的碱基序列、
     (7) 序列编号 19 所示的碱基序列、
     (8) 序列编号 20 所示的碱基序列、
     (9) 序列编号 21 所示的碱基序列、
     (10) 序列编号 22 所示的碱基序列、
     (11) 序列编号 23 所示的碱基序列、
     (12) 序列编号 24 所示的碱基序列、(13) 序列编号 13 所示碱基序列的互补序列、 (14) 序列编号 14 所示碱基序列的互补序列、 (15) 序列编号 15 所示碱基序列的互补序列、 (16) 序列编号 16 所示碱基序列的互补序列、 (17) 序列编号 17 所示碱基序列的互补序列、 (18) 序列编号 18 所示碱基序列的互补序列、 (19) 序列编号 19 所示碱基序列的互补序列、 (20) 序列编号 20 所示碱基序列的互补序列、 (21) 序列编号 21 所示碱基序列的互补序列、 (22) 序列编号 22 所示碱基序列的互补序列、 (23) 序列编号 23 所示碱基序列的互补序列、 以及 (24) 序列编号 24 所示碱基序列的互补序列。附图说明
     图 1 是显示实施例 1 结果的图。未被覆盖的方框显示使用非癌组织的基因组 DNA 测定与甲基化频度有相关关系的指标值的结果， 被覆盖的方框显示使用从 Capan-2( 癌细 胞株 ) 提取的基因组 DNA 测定与甲基化频度有相关关系的指标值的结果。图中， 从左边起 分别是， A 表示利用萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶液 A 检测的结合到目标区域 的甲基胞嘧啶抗体量的值， B 表示萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶液 B 检测的结 合到目标区域的甲基胞嘧啶抗体量的值， C 表示萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶 液 C 检测的结合到目标区域的甲基胞嘧啶抗体量的值。 具体实施方式作为 “生物来源标本” ， 例如可以举出细胞溶解液、 组织溶解液 ( 这里的组织是指 包括血液、 淋巴结等广义意思 )， 或就哺乳动物而言， 可以举出血液、 血浆、 血清、 淋巴液等 体液， 体分泌物 ( 尿、 乳汁等 ) 等生物体试样及从这些生物体试样提取得到的基因组 DNA。 另外， 作为其他的生物来源标本， 也可例如微生物、 病毒等来源的试样， 此时， 也可例如微生 物、 病毒的基因组 DNA。 人来源的血液为标本时， 可以期待在健康诊断、 简便的临床检查等中 利用本发明。
     另外， 作为这些生物来源标本所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样， 可列举如用甲基化 敏感性限制酶等处理之后的试样、 用在基因组 DNA 具有的目标 DNA 区域中没有其识别剪切 位点的限制性酶事先消化处理而得的试样、 在含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中用甲基 化敏感性限制酶消化处理而得的试样、 事先精制而得的 DNA 试样等。
     为了从哺乳动物来源的标本得到基因组 DNA， 例如使用市售的 DNA 提取用试剂盒 等提取 DNA 即可。在使用血液作为标本的情况下， 按照常用的方法从血液制备血浆或血清， 将所制备的血浆或血清作为标本， 对其中所含的游离 DNA( 包括胃癌细胞等癌细胞来源的 DNA) 进行分析时， 可以避开血细胞来源的 DNA 对胃癌细胞等癌细胞来源的 DNA 进行解析， 可 以使检测胃癌细胞等癌细胞、 含有其的组织等的灵敏度提高。
     通常， 构成基因 ( 基因组 DNA) 的碱基有 4 种。在这些碱基当中， 已知所谓仅是胞
     嘧啶被甲基化的现象， 这样的 DNA 的甲基化修饰限于由 5’ -CG-3’ 表示的碱基序列 (C 表示 胞嘧啶， G 表示鸟嘌呤。以下， 也会将该碱基序列记为 “CpG” ) 中的胞嘧啶。就胞嘧啶而言， 被甲基化的部位是其 5 位。在细胞分裂之前进行 DNA 复制时， 复制后马上成为仅是模板链 的 “CpG” 中的胞嘧啶被甲基化的状态， 在甲基转移酶的作用下立即将新生链的 “CpG” 中的 胞嘧啶也甲基化。因此， DNA 的甲基化后的状态在 DNA 复制后也被直接传给新的 2 组 DNA。 本发明中的 “甲基化后的 DNA” 是指通过这样的甲基化修饰而生成的 DNA。
     已知在各种病患 ( 例如癌 ) 中， 引起 DNA 的甲基化异常， 认为， 通过检测该 DNA 甲基 化异常， 有可能测定各种病患的程度。例如对病患来源的标本中的被 100％甲基化的区域， 实施本发明， 则定量或检测的甲基化 DNA 量增多， 例如病患来源的标本中有未 100％甲基化 的 DNA 区域， 如对该区域实施本发明， 则定量或检测的甲基化 DNA 的量要成为接近几乎为零 的值。另外， 例如， 在正常者的标本中的甲基化比例低， 且在疾患患者的标本中有甲基化比 例高的 DNA 区域， 如对该 DNA 区域实施本发明， 则对于正常者的情况， 定量或检测的甲基化 DNA 的量显示接近零的值， 对于来自疾患患者的情况， 其显示与正常者的值相比有统计学意 义的高值， 因此基于该值的差异， 可以判定 “疾患的程度” 。在此 “疾患的程度” 与一般在该 领域中使用的意思相同， 具体而言， 例如对于标本为细胞时， 是指该细胞的恶性程度， 另外， 例如标本为组织时， 是指该组织中疾患细胞的存在量等。另外， 标本为血浆·血清时， 是指 该个体患有病患的概率。 因此， 通过本发明的实施来考察标本的甲基化异常， 可以诊断各种 疾患。 “目标 DNA 区域” 是要调查该区域中所含的胞嘧啶有无甲基化的 DNA 区域。例如可 以举出含有在赖氨酰氧化酶、 HRAS 样阻抑因子、 bA305P22.2.1、 γ- 细丝蛋白、 HAND1、 RIKEN 2210016F16 的同系物、 FLJ32130、 PPARG 血管生成素相关蛋白、 凝血调节蛋白、 p53- 应答基 因 2、 微纤维蛋白 2、 神经丝蛋白 3、 解聚素及金属蛋白酶结构域 23、 G- 蛋白偶联受体 7、 G- 蛋 白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体、 溶质载体蛋白家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上 腺素成员 2 等有用蛋白质基因的启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基 序列中存在的 CpG 所示碱基序列中的一个以上的胞嘧啶的 DNA 的区域等。除了对这些目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 分别定量或检测之外， 例如， 在一个检测系中， 使用更多的这 些目标 DNA 区域， 可以相应地使其定量精度及检测灵敏度进一步提高。
     具体而言， 例如在有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因的情况下， 作为含有在其 启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基 序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出用序列编号 119 表 示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF270645 记载的碱基序列的碱基编号 16001 ～ 18661 所示的碱基序列 )。就序列编号 119 所示的碱基序列而言， 对人来源的赖氨酰氧化酶 蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2031 ～ 2033 表示， 上述外 显子 1 的碱基序列用碱基编号 1957 ～ 2661 表示， 在序列编号 119 所示的碱基序列中存在 的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 119 所示的碱基序列中在 CpG 密集 存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高 甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的 胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 119 表示的碱基序列中用碱基编号 1539、 1560、 1574、 1600、
     1623、 1635、 1644、 1654、 1661、 1682、 1686、 1696、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795 等 表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 HRAS 样阻抑因子基因的情况下， 作为 含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 HRAS 样阻抑因子基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出用序 列编号 120 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC068162 记载的碱基序列的碱基编 号 172001 ～ 173953 表示的碱基序列 )。就序列编号 120 表示的碱基序列而言， 人来源的 HRAS 样阻抑因子基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1743 ～ 1953 表示。在序列编号 120 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 120 表 示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌 细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胃 癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 120 表示的碱基序列中用碱基编 号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 1405、 1409、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1479、 1483、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520 等所示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 bA305P22.2.1 基因的情况下， 作为含 有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示 的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 bA305P22.2.1 基因的外显子 1 和 位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 121 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AL121673 记载的碱基序列的碱基编号 13001 ～ 13889 表示的碱基序列 )。 就序列编号 121 表示的碱基序列而言， 对人来源的 bA305P22.2.1 蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 849 ～ 851 表示， 上述外显 子 1 的碱基序列用碱基编号 663 ～ 889 表示。在序列编号 121 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 121 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在 的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基 化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧 啶， 例如可以举出序列编号 121 表示的碱基序列中用碱基编号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 γ- 细丝蛋白基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 γ- 细丝蛋白基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 122 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC074373 记载的碱基序列的碱基编号 63528 ～ 64390 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 122 表示的碱基序列而言， 对人来源的 γ- 细丝蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 572 ～ 574 表示， 上述外显子 1 的碱基序列用碱基编号 463 ～ 863 表示。 在序列编号 122 表示的碱基序列中存 在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 122 表示的碱基序列中在 CpG 密 集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即
     高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的 胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 122 表示的碱基序列中用碱基编号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363、 370、 379、 382、 384、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474、 486、 490、 503、 505 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 HAND1 基因的情况下， 作为含有在其启 动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序 列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 HAND1 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的 启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 123 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC026688 记载的碱基序列的碱基编号 24303 ～ 26500 表示的碱 基序列的互补序列 )。 就序列编号 123 表示的碱基序列而言， 对人来源的 HAND1 蛋白质的氨 基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 1656 ～ 1658 表示， 上述外显子 1 的碱 基序列用碱基编号 1400 ～ 2198 表示。在序列编号 123 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表 示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 123 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域 中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如 可以举出序列编号 123 表示的碱基序列中用碱基编号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272、 1292、 1305、 1307、 1316、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434 等表示的胞嘧 啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 RIKEN 2210016F16 基因的同系物 的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列 中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 RIKEN 2210016F16 基因的同系物的外显子 1 和位于其 5’上游的启动子区域的基因组 DNA 的 碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 124 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AL354733 记载的碱基序列的碱基编号 157056 ～ 159000 表示的碱基序列的互补碱基序 列 )。就序列编号 124 表示的碱基序列而言， 人来源的 RIKEN 2210016F16 基因的同系物蛋 白质的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1392 ～ 1945 表示。在序列编号 124 表示的碱基 序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 124 表示的碱基序列中 在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频 度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基 化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 124 表示的碱基序列中用碱基编号 1172、 1175、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1332、 1334、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 FLJ32130 基因的情况下， 作为含有在 其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱 基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 FLJ32130 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 125 表示的碱 基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC002310 记载的碱基序列的碱基编号 1 ～ 2379 表示的 碱基序列的互补碱基序列 )。就序列编号 125 表示的碱基序列而言， 对人来源的 FLJ32130 蛋白质的氨基酸末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2136 ～ 2138 表示， 认为是上述外显子 1 的碱基序列用碱基编号 2136 ～ 2379 表示。在序列编号 125 表示的碱基 序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 125 表示的碱基序列中 在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频 度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基 化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 125 表示的碱基序列中用碱基编号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 1911、 1915、 1925、 1940、 1955、 1968 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 PPARG 血管生成素相关蛋白基因的情 况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在 的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 PPARG 血管生成素 相关蛋白基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体 而言， 可以举出序列编号 126 表示的碱基序列。就序列编号 126 表示的碱基序列而言， 对人 来源的 PPARG 血管生成素相关蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基 编号 717 ～ 719 表示， 上述外显子 1 的 5’ 侧部分的碱基序列用碱基编号 1957 ～ 2661 表 示。在序列编号 126 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是 序列编号 126 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表 示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更 具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 126 表示的碱 基序列中用碱基编号 35、 43、 51、 54、 75、 85、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为凝血调节蛋白基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的凝血调节蛋白基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 127 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF495471 记载的碱基序列的碱基编号 1 ～ 6096 表示的碱基序列 )。 就序列编号 127 表示的碱基序列而言， 对人来源的凝血调节蛋白质的氨 基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2590 ～ 2592 表示， 上述外显子 1 的碱 基序列用碱基编号 2048 ～ 6096 表示。在序列编号 127 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表 示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 127 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域 中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如 可以举出序列编号 127 表示的碱基序列中用碱基编号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595、 1598、 1601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1724、 1726、 1756 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 p53- 应答基因 2 基因的情况下， 作为含 有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 p53- 应答基因 2 基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列 编号 128 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009471 记载的碱基序列的碱基编号 113501 ～ 116000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 128 表示的碱基序列而言， 人来源的 p53- 应答基因 2 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1558 ～ 1808 表示。 在序列 编号 128 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细 胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 128 表示的碱基序列中 用碱基编号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383 等 表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为微纤维蛋白 2 基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的微纤维蛋白 2 基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 129 表 示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC113387 记载的碱基序列的碱基编号 118801 ～ 121000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 129 表示的碱基序列而言， 人来源的微 纤维蛋白 2 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1091 ～ 1345 表示。在序列编号 129 表 示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞 中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌 细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 129 表示的碱基序列中用碱基编号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843 等表示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为神经丝蛋白 3 基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的神经丝蛋白 3 基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 130 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF106564 记载的碱基序列的碱基编号 28001 ～ 30000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 130 表示的碱基序列而言， 人来源的神经 丝蛋白 3 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 614 ～ 1694 表示。在序列编号 130 表示 的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中 甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌 细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 130 表示的碱基序列中用碱基编号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为解聚素及金属蛋白酶结构域 23 基因的 情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在 的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的解聚素及金属蛋 白酶结构域 23 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 131 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009225 记载的碱基序列的碱基编号 21001 ～ 23300 表示的碱基序列 )。就序列编号 131 表示的 碱基序列而言， 人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域 23 基因的外显子 1 的碱基序列， 用 碱基编号 1194 ～ 1630 表示。在序列编号 131 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的 碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例
     如可以举出序列编号 131 表示的碱基序列中用碱基编号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 1043、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106、 1112、 1120、 1124、 1126 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 G 蛋白偶联受体 7 基因的情况下， 作为 含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 G 蛋白偶联受体 7 基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列 编号 132 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009800 记载的碱基序列的碱基编号 75001 ～ 78000 表示的碱基序列 )。就序列编号 132 表示的碱基序列而言， 人来源的 G 蛋白 偶联受体 7 基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 1666 ～ 2652 表示。在序列编号 132 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细 胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺 癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 132 表示的碱基序列中用碱基编 号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620 等表示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 G- 蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样 肽受体基因的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的 碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 G- 蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区 域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 133 表示的碱基序列 ( 相当于 基因库检索号 No.AC008971 记载的碱基序列的碱基编号 57001 ～ 60000 表示的碱基序列 的互补序列 )。就序列编号 133 表示的碱基序列而言， 人来源的 G- 蛋白偶联生长抑素及血 管紧张素样肽受体基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 776 ～ 2632 表示。在序列编 号 133 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞 等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 133 表示的碱基序列中 用碱基编号 470、 472、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 540、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去 甲肾上腺素成员 2 基因的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码 区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人 来源的溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员 2 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 134 表示的碱 基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC026802 记载的碱基序列的碱基编号 78801 ～ 81000 表 示的碱基序列的互补序列 )。 就序列编号 134 表示的碱基序列而言， 人来源的溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员 2 基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 1479 ～ 1804 表示。在序列编号 134 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 134
     表示的碱基序列中用碱基编号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184 等表示的胞嘧啶。
     另外， 作为基因组 DNA 中的 “目标 DNA 区域” ， 具体可例举如下述序列编号 1 ～ 12 所示的碱基序列及它们的互补序列， 或者与它们的碱基序列具有 80％以上、 90％以上、 95％ 以上或 98％以上的序列同一性的碱基序列等。
     序列编号 1 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21965410 ～ 21964273 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 2 相当于基因库检索号 No.NT_024524.13 记载的碱基序列的碱基编号 29857545 ～ 29858420 所示的碱基序列。
     序列编号 3 相当于基因库检索号 No.NT_010718.15 记载的碱基序列的碱基编号 7188979 ～ 7189574 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 4 相当于基因库检索号 No.NW_926584.1 记载的碱基序列的碱基编号 7534656 ～ 7535486 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 5 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21984168 ～ 21984790 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 6 相当于基因库检索号 No.NW_924062.1 记载的碱基序列的碱基编号 21818162 ～ 21818836 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 7 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21998877 ～ 21999061 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 8 相当于基因库检索号 No.NT_023935.17 记载的碱基序列的碱基编号 19277002 ～ 19277451 所示的碱基序列。
     序列编号 9 相当于基因库检索号 No.NW_924484.1 记载的碱基序列的碱基编号 19064265 ～ 19065579 所示的碱基序列。
     序列编号 10 相当于基因库检索号 No.NT_022517.17 记载的碱基序列的碱基编号 50318280 ～ 50318573 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 11 相当于基因库检索号 No.NT_022517.17 记载的碱基序列的碱基编号 61176814 ～ 61177405 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 12 相当于基因库检索号 No.NT_034772.5 记载的碱基序列的碱基编号 14488398 ～ 14489126 所示的碱基序列。
     作为 “目标 DNA 区域” ( 以下， 也记为目标区域 )， 还可例举如含有在 MLH1、 RUNX3、 CDH1、 TIMP3、 CSPG、 RARβ、 14-3-3σ、 CALCA、 HIC1、 ESR1、 PTEN、 SOCS1、 BLT1、 ESR2、 MTMG、 TWIST、 INK4、 CDKN2、 GSTP、 DCR2、 TP73、 PGR、 HIC2、 MTHFR、 TFF1、 MLLT7、 SLC5A8、 THBS1、 SOCS2、 ACTB、 CDH13、 FGF18、 GSTM3、 HSD17B4、 HSPA2、 PPP1R13B、 PTGS2、 SYK、 TERT、 TITF1、 BRACA1、 AATF、 ABCB1、 ABCC1、 ABI1、 ABL1、 AF1Q、 AF3P21、 AF4、 AF9、 AFF3、 AKAP12、 AKAP9、 ALEX3、 ALK、 ALOX15、 APAF1、 APC、 ARHA、 ARHGAP26、 ARHGEF12、 ARNT、 ATBF1、 ATF1、 ATM、 AXIN2、 BCAS3、 BCAS4、 BCL1、 BCL10、 BCL11A、 BCL11B、 BCL2、 BCL5、 BCL7A、 BCR、 BIRC3、 BMPR1A、 BRCA2、 BRD4、 BRIP1、 BTG1、 BUB1B、 CAGE-1、 CARS、 CASC5、 CCDC6、 CCND2、 CCND3、 CDH11、 CDKN1B、 CDKN2A、 CDX2、 CEP110、 CKN1、 CLP1、 CLTC、 CLTCL1、 CNC、 COL1A1、 COX6C、 CREBBP、 CXXC6、 DAB2IP、 DDIT3、 DDX43、 DIRC1、 DIRC2、 DKK1、 E2F3、 EEN、 EGFR、 ELL、 EPS15、 ERBB2、 ERC1、 ERCC1、 ERCC4、 ERG、ETV1、 ETV6、 EVI1、 EWSR1、 EXT1、 EXT2、 FANCA、 FANCD2、 FANCF、 FAS、 FBP17、 FCRL4、 FEV、 FGFR1、 FHIT、 FLI1、 FOXO3A、 FUS、 FVT1、 GAS7、 GLI1、 GNAS、 GOLGA5、 GOPC、 GRB2、 HCMOGT-1、 HIST1H4I、 HLF、 HMGA2、 HOXA13、 HOXC11、 HOXC13、 HOXD13、 HSPBAP1、 HSPCB、 HSPD1、 HSPH1、 IKZF2、 INTS6、 IRF4、 JAG1、 JAG2、 JAK2、 JARID1A、 JAZF1、 JMJD2C、 JUN、 KIT、 KITLG、 KLF5、 KLF6、 LASP1、 LDB1、 LHFP、 LMO1、 LMO2、 LPHN2、 LPP、 LYL1、 MADH4、 MAF、 MAFB、 MDM2、 MDS2、 MET、 MKL1、 MLF1、 MLH1、 MLL、 MLLT10、 MMP2、 MN1、 MRE11B、 MSF、 MSH2、 MSH6、 MSI2、 MUC1、 MUTYH、 MXI1、 MYC、 MYH9、 MYST3、 NF1、 NFKB1、 NIN、 NKX2-5、 NONO、 NOTCH1、 N-RAS、 NTRK3、 NUMA1、 NUP214、 NUP98、 OLIG2、 P53、 PALB2、 PAX2、 PAX5、 PAX7、 PAX9、 PBX1、 PCM1、 PCSK7、 PDGFB、 PDGFRA、 PDGFRB、 PHOX2B、 PICALM、 PLAG1、 PLCB1、 PLK、 PML、 PMS1、 POLH、 POU5F1P1、 POU6F2、 PPP1R13L、 PRDM16、 PRRX1、 PSIP1、 PTCH、 RABEP1、 RAD51L1、 RAD53、 RANBP17、 RAP1GDS1、 RAP2B、 RARA、 RASSF1、 RB1、 RBL2、 RBM15、 RBM5、 RCHY1、 RECQL、 RECQL5、 RET、 RUNX、 RUNX1T1、 SBDS、 SDHC、 SDHD、 SET、 SHH、 SIL、 SIX1、 SNAI2、 SPI1、 SPINK7、 STARD3、 STAT3、 STK11、 STK4、 SUFU、 SYK、 SYNPO2、 TBX2、 TCF3、 THBS2、 THRAP3、 TMPRSS2、 TNF、 TOP1、 TPM4、 TPR、 TRIM24、 TRIM33、 TRIP11、 TSC1、 TSC2、 TSHR、 TTL、 VAV1、 VHL、 WFDC1、 WT1、 WWOX、 XPC、 ZBTB16、 ZNF146、 ZNF217 等基因的启动子区域、 非翻译区 域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 所示的碱基序列中的胞嘧啶一个 以上的 DNA 的区域。除了对这些目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 分别定量或检测之外， 例如， 在一个检测系中， 使用更多的这些目标 DNA 区域， 可以相应地使其定量精度及检测灵 敏度进一步提高。
     “目标 DNA 区域” 也可以是在基因组中散在的重复序列。 特别是， 明确了因疾病被甲 基化的重复序列的甲基化程度可以作为疾患的替代标记物利用。例如， 已知在癌中 SINE 和 LINE 的甲基化， 具体而言， 已知 AluJb、 AluJo、 AluSc、 A1uSg、 AluSg/x、 AluSp、 AluSq、 AluSq/ x、 AluSx、 AluY、 FRAM、 FLAM_A、 MIR、 MIRb、 MIR3、 L1Med、 L1M4、 L1M5、 L1MA3、 L1MA7、 L1MA9、 L1MC、 L1MC2、 L1MC4、 L1MC4a、 L1MC5、 L1MDa、 L1MD1、 L1MD2、 L1MEe、 L1ME3A、 L1PA15、 L1PREC2、 L2、 L3、 HAL1 等亚家族。
     基因组中的重复序列一般被分为简单重复序列 ( 被称为串联重复序列或衔接重 复 ) 和散在重复序列。
     简单重复序列的特征是相同序列在相同方向相邻存在， 大致被分为例如， (1)CCA 等较短序列重复的重复序列、 (2) 来自转录因子的重复序列、 (3) 着丝粒、 端粒、 动粒、 核糖 体基团基因之类的一系列的重复序列、 (4) 从 RNA、 蛋白质逆转录的经非活性处理了的假基 因、 (5) 通过基因复制扩增了的基因序列这 5 种。
     首先， 作为由较短碱基序列的重复， 已知 (A)n、 (T)n、 (GA)n、 (CA)n、 (TAA)n、 (GGA) n、 (CAGC)n、 (CATA)n、 (GAAA)n、 (TATG)n、 (TTTG)n、 (TTTA)n、 (TTTC)n、 (TAAA)n、 (TTCA) n、 (TATAA)n、 (TCTCC)n、 (TTTCC)n、 (TTTAA)n、 (TTTTC)n、 (TTTTA)n、 (TTTTG)n、 (CAAAA)n、 (CACCC)n、 (TATATG)n、 (CATATA)n、 (TCTCTG)n、 (AGGGGG)n、 (CCCCCA)n、 (TGGGGG)n(n 表示重 复数 ) 等序列。 接着， 作为来自转录因子的序列， 对于 hAT 组有 MER1-Charlie、 Zaphod， 对于 Tc-1 组有 MER2-Tigger、 Tc-1、 Mariner。作为来自其他基因组上的转录因子的重复序列， 已 知有 Tigger1、 Tigger2a、 Tigger5、 Charlie4a、 Charlie7 等。由于含有这些短碱基序列的 重复序列、 来自转录因子的重复序列一般是短且简单的碱基序列， 因此难以设定本发明方 法的特定寡核苷酸， 如果可以设定能够实施的特定寡核苷酸， 则未必要作为本发明方法的对象排除。另外， 卫星 DNA、 小卫星、 微卫星等是被分类为简单重复序列的重复序列。
     另外， 作为在基因中多拷贝存在的序列， 如果可以对于作为着丝粒中存在的序列 的 ALR6、 作为 snRNA 的 U2、 U6、 之外的如 tRNA、 rRNA 之类的通常已知的在基因组中存在多拷 贝的基因、 除此之外的通过基因重复而在基因组中存在多拷贝的基因等， 设计本发明方法 的特定寡核苷酸， 就可以使检测灵敏度比在一个基因组中检测一个基因有所提高。
     另外， 已知逆转录病毒、 在末端具有 LTR(Long terminal repeat， 长末端重复 ) 的 逆转录转座子、 MaLRs(Mammalian apparentLTR-Retrotransposons) 之类被认为是病毒来 源的内源序列、 来自逆转录病毒的 LTR 也在一个基因组中存在多个。
     例如， 作为逆转录转病毒来源的 LTR， 具体已知有 LTR1、 LTR1B、 LTR5、 LTR7、 LTR8、 LTR16A1、 LTR16A1、 LTR16C、 LTR26、 LTR26E、 MER48、 MLT2CB 等亚家族。另外， 逆转录转座子 来源的 LTR 被分为 ERV、 ERVK、 ERVL 各类， 具体而言， 可例举如 LTR8A、 LTR28、 MER21B、 MER83、 MER31B、 MER49、 MER66B、 HERVH、 ERVL、 LTR16A1、 LTR33A、 LTR50、 LTR52、 MLT2A1、 MLT2E、 MER11C、 MER11C 等亚家族。MaLRs 是指与典型的逆转录转座子同样在其序列的两端含有 LTR、 但在 LTR 中插入的内部序列并不是来源于逆转录病毒的序列的 DNA 因子。例如可例举 如 MLT1A1、 MLT1A2、 MLT1B、 MLT1C、 MLT1D、 MLT1F、 MLT1G、 MLT1H、 MLT1J、 MLT1K、 MLT11、 MLT2CB、 MSTA、 MSTA-int、 MSTB、 THE1A、 THE1B、 THE1B-internal、 THE1 等亚家族。
     散在重复序列的特征是， 不相邻而是散在， 被认为是逆转录转座子来源的。另外， 散在重复序列根据其长度， 被分为 SINE(Short InterspersedRepetitive Element ： 短链散 在重复序列 ) 和 LINE(Long InterspersedElements ： 长链散在重复序列 )。SINE 中大部分 是属于 Alu 家族的序列。Alu 家族的共同特征是具有 7SL RNA 的 3’ 侧的序列或 5’ 侧的序 列， 并且具有在称为 “Left-monomer” 和 “Right-monomer” 的区域插入的富 AT 区域。作为 Alu 家族的亚家族， 可例举如 Alu、 AluJb、 AluJo、 AluSc、 AluSg、 AluSp、 AluSq、 AluSx、 AluY， 以及 FAM(Fossil Alu Monomer) 和具有 FAM 的序列的 FLAM(Free Left Alu Monomer) 和 FRAM(Free Right AluMonomer)。作为 Alu 家族以外的 SINE， 已知有 MIR 和 Ther/MIR3， 作 为亚家族， 分别已知 MIR、 MIR3。另外， 作为包含人以外生物种的 Alu 家族的亚家族， 已知有 B1、 B2、 B4、 PB1、 PB1D 等。作为 LINE， 报道了 LINE1 至 Line23 的亚家族， 已知 LINE-1、 LINE2、 LINE3 在广泛的基因组中存在。另外， 对于 LINE-1， 已知有例如 L1M1、 L1M2、 L1M3、 L1M3d、 L1M4、 L1M4c、 L1MA2、 L1MA7、 L1MA8、 L1MA9、 L1MB1、 L1MB1、 L1MB3、 L1MB4、 L1MB5、 L1MB6、 L1MB7、 L1MCa、 L1MCb、 L1MC2、 L1MC3、 L1MC4、 L1MC4a、 L1MC5、 L1MDa、 L1ME、 L1MEc、 L1MEd、 L1MEg、 L1ME1、 L1ME2、 L1ME3、 L1ME3A、 L1ME3B、 L1ME4a、 L1PB3、 L1P4、 L1PA2、 L1PA3、 L1PA4、 L1PA5、 L1PA6、 L1PA7、 L1PA10、 L1PA12、 L1PA13、 L1PA14、 L1PA16、 L1PB1、 L1PB3、 L1PB4、 L1PREC2、 HAL1 等亚家族， 作为 LINE-2， 已知有 L2、 L2c 等亚家族。
     这样的在基因组中散在的重复序列中， 如果为因疾病被甲基化的， 则可以通过本 发明方法作为疾患的替代标记物， 作为高灵敏度的检测系而利用。
     “定量或检测 DNA” 中的定量是指， 从定量的甲基化 DNA 抗体， 计算标本中的目标 DNA 区域中的甲基化频度或与其具有相关关系的指标值， 表示例如标本为 1mL 血清时， 血清 1mL 中所含目标区域的 DNA 的甲基化频度或与其有相关关系的指标值。
     “定量或检测 DNA” 中的检测是指， 通过是否检测到甲基化 DNA 抗体， 来判断目标 DNA 区域中是否存在被甲基化了的 DNA， 当检测到甲基化 DNA 抗体时， 表示在标本中， 在目标DNA 区域存在被甲基化了的 DNA， 当没有检测到甲基化 DNA 抗体或特定寡核苷酸时， 表示在 标本中， 在目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 的存在量不到检测限。
     第一工序中， 将生物来源标本中所含的具有目标 DNA 区域的基因组 DNA 来源的双 链 DNA 暂时分离成单链状态。具体而言， 例如， 通过向双链 DNA 中添加退火缓冲液而得到混 合物。接着， 将所得混合物在 95℃煮沸约 30 秒， 之后在冰冷水上骤冷数分钟。例如， 血液等 所含游离 DNA 有可能是单链 DNA。因此， 当生物来源标本中所含基因组 DNA 为单链 DNA 时， 没有必要进行该操作。
     第二工序中的 “甲基化 DNA 抗体” 是指将 DNA 中的被甲基化了的碱基作为抗原而 结合的抗体。更优选的是， 为具有识别单链 DNA 中的 5 位被甲基化了的胞嘧啶并结合的性 质的抗体即可， 更具体而言， 也可以是甲基胞嘧啶抗体。另外， 即使是市售的甲基化 DNA 抗 体， 只要是特异性识别本发明记载的甲基化状态的 DNA 并可以特异性结合的抗体即可。甲 基化 DNA 抗体可通过将被甲基化了的碱基、 甲基化 DNA 等作为抗原并利用通常方法而制成。 具体而言， 可以从将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲基胞嘧啶的 DNA 等作为抗原而 制得的抗体， 以对 DNA 中的甲基胞嘧啶的特异性结合为指标进行选择而制得。作为向动物 免疫抗原而得到的抗体， 有免疫精制的抗原后利用 IgG 级分的抗体 ( 多克隆抗体 ) 的方法， 以及利用产生单一克隆的抗体 ( 单克隆抗体 ) 的方法。本发明中， 优选能够特异性识别甲 基化 DNA 或甲基胞嘧啶的抗体， 因此优选利用单克隆抗体。
     作为制造单克隆抗体的方法， 可例举如细胞融合法。 例如， 细胞融合法是使免疫小 鼠来源的脾细胞 (B 细胞 ) 与骨髓瘤细胞细胞融合， 制造杂交瘤， 选择杂交瘤产生的抗体， 可 以制造甲基胞嘧啶抗体 ( 单克隆抗体 )。 利用细胞融合法制造单克隆抗体时， 没有必要精制 抗原， 例如可以将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲基胞嘧啶的 DNA 等的混合物作 为抗原， 投与免疫用的动物。作为给药方法， 为将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲 基胞嘧啶的 DNA 等直接给予产生抗体的小鼠。当抗体难以产生时， 也可以使抗原结合到支 撑体来免疫。另外， 通过将佐剂溶液 ( 例如混合液体石蜡和 Aracel A， 并混合结核菌的死 菌作为佐剂得到的溶液 ) 和抗原充分混合， 掺入脂质体使其免疫， 由此可以提高抗原的免 疫性。 或者， 有如下的方法 ： 等量添加含有抗原的溶液和佐剂溶液， 充分成为乳液状之后， 向 小鼠的皮下或腹腔内注射的方法 ； 在与明矾水充分混合之后， 以百日咳死菌为佐剂并添加 的方法。 另外， 也可以在最初的免疫之后经过合适的期间后， 对小鼠的腹腔内或静胍内追加 免疫。另外， 在抗原量少的情况下， 可以将抗原悬浮的溶液直接注入小鼠脾脏进行免疫。自 最终免疫起数日后摘除脾脏并剥离脂肪组织之后， 制作脾细胞悬浮液。使该脾细胞和例如 HGPRT 缺失骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤。 作为细胞融合剂， 只要是可以将脾细胞 (B 细胞 ) 和骨髓瘤细胞有效融合的方法即可， 例如可以举出使用仙台病毒 (HVJ)、 聚乙二醇 (PEG) 的方法等。 另外， 可以利用使用高电压脉冲的方法进行细胞融合。 在细胞融合操作之 后， 用 HAT 培养基进行培养， 选择脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤的克隆， 等待细胞发 育直到可以筛选。就用于选择生产目标抗体的杂交瘤的抗体的检测法、 抗体效价的测定法 而言， 可以利用抗原抗体反应体系。具体而言， 在针对可溶性抗原的抗体测定法中， 可以举 出放射性同位素免疫定量法 (RIA)、 酶免疫定量法 (ELISA) 等。 考虑到甲基化 DNA 抗体的性 质 ( 在 1 个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 结合 1 个抗体 )， 作为目标 DNA 区域， 优选选择多 个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 )， 即存在 CpG 的区域， 可以提高定量精度及检测灵敏度。“特定寡核苷酸” 是指， 具有可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 碱基配对的碱基 序列、 且当与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 碱基配对时， 不抑制甲基化 DNA 抗体与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 中的被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 结合的寡核苷酸。即， 是不抑制单链 DNA 中的目标 DNA 区域中的被甲基化了的碱基与甲基化 DNA 抗体相结合的寡核苷酸。更具 体而言是指， 例如是不抑制目标 DNA 区域中的甲基胞嘧啶与甲基胞嘧啶抗体之间结合的寡 核苷酸， 并且是通过互补性可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的寡核苷酸。
     “可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的碱基序列” 是指形成与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 的结合体 ( 双链 ) 而必要的碱基序列， 即含有与目标 DNA 区域的碱基序列 的一部分相互补的碱基序列的碱基序列、 或含有对与目标 DNA 区域的 5’ 末端相比更靠近 5’ 末端侧 DNA 区域的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列、 或含有对与目标 DNA 区域的 3’ 末端相比更靠近 3’ 末端侧的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列。 另外， “不抑制甲基化 DNA 抗体对含有目标 DNA 区域的单链 DNA 中的被甲基化了的碱基 ( 胞 嘧啶 ) 的结合” 是指特定寡核苷酸的碱基序列为如下的碱基序列， 即， 特定寡核苷酸与上述 单链 DNA 的互补结合， 不在甲基化 DNA 抗体与被甲基化了的单链 DNA 结合而需要的占有空 间内发生的碱基序列。即， 认为甲基化 DNA 抗体与被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 的结合中， 不仅占用了直接结合的被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 )， 而且也占用了被甲基化了的碱基 ( 胞 嘧啶 ) 存在的周边空间。因此， 特定寡核苷酸只要是在甲基化 DNA 抗体与甲基化 DNA 结合 时需要的占有空间中不与上述单链 DNA 互补结合的寡核苷酸即可。
     本发明中， 使用至少一个以上的特定寡核苷酸， 可以同时检测至少一个以上的目 标 DNA 区域。即， 与上述单链 DNA 结合的特定寡核苷酸没有必要是 1 种， 只要是不抑制甲基 化 DNA 抗体的结合， 也可以使用 2 种以上。如使用多个特定寡核苷酸， 可以提高定量精度及 检测灵敏度。另外， 通过同时检测多个的目标区域， 可以增加作为测定对象的甲基化 DNA 的 量。
     另外， “特定寡核苷酸” 具体可例举如序列编号 13 ～ 24 中任一项所示的碱基序列 及其互补序列， 或者也可以例举与这些碱基序列有 80％以上、 90％以上、 95％以上或 98％ 以上的序列同一性的碱基序列等。
     第二工序中， 作为使单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸的复合体形成时 的优选方式， 可例举如在含有二价阳离子的反应系中形成。 更优选例如， 二价阳离子为镁离 子。在此， “含有二价阳离子的反应系” 是指， 在用于使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与特 定寡核苷酸结合的退火缓冲液中含有二价阳离子之类的反应系， 具体例如， 可以是以直到 1mM ～ 600mM 的浓度， 含有形成镁离子的盐 ( 例如， MgOAc2、 MgCl2 等 ) 的反应系。
     另外， 在第二工序中， 作为形成单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸的复合 体时的优选方式， 可例举如添加反向寡核苷酸 (counteroligonucleotide) 等。反向寡核苷 酸是将与目标 DNA 区域相同的碱基序列分割成短的寡核苷酸后得到的核苷酸。通常设计成 10 ～ 100 个碱基、 更优选 20 ～ 50 个碱基的长度。另外， 反向寡核苷酸未设计在特定寡核苷 酸与目标区域相结合的碱基序列上。反向寡核苷酸与基因组 DNA 相比， 大量过剩添加， 目的 在于， 在使目标 DNA 区域成为单链 ( 正链 ) 之后， 在使其与特定寡核苷酸 ( 负链 ) 结合时， 防止目标 DNA 区域的互补链 ( 负链 ) 和目标 DNA 区域的单链 ( 正链 ) 通过互补性再结合。 这是因为， 在使目标 DNA 区域与甲基化 DNA 抗体结合， 测定 DNA 的甲基化频度或与其有相关关系的指标值时， 目标区域为单链时更容易与甲基化 DNA 抗体结合。另外， 反向寡核苷酸与 目标 DNA 区域相比， 优选添加至少 10 倍、 通常为 100 倍以上的量。
     “形成复合体” 是指， 含有甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸与 甲基化 DNA 抗体结合状态的混合物。本发明中， 优选直到后述的第三工序， 通过将该复合体 中的甲基化 DNA 抗体或特定寡核苷酸结合到支撑体从而使该复合体固定到支撑体。
     作为 “支撑体” ， 只要是复合体可以结合的支撑体， 则可以是任何的材质和形状。 例如， 形状合适使用目的即可， 可例举如管状、 试验板状、 过滤器状、 盘状、 珠状等。另外， 作 为材质， 可以使用通常的免疫测定法用支撑体， 可例举如聚苯乙烯、 聚丙烯、 聚丙烯酰胺、 聚 甲基丙烯酸甲酯、 聚砜、 聚丙烯腈、 尼龙等合成树脂， 或者向上述合成树脂中加入磺基、 氨基 等反应性官能基后的材质。另外， 也可以是玻璃、 多糖类或其衍生物 ( 纤维素、 硝基纤维素 等 )、 硅胶、 多孔陶瓷、 金属氧化物等。
     作为使复合体结合到支撑体进行固定的方法， 可例举如将特定寡核苷酸固定化到 支撑体的方法。另外， 由于将含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 通过特定寡核苷 酸结合到支撑体， 因此通过其识别功能 ( 后述 ) 来定量或检测甲基化 DNA 抗体。
     为了使特定寡核苷酸可以在支撑体上固定化， 特定寡核苷酸是最终以形成与含有 被甲基化了的有目标 DNA 区域的单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体的复合体的状态， 在支撑体上 固定化即可。 (1) 也可以在上述单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合前的阶段， 将特定寡核苷酸固 定化到支撑体， 或者，
     (2) 也可以在上述单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合后的阶段， 将特定寡核苷酸固 定化到支撑体。
     为了使特定寡核苷酸固定化到支撑体， 具体而言， 可例举如将特定寡核苷酸的 5’ 末端或 3’ 末端生物素化而得的生物素化寡核苷酸固定到被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体 ( 例如， 被抗生蛋白链菌素覆盖的 PCR 管、 被抗生蛋白链菌素覆盖的磁珠、 被抗生蛋白链菌 素部分覆盖的色谱条等 ) 的方法。
     另外， 还有如下的方法， 即在使特定寡核苷酸的 5’ 末端或 3’ 末端与具有氨基、 硫 醇基、 醛基等活性官能团的分子共价结合之后， 使其与表面被硅烷偶联剂等活化后的玻璃、 多糖类衍生物、 硅胶、 或上述合成樹脂等、 或耐热性塑料制的支撑体共价结合的方法。 另外， 共价结合例如可以举出通过将 5 个甘油三酯串联连结而成的间隔区、 交联剂等使其共价结 合。另外， 还可以举出在玻璃或硅制支撑体上直接从特定寡核苷酸的末端侧开始化学合成 的方法。
     另外， 具体例如， 作为具有可以固定到支撑体的特征的特定寡核苷酸， 使用末端被 生物素标记了的 “生物素化特定寡核苷酸” ， 如下进行实施即可。
     (a) 向生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样中， 添加退火缓冲液 ( 例 如， 33mM Tris- 乙酸盐 pH 7.9、 66mM KOAc、 10mMMgOAc2、 0.5mM 二硫苏糖醇 ) 以及生物素化 特定寡核苷酸， 从而得到混合物。接着， 为了使生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的双链 DNA 成为单链 DNA， 将所得混合物在 95℃加热例如数分钟。之后， 为了形成含有目标 DNA 区 域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体， 将其迅速冷却至较生物素化特定寡核苷 酸的 Tm 值低约 10 ～ 20℃的温度， 在该温度下保温例如数分钟， 之后， 返回至室温 ( 在该阶
     段形成的结合体， 除了含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合 体之外， 还包括含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。
     (b) 向被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体， 添加上述 (a) 所得的混合物， 再将其在 37℃保温例如数分钟， 从而将含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结 合体固定到被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体。之后， 进行残留液的除去和清洗。将清洗 缓冲液 ( 例如， 含有 0.05％ Tween20 的磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaClpH7.4)) 以例如 300μL/ 孔的比例添加， 除去溶液。将该清洗操作重复数次， 将固定化 至支撑体的生物素化特定寡核苷酸与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 的结合体残留到孔上 ( 即使在该阶段， 结合体除了包括被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的 结合体之外， 还包括含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合 体 )。
     (c) 将甲基化 DNA 抗体以适当量 ( 例如， 将 4μg/mL 溶液以 100μL/ 孔的量 ) 添 加到孔中， 之后， 在室温下静置例如约 3 小时， 促进甲基化 DNA 抗体与上述单链 DNA 中含 有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的复合体的形成 ( 复 合体的形成 )( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸 的结合体没有形成复合体 )。之后， 进行残留溶液的除去和清洗。将清洗缓冲液 ( 例如， 0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mMNa2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)) 以例 如 300μL/ 孔的比例添加， 除去溶液。将该清洗操作重复数次， 将复合体残留到孔上 ( 复合 体的选择 )。
     作为在 (a) 中使用的退火缓冲液， 只要是适合使特定寡核苷酸与生物试样来源的 含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的即可， 不限定为上述退火缓冲液。如果使用溶解有二 价离子优选以 1 ～ 600mM 浓度的镁离子的退火缓冲液， 则可以增加结合的稳定性。
     (b) 及 (c) 中的清洗操作可以将在溶液中浮游的未被固定化的甲基化 DNA 抗体、 没 有与甲基化 DNA 抗体结合的在溶液中浮游的单链 DNA、 或者被后述限制性酶消化的在溶液 中浮游的 DNA 等从反应溶液中除去， 因此是重要的。另外， 清洗缓冲液只要是适合上述游离 的甲基化 DNA 抗体、 在溶液中浮游的单链 DNA 等的除去即可， 不限于上述清洗缓冲液， 也可 以是 DELFIA 缓冲液 (PerkinElmer 社制、 Tris-HCl pH 7.8 的 Tween80)、 TE 缓冲液等。
     另外， 如上所述， 上述 (a) ～ (c) 中， 上述的含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素 化特定寡核苷酸的结合， 是在生物素化特定寡核苷酸与被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体的 固定之前的阶段实施的， 但其顺序哪个在前均可。即， 例如， 通过向在被抗生蛋白链菌素覆 盖的支撑体上固定化了生物素化特定寡核苷酸中， 添加生物来源标本中含有的基因组 DNA 来源的 DNA 试样， 从而得到混合物。为了使生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目 标 DNA 区域的双链 DNA 成为单链， 将得到的混合物在 95℃加热例如数分钟， 之后为了形成与 生物素化特定寡核苷酸的结合体， 迅速冷却至较生物素化特定寡核苷酸的 Tm 值低约 10 ～ 20℃的温度， 将该温度保持例如数分钟 ( 在该阶段形成的结合体除了含有被甲基化了的目 标 DNA 区域的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区域以外的被甲基化 了的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体 )。之后， 也可以实施 (c) 的操作， 形成、 选择复合体 ( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形 成复合体 )。可以使用色谱条来实施上述 (a) ～ (c) 的操作。 该情况下， 具体可如下实施。 利用 被抗生蛋白链菌素部分覆盖的色谱条， 将使生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目 标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成的溶液展开。通过该操作， 生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核 苷酸的结合体被固定化到被抗生蛋白链菌素覆盖的部分 ( 在该阶段形成的接合体， 除了含 有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 和甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区 域以外的被甲基化了的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体 )。 接着， 利用上述色谱条将适量的 甲基化 DNA 抗体展开。通过这些操作， 包括生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有被 甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与甲基化 DNA 抗体的复合体 被固定化到被抗生蛋白链菌素覆盖的部分 ( 复合体的形成· 选择 )( 在该阶段， 含有没有被 甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。对于这些 操作， 复合体形成的顺序哪个在前均可。例如， 也可以是， 使含有被甲基化了的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与甲基化 DNA 抗体的复合体形成之后， 将其用色谱 条展开， 在被抗生蛋白链菌素覆盖的部分， 将该复合体固定化。在这些操作中， 通过利用色 谱条将溶液展开， 可以除去不需要的成分， 可以省略清洗操作。当然， 也可以在各操作间实 施清洗操作 ( 清洗缓冲液 ( 例如， 利用含有 0.05％ Tween20 的磷酸缓冲液 (1mMKH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 的色谱条的展开 )。
     第三工序中的 “识别功能” 是指用于检测或定量的基于识别的功能， 具体而言， 对 于甲基化 DNA 抗体的情况， 为进行了铕标记、 胶体金标记、 乳胶微球标记、 放射性同位素标 记、 荧光物质 (FITC 等 ) 标记、 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记、 碱性磷酸酯标记、 生物素标记等 的甲基化 DNA 抗体的这些标记的荧光·发色等功能， 另外， 作为该功能， 也可例举如抗体自 身与二次抗体结合的性质等。作为这些功能的定量或检测手段， 可例举如例如放射线检测 器、 分光光度计等的测定或目视等。
     对于甲基化 DNA 抗体的情况， 如上所述， 抗体自身与二次抗体结合的性质被认为 是功能。 即， 即使抗体自身没有被标记， 而是使用附加有可以定量或检测的识别功能的二次 抗体， 也可以间接定量或检测甲基化 DNA 抗体。
     对甲基化 DNA 抗体通过其识别功能进行定量或检测时， 具体而言， 例如， 将抗体自 身的特性作为功能使用时， 进行以下操作即可。向复合体中添加对甲基化 DNA 抗体的二次 抗体 ( 例如， Eu-N1 标记小鼠 IgG 抗体 ： PerkinElmer 社制 )， 在室温下静置约 1 小时， 促进二 次抗体对复合体的结合， 之后， 添加·混合促进溶液 (Enhancement Solution， PerkinElmer 社制 )， 例如在室温静置约 45 分钟。之后， 利用荧光检测器测定荧光 ( 激发 340nm/ 萤光 612nm)， 将甲基化 DNA 抗体定量或检测。作为二次抗体使用使 FITC 结合的抗体时， 也可以 通过公知的方法， 测定 FITC 的萤光， 定量或检测甲基化 DNA 抗体。另外， 例如， 在特定寡核 苷酸的固定化中没有利用生物素时， 可以用于定量或检测生物素化甲基化 DNA 抗体。定量 或检测生物素化甲基化 DNA 抗体时， 例如， 向生物素化甲基化 DNA 抗体添加· 混合 HRP 标记 抗生蛋白链菌素， 形成生物素化甲基化 DNA 抗体与 HRP 标记抗生蛋白链菌素的结合体， 通过 公知的方法测定 HRP 的活性， 从而可以对生物素化甲基化 DNA 抗体进行定量或检测。
     本发明包括以下变更方法 ： 在第一工序后至第三工序， 追加利用可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶将未被甲基化的单链 DNA 消化的工序的变更方法 ( 变更方法1) ； 以及， 在本发明的第一工序后至第三工序， 追加在含具有甲基化敏感性限制酶的识别序 列作为其一部分的特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中， 利用该甲基化敏感性限制酶将未被甲 基化的单链 DNA 消化的工序的变更方法 ( 变更方法 2)。
     该变更方法 ( 变更方法 1 及变更方法 2) 中的 “甲基化敏感性限制酶” 是指， 例如， 可以不消化含有被甲基化了的胞嘧啶的识别序列、 而仅消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识 别序列的限制性酶等。即， 对于甲基化敏感性限制酶本来可以识别的识别序列中所含胞嘧 啶为被甲基化了的 DNA 的情况， 即使使该甲基化敏感性限制酶作用该 DNA， 该 DNA 也不被剪 切。与此相对， 对于甲基化敏感性限制酶本来可以识别的识别序列中所含胞嘧啶没有被甲 基化的 DNA 的情况， 如使该甲基化敏感性限制酶作用该 DNA， 则该 DNA 被剪切。作为该甲 基化敏感性酶的具体示例， 例如可例举如 HpaII、 BstUI、 NarI、 SacII、 HhaI 等。另外， 上述 甲基化敏感性限制酶不切断半甲基状态的双链 DNA( 一侧的链的胞嘧啶 (CpG) 被甲基化， 另一侧链的互补的胞嘧啶 (CpG) 没有被甲基化的双链 DNA)， 这些被 Gruenbaum 等人明确了 (NucleicAcidResearch， 9、 2509-2515)。
     另外， “可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶” 是指， 例如， 可以不消化单链 DNA 中的含有被甲基化了胞嘧啶的识别序列、 而仅消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序 列的限制性酶等。 即， 甲基化敏感性限制酶中也有可以消化单链 DNA 的。 可例举如 HhaI 等。
     作为利用甲基化敏感性限制酶的消化处理的令人担心之处， 可以举出对无法完全 消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序列 ( 所谓 “剩余未切的 DNA” ) 的担心。在这样的担 心成为问题的情况下， 只要大量存在甲基化敏感性限制酶的识别位点， 可以将 “剩余未切的 DNA” 抑制在最小限， 作为目标 DNA 区域， 具有一个以上的甲基化敏感性限制酶的识别位点， 认为其识别位点越多越好。
     如上所述， 作为目标 DNA 区域， 考虑到甲基化 DNA 抗体的性质 (1 个抗体结合到 1 个被甲基化了碱基 ( 胞嘧啶 ))， 优选选择存在多个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶、 CpG) 的区 域作为目标 DNA 区域， 另外， 从将 “剩余未切的 DNA” 抑制在最小限的观点来看， 优选选择存 在多个甲基化敏感性限制酶的识别位点的区域。
     变更方法 2 中的 “特定掩蔽用寡核苷酸” 是指具有甲基化敏感性限制酶的识别序 列作为其一部分的寡核苷酸。具体而言是如下的寡核苷酸， 即， 与单链 DNA 中的目标 DNA 区 域中所含的多个位置的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中的 1 个位置的特定位置 ( 根据 目标区域的碱基序列的不同， 也包括在下述的 8 ～ 30 碱基长度中， 同时含有 1 个位置以上 的情况 ) 互补结合， 形成双链 DNA( 即， 上述位置成为双链 DNA 状态 )， 即便是仅以双链 DNA 为 基质的甲基化敏感性限制酶也可以将上述位置消化， 另外， 可以提高利用能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶 ( 能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶也能够消化双链 DNA， 就 其消化效率而言， 针对双链 DNA 的消化效率高于针对单链 DNA 的消化效率 ) 的上述位置的 消化效率， 并且， 是不会抑制含有目标区域的 DNA 的单链 DNA 和特定寡核苷酸的结合体的形 成的寡核苷酸。
     作为特定掩蔽用寡核苷酸， 更具体而言， 可例举如下的寡核苷酸， 即， 具有对于单 链 DNA 中的目的 DNA 区域所含的包括多个位置的甲基化敏感性限制酶的识别序列中的 1 个 位置的特定位置 ( 根据目标区域的碱基序列的不同， 也有在下述的 8 ～ 30 碱基长度中同时 含有 1 个位置以上的情况 ) 的 8 ～ 30 碱基长度的碱基序列有互补性的碱基序列、 且不抑制包括目标区域的 DNA 的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体的形成的寡核苷酸。
     混合到基因组 DNA 来源的 DNA 试样的特定掩蔽用寡核苷酸可以是 1 种也可以是多 种。如使用多种， 则包括目标区域 DNA 的单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶的识别位点的多 个成为双链 DNA 状态， 可以将甲基化敏感性限制酶的上述 “剩余未切 DNA” 抑制到最小限。 由于在特定掩蔽用寡核苷酸形成双链 DNA 的位置不能结合甲基化 DNA 抗体， 因此不优选对 于过多的甲基化敏感性限制酶使用特定掩蔽用寡核苷酸， 而是优选使用适合的种类。 如果， 对于目标 DNA 区域所含所有的甲基化敏感性限制酶识别位点使用特定掩蔽用寡核苷酸， 则 会阻碍该识别位点中被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 与甲基化 DNA 抗体的结合， 具有被甲基 化了的目标 DNA 区域的复合体的形成可能性会降低 ( 在该识别位点以外的 CpG， 当然结合有 甲基化 DNA 抗体， 在定量或检测甲基化 DNA 抗体时， 其定量精度及检测灵敏度降低 )。特定 掩蔽用寡核苷酸用于对以下位置的设计特别有用， 即， 例如， 在目标 DNA 区域所含多个位置 的甲基化敏感性限制酶的识别序列中， 必须甲基化的情况不被消化、 没有被甲基化的情况 要消化的位置 ( 例如， 在疾患患者标本中， 被 100％甲基化， 在健常者标本中没有被 100％甲 基化的位置等 )。
     该变更方法 ( 变更方法 1 及变更方法 2) 中， 通过在第一工序后至第三工序开始 前， 实施利用至少 1 种的甲基化敏感性限制酶进行消化的工序， 可以将具有没有被甲基化 的目标 DNA 区域的复合体的形成抑制到最小限 ( 排除 )， 可以提高目标 DNA 区域中被甲基化 了的 DNA 的定量精度及检测灵敏度。
     变更方法 1 中， 在第一工序结束后至第三工序开始前实施的， 使用可以消化单链 DNA 的至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶对第一工序所得的单链 DNA 进行消化处理的 操作， 具体例如可如下实施。向第一工序所得的含有单链 DNA 的标本液 10μL 中加入最适 的 10× 缓冲液 3μL、 可以消化单链的甲基化敏感性酶 (HhaI)15U， 另外， 根据需要适量加 入 BSA 等， 接着， 向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 30μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚。这样， 目标 DNA 区域内的没有被甲基化的 HhaI 识别位点被消化 ( 处理溶液 )。例如， 在复合体形成前实施本操作时， 由于在复合体形成、 及 ( 或 ) 选择时实施清洗操作， 因此将 上述处理溶液直接用于复合体形成即可。 另外， 在复合体选择后实施本操作时， 由于需要从 处理溶液中除去在处理溶液中存在的浮游的单链 DNA( 该甲基化敏感性限制酶的识别位点 没有被甲基化， 因此被消化生成的单链 DNA)， 因此必须在本操作结束之后， 再次实施与在复 合体形成及 ( 或 ) 选择时实施的清洗操作同样的清洗操作。
     变更方法 2 中， 在第一工序结束后至第三工序开始前实施的、 向第一工序所得的 单链 DNA 中添加至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶及具有该甲基化敏感性限制酶的识别 序列作为其一部分的特定掩蔽用寡核苷酸而进行消化处理的操作， 具体例如可如下实施。 向第一工序所得的含有单链 DNA 的标本液 10μL 中， 加入最适的 10× 缓冲液 3μL、 甲基化 敏感性酶 (HhaI、 HhaI 等 )15U、 与上述甲基化敏感性酶的识别序列中的 1 个位置的特定位 置相对的特定掩蔽用寡核苷酸约 10pmol， 另外， 根据需要适量添加 BSA 等， 接着， 向该混合 物中添加灭菌超纯水使液量为 30μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚。这样， 目标 DNA 区域 内的没有被甲基化的该箇所被消化 ( 处理溶液 )。例如， 在复合体形成前实施本操作时， 由 于在复合体形成、 及 ( 或 ) 选择时实施清洗操作， 因此将上述处理溶液直接用于复合体形成 即可。 另外， 在复合体选择后实施本操作时， 由于需要从处理溶液中除去在处理溶液中存在的浮游的单链 DNA( 该甲基化敏感性限制酶的识别位点没有被甲基化， 因此被消化生成的 单链 DNA)， 因此必须在本操作结束之后， 再次实施与在复合体形成及 ( 或 ) 选择时实施的清 洗操作同样的清洗操作。
     另外， 作为 “生物来源标本中所含的基因组 DNA 来源的 DNA 试样” 的优选方式之一， 可举出预先用不将该基因组 DNA 所具有的目标 DNA 区域作为识别切断位点的限制酶实施消 化处理而成的 DNA 试样。在使生物来源标本中所含的包括基因组 DNA 具有的目标区域 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体形成的情况下， 对于该单链 DNA， 不仅被认为如含 有目标 DNA 区域则短的更容易形成复合体， 而且操作性也好。减短单链 DNA 中， 在原始基因 组 DNA 时事先减短是有效的。 因此， 也可以将不以目标 DNA 区域为识别剪切位点的限制性酶 直接用于生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样而实施消化处理。另外， 作为利 用不以目标 DNA 区域为识别剪切位点的限制性酶进行消化处理的方法， 使用一般的限制性 酶处理法即可。另外， 标本为事先精制而成的 DNA 试样时， 使用一般使用的量的限制性酶进 行实施即可， 标本为组织溶解液、 细胞溶解液等时， 使用大量过剩的限制酶、 例如相当于 DNA 量为 500 倍量或其以上的限制酶实施即可。
     另外， 作为 “生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样” 的优选方式之一， 可例举如用至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶消化处理而成的 DNA 试样。通过将生物来 源标本本身用甲基化敏感性限制酶消化处理， 可以在最终工序中精度良好地定量或检测甲 基化。该方法对于消除如上所述的 “剩余未切的 DNA” 是有用的。作为将标本本身用甲基 化敏感性限制酶消化的方法， 对于标本中基因组 DNA 以双链 DNA 存在的情况， 使用甲基化敏 感性限制酶， 实施一般的限制性酶处理即可。另外， 对于标本中基因组 DNA 以单链 DNA 存在 的情况， 或者标本中基因组 DNA 以双链 DNA 和单链 DNA 混在的情况， 利用依据变更方法 1 及 变更方法 2 的方法来实施处理即可。具体而言， 例如如下的方法 ： 向标本液 10μL 中加入最 适的 10× 缓冲液 5μL、 可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶 (HhaI)15U， 另外根据需 要适量添加 BSA 等， 再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 50μL， 在 37℃孵育例如 1 小 时～ 1 晚等的方法 ； 或者， 向标本 10μL 中添加最适的 10× 缓冲液 5μL、 甲基化敏感性限制 酶 (HpaII、 HhaI 等 )15U、 与上述甲基化敏感性酶的识别序列中 1 个位置的特定位置相对的 特定掩蔽用寡核苷酸约 15pmol， 另外还根据需要适量添加 BSA 等， 接着， 向该混合物中添加 灭菌超纯水使液量为 50μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚等的方法等。另外， 标本是事先 精制而成的 DNA 试样时， 使用一般使用的量的限制性酶实施处理即可， 标本为组织溶解液、 例如相当于 DNA 量为 500 倍量或其 细胞溶解液等时， 使用大量过剩的甲基化敏感性限制酶、 以上的甲基化敏感性限制酶实施处理即可。
     作为对血液、 尿等生物体试样中所含微量物质进行定量或检测的方法， 广泛使用 免疫学的测定方法。 在该方法中， 使用色谱仪的所谓免疫色谱法操作简单、 检测需要的时间 也短， 因此目前在很多场合例如医院的临床检查、 研究室中的鉴定试验等广泛使用。另外， 近年， 将标记了的 DNA( 基因 ) 在色谱条上展开， 使用可以捕获目的 DNA( 基因 ) 的探针进行 杂交， 从而检查目的 DNA( 基因 ) 的所谓杂交色谱法逐渐被使用。该方法也是操作简单， 检 测需要的时间也短， 因此目前开始在医院的临床检查、 研究室中的鉴定试验等广泛使用。 本 发明在概念上可以形成一种混合了上述免疫色谱法与杂交色谱法的方法。本发明中， 对于 复合体形成及复合体的选择， 其顺序没有特别限定， 因此可以使用各种方法。 具体例如可如下实施。 方法 1 ： 向第一工序结束后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸， 使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成 ( 在该阶段形成的结合体除了包括 含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有没 有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )， 接着， 添加具有功能的 甲基化抗体， 使含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具 有功能的甲基化 DNA 抗体结合的复合体形成 ( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。如将所得的试样滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述复合体通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素 覆盖了的部分捕获。之后， 对形成所得复合体的甲基化 DNA 抗体通过其功能进行定量或检 测， 可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     方法 2 ： 向第一工序结束后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸， 使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成 ( 在该阶段形成的结合体除了包 括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有 未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。如将所得的试样滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述结合体通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白 链菌素覆盖了的部分捕获 ( 在该阶段， 结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的 单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。之后， 如将具有功能的甲基化抗体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移 动到展开部， 与结合体的被甲基化了而得胞嘧啶结合， 形成结合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具有功能的甲基化 DNA 抗体的复合体 ( 在 该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成 复合体 )。 通过对获得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行定量或检测， 可以对 目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     方法 3 ： 如将生物素化特定寡核苷酸滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述寡核苷 酸通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素覆盖了的部分捕获。 接着， 如将 第一工序结束后的试样滴到 ( 导入 ) 到导入部， 则移动到展开部， 以含有目标 DNA 区域的单 链 DNA 在已经被捕获的生物素化特定寡核苷酸形成结合体的形式被捕获 ( 在该阶段形成的 结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之 外， 也包括含有未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。之后， 如将具有功能的甲基化抗体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移动到展开部， 与结合体的被甲基化了 的胞嘧啶结合， 形成结合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡 核苷酸与具有功能的甲基化 DNA 抗体的复合体 ( 在该阶段， 含有未被甲基化的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。对所得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行定量或检测， 从而可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定 量或检测。
     方法 4 ： 如将生物素化特定寡核苷酸滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述寡核 苷酸利用毛细管现象被移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕获。向第一 工序结束后的试样中加入具有功能的甲基化 DNA 抗体， 形成具有被甲基化了的胞嘧啶单链
     DNA( 其中， 存在含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与目的以外的单链 DNA) 与具有功能的甲基化 DNA 抗体的结合体 ( 在该阶段形成的结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单 链 DNA 与甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区域以外的被甲基化了的单链 DNA 与 甲基化抗体的结合体 )。如将所得的结合体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移动到展开部， 含有被 甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与已经被捕获的生物素化特定寡核苷酸结合， 形成结 合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具有功能的甲 基化 DNA 抗体的复合体 ( 在该阶段， 目标 DNA 区域以外的被甲基化了的单链 DNA 与甲基化 抗体的结合体没有形成复合体 )。对所得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行 定量或检测， 从而可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     也可以是， 在一个色谱条上存在多个检测部位 ( 将可以分别捕获不同目标 DNA 区 域的特定寡核苷酸固定到支撑体 )， 依次定量或检测各目标 DNA 区域， 另外， 如果 1 个检测 部位可以捕获多个目标 DNA 区域， 即， 在 1 个检测部位， 固定化多个可以捕获多个目标 DNA 区域的特定寡核苷酸， 则可以使检测灵敏度显著提高。 另外， 使用多个具有可以捕获多个目 标 DNA 区域的功能的特定寡核苷酸来形成多个目标 DNA 区域与复合体， 可以使检测灵敏度 显著提高。进而， 即使在 1 个目标区域中设计多个特定寡核苷酸， 将其用于支撑体侧或检测 侧， 也可以使检测灵敏度显著提高。
     这样在本发明可以使用的限制性酶、 特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体作为检测用 试剂盒的试剂有用。本发明还提供含有这些限制性酶、 特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体等 作为试剂的检测用试剂盒、 将这些特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体等固定化到支撑体上而 成的检测用芯片， 本发明的权利要求范围当然也包括以利用该方法的实质性原理而得的上 述检测用试剂盒、 检测用芯片之类的方式的使用。 实施例 以下， 通过实施例更详细地说明本发明， 但本发明不限于此。
     实施例 1
     将从 ATCC 购入的哺乳动物来源的结肠腺癌细胞株 Capan-2(ATCCNO.HTB-80) 在等 量混合了 McCoy ‘s5a(Gibco、 Cat.No.16600-082) 和 FBS(ATCC、 CatNo.30-2020) 的培养基中 培养直到融合， 由此得到约 1×107 细胞。 向得到的细胞加入 SEDTA 缓冲液 [10mM Tris-HCl pH 8.0、 10mM EDTA pH 8.0、 100mM NaCl]10 倍容量之后， 将其均质化。
     向所得混合物中加入蛋白酶 K(Sigma) 使其浓度为 500μg/ml 及十二烷基硫酸钠 使其浓度为 1％ (w/v)， 之后将其在 55℃振荡约 16 小时， 接着， 使用被 1M Tris-HCl、 pH 8.0 饱和了的苯酚， 进行苯酚· 氯仿提取处理。将水层回收， 向其中加入 NaCl 使浓度为 0.5N 之 后， 对其进行乙醇沉淀处理， 回收生成的沉淀 ( 基因组 DNA)。将回收的沉淀溶解到 TE 缓冲 液 (10mM Tris、 1mM EDTA、 pH 8.0)， 向其中加入 RNase A(Sigma) 使其浓度为 40μg/ml， 之 后在 37℃孵育 1 小时， 接着， 进行苯酚· 氯仿提取处理。将水层回收， 向其中加入 NaCl 使其 浓度为 0.5N 后， 对其进行乙醇沉淀处理， 将生成的沉淀 ( 基因组 DNA) 回收。将回收的沉淀 用 70％乙醇清洗， 得到 Capan-2 基因组 DNA。
     分别以双份的方式制备从 Clontech 购得的血液来源基因组 DNA 及上述 Capan-2 基因组 DNA 各自的 500ng/20μL TE 缓冲液溶液。
     将制备的各基因组 DNA 溶液 20μL、 限制性酶 X spI 10U 与对 X spI 最适的 10× 缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8.5、 100mM MgCl2、 10mM 二硫苏糖醇、 1000mM KCl)5μl 混合， 向其中加入灭菌超纯水使液量为 50μl， 将其在 37℃孵育 1 小时， 制备基因组溶液。
     作为用于获得序列编号 1 ～ 12 中任一项所示目标 DNA 区域的特定寡核苷酸， 合成 了与该 DNA 区域通过互补性结合的具有序列编号 13 ～ 24 所示碱基序列的 5’ 末端生物素 化寡核苷酸， 如下制备各自 0.1pmoL/μL 的 TE 缓冲液溶液。
     将具有为了取得序列编号 1 的目标区域的序列编号 13 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 1。
     将具有为了取得序列编号 2 的目标区域的序列编号 14 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 2。
     将具有为了取得序列编号 3 的目标区域的序列编号 15 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 3。
     将具有为了取得序列编号 4 的目标区域的序列编号 16 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 4。
     将具有为了取得序列编号 5 的目标区域的序列编号 17 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 5。
     将具有为了取得序列编号 6 的目标区域的序列编号 18 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 6。
     将具有为了取得序列编号 7 的目标区域的序列编号 19 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 7。
     将具有为了取得序列编号 8 的目标区域的序列编号 20 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 8。
     将具有为了取得序列编号 9 的目标区域的序列编号 21 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 9。
     将具有为了取得序列编号 10 的目标区域的序列编号 22 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 10。
     将具有为了取得序列编号 11 的目标区域的序列编号 23 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 11。
     将具有为了取得序列编号 12 的目标区域的序列编号 24 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 12。
     将上述特定寡核苷酸溶液 1 ～ 12 分别等量混合， 制备特定寡核苷酸溶液 13。
     作为对序列编号 1 ～ 12 中任一种所示目标区域内的碱基序列设计的反向寡核苷 酸， 合成序列编号 25 ～ 118 中的任一种所示的寡核苷酸， 制备各自 10pmoL/μL 的 TE 缓冲 液溶液。将以相同的 DNA 区域为目标的反向寡核苷酸溶液分别等量混合， 分别制备如下所 示的反向寡核苷酸混合液。
     将序列编号 25 ～ 42 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 1。
     将序列编号 43 ～ 60 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 2。
     将序列编号 61 ～ 66 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 3。
     将序列编号 67 ～ 70 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 4。将序列编号 71 ～ 76 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 5。 将序列编号 77 ～ 82 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 6。 将序列编号 83 ～ 88 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 7。 将序列编号 89 ～ 94 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 8。 将序列编号 95 ～ 100 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 9。 将序列编号 101 ～ 106 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 将序列编号 107 ～ 112 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 将序列编号 113 ～ 118 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液10。
     11。
     12。 将上述反向寡核苷酸混合液 1 ～ 12 分别等量混合， 制备反向寡核苷酸混合液 13。
     将特定寡核苷酸溶液与反向寡核苷酸混合液分别等量混合， 制备下述溶液 A、 溶液 B、 溶液 C。
     溶液 A ： 特定寡核苷酸溶液 1 与反向寡核苷酸混合液 1
     溶液 B ： 特定寡核苷酸溶液 2 与反向寡核苷酸混合液 2
     溶液 C ： 特定寡核苷酸溶液 13 与反向寡核苷酸混合液 13
     向 PCR 管中加入上述制备的基因组溶液 30μL、 上述溶液 A ～ C 中的任一种 30μL、 缓冲液 (330mM Tris- 乙酸盐 pH 7.9、 660mM KOAc、 100mMMgOAc2、 5mM 二硫苏糖醇 )15μL、 10mM MgCl2 溶液 60μL 以及 1mg/mL BSA 溶液 15μL， 使液量为 150μL， 进行混合。之后， 将 该 PCR 管在 95℃加热 10 分钟， 迅速冷却至 70℃， 并在该温度下保温 10 分钟。接着， 冷却至 50℃保温 10 分钟， 再在 37℃保温 10 分钟后返回至室温， 促进 5’ 末端生物素标记寡核苷酸 与 DNA 片段的结合体的形成。
     将所得的混合物全部转移至被抗生蛋白链菌素覆盖的孔中， 在室温放置约 30 分 钟， 将上述 5’ 末端生物素标记寡核苷酸与 DNA 片段的结合体固定化到孔。之后， 利用移液 管将溶液除去， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaClpH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     向各孔中添加甲基胞嘧啶抗体 [Aviva Systems Biology 社制、 0.5μg/mL 0.1％ BSA 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 溶液 ]100μL， 在室 温下放置 1 小时。 用移液管将孔内的溶液去除， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓 冲液 (1mMKH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     以 100μL 的比例， 向各孔中添加 Eu-N1 标记小鼠 IgG 抗体 [PerkinElmer 社制、 0.05g/mL 0.1％ BSA 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mMNa2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 溶 液 ]， 在室温下放置 1 小时后， 用移液管将孔内的溶液除去， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     以 150μL 的比例向各孔中添加促进溶液 (Perkin Elmer 社制 )， 在室温下搅拌 5 分钟， 在室温下放置 15 分钟后， 以激发 340nm/ 萤光 612nm 测定萤光。
     将结果示于图 1。与作为检测对象的目标区域为 1 种的溶液 A 及溶液 B 相比较，
     同时检测作为检测对象的多个目标区域的溶液 C 中， 甲基化频度或具有相关关系的指标值 高。另外， 与非癌细胞来源的人基因组 DNA 相比较， 从 Capan-2 癌细胞株提取的基因组 DNA 的与作为检测对象的目标区域的甲基化频度有相关关系的指标值高。
     本实验中， 对多个目标 DNA 区域的甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行同 时测定， 这与对单一的目标 DNA 区域的甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行测定相 比较， 可以有效地测定甲基化频度或与其有相关关系的指标值。 另外， 与非癌组织来源的基 因组 DNA 相比较， 作为胰腺癌细胞的 Capan-2 细胞株来源的基因组 DNA 中的甲基化频度或 与其有相关关系的指标值高， 因此， 确认了， 通过混合在本考察中使用的目标 DNA 区域来对 甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行测定， 可以作为癌的诊断指标。另外， 确认了， 即使混合了在本考察中利用的特定寡核苷酸、 反向寡核苷酸及特定寡核苷酸， 也可以在癌 诊断中利用。
     产业上利用的可能性
     通过本发明， 可以提供一种简便定量或检测生物来源标本中所含基因组 DNA 具有 的目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 的方法等。
     序列表文本
     背景技術 作为用于评价生物来源标本所含基因组 DNA 中目标 DNA 区域中的 DNA 的甲基化状 态的方法， 例如， 有测定在基因组 DNA 中目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 的含量的方法 ( 例如， 参照 Nucleic Acids Res.1994 Aug 11 ； 22(15) ： 2990-7、 和 Proc Natl Acad Sci USA.1997 Mar18 ； 94(6) ： 2284-9)。在该测定方法中， 首先需要从基因组 DNA 来源的 DNA 试 样中提取含有目标 DNA 区域的 DNA， 提取操作十分繁杂。
     另外， 作为测定被提取的 DNA 的目标区域中的被甲基化了的 DNA 含量的方法， 已知 有以下的方法， 例如 (1) 使用亚硫酸盐等修饰该 DNA 之后， 将其供于 DNA 聚合酶引起的 DNA 合成的链反应 (Polymerase ChainReaction( 聚合酶链反应 ) ； 以下有时记为 PCR)， 从而将 目标区域扩增的方法 ； (2) 使用甲基化敏感性限制酶将该 DNA 消化后， 将其供于 PCR， 从而使 目标区域扩增的方法。这些方法的任一种中， 用于甲基化的检测的 DNA 的修饰以及其后的 生成物的精制、 用于 PCR 的反应系的制备、 DNA 扩增的确认等中均需要耗时。
     另外， 作为测定被提取的 DNA 的目标区域中的被甲基化了的 DNA 含量的方法， 已知 有以下的方法， 例如 (1) 使用亚硫酸盐等修饰该 DNA 之后， 将其供于 DNA 聚合酶引起的 DNA 合成的链反应 (Polymerase ChainReaction( 聚合酶链反应 ) ； 以下有时记为 PCR)， 从而将 目标区域扩增的方法 ； (2) 使用甲基化敏感性限制酶将该 DNA 消化后， 将其供于 PCR， 从而使 目标区域扩增的方法。这些方法的任一种中， 用于甲基化的检测的 DNA 的修饰以及其后的 生成物的精制、 用于 PCR 的反应系的制备、 DNA 扩增的确认等中均需要耗时。
    发明内容 本发明的目的在于， 提供一种简便测定生物来源标本所含的基因组 DNA 中目标 DNA 区域 ( 以下， 有时也记为目标区域 ) 中的被甲基化了的 DNA 含量的方法。
     即， 本发明提供了以下所述的发明。
     [ 发明 1]
     一种定量或检测方法， 其是对生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的目标 DNA 区 域中的被甲基化了的 DNA 进行定量或检测的方法， 其特征在于， 具有以下工序 ：
     第一工序， 其中， 将生物来源标本中所含具有目标 DNA 区域的基因组 DNA 来源的双 链 DNA 分离成单链 DNA ；
     第二工序， 其中， 将上述单链 DNA、 甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸混合， 形成该单 链 DNA 与该甲基化 DNA 抗体与该特定寡核苷酸的复合体， 该特定寡核苷酸不抑制该单链 DNA 中的被甲基化了的目标 DNA 区域与该甲基化 DNA 抗体结合， 且含有与以下所示任一种碱基 序列相互补的序列的一部分碱基序列 ；
     第三工序， 其中， 基于上述复合体所含甲基化 DNA 抗体所具有的能利用于检测的 识别功能而进行检测或定量， 从而对生物来源标本中所含目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 进行检测或定量 ；
     (1) 序列编号 1 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (2) 序列编号 2 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (3) 序列编号 3 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     即， 本发明提供了以下所述的发明。
     [ 发明 1]
     一种定量或检测方法， 其是对生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的目标 DNA 区 域中的被甲基化了的 DNA 进行定量或检测的方法， 其特征在于， 具有以下工序 ：
     第一工序， 其中， 将生物来源标本中所含具有目标 DNA 区域的基因组 DNA 来源的双 链 DNA 分离成单链 DNA ；
     第二工序， 其中， 将上述单链 DNA、 甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸混合， 形成该单 链 DNA 与该甲基化 DNA 抗体与该特定寡核苷酸的复合体， 该特定寡核苷酸不抑制该单链 DNA 中的被甲基化了的目标 DNA 区域与该甲基化 DNA 抗体结合， 且含有与以下所示任一种碱基 序列相互补的序列的一部分碱基序列 ；
     第三工序， 其中， 基于上述复合体所含甲基化 DNA 抗体所具有的能利用于检测的 识别功能而进行检测或定量， 从而对生物来源标本中所含目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 进行检测或定量 ；
     (1) 序列编号 1 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (2) 序列编号 2 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (3) 序列编号 3 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
     (4) 序列编号 4 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (5) 序列编号 5 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (6) 序列编号 6 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (7) 序列编号 7 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (8) 序列编号 8 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (9) 序列编号 9 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (10) 序列编号 10 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (11) 序列编号 11 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (12) 序列编号 12 所示碱基序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、 (13) 序列编号 1 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (14) 序列编号 2 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (15) 序列编号 3 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (16) 序列编号 4 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (17) 序列编号 5 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (18) 序列编号 6 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (19) 序列编号 7 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (20) 序列编号 8 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 (21) 序列编号 9 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱基序列、
    基序列、
    基序列、
    基序列、
    基序列、
    基序列、
    基序列、
    基序列、
    基序列、 (22) 序列编号 10 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、
     (23) 序列编号 11 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、 以及
     (24) 序列编号 12 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列。
     [ 发明 2]
     根据发明 1 所述的方法， 其中， 特定寡核苷酸含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (5) 序列编号 17 所示的碱基序列、 (6) 序列编号 18 所示的碱基序列、 (7) 序列编号 19 所示的碱基序列、 (8) 序列编号 20 所示的碱基序列、 (9) 序列编号 21 所示的碱基序列、 (10) 序列编号 22 所示的碱基序列、 (11) 序列编号 23 所示的碱基序列、 (12) 序列编号 24 所示的碱基序列、 (13) 序列编号 13 所示碱基序列的互补序列、 (14) 序列编号 14 所示碱基序列的互补序列、 (15) 序列编号 15 所示碱基序列的互补序列、 (16) 序列编号 16 所示碱基序列的互补序列、 (17) 序列编号 17 所示碱基序列的互补序列、 (18) 序列编号 18 所示碱基序列的互补序列、 (19) 序列编号 19 所示碱基序列的互补序列、 (20) 序列编号 20 所示碱基序列的互补序列、 (21) 序列编号 21 所示碱基序列的互补序列、 (22) 序列编号 22 所示碱基序列的互补序列、 (23) 序列编号 23 所示碱基序列的互补序列、 以及 (24) 序列编号 24 所示碱基序列的互补序列。 [ 发明 3] 根据发明 1 或 2 所述的方法， 其中， 在第二工序中形成复合体时， 添加反向寡核苷酸。 [ 发明 4]
     根据发明 1 ～ 3 中任一项所述的方法， 其中， 第二工序中的复合体的形成在含有二 价阳离子的反应系中进行。
     [ 发明 5]
     根据发明 1 ～ 4 中任一项所述的方法， 其中， 在第三工序之前， 使由第二工序形成 的复合体中的甲基化 DNA 抗体结合到支撑体。
     [ 发明 6]
     根据发明 1 ～ 5 中任一项所述的方法， 其中， 在第一工序后至第三工序， 还具有利 用能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶将未甲基化的单链 DNA 消化的工序。
     [ 发明 7]
     根据发明 1 ～ 6 中任一项所述的方法， 其中， 在第一工序后至第三工序， 还具有在 含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中， 利用该甲基化敏感性限制酶将未甲基化的单链 DNA 消化的工序， 所述特定掩蔽用寡核苷酸中作为其一部分含有甲基化敏感性限制酶的识别序 列。
     [ 发明 8]
     根据发明 6 所述的方法， 其中， 能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶为 HhaI。
     [ 发明 9]
     根据发明 1 ～ 8 中任一项所述的方法， 其中， 甲基化 DNA 抗体为甲基胞嘧啶抗体。
     [ 发明 10]
     根据发明 1 ～ 9 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本为哺乳动物的血液、 血 清、 血浆、 体液、 细胞溶解液或组织溶解液。
     [ 发明 11]
     根据发明 1 ～ 10 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为事先被限制酶消化处理而成的 DNA 试样， 所述限制酶不以该基因组 DNA 具 有的目标 DNA 区域为识别剪切位点。
     [ 发明 12]
     根据发明 1 ～ 11 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为被甲基化敏感性限制酶消化处理而得的 DNA 试样。
     [ 发明 13]
     根据发明 1 ～ 12 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为在含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中被甲基化敏感性限制酶消化处理 而得的 DNA 试样。
     [ 发明 14]
     根据发明 7、 12 或 13 中任一项所述的方法， 其中， 甲基化敏感性限制酶为 HpaII 或 HhaI。
     [ 发明 15]
     根据发明 1 ～ 14 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本所含基因组 DNA 来源 的 DNA 试样为事先被精制而成的 DNA 试样。
     [ 发明 16]
     根据发明 1 ～ 15 中任一项所述的方法， 其中， 基因组 DNA 具有的目标 DNA 区域有 甲基化敏感性限制酶的识别剪切位点。
     [ 发明 17]
     一种 DNA， 其含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (5) 序列编号 17 所示的碱基序列、
     (6) 序列编号 18 所示的碱基序列、
     (7) 序列编号 19 所示的碱基序列、
     (8) 序列编号 20 所示的碱基序列、
     (9) 序列编号 21 所示的碱基序列、
     (10) 序列编号 22 所示的碱基序列、
     (11) 序列编号 23 所示的碱基序列、
     (12) 序列编号 24 所示的碱基序列、(13) 序列编号 13 所示碱基序列的互补序列、 (14) 序列编号 14 所示碱基序列的互补序列、 (15) 序列编号 15 所示碱基序列的互补序列、 (16) 序列编号 16 所示碱基序列的互补序列、 (17) 序列编号 17 所示碱基序列的互补序列、 (18) 序列编号 18 所示碱基序列的互补序列、 (19) 序列编号 19 所示碱基序列的互补序列、 (20) 序列编号 20 所示碱基序列的互补序列、 (21) 序列编号 21 所示碱基序列的互补序列、 (22) 序列编号 22 所示碱基序列的互补序列、 (23) 序列编号 23 所示碱基序列的互补序列、 以及 (24) 序列编号 24 所示碱基序列的互补序列。附图说明
    图 1 是显示实施例 1 结果的图。未被覆盖的方框显示使用非癌组织的基因组 DNA 测定与甲基化频度有相关关系的指标值的结果， 被覆盖的方框显示使用从 Capan-2( 癌细 胞株 ) 提取的基因组 DNA 测定与甲基化频度有相关关系的指标值的结果。图中， 从左边起 分别是， A 表示利用萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶液 A 检测的结合到目标区域 的甲基胞嘧啶抗体量的值， B 表示萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶液 B 检测的结 合到目标区域的甲基胞嘧啶抗体量的值， C 表示萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶 液 C 检测的结合到目标区域的甲基胞嘧啶抗体量的值。 具体实施方式作为 “生物来源标本” ， 例如可以举出细胞溶解液、 组织溶解液 ( 这里的组织是指 包括血液、 淋巴结等广义意思 )， 或就哺乳动物而言， 可以举出血液、 血浆、 血清、 淋巴液等 体液， 体分泌物 ( 尿、 乳汁等 ) 等生物体试样及从这些生物体试样提取得到的基因组 DNA。 另外， 作为其他的生物来源标本， 也可例如微生物、 病毒等来源的试样， 此时， 也可例如微生 物、 病毒的基因组 DNA。 人来源的血液为标本时， 可以期待在健康诊断、 简便的临床检查等中 利用本发明。
     另外， 作为这些生物来源标本所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样， 可列举如用甲基化 敏感性限制酶等处理之后的试样、 用在基因组 DNA 具有的目标 DNA 区域中没有其识别剪切 位点的限制性酶事先消化处理而得的试样、 在含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中用甲基 化敏感性限制酶消化处理而得的试样、 事先精制而得的 DNA 试样等。
     为了从哺乳动物来源的标本得到基因组 DNA， 例如使用市售的 DNA 提取用试剂盒 等提取 DNA 即可。在使用血液作为标本的情况下， 按照常用的方法从血液制备血浆或血清， 将所制备的血浆或血清作为标本， 对其中所含的游离 DNA( 包括胃癌细胞等癌细胞来源的 DNA) 进行分析时， 可以避开血细胞来源的 DNA 对胃癌细胞等癌细胞来源的 DNA 进行解析， 可 以使检测胃癌细胞等癌细胞、 含有其的组织等的灵敏度提高。
     通常， 构成基因 ( 基因组 DNA) 的碱基有 4 种。在这些碱基当中， 已知所谓仅是胞
     嘧啶被甲基化的现象， 这样的 DNA 的甲基化修饰限于由 5’ -CG-3’ 表示的碱基序列 (C 表示 胞嘧啶， G 表示鸟嘌呤。以下， 也会将该碱基序列记为 “CpG” ) 中的胞嘧啶。就胞嘧啶而言， 被甲基化的部位是其 5 位。在细胞分裂之前进行 DNA 复制时， 复制后马上成为仅是模板链 的 “CpG” 中的胞嘧啶被甲基化的状态， 在甲基转移酶的作用下立即将新生链的 “CpG” 中的 胞嘧啶也甲基化。因此， DNA 的甲基化后的状态在 DNA 复制后也被直接传给新的 2 组 DNA。 本发明中的 “甲基化后的 DNA” 是指通过这样的甲基化修饰而生成的 DNA。
     已知在各种病患 ( 例如癌 ) 中， 引起 DNA 的甲基化异常， 认为， 通过检测该 DNA 甲基 化异常， 有可能测定各种病患的程度。例如对病患来源的标本中的被 100％甲基化的区域， 实施本发明， 则定量或检测的甲基化 DNA 量增多， 例如病患来源的标本中有未 100％甲基化 的 DNA 区域， 如对该区域实施本发明， 则定量或检测的甲基化 DNA 的量要成为接近几乎为零 的值。另外， 例如， 在正常者的标本中的甲基化比例低， 且在疾患患者的标本中有甲基化比 例高的 DNA 区域， 如对该 DNA 区域实施本发明， 则对于正常者的情况， 定量或检测的甲基化 DNA 的量显示接近零的值， 对于来自疾患患者的情况， 其显示与正常者的值相比有统计学意 义的高值， 因此基于该值的差异， 可以判定 “疾患的程度” 。在此 “疾患的程度” 与一般在该 领域中使用的意思相同， 具体而言， 例如对于标本为细胞时， 是指该细胞的恶性程度， 另外， 例如标本为组织时， 是指该组织中疾患细胞的存在量等。另外， 标本为血浆·血清时， 是指 该个体患有病患的概率。 因此， 通过本发明的实施来考察标本的甲基化异常， 可以诊断各种 疾患。 “目标 DNA 区域” 是要调查该区域中所含的胞嘧啶有无甲基化的 DNA 区域。例如可 以举出含有在赖氨酰氧化酶、 HRAS 样阻抑因子、 bA305P22.2.1、 γ- 细丝蛋白、 HAND1、 RIKEN 2210016F16 的同系物、 FLJ32130、 PPARG 血管生成素相关蛋白、 凝血调节蛋白、 p53- 应答基 因 2、 微纤维蛋白 2、 神经丝蛋白 3、 解聚素及金属蛋白酶结构域 23、 G- 蛋白偶联受体 7、 G- 蛋 白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体、 溶质载体蛋白家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上 腺素成员 2 等有用蛋白质基因的启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基 序列中存在的 CpG 所示碱基序列中的一个以上的胞嘧啶的 DNA 的区域等。除了对这些目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 分别定量或检测之外， 例如， 在一个检测系中， 使用更多的这 些目标 DNA 区域， 可以相应地使其定量精度及检测灵敏度进一步提高。
     具体而言， 例如在有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因的情况下， 作为含有在其 启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基 序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出用序列编号 119 表 示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF270645 记载的碱基序列的碱基编号 16001 ～ 18661 所示的碱基序列 )。就序列编号 119 所示的碱基序列而言， 对人来源的赖氨酰氧化酶 蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2031 ～ 2033 表示， 上述外 显子 1 的碱基序列用碱基编号 1957 ～ 2661 表示， 在序列编号 119 所示的碱基序列中存在 的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 119 所示的碱基序列中在 CpG 密集 存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高 甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的 胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 119 表示的碱基序列中用碱基编号 1539、 1560、 1574、 1600、
     1623、 1635、 1644、 1654、 1661、 1682、 1686、 1696、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795 等 表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 HRAS 样阻抑因子基因的情况下， 作为 含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 HRAS 样阻抑因子基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出用序 列编号 120 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC068162 记载的碱基序列的碱基编 号 172001 ～ 173953 表示的碱基序列 )。就序列编号 120 表示的碱基序列而言， 人来源的 HRAS 样阻抑因子基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1743 ～ 1953 表示。在序列编号 120 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 120 表 示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌 细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胃 癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 120 表示的碱基序列中用碱基编 号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 1405、 1409、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1479、 1483、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520 等所示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 bA305P22.2.1 基因的情况下， 作为含 有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示 的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 bA305P22.2.1 基因的外显子 1 和 位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 121 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AL121673 记载的碱基序列的碱基编号 13001 ～ 13889 表示的碱基序列 )。 就序列编号 121 表示的碱基序列而言， 对人来源的 bA305P22.2.1 蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 849 ～ 851 表示， 上述外显 子 1 的碱基序列用碱基编号 663 ～ 889 表示。在序列编号 121 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 121 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在 的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基 化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧 啶， 例如可以举出序列编号 121 表示的碱基序列中用碱基编号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 γ- 细丝蛋白基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 γ- 细丝蛋白基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 122 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC074373 记载的碱基序列的碱基编号 63528 ～ 64390 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 122 表示的碱基序列而言， 对人来源的 γ- 细丝蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 572 ～ 574 表示， 上述外显子 1 的碱基序列用碱基编号 463 ～ 863 表示。 在序列编号 122 表示的碱基序列中存 在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 122 表示的碱基序列中在 CpG 密 集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即
     高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的 胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 122 表示的碱基序列中用碱基编号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363、 370、 379、 382、 384、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474、 486、 490、 503、 505 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 HAND1 基因的情况下， 作为含有在其启 动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序 列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 HAND1 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的 启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 123 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC026688 记载的碱基序列的碱基编号 24303 ～ 26500 表示的碱 基序列的互补序列 )。 就序列编号 123 表示的碱基序列而言， 对人来源的 HAND1 蛋白质的氨 基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 1656 ～ 1658 表示， 上述外显子 1 的碱 基序列用碱基编号 1400 ～ 2198 表示。在序列编号 123 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表 示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 123 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域 中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如 可以举出序列编号 123 表示的碱基序列中用碱基编号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272、 1292、 1305、 1307、 1316、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434 等表示的胞嘧 啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 RIKEN 2210016F16 基因的同系物 的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列 中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 RIKEN 2210016F16 基因的同系物的外显子 1 和位于其 5’上游的启动子区域的基因组 DNA 的 碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 124 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AL354733 记载的碱基序列的碱基编号 157056 ～ 159000 表示的碱基序列的互补碱基序 列 )。就序列编号 124 表示的碱基序列而言， 人来源的 RIKEN 2210016F16 基因的同系物蛋 白质的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1392 ～ 1945 表示。在序列编号 124 表示的碱基 序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 124 表示的碱基序列中 在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频 度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基 化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 124 表示的碱基序列中用碱基编号 1172、 1175、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1332、 1334、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 FLJ32130 基因的情况下， 作为含有在 其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱 基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 FLJ32130 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 125 表示的碱 基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC002310 记载的碱基序列的碱基编号 1 ～ 2379 表示的 碱基序列的互补碱基序列 )。就序列编号 125 表示的碱基序列而言， 对人来源的 FLJ32130 蛋白质的氨基酸末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2136 ～ 2138 表示， 认为是上述外显子 1 的碱基序列用碱基编号 2136 ～ 2379 表示。在序列编号 125 表示的碱基 序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 125 表示的碱基序列中 在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频 度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基 化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 125 表示的碱基序列中用碱基编号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 1911、 1915、 1925、 1940、 1955、 1968 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 PPARG 血管生成素相关蛋白基因的情 况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在 的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 PPARG 血管生成素 相关蛋白基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体 而言， 可以举出序列编号 126 表示的碱基序列。就序列编号 126 表示的碱基序列而言， 对人 来源的 PPARG 血管生成素相关蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基 编号 717 ～ 719 表示， 上述外显子 1 的 5’ 侧部分的碱基序列用碱基编号 1957 ～ 2661 表 示。在序列编号 126 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是 序列编号 126 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表 示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更 具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 126 表示的碱 基序列中用碱基编号 35、 43、 51、 54、 75、 85、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为凝血调节蛋白基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的凝血调节蛋白基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 127 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF495471 记载的碱基序列的碱基编号 1 ～ 6096 表示的碱基序列 )。 就序列编号 127 表示的碱基序列而言， 对人来源的凝血调节蛋白质的氨 基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2590 ～ 2592 表示， 上述外显子 1 的碱 基序列用碱基编号 2048 ～ 6096 表示。在序列编号 127 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表 示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 127 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域 中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如 可以举出序列编号 127 表示的碱基序列中用碱基编号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595、 1598、 1601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1724、 1726、 1756 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 p53- 应答基因 2 基因的情况下， 作为含 有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 p53- 应答基因 2 基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列 编号 128 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009471 记载的碱基序列的碱基编号 113501 ～ 116000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 128 表示的碱基序列而言， 人来源的 p53- 应答基因 2 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1558 ～ 1808 表示。 在序列 编号 128 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细 胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 128 表示的碱基序列中 用碱基编号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383 等 表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为微纤维蛋白 2 基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的微纤维蛋白 2 基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 129 表 示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC113387 记载的碱基序列的碱基编号 118801 ～ 121000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 129 表示的碱基序列而言， 人来源的微 纤维蛋白 2 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1091 ～ 1345 表示。在序列编号 129 表 示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞 中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌 细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 129 表示的碱基序列中用碱基编号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843 等表示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为神经丝蛋白 3 基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的神经丝蛋白 3 基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 130 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF106564 记载的碱基序列的碱基编号 28001 ～ 30000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 130 表示的碱基序列而言， 人来源的神经 丝蛋白 3 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 614 ～ 1694 表示。在序列编号 130 表示 的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中 甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌 细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 130 表示的碱基序列中用碱基编号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为解聚素及金属蛋白酶结构域 23 基因的 情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在 的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的解聚素及金属蛋 白酶结构域 23 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 131 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009225 记载的碱基序列的碱基编号 21001 ～ 23300 表示的碱基序列 )。就序列编号 131 表示的 碱基序列而言， 人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域 23 基因的外显子 1 的碱基序列， 用 碱基编号 1194 ～ 1630 表示。在序列编号 131 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的 碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例
     如可以举出序列编号 131 表示的碱基序列中用碱基编号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 1043、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106、 1112、 1120、 1124、 1126 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 G 蛋白偶联受体 7 基因的情况下， 作为 含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 G 蛋白偶联受体 7 基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列 编号 132 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009800 记载的碱基序列的碱基编号 75001 ～ 78000 表示的碱基序列 )。就序列编号 132 表示的碱基序列而言， 人来源的 G 蛋白 偶联受体 7 基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 1666 ～ 2652 表示。在序列编号 132 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细 胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺 癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 132 表示的碱基序列中用碱基编 号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620 等表示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 G- 蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样 肽受体基因的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的 碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 G- 蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区 域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 133 表示的碱基序列 ( 相当于 基因库检索号 No.AC008971 记载的碱基序列的碱基编号 57001 ～ 60000 表示的碱基序列 的互补序列 )。就序列编号 133 表示的碱基序列而言， 人来源的 G- 蛋白偶联生长抑素及血 管紧张素样肽受体基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 776 ～ 2632 表示。在序列编 号 133 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞 等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 133 表示的碱基序列中 用碱基编号 470、 472、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 540、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去 甲肾上腺素成员 2 基因的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码 区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人 来源的溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员 2 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 134 表示的碱 基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC026802 记载的碱基序列的碱基编号 78801 ～ 81000 表 示的碱基序列的互补序列 )。 就序列编号 134 表示的碱基序列而言， 人来源的溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员 2 基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 1479 ～ 1804 表示。在序列编号 134 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 134
     表示的碱基序列中用碱基编号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184 等表示的胞嘧啶。
     另外， 作为基因组 DNA 中的 “目标 DNA 区域” ， 具体可例举如下述序列编号 1 ～ 12 所示的碱基序列及它们的互补序列， 或者与它们的碱基序列具有 80％以上、 90％以上、 95％ 以上或 98％以上的序列同一性的碱基序列等。
     序列编号 1 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21965410 ～ 21964273 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 2 相当于基因库检索号 No.NT_024524.13 记载的碱基序列的碱基编号 29857545 ～ 29858420 所示的碱基序列。
     序列编号 3 相当于基因库检索号 No.NT_010718.15 记载的碱基序列的碱基编号 7188979 ～ 7189574 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 4 相当于基因库检索号 No.NW_926584.1 记载的碱基序列的碱基编号 7534656 ～ 7535486 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 5 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21984168 ～ 21984790 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 6 相当于基因库检索号 No.NW_924062.1 记载的碱基序列的碱基编号 21818162 ～ 21818836 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 7 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21998877 ～ 21999061 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 8 相当于基因库检索号 No.NT_023935.17 记载的碱基序列的碱基编号 19277002 ～ 19277451 所示的碱基序列。
     序列编号 9 相当于基因库检索号 No.NW_924484.1 记载的碱基序列的碱基编号 19064265 ～ 19065579 所示的碱基序列。
     序列编号 10 相当于基因库检索号 No.NT_022517.17 记载的碱基序列的碱基编号 50318280 ～ 50318573 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 11 相当于基因库检索号 No.NT_022517.17 记载的碱基序列的碱基编号 61176814 ～ 61177405 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 12 相当于基因库检索号 No.NT_034772.5 记载的碱基序列的碱基编号 14488398 ～ 14489126 所示的碱基序列。
     作为 “目标 DNA 区域” ( 以下， 也记为目标区域 )， 还可例举如含有在 MLH1、 RUNX3、 CDH1、 TIMP3、 CSPG、 RARβ、 14-3-3σ、 CALCA、 HIC1、 ESR1、 PTEN、 SOCS1、 BLT1、 ESR2、 MTMG、 TWIST、 INK4、 CDKN2、 GSTP、 DCR2、 TP73、 PGR、 HIC2、 MTHFR、 TFF1、 MLLT7、 SLC5A8、 THBS1、 SOCS2、 ACTB、 CDH13、 FGF18、 GSTM3、 HSD17B4、 HSPA2、 PPP1R13B、 PTGS2、 SYK、 TERT、 TITF1、 BRACA1、 AATF、 ABCB1、 ABCC1、 ABI1、 ABL1、 AF1Q、 AF3P21、 AF4、 AF9、 AFF3、 AKAP12、 AKAP9、 ALEX3、 ALK、 ALOX15、 APAF1、 APC、 ARHA、 ARHGAP26、 ARHGEF12、 ARNT、 ATBF1、 ATF1、 ATM、 AXIN2、 BCAS3、 BCAS4、 BCL1、 BCL10、 BCL11A、 BCL11B、 BCL2、 BCL5、 BCL7A、 BCR、 BIRC3、 BMPR1A、 BRCA2、 BRD4、 BRIP1、 BTG1、 BUB1B、 CAGE-1、 CARS、 CASC5、 CCDC6、 CCND2、 CCND3、 CDH11、 CDKN1B、 CDKN2A、 CDX2、 CEP110、 CKN1、 CLP1、 CLTC、 CLTCL1、 CNC、 COL1A1、 COX6C、 CREBBP、 CXXC6、 DAB2IP、 DDIT3、 DDX43、 DIRC1、 DIRC2、 DKK1、 E2F3、 EEN、 EGFR、 ELL、 EPS15、 ERBB2、 ERC1、 ERCC1、 ERCC4、 ERG、ETV1、 ETV6、 EVI1、 EWSR1、 EXT1、 EXT2、 FANCA、 FANCD2、 FANCF、 FAS、 FBP17、 FCRL4、 FEV、 FGFR1、 FHIT、 FLI1、 FOXO3A、 FUS、 FVT1、 GAS7、 GLI1、 GNAS、 GOLGA5、 GOPC、 GRB2、 HCMOGT-1、 HIST1H4I、 HLF、 HMGA2、 HOXA13、 HOXC11、 HOXC13、 HOXD13、 HSPBAP1、 HSPCB、 HSPD1、 HSPH1、 IKZF2、 INTS6、 IRF4、 JAG1、 JAG2、 JAK2、 JARID1A、 JAZF1、 JMJD2C、 JUN、 KIT、 KITLG、 KLF5、 KLF6、 LASP1、 LDB1、 LHFP、 LMO1、 LMO2、 LPHN2、 LPP、 LYL1、 MADH4、 MAF、 MAFB、 MDM2、 MDS2、 MET、 MKL1、 MLF1、 MLH1、 MLL、 MLLT10、 MMP2、 MN1、 MRE11B、 MSF、 MSH2、 MSH6、 MSI2、 MUC1、 MUTYH、 MXI1、 MYC、 MYH9、 MYST3、 NF1、 NFKB1、 NIN、 NKX2-5、 NONO、 NOTCH1、 N-RAS、 NTRK3、 NUMA1、 NUP214、 NUP98、 OLIG2、 P53、 PALB2、 PAX2、 PAX5、 PAX7、 PAX9、 PBX1、 PCM1、 PCSK7、 PDGFB、 PDGFRA、 PDGFRB、 PHOX2B、 PICALM、 PLAG1、 PLCB1、 PLK、 PML、 PMS1、 POLH、 POU5F1P1、 POU6F2、 PPP1R13L、 PRDM16、 PRRX1、 PSIP1、 PTCH、 RABEP1、 RAD51L1、 RAD53、 RANBP17、 RAP1GDS1、 RAP2B、 RARA、 RASSF1、 RB1、 RBL2、 RBM15、 RBM5、 RCHY1、 RECQL、 RECQL5、 RET、 RUNX、 RUNX1T1、 SBDS、 SDHC、 SDHD、 SET、 SHH、 SIL、 SIX1、 SNAI2、 SPI1、 SPINK7、 STARD3、 STAT3、 STK11、 STK4、 SUFU、 SYK、 SYNPO2、 TBX2、 TCF3、 THBS2、 THRAP3、 TMPRSS2、 TNF、 TOP1、 TPM4、 TPR、 TRIM24、 TRIM33、 TRIP11、 TSC1、 TSC2、 TSHR、 TTL、 VAV1、 VHL、 WFDC1、 WT1、 WWOX、 XPC、 ZBTB16、 ZNF146、 ZNF217 等基因的启动子区域、 非翻译区 域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 所示的碱基序列中的胞嘧啶一个 以上的 DNA 的区域。除了对这些目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 分别定量或检测之外， 例如， 在一个检测系中， 使用更多的这些目标 DNA 区域， 可以相应地使其定量精度及检测灵 敏度进一步提高。
     “目标 DNA 区域” 也可以是在基因组中散在的重复序列。 特别是， 明确了因疾病被甲 基化的重复序列的甲基化程度可以作为疾患的替代标记物利用。例如， 已知在癌中 SINE 和 LINE 的甲基化， 具体而言， 已知 AluJb、 AluJo、 AluSc、 A1uSg、 AluSg/x、 AluSp、 AluSq、 AluSq/ x、 AluSx、 AluY、 FRAM、 FLAM_A、 MIR、 MIRb、 MIR3、 L1Med、 L1M4、 L1M5、 L1MA3、 L1MA7、 L1MA9、 L1MC、 L1MC2、 L1MC4、 L1MC4a、 L1MC5、 L1MDa、 L1MD1、 L1MD2、 L1MEe、 L1ME3A、 L1PA15、 L1PREC2、 L2、 L3、 HAL1 等亚家族。
     基因组中的重复序列一般被分为简单重复序列 ( 被称为串联重复序列或衔接重 复 ) 和散在重复序列。
     简单重复序列的特征是相同序列在相同方向相邻存在， 大致被分为例如， (1)CCA 等较短序列重复的重复序列、 (2) 来自转录因子的重复序列、 (3) 着丝粒、 端粒、 动粒、 核糖 体基团基因之类的一系列的重复序列、 (4) 从 RNA、 蛋白质逆转录的经非活性处理了的假基 因、 (5) 通过基因复制扩增了的基因序列这 5 种。
     首先， 作为由较短碱基序列的重复， 已知 (A)n、 (T)n、 (GA)n、 (CA)n、 (TAA)n、 (GGA) n、 (CAGC)n、 (CATA)n、 (GAAA)n、 (TATG)n、 (TTTG)n、 (TTTA)n、 (TTTC)n、 (TAAA)n、 (TTCA) n、 (TATAA)n、 (TCTCC)n、 (TTTCC)n、 (TTTAA)n、 (TTTTC)n、 (TTTTA)n、 (TTTTG)n、 (CAAAA)n、 (CACCC)n、 (TATATG)n、 (CATATA)n、 (TCTCTG)n、 (AGGGGG)n、 (CCCCCA)n、 (TGGGGG)n(n 表示重 复数 ) 等序列。 接着， 作为来自转录因子的序列， 对于 hAT 组有 MER1-Charlie、 Zaphod， 对于 Tc-1 组有 MER2-Tigger、 Tc-1、 Mariner。作为来自其他基因组上的转录因子的重复序列， 已 知有 Tigger1、 Tigger2a、 Tigger5、 Charlie4a、 Charlie7 等。由于含有这些短碱基序列的 重复序列、 来自转录因子的重复序列一般是短且简单的碱基序列， 因此难以设定本发明方 法的特定寡核苷酸， 如果可以设定能够实施的特定寡核苷酸， 则未必要作为本发明方法的对象排除。另外， 卫星 DNA、 小卫星、 微卫星等是被分类为简单重复序列的重复序列。
     另外， 作为在基因中多拷贝存在的序列， 如果可以对于作为着丝粒中存在的序列 的 ALR6、 作为 snRNA 的 U2、 U6、 之外的如 tRNA、 rRNA 之类的通常已知的在基因组中存在多拷 贝的基因、 除此之外的通过基因重复而在基因组中存在多拷贝的基因等， 设计本发明方法 的特定寡核苷酸， 就可以使检测灵敏度比在一个基因组中检测一个基因有所提高。
     另外， 已知逆转录病毒、 在末端具有 LTR(Long terminal repeat， 长末端重复 ) 的 逆转录转座子、 MaLRs(Mammalian apparentLTR-Retrotransposons) 之类被认为是病毒来 源的内源序列、 来自逆转录病毒的 LTR 也在一个基因组中存在多个。
     例如， 作为逆转录转病毒来源的 LTR， 具体已知有 LTR1、 LTR1B、 LTR5、 LTR7、 LTR8、 LTR16A1、 LTR16A1、 LTR16C、 LTR26、 LTR26E、 MER48、 MLT2CB 等亚家族。另外， 逆转录转座子 来源的 LTR 被分为 ERV、 ERVK、 ERVL 各类， 具体而言， 可例举如 LTR8A、 LTR28、 MER21B、 MER83、 MER31B、 MER49、 MER66B、 HERVH、 ERVL、 LTR16A1、 LTR33A、 LTR50、 LTR52、 MLT2A1、 MLT2E、 MER11C、 MER11C 等亚家族。MaLRs 是指与典型的逆转录转座子同样在其序列的两端含有 LTR、 但在 LTR 中插入的内部序列并不是来源于逆转录病毒的序列的 DNA 因子。例如可例举 如 MLT1A1、 MLT1A2、 MLT1B、 MLT1C、 MLT1D、 MLT1F、 MLT1G、 MLT1H、 MLT1J、 MLT1K、 MLT11、 MLT2CB、 MSTA、 MSTA-int、 MSTB、 THE1A、 THE1B、 THE1B-internal、 THE1 等亚家族。
     散在重复序列的特征是， 不相邻而是散在， 被认为是逆转录转座子来源的。另外， 散在重复序列根据其长度， 被分为 SINE(Short InterspersedRepetitive Element ： 短链散 在重复序列 ) 和 LINE(Long InterspersedElements ： 长链散在重复序列 )。SINE 中大部分 是属于 Alu 家族的序列。Alu 家族的共同特征是具有 7SL RNA 的 3’ 侧的序列或 5’ 侧的序 列， 并且具有在称为 “Left-monomer” 和 “Right-monomer” 的区域插入的富 AT 区域。作为 Alu 家族的亚家族， 可例举如 Alu、 AluJb、 AluJo、 AluSc、 AluSg、 AluSp、 AluSq、 AluSx、 AluY， 以及 FAM(Fossil Alu Monomer) 和具有 FAM 的序列的 FLAM(Free Left Alu Monomer) 和 FRAM(Free Right AluMonomer)。作为 Alu 家族以外的 SINE， 已知有 MIR 和 Ther/MIR3， 作 为亚家族， 分别已知 MIR、 MIR3。另外， 作为包含人以外生物种的 Alu 家族的亚家族， 已知有 B1、 B2、 B4、 PB1、 PB1D 等。作为 LINE， 报道了 LINE1 至 Line23 的亚家族， 已知 LINE-1、 LINE2、 LINE3 在广泛的基因组中存在。另外， 对于 LINE-1， 已知有例如 L1M1、 L1M2、 L1M3、 L1M3d、 L1M4、 L1M4c、 L1MA2、 L1MA7、 L1MA8、 L1MA9、 L1MB1、 L1MB1、 L1MB3、 L1MB4、 L1MB5、 L1MB6、 L1MB7、 L1MCa、 L1MCb、 L1MC2、 L1MC3、 L1MC4、 L1MC4a、 L1MC5、 L1MDa、 L1ME、 L1MEc、 L1MEd、 L1MEg、 L1ME1、 L1ME2、 L1ME3、 L1ME3A、 L1ME3B、 L1ME4a、 L1PB3、 L1P4、 L1PA2、 L1PA3、 L1PA4、 L1PA5、 L1PA6、 L1PA7、 L1PA10、 L1PA12、 L1PA13、 L1PA14、 L1PA16、 L1PB1、 L1PB3、 L1PB4、 L1PREC2、 HAL1 等亚家族， 作为 LINE-2， 已知有 L2、 L2c 等亚家族。
     这样的在基因组中散在的重复序列中， 如果为因疾病被甲基化的， 则可以通过本 发明方法作为疾患的替代标记物， 作为高灵敏度的检测系而利用。
     “定量或检测 DNA” 中的定量是指， 从定量的甲基化 DNA 抗体， 计算标本中的目标 DNA 区域中的甲基化频度或与其具有相关关系的指标值， 表示例如标本为 1mL 血清时， 血清 1mL 中所含目标区域的 DNA 的甲基化频度或与其有相关关系的指标值。
     “定量或检测 DNA” 中的检测是指， 通过是否检测到甲基化 DNA 抗体， 来判断目标 DNA 区域中是否存在被甲基化了的 DNA， 当检测到甲基化 DNA 抗体时， 表示在标本中， 在目标DNA 区域存在被甲基化了的 DNA， 当没有检测到甲基化 DNA 抗体或特定寡核苷酸时， 表示在 标本中， 在目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 的存在量不到检测限。
     第一工序中， 将生物来源标本中所含的具有目标 DNA 区域的基因组 DNA 来源的双 链 DNA 暂时分离成单链状态。具体而言， 例如， 通过向双链 DNA 中添加退火缓冲液而得到混 合物。接着， 将所得混合物在 95℃煮沸约 30 秒， 之后在冰冷水上骤冷数分钟。例如， 血液等 所含游离 DNA 有可能是单链 DNA。因此， 当生物来源标本中所含基因组 DNA 为单链 DNA 时， 没有必要进行该操作。
     第二工序中的 “甲基化 DNA 抗体” 是指将 DNA 中的被甲基化了的碱基作为抗原而 结合的抗体。更优选的是， 为具有识别单链 DNA 中的 5 位被甲基化了的胞嘧啶并结合的性 质的抗体即可， 更具体而言， 也可以是甲基胞嘧啶抗体。另外， 即使是市售的甲基化 DNA 抗 体， 只要是特异性识别本发明记载的甲基化状态的 DNA 并可以特异性结合的抗体即可。甲 基化 DNA 抗体可通过将被甲基化了的碱基、 甲基化 DNA 等作为抗原并利用通常方法而制成。 具体而言， 可以从将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲基胞嘧啶的 DNA 等作为抗原而 制得的抗体， 以对 DNA 中的甲基胞嘧啶的特异性结合为指标进行选择而制得。作为向动物 免疫抗原而得到的抗体， 有免疫精制的抗原后利用 IgG 级分的抗体 ( 多克隆抗体 ) 的方法， 以及利用产生单一克隆的抗体 ( 单克隆抗体 ) 的方法。本发明中， 优选能够特异性识别甲 基化 DNA 或甲基胞嘧啶的抗体， 因此优选利用单克隆抗体。
     作为制造单克隆抗体的方法， 可例举如细胞融合法。 例如， 细胞融合法是使免疫小 鼠来源的脾细胞 (B 细胞 ) 与骨髓瘤细胞细胞融合， 制造杂交瘤， 选择杂交瘤产生的抗体， 可 以制造甲基胞嘧啶抗体 ( 单克隆抗体 )。 利用细胞融合法制造单克隆抗体时， 没有必要精制 抗原， 例如可以将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲基胞嘧啶的 DNA 等的混合物作 为抗原， 投与免疫用的动物。作为给药方法， 为将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲 基胞嘧啶的 DNA 等直接给予产生抗体的小鼠。当抗体难以产生时， 也可以使抗原结合到支 撑体来免疫。另外， 通过将佐剂溶液 ( 例如混合液体石蜡和 Aracel A， 并混合结核菌的死 菌作为佐剂得到的溶液 ) 和抗原充分混合， 掺入脂质体使其免疫， 由此可以提高抗原的免 疫性。 或者， 有如下的方法 ： 等量添加含有抗原的溶液和佐剂溶液， 充分成为乳液状之后， 向 小鼠的皮下或腹腔内注射的方法 ； 在与明矾水充分混合之后， 以百日咳死菌为佐剂并添加 的方法。 另外， 也可以在最初的免疫之后经过合适的期间后， 对小鼠的腹腔内或静胍内追加 免疫。另外， 在抗原量少的情况下， 可以将抗原悬浮的溶液直接注入小鼠脾脏进行免疫。自 最终免疫起数日后摘除脾脏并剥离脂肪组织之后， 制作脾细胞悬浮液。使该脾细胞和例如 HGPRT 缺失骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤。 作为细胞融合剂， 只要是可以将脾细胞 (B 细胞 ) 和骨髓瘤细胞有效融合的方法即可， 例如可以举出使用仙台病毒 (HVJ)、 聚乙二醇 (PEG) 的方法等。 另外， 可以利用使用高电压脉冲的方法进行细胞融合。 在细胞融合操作之 后， 用 HAT 培养基进行培养， 选择脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤的克隆， 等待细胞发 育直到可以筛选。就用于选择生产目标抗体的杂交瘤的抗体的检测法、 抗体效价的测定法 而言， 可以利用抗原抗体反应体系。具体而言， 在针对可溶性抗原的抗体测定法中， 可以举 出放射性同位素免疫定量法 (RIA)、 酶免疫定量法 (ELISA) 等。 考虑到甲基化 DNA 抗体的性 质 ( 在 1 个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 结合 1 个抗体 )， 作为目标 DNA 区域， 优选选择多 个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 )， 即存在 CpG 的区域， 可以提高定量精度及检测灵敏度。“特定寡核苷酸” 是指， 具有可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 碱基配对的碱基 序列、 且当与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 碱基配对时， 不抑制甲基化 DNA 抗体与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 中的被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 结合的寡核苷酸。即， 是不抑制单链 DNA 中的目标 DNA 区域中的被甲基化了的碱基与甲基化 DNA 抗体相结合的寡核苷酸。更具 体而言是指， 例如是不抑制目标 DNA 区域中的甲基胞嘧啶与甲基胞嘧啶抗体之间结合的寡 核苷酸， 并且是通过互补性可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的寡核苷酸。
     “可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的碱基序列” 是指形成与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 的结合体 ( 双链 ) 而必要的碱基序列， 即含有与目标 DNA 区域的碱基序列 的一部分相互补的碱基序列的碱基序列、 或含有对与目标 DNA 区域的 5’ 末端相比更靠近 5’ 末端侧 DNA 区域的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列、 或含有对与目标 DNA 区域的 3’ 末端相比更靠近 3’ 末端侧的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列。 另外， “不抑制甲基化 DNA 抗体对含有目标 DNA 区域的单链 DNA 中的被甲基化了的碱基 ( 胞 嘧啶 ) 的结合” 是指特定寡核苷酸的碱基序列为如下的碱基序列， 即， 特定寡核苷酸与上述 单链 DNA 的互补结合， 不在甲基化 DNA 抗体与被甲基化了的单链 DNA 结合而需要的占有空 间内发生的碱基序列。即， 认为甲基化 DNA 抗体与被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 的结合中， 不仅占用了直接结合的被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 )， 而且也占用了被甲基化了的碱基 ( 胞 嘧啶 ) 存在的周边空间。因此， 特定寡核苷酸只要是在甲基化 DNA 抗体与甲基化 DNA 结合 时需要的占有空间中不与上述单链 DNA 互补结合的寡核苷酸即可。
     本发明中， 使用至少一个以上的特定寡核苷酸， 可以同时检测至少一个以上的目 标 DNA 区域。即， 与上述单链 DNA 结合的特定寡核苷酸没有必要是 1 种， 只要是不抑制甲基 化 DNA 抗体的结合， 也可以使用 2 种以上。如使用多个特定寡核苷酸， 可以提高定量精度及 检测灵敏度。另外， 通过同时检测多个的目标区域， 可以增加作为测定对象的甲基化 DNA 的 量。
     另外， “特定寡核苷酸” 具体可例举如序列编号 13 ～ 24 中任一项所示的碱基序列 及其互补序列， 或者也可以例举与这些碱基序列有 80％以上、 90％以上、 95％以上或 98％ 以上的序列同一性的碱基序列等。
     第二工序中， 作为使单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸的复合体形成时 的优选方式， 可例举如在含有二价阳离子的反应系中形成。 更优选例如， 二价阳离子为镁离 子。在此， “含有二价阳离子的反应系” 是指， 在用于使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与特 定寡核苷酸结合的退火缓冲液中含有二价阳离子之类的反应系， 具体例如， 可以是以直到 1mM ～ 600mM 的浓度， 含有形成镁离子的盐 ( 例如， MgOAc2、 MgCl2 等 ) 的反应系。
     另外， 在第二工序中， 作为形成单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸的复合 体时的优选方式， 可例举如添加反向寡核苷酸 (counteroligonucleotide) 等。反向寡核苷 酸是将与目标 DNA 区域相同的碱基序列分割成短的寡核苷酸后得到的核苷酸。通常设计成 10 ～ 100 个碱基、 更优选 20 ～ 50 个碱基的长度。另外， 反向寡核苷酸未设计在特定寡核苷 酸与目标区域相结合的碱基序列上。反向寡核苷酸与基因组 DNA 相比， 大量过剩添加， 目的 在于， 在使目标 DNA 区域成为单链 ( 正链 ) 之后， 在使其与特定寡核苷酸 ( 负链 ) 结合时， 防止目标 DNA 区域的互补链 ( 负链 ) 和目标 DNA 区域的单链 ( 正链 ) 通过互补性再结合。 这是因为， 在使目标 DNA 区域与甲基化 DNA 抗体结合， 测定 DNA 的甲基化频度或与其有相关关系的指标值时， 目标区域为单链时更容易与甲基化 DNA 抗体结合。另外， 反向寡核苷酸与 目标 DNA 区域相比， 优选添加至少 10 倍、 通常为 100 倍以上的量。
     “形成复合体” 是指， 含有甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸与 甲基化 DNA 抗体结合状态的混合物。本发明中， 优选直到后述的第三工序， 通过将该复合体 中的甲基化 DNA 抗体或特定寡核苷酸结合到支撑体从而使该复合体固定到支撑体。
     作为 “支撑体” ， 只要是复合体可以结合的支撑体， 则可以是任何的材质和形状。 例如， 形状合适使用目的即可， 可例举如管状、 试验板状、 过滤器状、 盘状、 珠状等。另外， 作 为材质， 可以使用通常的免疫测定法用支撑体， 可例举如聚苯乙烯、 聚丙烯、 聚丙烯酰胺、 聚 甲基丙烯酸甲酯、 聚砜、 聚丙烯腈、 尼龙等合成树脂， 或者向上述合成树脂中加入磺基、 氨基 等反应性官能基后的材质。另外， 也可以是玻璃、 多糖类或其衍生物 ( 纤维素、 硝基纤维素 等 )、 硅胶、 多孔陶瓷、 金属氧化物等。
     作为使复合体结合到支撑体进行固定的方法， 可例举如将特定寡核苷酸固定化到 支撑体的方法。另外， 由于将含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 通过特定寡核苷 酸结合到支撑体， 因此通过其识别功能 ( 后述 ) 来定量或检测甲基化 DNA 抗体。
     为了使特定寡核苷酸可以在支撑体上固定化， 特定寡核苷酸是最终以形成与含有 被甲基化了的有目标 DNA 区域的单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体的复合体的状态， 在支撑体上 固定化即可。 (1) 也可以在上述单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合前的阶段， 将特定寡核苷酸固 定化到支撑体， 或者，
     (2) 也可以在上述单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合后的阶段， 将特定寡核苷酸固 定化到支撑体。
     为了使特定寡核苷酸固定化到支撑体， 具体而言， 可例举如将特定寡核苷酸的 5’ 末端或 3’ 末端生物素化而得的生物素化寡核苷酸固定到被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体 ( 例如， 被抗生蛋白链菌素覆盖的 PCR 管、 被抗生蛋白链菌素覆盖的磁珠、 被抗生蛋白链菌 素部分覆盖的色谱条等 ) 的方法。
     另外， 还有如下的方法， 即在使特定寡核苷酸的 5’ 末端或 3’ 末端与具有氨基、 硫 醇基、 醛基等活性官能团的分子共价结合之后， 使其与表面被硅烷偶联剂等活化后的玻璃、 多糖类衍生物、 硅胶、 或上述合成樹脂等、 或耐热性塑料制的支撑体共价结合的方法。 另外， 共价结合例如可以举出通过将 5 个甘油三酯串联连结而成的间隔区、 交联剂等使其共价结 合。另外， 还可以举出在玻璃或硅制支撑体上直接从特定寡核苷酸的末端侧开始化学合成 的方法。
     另外， 具体例如， 作为具有可以固定到支撑体的特征的特定寡核苷酸， 使用末端被 生物素标记了的 “生物素化特定寡核苷酸” ， 如下进行实施即可。
     (a) 向生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样中， 添加退火缓冲液 ( 例 如， 33mM Tris- 乙酸盐 pH 7.9、 66mM KOAc、 10mMMgOAc2、 0.5mM 二硫苏糖醇 ) 以及生物素化 特定寡核苷酸， 从而得到混合物。接着， 为了使生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的双链 DNA 成为单链 DNA， 将所得混合物在 95℃加热例如数分钟。之后， 为了形成含有目标 DNA 区 域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体， 将其迅速冷却至较生物素化特定寡核苷 酸的 Tm 值低约 10 ～ 20℃的温度， 在该温度下保温例如数分钟， 之后， 返回至室温 ( 在该阶
     段形成的结合体， 除了含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合 体之外， 还包括含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。
     (b) 向被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体， 添加上述 (a) 所得的混合物， 再将其在 37℃保温例如数分钟， 从而将含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结 合体固定到被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体。之后， 进行残留液的除去和清洗。将清洗 缓冲液 ( 例如， 含有 0.05％ Tween20 的磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaClpH7.4)) 以例如 300μL/ 孔的比例添加， 除去溶液。将该清洗操作重复数次， 将固定化 至支撑体的生物素化特定寡核苷酸与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 的结合体残留到孔上 ( 即使在该阶段， 结合体除了包括被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的 结合体之外， 还包括含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合 体 )。
     (c) 将甲基化 DNA 抗体以适当量 ( 例如， 将 4μg/mL 溶液以 100μL/ 孔的量 ) 添 加到孔中， 之后， 在室温下静置例如约 3 小时， 促进甲基化 DNA 抗体与上述单链 DNA 中含 有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的复合体的形成 ( 复 合体的形成 )( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸 的结合体没有形成复合体 )。之后， 进行残留溶液的除去和清洗。将清洗缓冲液 ( 例如， 0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mMNa2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)) 以例 如 300μL/ 孔的比例添加， 除去溶液。将该清洗操作重复数次， 将复合体残留到孔上 ( 复合 体的选择 )。
     作为在 (a) 中使用的退火缓冲液， 只要是适合使特定寡核苷酸与生物试样来源的 含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的即可， 不限定为上述退火缓冲液。如果使用溶解有二 价离子优选以 1 ～ 600mM 浓度的镁离子的退火缓冲液， 则可以增加结合的稳定性。
     (b) 及 (c) 中的清洗操作可以将在溶液中浮游的未被固定化的甲基化 DNA 抗体、 没 有与甲基化 DNA 抗体结合的在溶液中浮游的单链 DNA、 或者被后述限制性酶消化的在溶液 中浮游的 DNA 等从反应溶液中除去， 因此是重要的。另外， 清洗缓冲液只要是适合上述游离 的甲基化 DNA 抗体、 在溶液中浮游的单链 DNA 等的除去即可， 不限于上述清洗缓冲液， 也可 以是 DELFIA 缓冲液 (PerkinElmer 社制、 Tris-HCl pH 7.8 的 Tween80)、 TE 缓冲液等。
     另外， 如上所述， 上述 (a) ～ (c) 中， 上述的含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素 化特定寡核苷酸的结合， 是在生物素化特定寡核苷酸与被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体的 固定之前的阶段实施的， 但其顺序哪个在前均可。即， 例如， 通过向在被抗生蛋白链菌素覆 盖的支撑体上固定化了生物素化特定寡核苷酸中， 添加生物来源标本中含有的基因组 DNA 来源的 DNA 试样， 从而得到混合物。为了使生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目 标 DNA 区域的双链 DNA 成为单链， 将得到的混合物在 95℃加热例如数分钟， 之后为了形成与 生物素化特定寡核苷酸的结合体， 迅速冷却至较生物素化特定寡核苷酸的 Tm 值低约 10 ～ 20℃的温度， 将该温度保持例如数分钟 ( 在该阶段形成的结合体除了含有被甲基化了的目 标 DNA 区域的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区域以外的被甲基化 了的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体 )。之后， 也可以实施 (c) 的操作， 形成、 选择复合体 ( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形 成复合体 )。可以使用色谱条来实施上述 (a) ～ (c) 的操作。 该情况下， 具体可如下实施。 利用 被抗生蛋白链菌素部分覆盖的色谱条， 将使生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目 标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成的溶液展开。通过该操作， 生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核 苷酸的结合体被固定化到被抗生蛋白链菌素覆盖的部分 ( 在该阶段形成的接合体， 除了含 有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 和甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区 域以外的被甲基化了的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体 )。 接着， 利用上述色谱条将适量的 甲基化 DNA 抗体展开。通过这些操作， 包括生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有被 甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与甲基化 DNA 抗体的复合体 被固定化到被抗生蛋白链菌素覆盖的部分 ( 复合体的形成· 选择 )( 在该阶段， 含有没有被 甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。对于这些 操作， 复合体形成的顺序哪个在前均可。例如， 也可以是， 使含有被甲基化了的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与甲基化 DNA 抗体的复合体形成之后， 将其用色谱 条展开， 在被抗生蛋白链菌素覆盖的部分， 将该复合体固定化。在这些操作中， 通过利用色 谱条将溶液展开， 可以除去不需要的成分， 可以省略清洗操作。当然， 也可以在各操作间实 施清洗操作 ( 清洗缓冲液 ( 例如， 利用含有 0.05％ Tween20 的磷酸缓冲液 (1mMKH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 的色谱条的展开 )。
     第三工序中的 “识别功能” 是指用于检测或定量的基于识别的功能， 具体而言， 对 于甲基化 DNA 抗体的情况， 为进行了铕标记、 胶体金标记、 乳胶微球标记、 放射性同位素标 记、 荧光物质 (FITC 等 ) 标记、 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记、 碱性磷酸酯标记、 生物素标记等 的甲基化 DNA 抗体的这些标记的荧光·发色等功能， 另外， 作为该功能， 也可例举如抗体自 身与二次抗体结合的性质等。作为这些功能的定量或检测手段， 可例举如例如放射线检测 器、 分光光度计等的测定或目视等。
     对于甲基化 DNA 抗体的情况， 如上所述， 抗体自身与二次抗体结合的性质被认为 是功能。 即， 即使抗体自身没有被标记， 而是使用附加有可以定量或检测的识别功能的二次 抗体， 也可以间接定量或检测甲基化 DNA 抗体。
     对甲基化 DNA 抗体通过其识别功能进行定量或检测时， 具体而言， 例如， 将抗体自 身的特性作为功能使用时， 进行以下操作即可。向复合体中添加对甲基化 DNA 抗体的二次 抗体 ( 例如， Eu-N1 标记小鼠 IgG 抗体 ： PerkinElmer 社制 )， 在室温下静置约 1 小时， 促进二 次抗体对复合体的结合， 之后， 添加·混合促进溶液 (Enhancement Solution， PerkinElmer 社制 )， 例如在室温静置约 45 分钟。之后， 利用荧光检测器测定荧光 ( 激发 340nm/ 萤光 612nm)， 将甲基化 DNA 抗体定量或检测。作为二次抗体使用使 FITC 结合的抗体时， 也可以 通过公知的方法， 测定 FITC 的萤光， 定量或检测甲基化 DNA 抗体。另外， 例如， 在特定寡核 苷酸的固定化中没有利用生物素时， 可以用于定量或检测生物素化甲基化 DNA 抗体。定量 或检测生物素化甲基化 DNA 抗体时， 例如， 向生物素化甲基化 DNA 抗体添加· 混合 HRP 标记 抗生蛋白链菌素， 形成生物素化甲基化 DNA 抗体与 HRP 标记抗生蛋白链菌素的结合体， 通过 公知的方法测定 HRP 的活性， 从而可以对生物素化甲基化 DNA 抗体进行定量或检测。
     本发明包括以下变更方法 ： 在第一工序后至第三工序， 追加利用可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶将未被甲基化的单链 DNA 消化的工序的变更方法 ( 变更方法1) ； 以及， 在本发明的第一工序后至第三工序， 追加在含具有甲基化敏感性限制酶的识别序 列作为其一部分的特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中， 利用该甲基化敏感性限制酶将未被甲 基化的单链 DNA 消化的工序的变更方法 ( 变更方法 2)。
     该变更方法 ( 变更方法 1 及变更方法 2) 中的 “甲基化敏感性限制酶” 是指， 例如， 可以不消化含有被甲基化了的胞嘧啶的识别序列、 而仅消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识 别序列的限制性酶等。即， 对于甲基化敏感性限制酶本来可以识别的识别序列中所含胞嘧 啶为被甲基化了的 DNA 的情况， 即使使该甲基化敏感性限制酶作用该 DNA， 该 DNA 也不被剪 切。与此相对， 对于甲基化敏感性限制酶本来可以识别的识别序列中所含胞嘧啶没有被甲 基化的 DNA 的情况， 如使该甲基化敏感性限制酶作用该 DNA， 则该 DNA 被剪切。作为该甲 基化敏感性酶的具体示例， 例如可例举如 HpaII、 BstUI、 NarI、 SacII、 HhaI 等。另外， 上述 甲基化敏感性限制酶不切断半甲基状态的双链 DNA( 一侧的链的胞嘧啶 (CpG) 被甲基化， 另一侧链的互补的胞嘧啶 (CpG) 没有被甲基化的双链 DNA)， 这些被 Gruenbaum 等人明确了 (NucleicAcidResearch， 9、 2509-2515)。
     另外， “可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶” 是指， 例如， 可以不消化单链 DNA 中的含有被甲基化了胞嘧啶的识别序列、 而仅消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序 列的限制性酶等。 即， 甲基化敏感性限制酶中也有可以消化单链 DNA 的。 可例举如 HhaI 等。
     作为利用甲基化敏感性限制酶的消化处理的令人担心之处， 可以举出对无法完全 消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序列 ( 所谓 “剩余未切的 DNA” ) 的担心。在这样的担 心成为问题的情况下， 只要大量存在甲基化敏感性限制酶的识别位点， 可以将 “剩余未切的 DNA” 抑制在最小限， 作为目标 DNA 区域， 具有一个以上的甲基化敏感性限制酶的识别位点， 认为其识别位点越多越好。
     如上所述， 作为目标 DNA 区域， 考虑到甲基化 DNA 抗体的性质 (1 个抗体结合到 1 个被甲基化了碱基 ( 胞嘧啶 ))， 优选选择存在多个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶、 CpG) 的区 域作为目标 DNA 区域， 另外， 从将 “剩余未切的 DNA” 抑制在最小限的观点来看， 优选选择存 在多个甲基化敏感性限制酶的识别位点的区域。
     变更方法 2 中的 “特定掩蔽用寡核苷酸” 是指具有甲基化敏感性限制酶的识别序 列作为其一部分的寡核苷酸。具体而言是如下的寡核苷酸， 即， 与单链 DNA 中的目标 DNA 区 域中所含的多个位置的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中的 1 个位置的特定位置 ( 根据 目标区域的碱基序列的不同， 也包括在下述的 8 ～ 30 碱基长度中， 同时含有 1 个位置以上 的情况 ) 互补结合， 形成双链 DNA( 即， 上述位置成为双链 DNA 状态 )， 即便是仅以双链 DNA 为 基质的甲基化敏感性限制酶也可以将上述位置消化， 另外， 可以提高利用能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶 ( 能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶也能够消化双链 DNA， 就 其消化效率而言， 针对双链 DNA 的消化效率高于针对单链 DNA 的消化效率 ) 的上述位置的 消化效率， 并且， 是不会抑制含有目标区域的 DNA 的单链 DNA 和特定寡核苷酸的结合体的形 成的寡核苷酸。
     作为特定掩蔽用寡核苷酸， 更具体而言， 可例举如下的寡核苷酸， 即， 具有对于单 链 DNA 中的目的 DNA 区域所含的包括多个位置的甲基化敏感性限制酶的识别序列中的 1 个 位置的特定位置 ( 根据目标区域的碱基序列的不同， 也有在下述的 8 ～ 30 碱基长度中同时 含有 1 个位置以上的情况 ) 的 8 ～ 30 碱基长度的碱基序列有互补性的碱基序列、 且不抑制包括目标区域的 DNA 的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体的形成的寡核苷酸。
     混合到基因组 DNA 来源的 DNA 试样的特定掩蔽用寡核苷酸可以是 1 种也可以是多 种。如使用多种， 则包括目标区域 DNA 的单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶的识别位点的多 个成为双链 DNA 状态， 可以将甲基化敏感性限制酶的上述 “剩余未切 DNA” 抑制到最小限。 由于在特定掩蔽用寡核苷酸形成双链 DNA 的位置不能结合甲基化 DNA 抗体， 因此不优选对 于过多的甲基化敏感性限制酶使用特定掩蔽用寡核苷酸， 而是优选使用适合的种类。 如果， 对于目标 DNA 区域所含所有的甲基化敏感性限制酶识别位点使用特定掩蔽用寡核苷酸， 则 会阻碍该识别位点中被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 与甲基化 DNA 抗体的结合， 具有被甲基 化了的目标 DNA 区域的复合体的形成可能性会降低 ( 在该识别位点以外的 CpG， 当然结合有 甲基化 DNA 抗体， 在定量或检测甲基化 DNA 抗体时， 其定量精度及检测灵敏度降低 )。特定 掩蔽用寡核苷酸用于对以下位置的设计特别有用， 即， 例如， 在目标 DNA 区域所含多个位置 的甲基化敏感性限制酶的识别序列中， 必须甲基化的情况不被消化、 没有被甲基化的情况 要消化的位置 ( 例如， 在疾患患者标本中， 被 100％甲基化， 在健常者标本中没有被 100％甲 基化的位置等 )。
     该变更方法 ( 变更方法 1 及变更方法 2) 中， 通过在第一工序后至第三工序开始 前， 实施利用至少 1 种的甲基化敏感性限制酶进行消化的工序， 可以将具有没有被甲基化 的目标 DNA 区域的复合体的形成抑制到最小限 ( 排除 )， 可以提高目标 DNA 区域中被甲基化 了的 DNA 的定量精度及检测灵敏度。
     变更方法 1 中， 在第一工序结束后至第三工序开始前实施的， 使用可以消化单链 DNA 的至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶对第一工序所得的单链 DNA 进行消化处理的 操作， 具体例如可如下实施。向第一工序所得的含有单链 DNA 的标本液 10μL 中加入最适 的 10× 缓冲液 3μL、 可以消化单链的甲基化敏感性酶 (HhaI)15U， 另外， 根据需要适量加 入 BSA 等， 接着， 向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 30μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚。这样， 目标 DNA 区域内的没有被甲基化的 HhaI 识别位点被消化 ( 处理溶液 )。例如， 在复合体形成前实施本操作时， 由于在复合体形成、 及 ( 或 ) 选择时实施清洗操作， 因此将 上述处理溶液直接用于复合体形成即可。 另外， 在复合体选择后实施本操作时， 由于需要从 处理溶液中除去在处理溶液中存在的浮游的单链 DNA( 该甲基化敏感性限制酶的识别位点 没有被甲基化， 因此被消化生成的单链 DNA)， 因此必须在本操作结束之后， 再次实施与在复 合体形成及 ( 或 ) 选择时实施的清洗操作同样的清洗操作。
     变更方法 2 中， 在第一工序结束后至第三工序开始前实施的、 向第一工序所得的 单链 DNA 中添加至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶及具有该甲基化敏感性限制酶的识别 序列作为其一部分的特定掩蔽用寡核苷酸而进行消化处理的操作， 具体例如可如下实施。 向第一工序所得的含有单链 DNA 的标本液 10μL 中， 加入最适的 10× 缓冲液 3μL、 甲基化 敏感性酶 (HhaI、 HhaI 等 )15U、 与上述甲基化敏感性酶的识别序列中的 1 个位置的特定位 置相对的特定掩蔽用寡核苷酸约 10pmol， 另外， 根据需要适量添加 BSA 等， 接着， 向该混合 物中添加灭菌超纯水使液量为 30μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚。这样， 目标 DNA 区域 内的没有被甲基化的该箇所被消化 ( 处理溶液 )。例如， 在复合体形成前实施本操作时， 由 于在复合体形成、 及 ( 或 ) 选择时实施清洗操作， 因此将上述处理溶液直接用于复合体形成 即可。 另外， 在复合体选择后实施本操作时， 由于需要从处理溶液中除去在处理溶液中存在的浮游的单链 DNA( 该甲基化敏感性限制酶的识别位点没有被甲基化， 因此被消化生成的 单链 DNA)， 因此必须在本操作结束之后， 再次实施与在复合体形成及 ( 或 ) 选择时实施的清 洗操作同样的清洗操作。
     另外， 作为 “生物来源标本中所含的基因组 DNA 来源的 DNA 试样” 的优选方式之一， 可举出预先用不将该基因组 DNA 所具有的目标 DNA 区域作为识别切断位点的限制酶实施消 化处理而成的 DNA 试样。在使生物来源标本中所含的包括基因组 DNA 具有的目标区域 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体形成的情况下， 对于该单链 DNA， 不仅被认为如含 有目标 DNA 区域则短的更容易形成复合体， 而且操作性也好。减短单链 DNA 中， 在原始基因 组 DNA 时事先减短是有效的。 因此， 也可以将不以目标 DNA 区域为识别剪切位点的限制性酶 直接用于生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样而实施消化处理。另外， 作为利 用不以目标 DNA 区域为识别剪切位点的限制性酶进行消化处理的方法， 使用一般的限制性 酶处理法即可。另外， 标本为事先精制而成的 DNA 试样时， 使用一般使用的量的限制性酶进 行实施即可， 标本为组织溶解液、 细胞溶解液等时， 使用大量过剩的限制酶、 例如相当于 DNA 量为 500 倍量或其以上的限制酶实施即可。
     另外， 作为 “生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样” 的优选方式之一， 可例举如用至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶消化处理而成的 DNA 试样。通过将生物来 源标本本身用甲基化敏感性限制酶消化处理， 可以在最终工序中精度良好地定量或检测甲 基化。该方法对于消除如上所述的 “剩余未切的 DNA” 是有用的。作为将标本本身用甲基 化敏感性限制酶消化的方法， 对于标本中基因组 DNA 以双链 DNA 存在的情况， 使用甲基化敏 感性限制酶， 实施一般的限制性酶处理即可。另外， 对于标本中基因组 DNA 以单链 DNA 存在 的情况， 或者标本中基因组 DNA 以双链 DNA 和单链 DNA 混在的情况， 利用依据变更方法 1 及 变更方法 2 的方法来实施处理即可。具体而言， 例如如下的方法 ： 向标本液 10μL 中加入最 适的 10× 缓冲液 5μL、 可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶 (HhaI)15U， 另外根据需 要适量添加 BSA 等， 再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 50μL， 在 37℃孵育例如 1 小 时～ 1 晚等的方法 ； 或者， 向标本 10μL 中添加最适的 10× 缓冲液 5μL、 甲基化敏感性限制 酶 (HpaII、 HhaI 等 )15U、 与上述甲基化敏感性酶的识别序列中 1 个位置的特定位置相对的 特定掩蔽用寡核苷酸约 15pmol， 另外还根据需要适量添加 BSA 等， 接着， 向该混合物中添加 灭菌超纯水使液量为 50μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚等的方法等。另外， 标本是事先 精制而成的 DNA 试样时， 使用一般使用的量的限制性酶实施处理即可， 标本为组织溶解液、 例如相当于 DNA 量为 500 倍量或其 细胞溶解液等时， 使用大量过剩的甲基化敏感性限制酶、 以上的甲基化敏感性限制酶实施处理即可。
     作为对血液、 尿等生物体试样中所含微量物质进行定量或检测的方法， 广泛使用 免疫学的测定方法。 在该方法中， 使用色谱仪的所谓免疫色谱法操作简单、 检测需要的时间 也短， 因此目前在很多场合例如医院的临床检查、 研究室中的鉴定试验等广泛使用。另外， 近年， 将标记了的 DNA( 基因 ) 在色谱条上展开， 使用可以捕获目的 DNA( 基因 ) 的探针进行 杂交， 从而检查目的 DNA( 基因 ) 的所谓杂交色谱法逐渐被使用。该方法也是操作简单， 检 测需要的时间也短， 因此目前开始在医院的临床检查、 研究室中的鉴定试验等广泛使用。 本 发明在概念上可以形成一种混合了上述免疫色谱法与杂交色谱法的方法。本发明中， 对于 复合体形成及复合体的选择， 其顺序没有特别限定， 因此可以使用各种方法。 具体例如可如下实施。 方法 1 ： 向第一工序结束后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸， 使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成 ( 在该阶段形成的结合体除了包括 含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有没 有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )， 接着， 添加具有功能的 甲基化抗体， 使含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具 有功能的甲基化 DNA 抗体结合的复合体形成 ( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。如将所得的试样滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述复合体通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素 覆盖了的部分捕获。之后， 对形成所得复合体的甲基化 DNA 抗体通过其功能进行定量或检 测， 可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     方法 2 ： 向第一工序结束后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸， 使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成 ( 在该阶段形成的结合体除了包 括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有 未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。如将所得的试样滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述结合体通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白 链菌素覆盖了的部分捕获 ( 在该阶段， 结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的 单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。之后， 如将具有功能的甲基化抗体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移 动到展开部， 与结合体的被甲基化了而得胞嘧啶结合， 形成结合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具有功能的甲基化 DNA 抗体的复合体 ( 在 该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成 复合体 )。 通过对获得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行定量或检测， 可以对 目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     方法 3 ： 如将生物素化特定寡核苷酸滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述寡核苷 酸通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素覆盖了的部分捕获。 接着， 如将 第一工序结束后的试样滴到 ( 导入 ) 到导入部， 则移动到展开部， 以含有目标 DNA 区域的单 链 DNA 在已经被捕获的生物素化特定寡核苷酸形成结合体的形式被捕获 ( 在该阶段形成的 结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之 外， 也包括含有未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。之后， 如将具有功能的甲基化抗体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移动到展开部， 与结合体的被甲基化了 的胞嘧啶结合， 形成结合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡 核苷酸与具有功能的甲基化 DNA 抗体的复合体 ( 在该阶段， 含有未被甲基化的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。对所得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行定量或检测， 从而可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定 量或检测。
     方法 4 ： 如将生物素化特定寡核苷酸滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述寡核 苷酸利用毛细管现象被移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕获。向第一 工序结束后的试样中加入具有功能的甲基化 DNA 抗体， 形成具有被甲基化了的胞嘧啶单链
     DNA( 其中， 存在含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与目的以外的单链 DNA) 与具有功能的甲基化 DNA 抗体的结合体 ( 在该阶段形成的结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单 链 DNA 与甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区域以外的被甲基化了的单链 DNA 与 甲基化抗体的结合体 )。如将所得的结合体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移动到展开部， 含有被 甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与已经被捕获的生物素化特定寡核苷酸结合， 形成结 合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具有功能的甲 基化 DNA 抗体的复合体 ( 在该阶段， 目标 DNA 区域以外的被甲基化了的单链 DNA 与甲基化 抗体的结合体没有形成复合体 )。对所得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行 定量或检测， 从而可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     也可以是， 在一个色谱条上存在多个检测部位 ( 将可以分别捕获不同目标 DNA 区 域的特定寡核苷酸固定到支撑体 )， 依次定量或检测各目标 DNA 区域， 另外， 如果 1 个检测 部位可以捕获多个目标 DNA 区域， 即， 在 1 个检测部位， 固定化多个可以捕获多个目标 DNA 区域的特定寡核苷酸， 则可以使检测灵敏度显著提高。 另外， 使用多个具有可以捕获多个目 标 DNA 区域的功能的特定寡核苷酸来形成多个目标 DNA 区域与复合体， 可以使检测灵敏度 显著提高。进而， 即使在 1 个目标区域中设计多个特定寡核苷酸， 将其用于支撑体侧或检测 侧， 也可以使检测灵敏度显著提高。
     这样在本发明可以使用的限制性酶、 特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体作为检测用 试剂盒的试剂有用。本发明还提供含有这些限制性酶、 特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体等 作为试剂的检测用试剂盒、 将这些特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体等固定化到支撑体上而 成的检测用芯片， 本发明的权利要求范围当然也包括以利用该方法的实质性原理而得的上 述检测用试剂盒、 检测用芯片之类的方式的使用。 实施例 以下， 通过实施例更详细地说明本发明， 但本发明不限于此。
     实施例 1
     将从 ATCC 购入的哺乳动物来源的结肠腺癌细胞株 Capan-2(ATCCNO.HTB-80) 在等 量混合了 McCoy ‘s5a(Gibco、 Cat.No.16600-082) 和 FBS(ATCC、 CatNo.30-2020) 的培养基中 培养直到融合， 由此得到约 1×107 细胞。 向得到的细胞加入 SEDTA 缓冲液 [10mM Tris-HCl pH 8.0、 10mM EDTA pH 8.0、 100mM NaCl]10 倍容量之后， 将其均质化。
     向所得混合物中加入蛋白酶 K(Sigma) 使其浓度为 500μg/ml 及十二烷基硫酸钠 使其浓度为 1％ (w/v)， 之后将其在 55℃振荡约 16 小时， 接着， 使用被 1M Tris-HCl、 pH 8.0 饱和了的苯酚， 进行苯酚· 氯仿提取处理。将水层回收， 向其中加入 NaCl 使浓度为 0.5N 之 后， 对其进行乙醇沉淀处理， 回收生成的沉淀 ( 基因组 DNA)。将回收的沉淀溶解到 TE 缓冲 液 (10mM Tris、 1mM EDTA、 pH 8.0)， 向其中加入 RNase A(Sigma) 使其浓度为 40μg/ml， 之 后在 37℃孵育 1 小时， 接着， 进行苯酚· 氯仿提取处理。将水层回收， 向其中加入 NaCl 使其 浓度为 0.5N 后， 对其进行乙醇沉淀处理， 将生成的沉淀 ( 基因组 DNA) 回收。将回收的沉淀 用 70％乙醇清洗， 得到 Capan-2 基因组 DNA。
     分别以双份的方式制备从 Clontech 购得的血液来源基因组 DNA 及上述 Capan-2 基因组 DNA 各自的 500ng/20μL TE 缓冲液溶液。
     将制备的各基因组 DNA 溶液 20μL、 限制性酶 X spI 10U 与对 X spI 最适的 10× 缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8.5、 100mM MgCl2、 10mM 二硫苏糖醇、 1000mM KCl)5μl 混合， 向其中加入灭菌超纯水使液量为 50μl， 将其在 37℃孵育 1 小时， 制备基因组溶液。
     作为用于获得序列编号 1 ～ 12 中任一项所示目标 DNA 区域的特定寡核苷酸， 合成 了与该 DNA 区域通过互补性结合的具有序列编号 13 ～ 24 所示碱基序列的 5’ 末端生物素 化寡核苷酸， 如下制备各自 0.1pmoL/μL 的 TE 缓冲液溶液。
     将具有为了取得序列编号 1 的目标区域的序列编号 13 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 1。
     将具有为了取得序列编号 2 的目标区域的序列编号 14 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 2。
     将具有为了取得序列编号 3 的目标区域的序列编号 15 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 3。
     将具有为了取得序列编号 4 的目标区域的序列编号 16 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 4。
     将具有为了取得序列编号 5 的目标区域的序列编号 17 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 5。
     将具有为了取得序列编号 6 的目标区域的序列编号 18 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 6。
     将具有为了取得序列编号 7 的目标区域的序列编号 19 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 7。
     将具有为了取得序列编号 8 的目标区域的序列编号 20 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 8。
     将具有为了取得序列编号 9 的目标区域的序列编号 21 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 9。
     将具有为了取得序列编号 10 的目标区域的序列编号 22 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 10。
     将具有为了取得序列编号 11 的目标区域的序列编号 23 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 11。
     将具有为了取得序列编号 12 的目标区域的序列编号 24 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 12。
     将上述特定寡核苷酸溶液 1 ～ 12 分别等量混合， 制备特定寡核苷酸溶液 13。
     作为对序列编号 1 ～ 12 中任一种所示目标区域内的碱基序列设计的反向寡核苷 酸， 合成序列编号 25 ～ 118 中的任一种所示的寡核苷酸， 制备各自 10pmoL/μL 的 TE 缓冲 液溶液。将以相同的 DNA 区域为目标的反向寡核苷酸溶液分别等量混合， 分别制备如下所 示的反向寡核苷酸混合液。
     将序列编号 25 ～ 42 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 1。
     将序列编号 43 ～ 60 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 2。
     将序列编号 61 ～ 66 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 3。
     将序列编号 67 ～ 70 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 4。将序列编号 71 ～ 76 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 5。 将序列编号 77 ～ 82 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 6。 将序列编号 83 ～ 88 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 7。 将序列编号 89 ～ 94 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 8。 将序列编号 95 ～ 100 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 9。 将序列编号 101 ～ 106 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 将序列编号 107 ～ 112 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 将序列编号 113 ～ 118 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液10。
    11。
    12。 将上述反向寡核苷酸混合液 1 ～ 12 分别等量混合， 制备反向寡核苷酸混合液 13。
     将特定寡核苷酸溶液与反向寡核苷酸混合液分别等量混合， 制备下述溶液 A、 溶液 B、 溶液 C。
     溶液 A ： 特定寡核苷酸溶液 1 与反向寡核苷酸混合液 1
     溶液 B ： 特定寡核苷酸溶液 2 与反向寡核苷酸混合液 2
     溶液 C ： 特定寡核苷酸溶液 13 与反向寡核苷酸混合液 13
     向 PCR 管中加入上述制备的基因组溶液 30μL、 上述溶液 A ～ C 中的任一种 30μL、 缓冲液 (330mM Tris- 乙酸盐 pH 7.9、 660mM KOAc、 100mMMgOAc2、 5mM 二硫苏糖醇 )15μL、 10mM MgCl2 溶液 60μL 以及 1mg/mL BSA 溶液 15μL， 使液量为 150μL， 进行混合。之后， 将 该 PCR 管在 95℃加热 10 分钟， 迅速冷却至 70℃， 并在该温度下保温 10 分钟。接着， 冷却至 50℃保温 10 分钟， 再在 37℃保温 10 分钟后返回至室温， 促进 5’ 末端生物素标记寡核苷酸 与 DNA 片段的结合体的形成。
     将所得的混合物全部转移至被抗生蛋白链菌素覆盖的孔中， 在室温放置约 30 分 钟， 将上述 5’ 末端生物素标记寡核苷酸与 DNA 片段的结合体固定化到孔。之后， 利用移液 管将溶液除去， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaClpH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     向各孔中添加甲基胞嘧啶抗体 [Aviva Systems Biology 社制、 0.5μg/mL 0.1％ BSA 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 溶液 ]100μL， 在室 温下放置 1 小时。 用移液管将孔内的溶液去除， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓 冲液 (1mMKH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     以 100μL 的比例， 向各孔中添加 Eu-N1 标记小鼠 IgG 抗体 [PerkinElmer 社制、 0.05g/mL 0.1％ BSA 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mMNa2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 溶 液 ]， 在室温下放置 1 小时后， 用移液管将孔内的溶液除去， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     以 150μL 的比例向各孔中添加促进溶液 (Perkin Elmer 社制 )， 在室温下搅拌 5 分钟， 在室温下放置 15 分钟后， 以激发 340nm/ 萤光 612nm 测定萤光。
     将结果示于图 1。与作为检测对象的目标区域为 1 种的溶液 A 及溶液 B 相比较，
     同时检测作为检测对象的多个目标区域的溶液 C 中， 甲基化频度或具有相关关系的指标值 高。另外， 与非癌细胞来源的人基因组 DNA 相比较， 从 Capan-2 癌细胞株提取的基因组 DNA 的与作为检测对象的目标区域的甲基化频度有相关关系的指标值高。
     本实验中， 对多个目标 DNA 区域的甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行同 时测定， 这与对单一的目标 DNA 区域的甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行测定相 比较， 可以有效地测定甲基化频度或与其有相关关系的指标值。 另外， 与非癌组织来源的基 因组 DNA 相比较， 作为胰腺癌细胞的 Capan-2 细胞株来源的基因组 DNA 中的甲基化频度或 与其有相关关系的指标值高， 因此， 确认了， 通过混合在本考察中使用的目标 DNA 区域来对 甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行测定， 可以作为癌的诊断指标。另外， 确认了， 即使混合了在本考察中利用的特定寡核苷酸、 反向寡核苷酸及特定寡核苷酸， 也可以在癌 诊断中利用。
     产业上利用的可能性
     通过本发明， 可以提供一种简便定量或检测生物来源标本中所含基因组 DNA 具有 的目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 的方法等。
     序列表文本
    
    
    
    序列编号 13 ～ 24 为固定设计的 5’ 末端生物素标记寡核苷酸 序列编号 25 ～ 118 设计的寡核苷酸32102046787 A CN 102046791
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     33102046787 A CN 102046791序列表2/49 页
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     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、
     基序列、 (22) 序列编号 10 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、
     (23) 序列编号 11 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、 以及
     (24) 序列编号 12 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列。
     [ 发明 2]
     根据发明 1 所述的方法， 其中， 特定寡核苷酸含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (23) 序列编号 11 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列、 以及
     (24) 序列编号 12 所示碱基序列的互补序列或与其有 80％以上的序列同一性的碱 基序列。
     [ 发明 2]
     根据发明 1 所述的方法， 其中， 特定寡核苷酸含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (5) 序列编号 17 所示的碱基序列、 (6) 序列编号 18 所示的碱基序列、 (7) 序列编号 19 所示的碱基序列、 (8) 序列编号 20 所示的碱基序列、 (9) 序列编号 21 所示的碱基序列、 (10) 序列编号 22 所示的碱基序列、 (11) 序列编号 23 所示的碱基序列、 (12) 序列编号 24 所示的碱基序列、 (13) 序列编号 13 所示碱基序列的互补序列、 (14) 序列编号 14 所示碱基序列的互补序列、 (15) 序列编号 15 所示碱基序列的互补序列、 (16) 序列编号 16 所示碱基序列的互补序列、 (17) 序列编号 17 所示碱基序列的互补序列、 (18) 序列编号 18 所示碱基序列的互补序列、 (19) 序列编号 19 所示碱基序列的互补序列、 (20) 序列编号 20 所示碱基序列的互补序列、 (21) 序列编号 21 所示碱基序列的互补序列、 (22) 序列编号 22 所示碱基序列的互补序列、 (23) 序列编号 23 所示碱基序列的互补序列、 以及 (24) 序列编号 24 所示碱基序列的互补序列。 [ 发明 3] 根据发明 1 或 2 所述的方法， 其中， 在第二工序中形成复合体时， 添加反向寡核苷酸。 [ 发明 4]
     根据发明 1 ～ 3 中任一项所述的方法， 其中， 第二工序中的复合体的形成在含有二 价阳离子的反应系中进行。
     [ 发明 5]
     根据发明 1 ～ 4 中任一项所述的方法， 其中， 在第三工序之前， 使由第二工序形成 的复合体中的甲基化 DNA 抗体结合到支撑体。
     [ 发明 6]
     根据发明 1 ～ 5 中任一项所述的方法， 其中， 在第一工序后至第三工序， 还具有利 用能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶将未甲基化的单链 DNA 消化的工序。
     [ 发明 7]
     根据发明 1 ～ 6 中任一项所述的方法， 其中， 在第一工序后至第三工序， 还具有在 含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中， 利用该甲基化敏感性限制酶将未甲基化的单链 DNA 消化的工序， 所述特定掩蔽用寡核苷酸中作为其一部分含有甲基化敏感性限制酶的识别序 列。
     [ 发明 8]
     根据发明 6 所述的方法， 其中， 能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶为 HhaI。
     [ 发明 9]
     根据发明 1 ～ 8 中任一项所述的方法， 其中， 甲基化 DNA 抗体为甲基胞嘧啶抗体。
     [ 发明 10]
     根据发明 1 ～ 9 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本为哺乳动物的血液、 血 清、 血浆、 体液、 细胞溶解液或组织溶解液。
     [ 发明 11]
     根据发明 1 ～ 10 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为事先被限制酶消化处理而成的 DNA 试样， 所述限制酶不以该基因组 DNA 具 有的目标 DNA 区域为识别剪切位点。
     [ 发明 12]
     根据发明 1 ～ 11 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为被甲基化敏感性限制酶消化处理而得的 DNA 试样。
     [ 发明 13]
     根据发明 1 ～ 12 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本中所含基因组 DNA 来 源的 DNA 试样为在含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中被甲基化敏感性限制酶消化处理 而得的 DNA 试样。
     [ 发明 14]
     根据发明 7、 12 或 13 中任一项所述的方法， 其中， 甲基化敏感性限制酶为 HpaII 或 HhaI。
     [ 发明 15]
     根据发明 1 ～ 14 中任一项所述的方法， 其中， 生物来源标本所含基因组 DNA 来源 的 DNA 试样为事先被精制而成的 DNA 试样。
     [ 发明 16]
     根据发明 1 ～ 15 中任一项所述的方法， 其中， 基因组 DNA 具有的目标 DNA 区域有 甲基化敏感性限制酶的识别剪切位点。
     [ 发明 17]
     一种 DNA， 其含有以下所示的任一种碱基序列，
     (1) 序列编号 13 所示的碱基序列、
     (2) 序列编号 14 所示的碱基序列、
     (3) 序列编号 15 所示的碱基序列、
     (4) 序列编号 16 所示的碱基序列、
     (5) 序列编号 17 所示的碱基序列、
     (6) 序列编号 18 所示的碱基序列、
     (7) 序列编号 19 所示的碱基序列、
     (8) 序列编号 20 所示的碱基序列、
     (9) 序列编号 21 所示的碱基序列、
     (10) 序列编号 22 所示的碱基序列、
     (11) 序列编号 23 所示的碱基序列、
     (12) 序列编号 24 所示的碱基序列、(13) 序列编号 13 所示碱基序列的互补序列、 (14) 序列编号 14 所示碱基序列的互补序列、 (15) 序列编号 15 所示碱基序列的互补序列、 (16) 序列编号 16 所示碱基序列的互补序列、 (17) 序列编号 17 所示碱基序列的互补序列、 (18) 序列编号 18 所示碱基序列的互补序列、 (19) 序列编号 19 所示碱基序列的互补序列、 (20) 序列编号 20 所示碱基序列的互补序列、 (21) 序列编号 21 所示碱基序列的互补序列、 (22) 序列编号 22 所示碱基序列的互补序列、 (23) 序列编号 23 所示碱基序列的互补序列、 以及 (24) 序列编号 24 所示碱基序列的互补序列。附图说明
    图 1 是显示实施例 1 结果的图。未被覆盖的方框显示使用非癌组织的基因组 DNA 测定与甲基化频度有相关关系的指标值的结果， 被覆盖的方框显示使用从 Capan-2( 癌细 胞株 ) 提取的基因组 DNA 测定与甲基化频度有相关关系的指标值的结果。图中， 从左边起 分别是， A 表示利用萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶液 A 检测的结合到目标区域 的甲基胞嘧啶抗体量的值， B 表示萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶液 B 检测的结 合到目标区域的甲基胞嘧啶抗体量的值， C 表示萤光 (612nm) 测定的使用特定寡核苷酸溶 液 C 检测的结合到目标区域的甲基胞嘧啶抗体量的值。 具体实施方式作为 “生物来源标本” ， 例如可以举出细胞溶解液、 组织溶解液 ( 这里的组织是指 包括血液、 淋巴结等广义意思 )， 或就哺乳动物而言， 可以举出血液、 血浆、 血清、 淋巴液等 体液， 体分泌物 ( 尿、 乳汁等 ) 等生物体试样及从这些生物体试样提取得到的基因组 DNA。 另外， 作为其他的生物来源标本， 也可例如微生物、 病毒等来源的试样， 此时， 也可例如微生 物、 病毒的基因组 DNA。 人来源的血液为标本时， 可以期待在健康诊断、 简便的临床检查等中 利用本发明。
     另外， 作为这些生物来源标本所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样， 可列举如用甲基化 敏感性限制酶等处理之后的试样、 用在基因组 DNA 具有的目标 DNA 区域中没有其识别剪切 位点的限制性酶事先消化处理而得的试样、 在含有特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中用甲基 化敏感性限制酶消化处理而得的试样、 事先精制而得的 DNA 试样等。
     为了从哺乳动物来源的标本得到基因组 DNA， 例如使用市售的 DNA 提取用试剂盒 等提取 DNA 即可。在使用血液作为标本的情况下， 按照常用的方法从血液制备血浆或血清， 将所制备的血浆或血清作为标本， 对其中所含的游离 DNA( 包括胃癌细胞等癌细胞来源的 DNA) 进行分析时， 可以避开血细胞来源的 DNA 对胃癌细胞等癌细胞来源的 DNA 进行解析， 可 以使检测胃癌细胞等癌细胞、 含有其的组织等的灵敏度提高。
     通常， 构成基因 ( 基因组 DNA) 的碱基有 4 种。在这些碱基当中， 已知所谓仅是胞
     嘧啶被甲基化的现象， 这样的 DNA 的甲基化修饰限于由 5’ -CG-3’ 表示的碱基序列 (C 表示 胞嘧啶， G 表示鸟嘌呤。以下， 也会将该碱基序列记为 “CpG” ) 中的胞嘧啶。就胞嘧啶而言， 被甲基化的部位是其 5 位。在细胞分裂之前进行 DNA 复制时， 复制后马上成为仅是模板链 的 “CpG” 中的胞嘧啶被甲基化的状态， 在甲基转移酶的作用下立即将新生链的 “CpG” 中的 胞嘧啶也甲基化。因此， DNA 的甲基化后的状态在 DNA 复制后也被直接传给新的 2 组 DNA。 本发明中的 “甲基化后的 DNA” 是指通过这样的甲基化修饰而生成的 DNA。
     已知在各种病患 ( 例如癌 ) 中， 引起 DNA 的甲基化异常， 认为， 通过检测该 DNA 甲基 化异常， 有可能测定各种病患的程度。例如对病患来源的标本中的被 100％甲基化的区域， 实施本发明， 则定量或检测的甲基化 DNA 量增多， 例如病患来源的标本中有未 100％甲基化 的 DNA 区域， 如对该区域实施本发明， 则定量或检测的甲基化 DNA 的量要成为接近几乎为零 的值。另外， 例如， 在正常者的标本中的甲基化比例低， 且在疾患患者的标本中有甲基化比 例高的 DNA 区域， 如对该 DNA 区域实施本发明， 则对于正常者的情况， 定量或检测的甲基化 DNA 的量显示接近零的值， 对于来自疾患患者的情况， 其显示与正常者的值相比有统计学意 义的高值， 因此基于该值的差异， 可以判定 “疾患的程度” 。在此 “疾患的程度” 与一般在该 领域中使用的意思相同， 具体而言， 例如对于标本为细胞时， 是指该细胞的恶性程度， 另外， 例如标本为组织时， 是指该组织中疾患细胞的存在量等。另外， 标本为血浆·血清时， 是指 该个体患有病患的概率。 因此， 通过本发明的实施来考察标本的甲基化异常， 可以诊断各种 疾患。 “目标 DNA 区域” 是要调查该区域中所含的胞嘧啶有无甲基化的 DNA 区域。例如可 以举出含有在赖氨酰氧化酶、 HRAS 样阻抑因子、 bA305P22.2.1、 γ- 细丝蛋白、 HAND1、 RIKEN 2210016F16 的同系物、 FLJ32130、 PPARG 血管生成素相关蛋白、 凝血调节蛋白、 p53- 应答基 因 2、 微纤维蛋白 2、 神经丝蛋白 3、 解聚素及金属蛋白酶结构域 23、 G- 蛋白偶联受体 7、 G- 蛋 白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体、 溶质载体蛋白家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上 腺素成员 2 等有用蛋白质基因的启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基 序列中存在的 CpG 所示碱基序列中的一个以上的胞嘧啶的 DNA 的区域等。除了对这些目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 分别定量或检测之外， 例如， 在一个检测系中， 使用更多的这 些目标 DNA 区域， 可以相应地使其定量精度及检测灵敏度进一步提高。
     具体而言， 例如在有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因的情况下， 作为含有在其 启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基 序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出用序列编号 119 表 示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF270645 记载的碱基序列的碱基编号 16001 ～ 18661 所示的碱基序列 )。就序列编号 119 所示的碱基序列而言， 对人来源的赖氨酰氧化酶 蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2031 ～ 2033 表示， 上述外 显子 1 的碱基序列用碱基编号 1957 ～ 2661 表示， 在序列编号 119 所示的碱基序列中存在 的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 119 所示的碱基序列中在 CpG 密集 存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高 甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的 胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 119 表示的碱基序列中用碱基编号 1539、 1560、 1574、 1600、
     1623、 1635、 1644、 1654、 1661、 1682、 1686、 1696、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795 等 表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 HRAS 样阻抑因子基因的情况下， 作为 含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 HRAS 样阻抑因子基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出用序 列编号 120 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC068162 记载的碱基序列的碱基编 号 172001 ～ 173953 表示的碱基序列 )。就序列编号 120 表示的碱基序列而言， 人来源的 HRAS 样阻抑因子基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1743 ～ 1953 表示。在序列编号 120 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 120 表 示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌 细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胃 癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 120 表示的碱基序列中用碱基编 号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 1405、 1409、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1479、 1483、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520 等所示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 bA305P22.2.1 基因的情况下， 作为含 有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示 的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 bA305P22.2.1 基因的外显子 1 和 位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 121 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AL121673 记载的碱基序列的碱基编号 13001 ～ 13889 表示的碱基序列 )。 就序列编号 121 表示的碱基序列而言， 对人来源的 bA305P22.2.1 蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 849 ～ 851 表示， 上述外显 子 1 的碱基序列用碱基编号 663 ～ 889 表示。在序列编号 121 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 121 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在 的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基 化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧 啶， 例如可以举出序列编号 121 表示的碱基序列中用碱基编号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 γ- 细丝蛋白基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 γ- 细丝蛋白基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 122 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC074373 记载的碱基序列的碱基编号 63528 ～ 64390 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 122 表示的碱基序列而言， 对人来源的 γ- 细丝蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 572 ～ 574 表示， 上述外显子 1 的碱基序列用碱基编号 463 ～ 863 表示。 在序列编号 122 表示的碱基序列中存 在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 122 表示的碱基序列中在 CpG 密 集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即
     高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的 胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 122 表示的碱基序列中用碱基编号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363、 370、 379、 382、 384、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474、 486、 490、 503、 505 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 HAND1 基因的情况下， 作为含有在其启 动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序 列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 HAND1 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的 启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 123 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC026688 记载的碱基序列的碱基编号 24303 ～ 26500 表示的碱 基序列的互补序列 )。 就序列编号 123 表示的碱基序列而言， 对人来源的 HAND1 蛋白质的氨 基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 1656 ～ 1658 表示， 上述外显子 1 的碱 基序列用碱基编号 1400 ～ 2198 表示。在序列编号 123 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表 示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 123 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域 中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如 可以举出序列编号 123 表示的碱基序列中用碱基编号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272、 1292、 1305、 1307、 1316、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434 等表示的胞嘧 啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 RIKEN 2210016F16 基因的同系物 的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列 中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 RIKEN 2210016F16 基因的同系物的外显子 1 和位于其 5’上游的启动子区域的基因组 DNA 的 碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 124 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AL354733 记载的碱基序列的碱基编号 157056 ～ 159000 表示的碱基序列的互补碱基序 列 )。就序列编号 124 表示的碱基序列而言， 人来源的 RIKEN 2210016F16 基因的同系物蛋 白质的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1392 ～ 1945 表示。在序列编号 124 表示的碱基 序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 124 表示的碱基序列中 在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频 度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基 化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 124 表示的碱基序列中用碱基编号 1172、 1175、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1332、 1334、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 FLJ32130 基因的情况下， 作为含有在 其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱 基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 FLJ32130 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 125 表示的碱 基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC002310 记载的碱基序列的碱基编号 1 ～ 2379 表示的 碱基序列的互补碱基序列 )。就序列编号 125 表示的碱基序列而言， 对人来源的 FLJ32130 蛋白质的氨基酸末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2136 ～ 2138 表示， 认为是上述外显子 1 的碱基序列用碱基编号 2136 ～ 2379 表示。在序列编号 125 表示的碱基 序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 125 表示的碱基序列中 在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频 度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基 化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 125 表示的碱基序列中用碱基编号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 1911、 1915、 1925、 1940、 1955、 1968 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 PPARG 血管生成素相关蛋白基因的情 况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在 的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 PPARG 血管生成素 相关蛋白基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体 而言， 可以举出序列编号 126 表示的碱基序列。就序列编号 126 表示的碱基序列而言， 对人 来源的 PPARG 血管生成素相关蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基 编号 717 ～ 719 表示， 上述外显子 1 的 5’ 侧部分的碱基序列用碱基编号 1957 ～ 2661 表 示。在序列编号 126 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是 序列编号 126 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表 示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更 具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 126 表示的碱 基序列中用碱基编号 35、 43、 51、 54、 75、 85、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为凝血调节蛋白基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的凝血调节蛋白基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 127 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF495471 记载的碱基序列的碱基编号 1 ～ 6096 表示的碱基序列 )。 就序列编号 127 表示的碱基序列而言， 对人来源的凝血调节蛋白质的氨 基末端的蛋氨酸进行编码的 ATG 密码子， 用碱基编号 2590 ～ 2592 表示， 上述外显子 1 的碱 基序列用碱基编号 2048 ～ 6096 表示。在序列编号 127 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表 示的碱基序列中的胞嘧啶， 特别是序列编号 127 表示的碱基序列中在 CpG 密集存在的区域 中存在的 CpG 中的胞嘧啶， 例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如 可以举出序列编号 127 表示的碱基序列中用碱基编号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595、 1598、 1601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1724、 1726、 1756 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 p53- 应答基因 2 基因的情况下， 作为含 有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 p53- 应答基因 2 基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列 编号 128 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009471 记载的碱基序列的碱基编号 113501 ～ 116000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 128 表示的碱基序列而言， 人来源的 p53- 应答基因 2 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1558 ～ 1808 表示。 在序列 编号 128 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细 胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 128 表示的碱基序列中 用碱基编号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383 等 表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为微纤维蛋白 2 基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的微纤维蛋白 2 基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 129 表 示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC113387 记载的碱基序列的碱基编号 118801 ～ 121000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 129 表示的碱基序列而言， 人来源的微 纤维蛋白 2 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 1091 ～ 1345 表示。在序列编号 129 表 示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞 中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌 细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 129 表示的碱基序列中用碱基编号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843 等表示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为神经丝蛋白 3 基因的情况下， 作为含有 在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的 碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的神经丝蛋白 3 基因的外显子 1 和位 于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 130 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AF106564 记载的碱基序列的碱基编号 28001 ～ 30000 表示的碱基序列的互补序列 )。就序列编号 130 表示的碱基序列而言， 人来源的神经 丝蛋白 3 基因的外显子 1 的碱基序列用碱基编号 614 ～ 1694 表示。在序列编号 130 表示 的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中 甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌 细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 130 表示的碱基序列中用碱基编号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为解聚素及金属蛋白酶结构域 23 基因的 情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在 的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的解聚素及金属蛋 白酶结构域 23 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 131 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009225 记载的碱基序列的碱基编号 21001 ～ 23300 表示的碱基序列 )。就序列编号 131 表示的 碱基序列而言， 人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域 23 基因的外显子 1 的碱基序列， 用 碱基编号 1194 ～ 1630 表示。在序列编号 131 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的 碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例
     如可以举出序列编号 131 表示的碱基序列中用碱基编号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 1043、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106、 1112、 1120、 1124、 1126 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 G 蛋白偶联受体 7 基因的情况下， 作为 含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表 示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 G 蛋白偶联受体 7 基因的外显 子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列 编号 132 表示的碱基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC009800 记载的碱基序列的碱基编号 75001 ～ 78000 表示的碱基序列 )。就序列编号 132 表示的碱基序列而言， 人来源的 G 蛋白 偶联受体 7 基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 1666 ～ 2652 表示。在序列编号 132 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细 胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺 癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 132 表示的碱基序列中用碱基编 号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620 等表示的胞嘧啶。 另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为 G- 蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样 肽受体基因的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的 碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人来源的 G- 蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区 域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 133 表示的碱基序列 ( 相当于 基因库检索号 No.AC008971 记载的碱基序列的碱基编号 57001 ～ 60000 表示的碱基序列 的互补序列 )。就序列编号 133 表示的碱基序列而言， 人来源的 G- 蛋白偶联生长抑素及血 管紧张素样肽受体基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 776 ～ 2632 表示。在序列编 号 133 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞 等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 133 表示的碱基序列中 用碱基编号 470、 472、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 540、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612 等表示的胞嘧啶。
     另外， 具体而言， 例如在有用蛋白质基因为溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去 甲肾上腺素成员 2 基因的情况下， 作为含有在其启动子区域、 非翻译区域或翻译区域 ( 编码 区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 表示的碱基序列一个以上的碱基序列， 可以举出含有人 来源的溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员 2 基因的外显子 1 和位于其 5’ 上游的启动子区域的基因组 DNA 的碱基序列， 更具体而言， 可以举出序列编号 134 表示的碱 基序列 ( 相当于基因库检索号 No.AC026802 记载的碱基序列的碱基编号 78801 ～ 81000 表 示的碱基序列的互补序列 )。 就序列编号 134 表示的碱基序列而言， 人来源的溶质载体家族 6 神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员 2 基因的外显子 1 的碱基序列， 用碱基编号 1479 ～ 1804 表示。在序列编号 134 表示的碱基序列中存在的用 CpG 表示的碱基序列中的胞嘧啶， 例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高 ( 即高甲基化状态 (hypermethylation))。 进一步更具体而言， 作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶， 例如可以举出序列编号 134
     表示的碱基序列中用碱基编号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184 等表示的胞嘧啶。
     另外， 作为基因组 DNA 中的 “目标 DNA 区域” ， 具体可例举如下述序列编号 1 ～ 12 所示的碱基序列及它们的互补序列， 或者与它们的碱基序列具有 80％以上、 90％以上、 95％ 以上或 98％以上的序列同一性的碱基序列等。
     序列编号 1 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21965410 ～ 21964273 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 2 相当于基因库检索号 No.NT_024524.13 记载的碱基序列的碱基编号 29857545 ～ 29858420 所示的碱基序列。
     序列编号 3 相当于基因库检索号 No.NT_010718.15 记载的碱基序列的碱基编号 7188979 ～ 7189574 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 4 相当于基因库检索号 No.NW_926584.1 记载的碱基序列的碱基编号 7534656 ～ 7535486 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 5 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21984168 ～ 21984790 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 6 相当于基因库检索号 No.NW_924062.1 记载的碱基序列的碱基编号 21818162 ～ 21818836 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 7 相当于基因库检索号 No.NT_008413.17 记载的碱基序列的碱基编号 21998877 ～ 21999061 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 8 相当于基因库检索号 No.NT_023935.17 记载的碱基序列的碱基编号 19277002 ～ 19277451 所示的碱基序列。
     序列编号 9 相当于基因库检索号 No.NW_924484.1 记载的碱基序列的碱基编号 19064265 ～ 19065579 所示的碱基序列。
     序列编号 10 相当于基因库检索号 No.NT_022517.17 记载的碱基序列的碱基编号 50318280 ～ 50318573 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 11 相当于基因库检索号 No.NT_022517.17 记载的碱基序列的碱基编号 61176814 ～ 61177405 所示的碱基序列的互补序列。
     序列编号 12 相当于基因库检索号 No.NT_034772.5 记载的碱基序列的碱基编号 14488398 ～ 14489126 所示的碱基序列。
     作为 “目标 DNA 区域” ( 以下， 也记为目标区域 )， 还可例举如含有在 MLH1、 RUNX3、 CDH1、 TIMP3、 CSPG、 RARβ、 14-3-3σ、 CALCA、 HIC1、 ESR1、 PTEN、 SOCS1、 BLT1、 ESR2、 MTMG、 TWIST、 INK4、 CDKN2、 GSTP、 DCR2、 TP73、 PGR、 HIC2、 MTHFR、 TFF1、 MLLT7、 SLC5A8、 THBS1、 SOCS2、 ACTB、 CDH13、 FGF18、 GSTM3、 HSD17B4、 HSPA2、 PPP1R13B、 PTGS2、 SYK、 TERT、 TITF1、 BRACA1、 AATF、 ABCB1、 ABCC1、 ABI1、 ABL1、 AF1Q、 AF3P21、 AF4、 AF9、 AFF3、 AKAP12、 AKAP9、 ALEX3、 ALK、 ALOX15、 APAF1、 APC、 ARHA、 ARHGAP26、 ARHGEF12、 ARNT、 ATBF1、 ATF1、 ATM、 AXIN2、 BCAS3、 BCAS4、 BCL1、 BCL10、 BCL11A、 BCL11B、 BCL2、 BCL5、 BCL7A、 BCR、 BIRC3、 BMPR1A、 BRCA2、 BRD4、 BRIP1、 BTG1、 BUB1B、 CAGE-1、 CARS、 CASC5、 CCDC6、 CCND2、 CCND3、 CDH11、 CDKN1B、 CDKN2A、 CDX2、 CEP110、 CKN1、 CLP1、 CLTC、 CLTCL1、 CNC、 COL1A1、 COX6C、 CREBBP、 CXXC6、 DAB2IP、 DDIT3、 DDX43、 DIRC1、 DIRC2、 DKK1、 E2F3、 EEN、 EGFR、 ELL、 EPS15、 ERBB2、 ERC1、 ERCC1、 ERCC4、 ERG、ETV1、 ETV6、 EVI1、 EWSR1、 EXT1、 EXT2、 FANCA、 FANCD2、 FANCF、 FAS、 FBP17、 FCRL4、 FEV、 FGFR1、 FHIT、 FLI1、 FOXO3A、 FUS、 FVT1、 GAS7、 GLI1、 GNAS、 GOLGA5、 GOPC、 GRB2、 HCMOGT-1、 HIST1H4I、 HLF、 HMGA2、 HOXA13、 HOXC11、 HOXC13、 HOXD13、 HSPBAP1、 HSPCB、 HSPD1、 HSPH1、 IKZF2、 INTS6、 IRF4、 JAG1、 JAG2、 JAK2、 JARID1A、 JAZF1、 JMJD2C、 JUN、 KIT、 KITLG、 KLF5、 KLF6、 LASP1、 LDB1、 LHFP、 LMO1、 LMO2、 LPHN2、 LPP、 LYL1、 MADH4、 MAF、 MAFB、 MDM2、 MDS2、 MET、 MKL1、 MLF1、 MLH1、 MLL、 MLLT10、 MMP2、 MN1、 MRE11B、 MSF、 MSH2、 MSH6、 MSI2、 MUC1、 MUTYH、 MXI1、 MYC、 MYH9、 MYST3、 NF1、 NFKB1、 NIN、 NKX2-5、 NONO、 NOTCH1、 N-RAS、 NTRK3、 NUMA1、 NUP214、 NUP98、 OLIG2、 P53、 PALB2、 PAX2、 PAX5、 PAX7、 PAX9、 PBX1、 PCM1、 PCSK7、 PDGFB、 PDGFRA、 PDGFRB、 PHOX2B、 PICALM、 PLAG1、 PLCB1、 PLK、 PML、 PMS1、 POLH、 POU5F1P1、 POU6F2、 PPP1R13L、 PRDM16、 PRRX1、 PSIP1、 PTCH、 RABEP1、 RAD51L1、 RAD53、 RANBP17、 RAP1GDS1、 RAP2B、 RARA、 RASSF1、 RB1、 RBL2、 RBM15、 RBM5、 RCHY1、 RECQL、 RECQL5、 RET、 RUNX、 RUNX1T1、 SBDS、 SDHC、 SDHD、 SET、 SHH、 SIL、 SIX1、 SNAI2、 SPI1、 SPINK7、 STARD3、 STAT3、 STK11、 STK4、 SUFU、 SYK、 SYNPO2、 TBX2、 TCF3、 THBS2、 THRAP3、 TMPRSS2、 TNF、 TOP1、 TPM4、 TPR、 TRIM24、 TRIM33、 TRIP11、 TSC1、 TSC2、 TSHR、 TTL、 VAV1、 VHL、 WFDC1、 WT1、 WWOX、 XPC、 ZBTB16、 ZNF146、 ZNF217 等基因的启动子区域、 非翻译区 域或翻译区域 ( 编码区域 ) 的碱基序列中存在的、 用 CpG 所示的碱基序列中的胞嘧啶一个 以上的 DNA 的区域。除了对这些目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 分别定量或检测之外， 例如， 在一个检测系中， 使用更多的这些目标 DNA 区域， 可以相应地使其定量精度及检测灵 敏度进一步提高。
     “目标 DNA 区域” 也可以是在基因组中散在的重复序列。 特别是， 明确了因疾病被甲 基化的重复序列的甲基化程度可以作为疾患的替代标记物利用。例如， 已知在癌中 SINE 和 LINE 的甲基化， 具体而言， 已知 AluJb、 AluJo、 AluSc、 A1uSg、 AluSg/x、 AluSp、 AluSq、 AluSq/ x、 AluSx、 AluY、 FRAM、 FLAM_A、 MIR、 MIRb、 MIR3、 L1Med、 L1M4、 L1M5、 L1MA3、 L1MA7、 L1MA9、 L1MC、 L1MC2、 L1MC4、 L1MC4a、 L1MC5、 L1MDa、 L1MD1、 L1MD2、 L1MEe、 L1ME3A、 L1PA15、 L1PREC2、 L2、 L3、 HAL1 等亚家族。
     基因组中的重复序列一般被分为简单重复序列 ( 被称为串联重复序列或衔接重 复 ) 和散在重复序列。
     简单重复序列的特征是相同序列在相同方向相邻存在， 大致被分为例如， (1)CCA 等较短序列重复的重复序列、 (2) 来自转录因子的重复序列、 (3) 着丝粒、 端粒、 动粒、 核糖 体基团基因之类的一系列的重复序列、 (4) 从 RNA、 蛋白质逆转录的经非活性处理了的假基 因、 (5) 通过基因复制扩增了的基因序列这 5 种。
     首先， 作为由较短碱基序列的重复， 已知 (A)n、 (T)n、 (GA)n、 (CA)n、 (TAA)n、 (GGA) n、 (CAGC)n、 (CATA)n、 (GAAA)n、 (TATG)n、 (TTTG)n、 (TTTA)n、 (TTTC)n、 (TAAA)n、 (TTCA) n、 (TATAA)n、 (TCTCC)n、 (TTTCC)n、 (TTTAA)n、 (TTTTC)n、 (TTTTA)n、 (TTTTG)n、 (CAAAA)n、 (CACCC)n、 (TATATG)n、 (CATATA)n、 (TCTCTG)n、 (AGGGGG)n、 (CCCCCA)n、 (TGGGGG)n(n 表示重 复数 ) 等序列。 接着， 作为来自转录因子的序列， 对于 hAT 组有 MER1-Charlie、 Zaphod， 对于 Tc-1 组有 MER2-Tigger、 Tc-1、 Mariner。作为来自其他基因组上的转录因子的重复序列， 已 知有 Tigger1、 Tigger2a、 Tigger5、 Charlie4a、 Charlie7 等。由于含有这些短碱基序列的 重复序列、 来自转录因子的重复序列一般是短且简单的碱基序列， 因此难以设定本发明方 法的特定寡核苷酸， 如果可以设定能够实施的特定寡核苷酸， 则未必要作为本发明方法的对象排除。另外， 卫星 DNA、 小卫星、 微卫星等是被分类为简单重复序列的重复序列。
     另外， 作为在基因中多拷贝存在的序列， 如果可以对于作为着丝粒中存在的序列 的 ALR6、 作为 snRNA 的 U2、 U6、 之外的如 tRNA、 rRNA 之类的通常已知的在基因组中存在多拷 贝的基因、 除此之外的通过基因重复而在基因组中存在多拷贝的基因等， 设计本发明方法 的特定寡核苷酸， 就可以使检测灵敏度比在一个基因组中检测一个基因有所提高。
     另外， 已知逆转录病毒、 在末端具有 LTR(Long terminal repeat， 长末端重复 ) 的 逆转录转座子、 MaLRs(Mammalian apparentLTR-Retrotransposons) 之类被认为是病毒来 源的内源序列、 来自逆转录病毒的 LTR 也在一个基因组中存在多个。
     例如， 作为逆转录转病毒来源的 LTR， 具体已知有 LTR1、 LTR1B、 LTR5、 LTR7、 LTR8、 LTR16A1、 LTR16A1、 LTR16C、 LTR26、 LTR26E、 MER48、 MLT2CB 等亚家族。另外， 逆转录转座子 来源的 LTR 被分为 ERV、 ERVK、 ERVL 各类， 具体而言， 可例举如 LTR8A、 LTR28、 MER21B、 MER83、 MER31B、 MER49、 MER66B、 HERVH、 ERVL、 LTR16A1、 LTR33A、 LTR50、 LTR52、 MLT2A1、 MLT2E、 MER11C、 MER11C 等亚家族。MaLRs 是指与典型的逆转录转座子同样在其序列的两端含有 LTR、 但在 LTR 中插入的内部序列并不是来源于逆转录病毒的序列的 DNA 因子。例如可例举 如 MLT1A1、 MLT1A2、 MLT1B、 MLT1C、 MLT1D、 MLT1F、 MLT1G、 MLT1H、 MLT1J、 MLT1K、 MLT11、 MLT2CB、 MSTA、 MSTA-int、 MSTB、 THE1A、 THE1B、 THE1B-internal、 THE1 等亚家族。
     散在重复序列的特征是， 不相邻而是散在， 被认为是逆转录转座子来源的。另外， 散在重复序列根据其长度， 被分为 SINE(Short InterspersedRepetitive Element ： 短链散 在重复序列 ) 和 LINE(Long InterspersedElements ： 长链散在重复序列 )。SINE 中大部分 是属于 Alu 家族的序列。Alu 家族的共同特征是具有 7SL RNA 的 3’ 侧的序列或 5’ 侧的序 列， 并且具有在称为 “Left-monomer” 和 “Right-monomer” 的区域插入的富 AT 区域。作为 Alu 家族的亚家族， 可例举如 Alu、 AluJb、 AluJo、 AluSc、 AluSg、 AluSp、 AluSq、 AluSx、 AluY， 以及 FAM(Fossil Alu Monomer) 和具有 FAM 的序列的 FLAM(Free Left Alu Monomer) 和 FRAM(Free Right AluMonomer)。作为 Alu 家族以外的 SINE， 已知有 MIR 和 Ther/MIR3， 作 为亚家族， 分别已知 MIR、 MIR3。另外， 作为包含人以外生物种的 Alu 家族的亚家族， 已知有 B1、 B2、 B4、 PB1、 PB1D 等。作为 LINE， 报道了 LINE1 至 Line23 的亚家族， 已知 LINE-1、 LINE2、 LINE3 在广泛的基因组中存在。另外， 对于 LINE-1， 已知有例如 L1M1、 L1M2、 L1M3、 L1M3d、 L1M4、 L1M4c、 L1MA2、 L1MA7、 L1MA8、 L1MA9、 L1MB1、 L1MB1、 L1MB3、 L1MB4、 L1MB5、 L1MB6、 L1MB7、 L1MCa、 L1MCb、 L1MC2、 L1MC3、 L1MC4、 L1MC4a、 L1MC5、 L1MDa、 L1ME、 L1MEc、 L1MEd、 L1MEg、 L1ME1、 L1ME2、 L1ME3、 L1ME3A、 L1ME3B、 L1ME4a、 L1PB3、 L1P4、 L1PA2、 L1PA3、 L1PA4、 L1PA5、 L1PA6、 L1PA7、 L1PA10、 L1PA12、 L1PA13、 L1PA14、 L1PA16、 L1PB1、 L1PB3、 L1PB4、 L1PREC2、 HAL1 等亚家族， 作为 LINE-2， 已知有 L2、 L2c 等亚家族。
     这样的在基因组中散在的重复序列中， 如果为因疾病被甲基化的， 则可以通过本 发明方法作为疾患的替代标记物， 作为高灵敏度的检测系而利用。
     “定量或检测 DNA” 中的定量是指， 从定量的甲基化 DNA 抗体， 计算标本中的目标 DNA 区域中的甲基化频度或与其具有相关关系的指标值， 表示例如标本为 1mL 血清时， 血清 1mL 中所含目标区域的 DNA 的甲基化频度或与其有相关关系的指标值。
     “定量或检测 DNA” 中的检测是指， 通过是否检测到甲基化 DNA 抗体， 来判断目标 DNA 区域中是否存在被甲基化了的 DNA， 当检测到甲基化 DNA 抗体时， 表示在标本中， 在目标DNA 区域存在被甲基化了的 DNA， 当没有检测到甲基化 DNA 抗体或特定寡核苷酸时， 表示在 标本中， 在目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 的存在量不到检测限。
     第一工序中， 将生物来源标本中所含的具有目标 DNA 区域的基因组 DNA 来源的双 链 DNA 暂时分离成单链状态。具体而言， 例如， 通过向双链 DNA 中添加退火缓冲液而得到混 合物。接着， 将所得混合物在 95℃煮沸约 30 秒， 之后在冰冷水上骤冷数分钟。例如， 血液等 所含游离 DNA 有可能是单链 DNA。因此， 当生物来源标本中所含基因组 DNA 为单链 DNA 时， 没有必要进行该操作。
     第二工序中的 “甲基化 DNA 抗体” 是指将 DNA 中的被甲基化了的碱基作为抗原而 结合的抗体。更优选的是， 为具有识别单链 DNA 中的 5 位被甲基化了的胞嘧啶并结合的性 质的抗体即可， 更具体而言， 也可以是甲基胞嘧啶抗体。另外， 即使是市售的甲基化 DNA 抗 体， 只要是特异性识别本发明记载的甲基化状态的 DNA 并可以特异性结合的抗体即可。甲 基化 DNA 抗体可通过将被甲基化了的碱基、 甲基化 DNA 等作为抗原并利用通常方法而制成。 具体而言， 可以从将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲基胞嘧啶的 DNA 等作为抗原而 制得的抗体， 以对 DNA 中的甲基胞嘧啶的特异性结合为指标进行选择而制得。作为向动物 免疫抗原而得到的抗体， 有免疫精制的抗原后利用 IgG 级分的抗体 ( 多克隆抗体 ) 的方法， 以及利用产生单一克隆的抗体 ( 单克隆抗体 ) 的方法。本发明中， 优选能够特异性识别甲 基化 DNA 或甲基胞嘧啶的抗体， 因此优选利用单克隆抗体。
     作为制造单克隆抗体的方法， 可例举如细胞融合法。 例如， 细胞融合法是使免疫小 鼠来源的脾细胞 (B 细胞 ) 与骨髓瘤细胞细胞融合， 制造杂交瘤， 选择杂交瘤产生的抗体， 可 以制造甲基胞嘧啶抗体 ( 单克隆抗体 )。 利用细胞融合法制造单克隆抗体时， 没有必要精制 抗原， 例如可以将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲基胞嘧啶的 DNA 等的混合物作 为抗原， 投与免疫用的动物。作为给药方法， 为将含有 5- 甲基胞苷、 5- 甲基胞嘧啶或 5- 甲 基胞嘧啶的 DNA 等直接给予产生抗体的小鼠。当抗体难以产生时， 也可以使抗原结合到支 撑体来免疫。另外， 通过将佐剂溶液 ( 例如混合液体石蜡和 Aracel A， 并混合结核菌的死 菌作为佐剂得到的溶液 ) 和抗原充分混合， 掺入脂质体使其免疫， 由此可以提高抗原的免 疫性。 或者， 有如下的方法 ： 等量添加含有抗原的溶液和佐剂溶液， 充分成为乳液状之后， 向 小鼠的皮下或腹腔内注射的方法 ； 在与明矾水充分混合之后， 以百日咳死菌为佐剂并添加 的方法。 另外， 也可以在最初的免疫之后经过合适的期间后， 对小鼠的腹腔内或静胍内追加 免疫。另外， 在抗原量少的情况下， 可以将抗原悬浮的溶液直接注入小鼠脾脏进行免疫。自 最终免疫起数日后摘除脾脏并剥离脂肪组织之后， 制作脾细胞悬浮液。使该脾细胞和例如 HGPRT 缺失骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤。 作为细胞融合剂， 只要是可以将脾细胞 (B 细胞 ) 和骨髓瘤细胞有效融合的方法即可， 例如可以举出使用仙台病毒 (HVJ)、 聚乙二醇 (PEG) 的方法等。 另外， 可以利用使用高电压脉冲的方法进行细胞融合。 在细胞融合操作之 后， 用 HAT 培养基进行培养， 选择脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤的克隆， 等待细胞发 育直到可以筛选。就用于选择生产目标抗体的杂交瘤的抗体的检测法、 抗体效价的测定法 而言， 可以利用抗原抗体反应体系。具体而言， 在针对可溶性抗原的抗体测定法中， 可以举 出放射性同位素免疫定量法 (RIA)、 酶免疫定量法 (ELISA) 等。 考虑到甲基化 DNA 抗体的性 质 ( 在 1 个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 结合 1 个抗体 )， 作为目标 DNA 区域， 优选选择多 个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 )， 即存在 CpG 的区域， 可以提高定量精度及检测灵敏度。“特定寡核苷酸” 是指， 具有可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 碱基配对的碱基 序列、 且当与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 碱基配对时， 不抑制甲基化 DNA 抗体与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 中的被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 结合的寡核苷酸。即， 是不抑制单链 DNA 中的目标 DNA 区域中的被甲基化了的碱基与甲基化 DNA 抗体相结合的寡核苷酸。更具 体而言是指， 例如是不抑制目标 DNA 区域中的甲基胞嘧啶与甲基胞嘧啶抗体之间结合的寡 核苷酸， 并且是通过互补性可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的寡核苷酸。
     “可以与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的碱基序列” 是指形成与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 的结合体 ( 双链 ) 而必要的碱基序列， 即含有与目标 DNA 区域的碱基序列 的一部分相互补的碱基序列的碱基序列、 或含有对与目标 DNA 区域的 5’ 末端相比更靠近 5’ 末端侧 DNA 区域的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列、 或含有对与目标 DNA 区域的 3’ 末端相比更靠近 3’ 末端侧的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列。 另外， “不抑制甲基化 DNA 抗体对含有目标 DNA 区域的单链 DNA 中的被甲基化了的碱基 ( 胞 嘧啶 ) 的结合” 是指特定寡核苷酸的碱基序列为如下的碱基序列， 即， 特定寡核苷酸与上述 单链 DNA 的互补结合， 不在甲基化 DNA 抗体与被甲基化了的单链 DNA 结合而需要的占有空 间内发生的碱基序列。即， 认为甲基化 DNA 抗体与被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 的结合中， 不仅占用了直接结合的被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 )， 而且也占用了被甲基化了的碱基 ( 胞 嘧啶 ) 存在的周边空间。因此， 特定寡核苷酸只要是在甲基化 DNA 抗体与甲基化 DNA 结合 时需要的占有空间中不与上述单链 DNA 互补结合的寡核苷酸即可。
     本发明中， 使用至少一个以上的特定寡核苷酸， 可以同时检测至少一个以上的目 标 DNA 区域。即， 与上述单链 DNA 结合的特定寡核苷酸没有必要是 1 种， 只要是不抑制甲基 化 DNA 抗体的结合， 也可以使用 2 种以上。如使用多个特定寡核苷酸， 可以提高定量精度及 检测灵敏度。另外， 通过同时检测多个的目标区域， 可以增加作为测定对象的甲基化 DNA 的 量。
     另外， “特定寡核苷酸” 具体可例举如序列编号 13 ～ 24 中任一项所示的碱基序列 及其互补序列， 或者也可以例举与这些碱基序列有 80％以上、 90％以上、 95％以上或 98％ 以上的序列同一性的碱基序列等。
     第二工序中， 作为使单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸的复合体形成时 的优选方式， 可例举如在含有二价阳离子的反应系中形成。 更优选例如， 二价阳离子为镁离 子。在此， “含有二价阳离子的反应系” 是指， 在用于使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与特 定寡核苷酸结合的退火缓冲液中含有二价阳离子之类的反应系， 具体例如， 可以是以直到 1mM ～ 600mM 的浓度， 含有形成镁离子的盐 ( 例如， MgOAc2、 MgCl2 等 ) 的反应系。
     另外， 在第二工序中， 作为形成单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体与特定寡核苷酸的复合 体时的优选方式， 可例举如添加反向寡核苷酸 (counteroligonucleotide) 等。反向寡核苷 酸是将与目标 DNA 区域相同的碱基序列分割成短的寡核苷酸后得到的核苷酸。通常设计成 10 ～ 100 个碱基、 更优选 20 ～ 50 个碱基的长度。另外， 反向寡核苷酸未设计在特定寡核苷 酸与目标区域相结合的碱基序列上。反向寡核苷酸与基因组 DNA 相比， 大量过剩添加， 目的 在于， 在使目标 DNA 区域成为单链 ( 正链 ) 之后， 在使其与特定寡核苷酸 ( 负链 ) 结合时， 防止目标 DNA 区域的互补链 ( 负链 ) 和目标 DNA 区域的单链 ( 正链 ) 通过互补性再结合。 这是因为， 在使目标 DNA 区域与甲基化 DNA 抗体结合， 测定 DNA 的甲基化频度或与其有相关关系的指标值时， 目标区域为单链时更容易与甲基化 DNA 抗体结合。另外， 反向寡核苷酸与 目标 DNA 区域相比， 优选添加至少 10 倍、 通常为 100 倍以上的量。
     “形成复合体” 是指， 含有甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸与 甲基化 DNA 抗体结合状态的混合物。本发明中， 优选直到后述的第三工序， 通过将该复合体 中的甲基化 DNA 抗体或特定寡核苷酸结合到支撑体从而使该复合体固定到支撑体。
     作为 “支撑体” ， 只要是复合体可以结合的支撑体， 则可以是任何的材质和形状。 例如， 形状合适使用目的即可， 可例举如管状、 试验板状、 过滤器状、 盘状、 珠状等。另外， 作 为材质， 可以使用通常的免疫测定法用支撑体， 可例举如聚苯乙烯、 聚丙烯、 聚丙烯酰胺、 聚 甲基丙烯酸甲酯、 聚砜、 聚丙烯腈、 尼龙等合成树脂， 或者向上述合成树脂中加入磺基、 氨基 等反应性官能基后的材质。另外， 也可以是玻璃、 多糖类或其衍生物 ( 纤维素、 硝基纤维素 等 )、 硅胶、 多孔陶瓷、 金属氧化物等。
     作为使复合体结合到支撑体进行固定的方法， 可例举如将特定寡核苷酸固定化到 支撑体的方法。另外， 由于将含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 通过特定寡核苷 酸结合到支撑体， 因此通过其识别功能 ( 后述 ) 来定量或检测甲基化 DNA 抗体。
     为了使特定寡核苷酸可以在支撑体上固定化， 特定寡核苷酸是最终以形成与含有 被甲基化了的有目标 DNA 区域的单链 DNA 与甲基化 DNA 抗体的复合体的状态， 在支撑体上 固定化即可。 (1) 也可以在上述单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合前的阶段， 将特定寡核苷酸固 定化到支撑体， 或者，
     (2) 也可以在上述单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合后的阶段， 将特定寡核苷酸固 定化到支撑体。
     为了使特定寡核苷酸固定化到支撑体， 具体而言， 可例举如将特定寡核苷酸的 5’ 末端或 3’ 末端生物素化而得的生物素化寡核苷酸固定到被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体 ( 例如， 被抗生蛋白链菌素覆盖的 PCR 管、 被抗生蛋白链菌素覆盖的磁珠、 被抗生蛋白链菌 素部分覆盖的色谱条等 ) 的方法。
     另外， 还有如下的方法， 即在使特定寡核苷酸的 5’ 末端或 3’ 末端与具有氨基、 硫 醇基、 醛基等活性官能团的分子共价结合之后， 使其与表面被硅烷偶联剂等活化后的玻璃、 多糖类衍生物、 硅胶、 或上述合成樹脂等、 或耐热性塑料制的支撑体共价结合的方法。 另外， 共价结合例如可以举出通过将 5 个甘油三酯串联连结而成的间隔区、 交联剂等使其共价结 合。另外， 还可以举出在玻璃或硅制支撑体上直接从特定寡核苷酸的末端侧开始化学合成 的方法。
     另外， 具体例如， 作为具有可以固定到支撑体的特征的特定寡核苷酸， 使用末端被 生物素标记了的 “生物素化特定寡核苷酸” ， 如下进行实施即可。
     (a) 向生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样中， 添加退火缓冲液 ( 例 如， 33mM Tris- 乙酸盐 pH 7.9、 66mM KOAc、 10mMMgOAc2、 0.5mM 二硫苏糖醇 ) 以及生物素化 特定寡核苷酸， 从而得到混合物。接着， 为了使生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的双链 DNA 成为单链 DNA， 将所得混合物在 95℃加热例如数分钟。之后， 为了形成含有目标 DNA 区 域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体， 将其迅速冷却至较生物素化特定寡核苷 酸的 Tm 值低约 10 ～ 20℃的温度， 在该温度下保温例如数分钟， 之后， 返回至室温 ( 在该阶
     段形成的结合体， 除了含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合 体之外， 还包括含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。
     (b) 向被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体， 添加上述 (a) 所得的混合物， 再将其在 37℃保温例如数分钟， 从而将含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结 合体固定到被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体。之后， 进行残留液的除去和清洗。将清洗 缓冲液 ( 例如， 含有 0.05％ Tween20 的磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaClpH7.4)) 以例如 300μL/ 孔的比例添加， 除去溶液。将该清洗操作重复数次， 将固定化 至支撑体的生物素化特定寡核苷酸与含有目标 DNA 区域的单链 DNA 的结合体残留到孔上 ( 即使在该阶段， 结合体除了包括被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的 结合体之外， 还包括含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合 体 )。
     (c) 将甲基化 DNA 抗体以适当量 ( 例如， 将 4μg/mL 溶液以 100μL/ 孔的量 ) 添 加到孔中， 之后， 在室温下静置例如约 3 小时， 促进甲基化 DNA 抗体与上述单链 DNA 中含 有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的复合体的形成 ( 复 合体的形成 )( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸 的结合体没有形成复合体 )。之后， 进行残留溶液的除去和清洗。将清洗缓冲液 ( 例如， 0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mMNa2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)) 以例 如 300μL/ 孔的比例添加， 除去溶液。将该清洗操作重复数次， 将复合体残留到孔上 ( 复合 体的选择 )。
     作为在 (a) 中使用的退火缓冲液， 只要是适合使特定寡核苷酸与生物试样来源的 含有目标 DNA 区域的单链 DNA 结合的即可， 不限定为上述退火缓冲液。如果使用溶解有二 价离子优选以 1 ～ 600mM 浓度的镁离子的退火缓冲液， 则可以增加结合的稳定性。
     (b) 及 (c) 中的清洗操作可以将在溶液中浮游的未被固定化的甲基化 DNA 抗体、 没 有与甲基化 DNA 抗体结合的在溶液中浮游的单链 DNA、 或者被后述限制性酶消化的在溶液 中浮游的 DNA 等从反应溶液中除去， 因此是重要的。另外， 清洗缓冲液只要是适合上述游离 的甲基化 DNA 抗体、 在溶液中浮游的单链 DNA 等的除去即可， 不限于上述清洗缓冲液， 也可 以是 DELFIA 缓冲液 (PerkinElmer 社制、 Tris-HCl pH 7.8 的 Tween80)、 TE 缓冲液等。
     另外， 如上所述， 上述 (a) ～ (c) 中， 上述的含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素 化特定寡核苷酸的结合， 是在生物素化特定寡核苷酸与被抗生蛋白链菌素覆盖的支撑体的 固定之前的阶段实施的， 但其顺序哪个在前均可。即， 例如， 通过向在被抗生蛋白链菌素覆 盖的支撑体上固定化了生物素化特定寡核苷酸中， 添加生物来源标本中含有的基因组 DNA 来源的 DNA 试样， 从而得到混合物。为了使生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目 标 DNA 区域的双链 DNA 成为单链， 将得到的混合物在 95℃加热例如数分钟， 之后为了形成与 生物素化特定寡核苷酸的结合体， 迅速冷却至较生物素化特定寡核苷酸的 Tm 值低约 10 ～ 20℃的温度， 将该温度保持例如数分钟 ( 在该阶段形成的结合体除了含有被甲基化了的目 标 DNA 区域的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区域以外的被甲基化 了的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体 )。之后， 也可以实施 (c) 的操作， 形成、 选择复合体 ( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形 成复合体 )。可以使用色谱条来实施上述 (a) ～ (c) 的操作。 该情况下， 具体可如下实施。 利用 被抗生蛋白链菌素部分覆盖的色谱条， 将使生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目 标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成的溶液展开。通过该操作， 生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核 苷酸的结合体被固定化到被抗生蛋白链菌素覆盖的部分 ( 在该阶段形成的接合体， 除了含 有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 和甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区 域以外的被甲基化了的单链 DNA 与甲基化抗体的结合体 )。 接着， 利用上述色谱条将适量的 甲基化 DNA 抗体展开。通过这些操作， 包括生物来源标本中所含基因组 DNA 具有的含有被 甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与甲基化 DNA 抗体的复合体 被固定化到被抗生蛋白链菌素覆盖的部分 ( 复合体的形成· 选择 )( 在该阶段， 含有没有被 甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。对于这些 操作， 复合体形成的顺序哪个在前均可。例如， 也可以是， 使含有被甲基化了的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与甲基化 DNA 抗体的复合体形成之后， 将其用色谱 条展开， 在被抗生蛋白链菌素覆盖的部分， 将该复合体固定化。在这些操作中， 通过利用色 谱条将溶液展开， 可以除去不需要的成分， 可以省略清洗操作。当然， 也可以在各操作间实 施清洗操作 ( 清洗缓冲液 ( 例如， 利用含有 0.05％ Tween20 的磷酸缓冲液 (1mMKH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 的色谱条的展开 )。
     第三工序中的 “识别功能” 是指用于检测或定量的基于识别的功能， 具体而言， 对 于甲基化 DNA 抗体的情况， 为进行了铕标记、 胶体金标记、 乳胶微球标记、 放射性同位素标 记、 荧光物质 (FITC 等 ) 标记、 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记、 碱性磷酸酯标记、 生物素标记等 的甲基化 DNA 抗体的这些标记的荧光·发色等功能， 另外， 作为该功能， 也可例举如抗体自 身与二次抗体结合的性质等。作为这些功能的定量或检测手段， 可例举如例如放射线检测 器、 分光光度计等的测定或目视等。
     对于甲基化 DNA 抗体的情况， 如上所述， 抗体自身与二次抗体结合的性质被认为 是功能。 即， 即使抗体自身没有被标记， 而是使用附加有可以定量或检测的识别功能的二次 抗体， 也可以间接定量或检测甲基化 DNA 抗体。
     对甲基化 DNA 抗体通过其识别功能进行定量或检测时， 具体而言， 例如， 将抗体自 身的特性作为功能使用时， 进行以下操作即可。向复合体中添加对甲基化 DNA 抗体的二次 抗体 ( 例如， Eu-N1 标记小鼠 IgG 抗体 ： PerkinElmer 社制 )， 在室温下静置约 1 小时， 促进二 次抗体对复合体的结合， 之后， 添加·混合促进溶液 (Enhancement Solution， PerkinElmer 社制 )， 例如在室温静置约 45 分钟。之后， 利用荧光检测器测定荧光 ( 激发 340nm/ 萤光 612nm)， 将甲基化 DNA 抗体定量或检测。作为二次抗体使用使 FITC 结合的抗体时， 也可以 通过公知的方法， 测定 FITC 的萤光， 定量或检测甲基化 DNA 抗体。另外， 例如， 在特定寡核 苷酸的固定化中没有利用生物素时， 可以用于定量或检测生物素化甲基化 DNA 抗体。定量 或检测生物素化甲基化 DNA 抗体时， 例如， 向生物素化甲基化 DNA 抗体添加· 混合 HRP 标记 抗生蛋白链菌素， 形成生物素化甲基化 DNA 抗体与 HRP 标记抗生蛋白链菌素的结合体， 通过 公知的方法测定 HRP 的活性， 从而可以对生物素化甲基化 DNA 抗体进行定量或检测。
     本发明包括以下变更方法 ： 在第一工序后至第三工序， 追加利用可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶将未被甲基化的单链 DNA 消化的工序的变更方法 ( 变更方法1) ； 以及， 在本发明的第一工序后至第三工序， 追加在含具有甲基化敏感性限制酶的识别序 列作为其一部分的特定掩蔽用寡核苷酸的反应系中， 利用该甲基化敏感性限制酶将未被甲 基化的单链 DNA 消化的工序的变更方法 ( 变更方法 2)。
     该变更方法 ( 变更方法 1 及变更方法 2) 中的 “甲基化敏感性限制酶” 是指， 例如， 可以不消化含有被甲基化了的胞嘧啶的识别序列、 而仅消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识 别序列的限制性酶等。即， 对于甲基化敏感性限制酶本来可以识别的识别序列中所含胞嘧 啶为被甲基化了的 DNA 的情况， 即使使该甲基化敏感性限制酶作用该 DNA， 该 DNA 也不被剪 切。与此相对， 对于甲基化敏感性限制酶本来可以识别的识别序列中所含胞嘧啶没有被甲 基化的 DNA 的情况， 如使该甲基化敏感性限制酶作用该 DNA， 则该 DNA 被剪切。作为该甲 基化敏感性酶的具体示例， 例如可例举如 HpaII、 BstUI、 NarI、 SacII、 HhaI 等。另外， 上述 甲基化敏感性限制酶不切断半甲基状态的双链 DNA( 一侧的链的胞嘧啶 (CpG) 被甲基化， 另一侧链的互补的胞嘧啶 (CpG) 没有被甲基化的双链 DNA)， 这些被 Gruenbaum 等人明确了 (NucleicAcidResearch， 9、 2509-2515)。
     另外， “可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶” 是指， 例如， 可以不消化单链 DNA 中的含有被甲基化了胞嘧啶的识别序列、 而仅消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序 列的限制性酶等。 即， 甲基化敏感性限制酶中也有可以消化单链 DNA 的。 可例举如 HhaI 等。
     作为利用甲基化敏感性限制酶的消化处理的令人担心之处， 可以举出对无法完全 消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序列 ( 所谓 “剩余未切的 DNA” ) 的担心。在这样的担 心成为问题的情况下， 只要大量存在甲基化敏感性限制酶的识别位点， 可以将 “剩余未切的 DNA” 抑制在最小限， 作为目标 DNA 区域， 具有一个以上的甲基化敏感性限制酶的识别位点， 认为其识别位点越多越好。
     如上所述， 作为目标 DNA 区域， 考虑到甲基化 DNA 抗体的性质 (1 个抗体结合到 1 个被甲基化了碱基 ( 胞嘧啶 ))， 优选选择存在多个被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶、 CpG) 的区 域作为目标 DNA 区域， 另外， 从将 “剩余未切的 DNA” 抑制在最小限的观点来看， 优选选择存 在多个甲基化敏感性限制酶的识别位点的区域。
     变更方法 2 中的 “特定掩蔽用寡核苷酸” 是指具有甲基化敏感性限制酶的识别序 列作为其一部分的寡核苷酸。具体而言是如下的寡核苷酸， 即， 与单链 DNA 中的目标 DNA 区 域中所含的多个位置的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中的 1 个位置的特定位置 ( 根据 目标区域的碱基序列的不同， 也包括在下述的 8 ～ 30 碱基长度中， 同时含有 1 个位置以上 的情况 ) 互补结合， 形成双链 DNA( 即， 上述位置成为双链 DNA 状态 )， 即便是仅以双链 DNA 为 基质的甲基化敏感性限制酶也可以将上述位置消化， 另外， 可以提高利用能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶 ( 能够消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶也能够消化双链 DNA， 就 其消化效率而言， 针对双链 DNA 的消化效率高于针对单链 DNA 的消化效率 ) 的上述位置的 消化效率， 并且， 是不会抑制含有目标区域的 DNA 的单链 DNA 和特定寡核苷酸的结合体的形 成的寡核苷酸。
     作为特定掩蔽用寡核苷酸， 更具体而言， 可例举如下的寡核苷酸， 即， 具有对于单 链 DNA 中的目的 DNA 区域所含的包括多个位置的甲基化敏感性限制酶的识别序列中的 1 个 位置的特定位置 ( 根据目标区域的碱基序列的不同， 也有在下述的 8 ～ 30 碱基长度中同时 含有 1 个位置以上的情况 ) 的 8 ～ 30 碱基长度的碱基序列有互补性的碱基序列、 且不抑制包括目标区域的 DNA 的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体的形成的寡核苷酸。
     混合到基因组 DNA 来源的 DNA 试样的特定掩蔽用寡核苷酸可以是 1 种也可以是多 种。如使用多种， 则包括目标区域 DNA 的单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶的识别位点的多 个成为双链 DNA 状态， 可以将甲基化敏感性限制酶的上述 “剩余未切 DNA” 抑制到最小限。 由于在特定掩蔽用寡核苷酸形成双链 DNA 的位置不能结合甲基化 DNA 抗体， 因此不优选对 于过多的甲基化敏感性限制酶使用特定掩蔽用寡核苷酸， 而是优选使用适合的种类。 如果， 对于目标 DNA 区域所含所有的甲基化敏感性限制酶识别位点使用特定掩蔽用寡核苷酸， 则 会阻碍该识别位点中被甲基化了的碱基 ( 胞嘧啶 ) 与甲基化 DNA 抗体的结合， 具有被甲基 化了的目标 DNA 区域的复合体的形成可能性会降低 ( 在该识别位点以外的 CpG， 当然结合有 甲基化 DNA 抗体， 在定量或检测甲基化 DNA 抗体时， 其定量精度及检测灵敏度降低 )。特定 掩蔽用寡核苷酸用于对以下位置的设计特别有用， 即， 例如， 在目标 DNA 区域所含多个位置 的甲基化敏感性限制酶的识别序列中， 必须甲基化的情况不被消化、 没有被甲基化的情况 要消化的位置 ( 例如， 在疾患患者标本中， 被 100％甲基化， 在健常者标本中没有被 100％甲 基化的位置等 )。
     该变更方法 ( 变更方法 1 及变更方法 2) 中， 通过在第一工序后至第三工序开始 前， 实施利用至少 1 种的甲基化敏感性限制酶进行消化的工序， 可以将具有没有被甲基化 的目标 DNA 区域的复合体的形成抑制到最小限 ( 排除 )， 可以提高目标 DNA 区域中被甲基化 了的 DNA 的定量精度及检测灵敏度。
     变更方法 1 中， 在第一工序结束后至第三工序开始前实施的， 使用可以消化单链 DNA 的至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶对第一工序所得的单链 DNA 进行消化处理的 操作， 具体例如可如下实施。向第一工序所得的含有单链 DNA 的标本液 10μL 中加入最适 的 10× 缓冲液 3μL、 可以消化单链的甲基化敏感性酶 (HhaI)15U， 另外， 根据需要适量加 入 BSA 等， 接着， 向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 30μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚。这样， 目标 DNA 区域内的没有被甲基化的 HhaI 识别位点被消化 ( 处理溶液 )。例如， 在复合体形成前实施本操作时， 由于在复合体形成、 及 ( 或 ) 选择时实施清洗操作， 因此将 上述处理溶液直接用于复合体形成即可。 另外， 在复合体选择后实施本操作时， 由于需要从 处理溶液中除去在处理溶液中存在的浮游的单链 DNA( 该甲基化敏感性限制酶的识别位点 没有被甲基化， 因此被消化生成的单链 DNA)， 因此必须在本操作结束之后， 再次实施与在复 合体形成及 ( 或 ) 选择时实施的清洗操作同样的清洗操作。
     变更方法 2 中， 在第一工序结束后至第三工序开始前实施的、 向第一工序所得的 单链 DNA 中添加至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶及具有该甲基化敏感性限制酶的识别 序列作为其一部分的特定掩蔽用寡核苷酸而进行消化处理的操作， 具体例如可如下实施。 向第一工序所得的含有单链 DNA 的标本液 10μL 中， 加入最适的 10× 缓冲液 3μL、 甲基化 敏感性酶 (HhaI、 HhaI 等 )15U、 与上述甲基化敏感性酶的识别序列中的 1 个位置的特定位 置相对的特定掩蔽用寡核苷酸约 10pmol， 另外， 根据需要适量添加 BSA 等， 接着， 向该混合 物中添加灭菌超纯水使液量为 30μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚。这样， 目标 DNA 区域 内的没有被甲基化的该箇所被消化 ( 处理溶液 )。例如， 在复合体形成前实施本操作时， 由 于在复合体形成、 及 ( 或 ) 选择时实施清洗操作， 因此将上述处理溶液直接用于复合体形成 即可。 另外， 在复合体选择后实施本操作时， 由于需要从处理溶液中除去在处理溶液中存在的浮游的单链 DNA( 该甲基化敏感性限制酶的识别位点没有被甲基化， 因此被消化生成的 单链 DNA)， 因此必须在本操作结束之后， 再次实施与在复合体形成及 ( 或 ) 选择时实施的清 洗操作同样的清洗操作。
     另外， 作为 “生物来源标本中所含的基因组 DNA 来源的 DNA 试样” 的优选方式之一， 可举出预先用不将该基因组 DNA 所具有的目标 DNA 区域作为识别切断位点的限制酶实施消 化处理而成的 DNA 试样。在使生物来源标本中所含的包括基因组 DNA 具有的目标区域 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体形成的情况下， 对于该单链 DNA， 不仅被认为如含 有目标 DNA 区域则短的更容易形成复合体， 而且操作性也好。减短单链 DNA 中， 在原始基因 组 DNA 时事先减短是有效的。 因此， 也可以将不以目标 DNA 区域为识别剪切位点的限制性酶 直接用于生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样而实施消化处理。另外， 作为利 用不以目标 DNA 区域为识别剪切位点的限制性酶进行消化处理的方法， 使用一般的限制性 酶处理法即可。另外， 标本为事先精制而成的 DNA 试样时， 使用一般使用的量的限制性酶进 行实施即可， 标本为组织溶解液、 细胞溶解液等时， 使用大量过剩的限制酶、 例如相当于 DNA 量为 500 倍量或其以上的限制酶实施即可。
     另外， 作为 “生物来源标本中所含基因组 DNA 来源的 DNA 试样” 的优选方式之一， 可例举如用至少 1 种以上的甲基化敏感性限制酶消化处理而成的 DNA 试样。通过将生物来 源标本本身用甲基化敏感性限制酶消化处理， 可以在最终工序中精度良好地定量或检测甲 基化。该方法对于消除如上所述的 “剩余未切的 DNA” 是有用的。作为将标本本身用甲基 化敏感性限制酶消化的方法， 对于标本中基因组 DNA 以双链 DNA 存在的情况， 使用甲基化敏 感性限制酶， 实施一般的限制性酶处理即可。另外， 对于标本中基因组 DNA 以单链 DNA 存在 的情况， 或者标本中基因组 DNA 以双链 DNA 和单链 DNA 混在的情况， 利用依据变更方法 1 及 变更方法 2 的方法来实施处理即可。具体而言， 例如如下的方法 ： 向标本液 10μL 中加入最 适的 10× 缓冲液 5μL、 可以消化单链 DNA 的甲基化敏感性限制酶 (HhaI)15U， 另外根据需 要适量添加 BSA 等， 再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 50μL， 在 37℃孵育例如 1 小 时～ 1 晚等的方法 ； 或者， 向标本 10μL 中添加最适的 10× 缓冲液 5μL、 甲基化敏感性限制 酶 (HpaII、 HhaI 等 )15U、 与上述甲基化敏感性酶的识别序列中 1 个位置的特定位置相对的 特定掩蔽用寡核苷酸约 15pmol， 另外还根据需要适量添加 BSA 等， 接着， 向该混合物中添加 灭菌超纯水使液量为 50μL， 在 37℃孵育例如 1 小时～ 1 晚等的方法等。另外， 标本是事先 精制而成的 DNA 试样时， 使用一般使用的量的限制性酶实施处理即可， 标本为组织溶解液、 例如相当于 DNA 量为 500 倍量或其 细胞溶解液等时， 使用大量过剩的甲基化敏感性限制酶、 以上的甲基化敏感性限制酶实施处理即可。
     作为对血液、 尿等生物体试样中所含微量物质进行定量或检测的方法， 广泛使用 免疫学的测定方法。 在该方法中， 使用色谱仪的所谓免疫色谱法操作简单、 检测需要的时间 也短， 因此目前在很多场合例如医院的临床检查、 研究室中的鉴定试验等广泛使用。另外， 近年， 将标记了的 DNA( 基因 ) 在色谱条上展开， 使用可以捕获目的 DNA( 基因 ) 的探针进行 杂交， 从而检查目的 DNA( 基因 ) 的所谓杂交色谱法逐渐被使用。该方法也是操作简单， 检 测需要的时间也短， 因此目前开始在医院的临床检查、 研究室中的鉴定试验等广泛使用。 本 发明在概念上可以形成一种混合了上述免疫色谱法与杂交色谱法的方法。本发明中， 对于 复合体形成及复合体的选择， 其顺序没有特别限定， 因此可以使用各种方法。 具体例如可如下实施。 方法 1 ： 向第一工序结束后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸， 使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成 ( 在该阶段形成的结合体除了包括 含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有没 有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )， 接着， 添加具有功能的 甲基化抗体， 使含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具 有功能的甲基化 DNA 抗体结合的复合体形成 ( 在该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。如将所得的试样滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述复合体通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素 覆盖了的部分捕获。之后， 对形成所得复合体的甲基化 DNA 抗体通过其功能进行定量或检 测， 可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     方法 2 ： 向第一工序结束后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸， 使含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸的结合体形成 ( 在该阶段形成的结合体除了包 括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有 未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。如将所得的试样滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述结合体通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白 链菌素覆盖了的部分捕获 ( 在该阶段， 结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的 单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之外， 还包括含有未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。之后， 如将具有功能的甲基化抗体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移 动到展开部， 与结合体的被甲基化了而得胞嘧啶结合， 形成结合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具有功能的甲基化 DNA 抗体的复合体 ( 在 该阶段， 含有没有被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成 复合体 )。 通过对获得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行定量或检测， 可以对 目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     方法 3 ： 如将生物素化特定寡核苷酸滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述寡核苷 酸通过毛细管现象移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素覆盖了的部分捕获。 接着， 如将 第一工序结束后的试样滴到 ( 导入 ) 到导入部， 则移动到展开部， 以含有目标 DNA 区域的单 链 DNA 在已经被捕获的生物素化特定寡核苷酸形成结合体的形式被捕获 ( 在该阶段形成的 结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体之 外， 也包括含有未被甲基化的目标 DNA 区域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体 )。之后， 如将具有功能的甲基化抗体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移动到展开部， 与结合体的被甲基化了 的胞嘧啶结合， 形成结合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡 核苷酸与具有功能的甲基化 DNA 抗体的复合体 ( 在该阶段， 含有未被甲基化的目标 DNA 区 域的单链 DNA 与特定寡核苷酸的结合体没有形成复合体 )。对所得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行定量或检测， 从而可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定 量或检测。
     方法 4 ： 如将生物素化特定寡核苷酸滴到 ( 导入 ) 色谱条的导入部， 则上述寡核 苷酸利用毛细管现象被移动到展开部， 被事先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕获。向第一 工序结束后的试样中加入具有功能的甲基化 DNA 抗体， 形成具有被甲基化了的胞嘧啶单链
     DNA( 其中， 存在含有目标 DNA 区域的单链 DNA 与目的以外的单链 DNA) 与具有功能的甲基化 DNA 抗体的结合体 ( 在该阶段形成的结合体除了包括含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单 链 DNA 与甲基化抗体的结合体之外， 还包括目标 DNA 区域以外的被甲基化了的单链 DNA 与 甲基化抗体的结合体 )。如将所得的结合体滴到 ( 导入 ) 导入部， 则移动到展开部， 含有被 甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与已经被捕获的生物素化特定寡核苷酸结合， 形成结 合有含有被甲基化了的目标 DNA 区域的单链 DNA 与生物素化特定寡核苷酸与具有功能的甲 基化 DNA 抗体的复合体 ( 在该阶段， 目标 DNA 区域以外的被甲基化了的单链 DNA 与甲基化 抗体的结合体没有形成复合体 )。对所得的形成复合体的甲基化 DNA 抗体利用其功能进行 定量或检测， 从而可以对目标 DNA 区域中被甲基化了的 DNA 进行定量或检测。
     也可以是， 在一个色谱条上存在多个检测部位 ( 将可以分别捕获不同目标 DNA 区 域的特定寡核苷酸固定到支撑体 )， 依次定量或检测各目标 DNA 区域， 另外， 如果 1 个检测 部位可以捕获多个目标 DNA 区域， 即， 在 1 个检测部位， 固定化多个可以捕获多个目标 DNA 区域的特定寡核苷酸， 则可以使检测灵敏度显著提高。 另外， 使用多个具有可以捕获多个目 标 DNA 区域的功能的特定寡核苷酸来形成多个目标 DNA 区域与复合体， 可以使检测灵敏度 显著提高。进而， 即使在 1 个目标区域中设计多个特定寡核苷酸， 将其用于支撑体侧或检测 侧， 也可以使检测灵敏度显著提高。
     这样在本发明可以使用的限制性酶、 特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体作为检测用 试剂盒的试剂有用。本发明还提供含有这些限制性酶、 特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体等 作为试剂的检测用试剂盒、 将这些特定寡核苷酸或甲基化 DNA 抗体等固定化到支撑体上而 成的检测用芯片， 本发明的权利要求范围当然也包括以利用该方法的实质性原理而得的上 述检测用试剂盒、 检测用芯片之类的方式的使用。 实施例 以下， 通过实施例更详细地说明本发明， 但本发明不限于此。
     实施例 1
     将从 ATCC 购入的哺乳动物来源的结肠腺癌细胞株 Capan-2(ATCCNO.HTB-80) 在等 量混合了 McCoy ‘s5a(Gibco、 Cat.No.16600-082) 和 FBS(ATCC、 CatNo.30-2020) 的培养基中 培养直到融合， 由此得到约 1×107 细胞。 向得到的细胞加入 SEDTA 缓冲液 [10mM Tris-HCl pH 8.0、 10mM EDTA pH 8.0、 100mM NaCl]10 倍容量之后， 将其均质化。
     向所得混合物中加入蛋白酶 K(Sigma) 使其浓度为 500μg/ml 及十二烷基硫酸钠 使其浓度为 1％ (w/v)， 之后将其在 55℃振荡约 16 小时， 接着， 使用被 1M Tris-HCl、 pH 8.0 饱和了的苯酚， 进行苯酚· 氯仿提取处理。将水层回收， 向其中加入 NaCl 使浓度为 0.5N 之 后， 对其进行乙醇沉淀处理， 回收生成的沉淀 ( 基因组 DNA)。将回收的沉淀溶解到 TE 缓冲 液 (10mM Tris、 1mM EDTA、 pH 8.0)， 向其中加入 RNase A(Sigma) 使其浓度为 40μg/ml， 之 后在 37℃孵育 1 小时， 接着， 进行苯酚· 氯仿提取处理。将水层回收， 向其中加入 NaCl 使其 浓度为 0.5N 后， 对其进行乙醇沉淀处理， 将生成的沉淀 ( 基因组 DNA) 回收。将回收的沉淀 用 70％乙醇清洗， 得到 Capan-2 基因组 DNA。
     分别以双份的方式制备从 Clontech 购得的血液来源基因组 DNA 及上述 Capan-2 基因组 DNA 各自的 500ng/20μL TE 缓冲液溶液。
     将制备的各基因组 DNA 溶液 20μL、 限制性酶 X spI 10U 与对 X spI 最适的 10× 缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8.5、 100mM MgCl2、 10mM 二硫苏糖醇、 1000mM KCl)5μl 混合， 向其中加入灭菌超纯水使液量为 50μl， 将其在 37℃孵育 1 小时， 制备基因组溶液。
     作为用于获得序列编号 1 ～ 12 中任一项所示目标 DNA 区域的特定寡核苷酸， 合成 了与该 DNA 区域通过互补性结合的具有序列编号 13 ～ 24 所示碱基序列的 5’ 末端生物素 化寡核苷酸， 如下制备各自 0.1pmoL/μL 的 TE 缓冲液溶液。
     将具有为了取得序列编号 1 的目标区域的序列编号 13 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 1。
     将具有为了取得序列编号 2 的目标区域的序列编号 14 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 2。
     将具有为了取得序列编号 3 的目标区域的序列编号 15 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 3。
     将具有为了取得序列编号 4 的目标区域的序列编号 16 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 4。
     将具有为了取得序列编号 5 的目标区域的序列编号 17 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 5。
     将具有为了取得序列编号 6 的目标区域的序列编号 18 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 6。
     将具有为了取得序列编号 7 的目标区域的序列编号 19 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 7。
     将具有为了取得序列编号 8 的目标区域的序列编号 20 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 8。
     将具有为了取得序列编号 9 的目标区域的序列编号 21 所示的碱基序列的 5’ 末端 生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 9。
     将具有为了取得序列编号 10 的目标区域的序列编号 22 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 10。
     将具有为了取得序列编号 11 的目标区域的序列编号 23 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 11。
     将具有为了取得序列编号 12 的目标区域的序列编号 24 所示的碱基序列的 5’ 末 端生物素化寡核苷酸的溶液作为特定寡核苷酸溶液 12。
     将上述特定寡核苷酸溶液 1 ～ 12 分别等量混合， 制备特定寡核苷酸溶液 13。
     作为对序列编号 1 ～ 12 中任一种所示目标区域内的碱基序列设计的反向寡核苷 酸， 合成序列编号 25 ～ 118 中的任一种所示的寡核苷酸， 制备各自 10pmoL/μL 的 TE 缓冲 液溶液。将以相同的 DNA 区域为目标的反向寡核苷酸溶液分别等量混合， 分别制备如下所 示的反向寡核苷酸混合液。
     将序列编号 25 ～ 42 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 1。
     将序列编号 43 ～ 60 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 2。
     将序列编号 61 ～ 66 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 3。
     将序列编号 67 ～ 70 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 4。将序列编号 71 ～ 76 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 5。 将序列编号 77 ～ 82 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 6。 将序列编号 83 ～ 88 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 7。 将序列编号 89 ～ 94 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 8。 将序列编号 95 ～ 100 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 9。 将序列编号 101 ～ 106 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 将序列编号 107 ～ 112 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液 将序列编号 113 ～ 118 各自所示的寡核苷酸的混合液作为反向寡核苷酸混合液10。
    11。
    12。 将上述反向寡核苷酸混合液 1 ～ 12 分别等量混合， 制备反向寡核苷酸混合液 13。
     将特定寡核苷酸溶液与反向寡核苷酸混合液分别等量混合， 制备下述溶液 A、 溶液 B、 溶液 C。
     溶液 A ： 特定寡核苷酸溶液 1 与反向寡核苷酸混合液 1
     溶液 B ： 特定寡核苷酸溶液 2 与反向寡核苷酸混合液 2
     溶液 C ： 特定寡核苷酸溶液 13 与反向寡核苷酸混合液 13
     向 PCR 管中加入上述制备的基因组溶液 30μL、 上述溶液 A ～ C 中的任一种 30μL、 缓冲液 (330mM Tris- 乙酸盐 pH 7.9、 660mM KOAc、 100mMMgOAc2、 5mM 二硫苏糖醇 )15μL、 10mM MgCl2 溶液 60μL 以及 1mg/mL BSA 溶液 15μL， 使液量为 150μL， 进行混合。之后， 将 该 PCR 管在 95℃加热 10 分钟， 迅速冷却至 70℃， 并在该温度下保温 10 分钟。接着， 冷却至 50℃保温 10 分钟， 再在 37℃保温 10 分钟后返回至室温， 促进 5’ 末端生物素标记寡核苷酸 与 DNA 片段的结合体的形成。
     将所得的混合物全部转移至被抗生蛋白链菌素覆盖的孔中， 在室温放置约 30 分 钟， 将上述 5’ 末端生物素标记寡核苷酸与 DNA 片段的结合体固定化到孔。之后， 利用移液 管将溶液除去， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaClpH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     向各孔中添加甲基胞嘧啶抗体 [Aviva Systems Biology 社制、 0.5μg/mL 0.1％ BSA 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 溶液 ]100μL， 在室 温下放置 1 小时。 用移液管将孔内的溶液去除， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓 冲液 (1mMKH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     以 100μL 的比例， 向各孔中添加 Eu-N1 标记小鼠 IgG 抗体 [PerkinElmer 社制、 0.05g/mL 0.1％ BSA 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mMNa2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4) 溶 液 ]， 在室温下放置 1 小时后， 用移液管将孔内的溶液除去， 用清洗缓冲液 [0.05％ Tween20 含有磷酸缓冲液 (1mM KH2PO4、 3mM Na2HPO 7H2O、 154mM NaCl pH7.4)]200μL 对各孔清洗 3 次。
     以 150μL 的比例向各孔中添加促进溶液 (Perkin Elmer 社制 )， 在室温下搅拌 5 分钟， 在室温下放置 15 分钟后， 以激发 340nm/ 萤光 612nm 测定萤光。
     将结果示于图 1。与作为检测对象的目标区域为 1 种的溶液 A 及溶液 B 相比较，
     同时检测作为检测对象的多个目标区域的溶液 C 中， 甲基化频度或具有相关关系的指标值 高。另外， 与非癌细胞来源的人基因组 DNA 相比较， 从 Capan-2 癌细胞株提取的基因组 DNA 的与作为检测对象的目标区域的甲基化频度有相关关系的指标值高。
     本实验中， 对多个目标 DNA 区域的甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行同 时测定， 这与对单一的目标 DNA 区域的甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行测定相 比较， 可以有效地测定甲基化频度或与其有相关关系的指标值。 另外， 与非癌组织来源的基 因组 DNA 相比较， 作为胰腺癌细胞的 Capan-2 细胞株来源的基因组 DNA 中的甲基化频度或 与其有相关关系的指标值高， 因此， 确认了， 通过混合在本考察中使用的目标 DNA 区域来对 甲基化频度或与其有相关关系的指标值进行测定， 可以作为癌的诊断指标。另外， 确认了， 即使混合了在本考察中利用的特定寡核苷酸、 反向寡核苷酸及特定寡核苷酸， 也可以在癌 诊断中利用。
     产业上利用的可能性
     通过本发明， 可以提供一种简便定量或检测生物来源标本中所含基因组 DNA 具有 的目标 DNA 区域中的被甲基化了的 DNA 的方法等。
     序列表文本
    
    
    
    序列编号 13 ～ 24 为固定设计的 5’ 末端生物素标记寡核苷酸 序列编号 25 ～ 118 设计的寡核苷酸32102046787 A CN 102046791
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