(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的制备方法 【技术领域】
本发明属于化合物手性合成领域，具体地说，涉及一种(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的制备方法。
背景技术
他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-C0A)的结构类似物，因此可以通过抑制HMG-C0A还原酶的作用，从而抑制体内胆固醇的合成，它能有效地促进低密度脂肪蛋白、极低密度脂蛋白及其它乳糜微粒的降解代谢，达到降低血浆中胆固醇及脂肪蛋白水平的目的，同时增加高密度脂肪蛋白，这类药物可以有效的防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。
在他汀类药物的合成中，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯既可作为阿托伐他汀合成的直接底物，也可作为其他他汀类药物合成的中间体，因此，具有重要价值。
他汀类药物的合成工艺中，难点在于侧链的2个手性羟基的获得。因此，如何高选择性低成本地得到他汀手性侧链成为他汀类药物合成的关键。
利用微生物细胞不对称还原前手性碳基制备手性醇，为合成他汀类药物的关键手性中间体提供了一条有效的途径，对这方面进行深入的研究具有重要的理论和现实意义，有助于推动手性技术和手性制药工业的发展。
酵母细胞在不对称还原前手性羰基制备手性醇中具有许多优势，如来源广泛，操作简单，不需要酶的分离，不需要添加价格昂贵的辅酶等，所以使用酵母做催化剂，生物催化不对称合成手性羟基酯有着良好的应用前景，对于其合成的研究也具有重要的理论和应用价值。
但目前还没有使用毕赤酵母合成(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的报道，更没有使用毕赤酵母高选择性低成本地获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供一种(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的制备方法，从而高选择性低成本地获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯。
本发明提供的利用巴氏毕赤酵母制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的方法，以5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯为底物，使用巴氏毕赤酵母菌体催化，制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯。
根据本发明的一个优选实施例，使用的巴氏毕赤酵母为巴氏毕赤酵母Gs115和巴氏毕赤酵母X-33。
根据本发明的一个优选实施例，巴氏毕赤酵母在pH5-9的缓冲液中催化5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯反应4-24h，缓冲液中还含有供氢体葡萄糖，加入的葡萄糖的含量优选的为40-200g/L。优选的底物浓度为6-9.5g/L，巴氏毕赤酵母菌体含量为60-220g湿菌体/L。
使用本发明提供的方法，制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，获得了单一构型的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，提高了其实际得率，还可减少了纯化步骤，降低生产成本。相对于传统的化学催化合成法及需要添加辅酶NADH/NAD+的酶催化不对称还原方法，本发明提供的方法还具有以下优势：(1)生成的产物(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值高，产品纯度高，收率高；(2)生物催化剂为微生物菌体，可以通过发酵高密度生产，发酵工艺成熟，产量稳定，成本低廉；(3)在反应体系中添加供氢体，可以获得高光学纯度、高反应收率、高产物浓度的目标产物；(4)在整个反应过程中不需要添加辅酶，可以大幅度降低生产成本；(5)反应条件温和，易操作易控制，且环境友好，污染少。
说明书附图
图1为以巴氏毕赤酵母X-33的湿菌体催化获得的反应液的液相色谱图。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明的下述实施例中，反应液上清的处理过程如下：将反应液上清用乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，40℃水浴旋转蒸发，得到黄色油状液体，该黄色油状液体经检测，确定为3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯。
在本发明的下述实施例中，将产物3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯溶于乙酸乙酯后，经LCMS(参考保健食品中降糖药物的LCMS检测[J]。王小兵，张建丽，中国当代医药，2006，16(17)：16-17中提供的方法)、NMR检测(参考表儿茶素和儿茶素中羟基的选择性保护[J].陈薇，Tan Kheng Lin，付才力，黄德建，合成化学，2008，16(2)：133-135中提供的方法)及比旋光度的测定(参考4-氯-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成，仪明君，南京工业大学硕士学位论文中提供的方法)，确定其构型。
在本发明的下述实施例中，产物(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率采用高效液相色谱法测定，具体如下：
液相色谱柱：XDB-C18(4.6mm×250mm，5um)；柱流速：1mL/min；温度：30℃；进样量：2uL；波长：219nm。
在本发明地下述实施例中，产物(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值采用手性高效液相色谱法测定，具体如下：
手性液相色谱柱：OD-H(4.6mm×250mm，5um)；柱流速：1mL/min；温度：30℃；进样量：2uL；波长：219nm。
在本发明的下述实施例中，使用的菌株：燕山面包酵母(购买于河北马利食品有限公司)，马利面包酵母(购买于中澳合资哈尔滨马利酵母有限公司)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(购买于上海工业微生物研究所)，巴氏毕赤酵母(PichiaPastoris)Gs115(购买于美国Invitrogen公司)，巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)X-33(购买于美国Invitrogen公司)。
在本发明的下述实施例中，使用的种子培养基和发酵培养基配方均为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
实施例1、微生物菌株的培养和筛选
将燕山面包酵母、马利面包酵母、酿酒酵母、巴氏毕赤酵母Gs115和巴氏毕赤酵母X-33分别转入种子培养基中，于180r/min，30℃培养24-48小时，获得相应种子液，然后将种子液分别转入发酵培养基中，于180r/min，30℃培养24-48小时，获得相应发酵液。
将发酵液分别于6000r/min离心5min，将收集获得的湿菌体用0.1M，pH6的磷酸钾缓冲液洗涤两次，称量2g菌体，将菌体转入25mL相同的磷酸盐缓冲液中，加入0.5g葡萄糖，并加入0.05g 5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯，于30℃，180r/min，反应24小时。
反应结束后，将反应液于6000r/min离心5min，收集上清液。
将上清过滤后，使用高效液相色谱分析3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率，检测结果如表1所示，其中，使用巴氏毕赤酵母X-33的发酵液催化反应的反应液的检测结果如图1所示。
过滤后的上清液经乙酸乙酯萃取等处理，获得3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，然后用异丙醇溶解，检测3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值，并测其构型，结果如表1所示。
表1、微生物菌株的筛选
菌体种类 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 构型 燕山面包酵母 76.70 1.80 S/R 马利面包酵母 79.28 30.1 S/R 酿酒酵母 87.68 21.2 S/R 巴氏毕赤酵母Gs115 74.20 98.1 S 巴氏毕赤酵母X-33 81.71 99.0 S
根据表1的结果，使用燕山面包酵母、马利面包酵母和酿酒酵母催化获得的3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯具有S和R两种构型，需要做进一步纯化分离才能获得单一构型(S构型)的3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，而巴氏毕赤酵母Gs115和巴氏毕赤酵母X-33获得的3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯几乎全为S构型，可直接使用，因此，使用巴氏毕赤酵母可直接制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，减少了纯化步骤，并提高了(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的实际得率。
实施例2、菌体的重复利用
2.1、巴氏毕赤酵母X-33菌体的重复利用
2.1.1、菌体发酵
将巴氏毕赤酵母X-33按实施例1方法发酵培养24h后，将发酵液于6000r/min离心5min，收集湿菌体。
2.1.2、催化反应
称取3g湿菌体，置于25mL 0.1M，pH6的磷酸钾缓冲液中，然后向缓冲液中加入葡萄糖0.5g，5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯0.1445g，于30℃，180r/min，反应24小时。
反应结束后，将反应液于6000r/min离心5min，分别收集上清液和菌体。
2.1.3、菌体重复利用
使用磷酸钾缓冲液洗涤收集的菌体两次后，加入25mL 0.1M，pH6的磷酸钾缓冲液中，摇匀，然后向缓冲液中分别加入5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯和葡萄糖，在与步骤2.1.2同样的条件下转化24h后检测(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率，检测结果如表2.1所示。
2.1.4、菌体多次重复利用
重复步骤2.1.3的操作，对菌体进行重复利用，共重复利用7次，在每次重复利用后检测获得的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对应体过量值和收率，检测结果如表2.1所示。
表2.1、反复利用毕赤酵母X-33菌体的结果
重复利用次数 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 1 89.01 98.61 2 82.70 98.77 3 30.10 98.38 4 15.00 97.50 5 14.50 97.81 6 14.66 98.19 7 12.69 97.67
根据表2.1的结果，多次重复使用毕赤酵母X-33菌体催化制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，不影响对映体过量值；当毕赤酵母X-33菌体的重复利用次数为1次和2次时，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率仅略低于首次利用毕赤酵母X-33菌体催化的收率，而毕赤酵母X-33菌体的重复利用次数达到3次后，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率即开始急剧下降，因此，用于催化的毕赤酵母X-33菌体可重复利用2次而不影响收率。
2.2、巴氏毕赤酵母Gs115菌体的重复利用
使用巴氏毕赤酵母Gs115，按实施例2.1的步骤进行操作，获得的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率的检测结果如表2.2所示。
表2.2、反复利用毕赤酵母Gs115菌体的结果
重复利用次数 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 1 80.18 98.05 2 79.23 98.20 3 23.18 98.28 4 13.99 97.84 5 11.51 97.88 6 14.69 97.69 7 12.63 97.92
根据表2.2的结果，多次重复使用毕赤酵母Gs115菌体催化制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，不影响对映体过量值，毕赤酵母Gs115菌体的重复利用次数为1次和2次时，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率略低于首次利用毕赤酵母Gs115菌体催化的收率，而毕赤酵母Gs115菌体的重复利用次数达到3次后，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率即开始急剧下降，因此，用于催化的毕赤酵母Gs115菌体可重复利用2次而基本不影响得率。
实施例3、反应液pH信的影响
3.1、pH值对巴氏毕赤酵母X-33催化反应的影响
将巴氏毕赤酵母X-33按实施例1方法发酵培养24h，再将发酵液于6000r/min离心5min，收集湿菌体。
称取5份湿菌体，每份3g，分别置于25mL 0.1M磷酸钾缓冲液中，缓冲液的pH分别为5、6、7、8、9，然后分别向缓冲液中加入葡萄糖0.5g，5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯0.1445g，于30℃，180r/min，反应24小时。
反应结束后，按实施例1中的方法，检测在不同pH值的缓冲液中进行反应获得的反应液中的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率和(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值，结果如表3.1所示。
表3.1、pH值对毕赤酵母X-33转化的影响
pH 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 5 57.44 95.98 6 89.24 98.69 7 84.38 98.27
pH 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 8 49.89 97.22 9 43.60 97.58
根据表3.1的结果，在pH为5-9的缓冲液中反应，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，在pH为6-7的缓冲液中反应，获得的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率均较理想，最优的是在pH为6的缓冲液中反应。
3.2、pH值对巴氏毕赤酵母Gs115催化反应的影响
使用巴氏毕赤酵母Gs115，重复实施例3.1的步骤，获得的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率的检测结果如表3.2所示。
表3.2、pH值对毕赤酵母Gs115转化的影响
pH 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 5 56.43 92.90 6 84.16 98.39 7 79.79 98.07 8 43.97 97.62 9 40.81 97.73
根据表3.2的结果，在pH为5-9的缓冲液中反应，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，在pH为6-7的缓冲液中反应，获得的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率均较理想，最优的是在pH为6的缓冲液中反应。
实施例4、不同反应时间的影响
4.1、不同反应时间对巴氏毕赤酵母X-33的影响
将巴氏毕赤酵母X-33按实施例1方法发酵培养24h后，将发酵液于6000r/min离心5min，收集湿菌体。
称取6份湿菌体，每份3g，分别置于25mL 0.1M，pH为6的磷酸钾缓冲液，加入葡萄糖3g，5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯0.175g，于30℃，180r/min，分别反应4h、8h、12h、16h、20h、24h。
反应结束后，按实施例1中的方法，检测不同反应时间收集的反应液的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率和(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值，结果如表4.1所示。
表4.1、毕赤酵母X-33转化时间曲线
反应时间(h) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 4 68.89 98.30 8 76.05 98.09 12 87.80 98.25 16 87.72 97.91 20 86.97 98.27 24 86.81 98.18
根据表4.1的结果，反应8h后，收率能达到70％以上，反应12h后收率超过85％，当反应时间超过12h后，增加的反应时间对收率无明显影响，但反应4-24h，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯；反应时间对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值无明显影响，反应4-24h，对映体过量值均超过95％。
4.2、不同反应时间对巴氏毕赤酵母Gs115的影响
使用巴氏毕赤酵母Gs115，重复实施例4的上述步骤，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率的检测结果如表4.2所示。
表4.2、毕赤酵母Gs115转化时间曲线
反应时间(h) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 4 50.38 97.36 8 72.21 97.83 12 81.79 97.96 16 81.75 97.68 20 80.78 98.35 24 80.01 98.24
根据表4.2的结果，反应时间对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率有一定影响，在反应8h后，收率能达到70％以上，反应12h后收率超过80％，当反应时间操作12h后，增加的反应时间对收率无明显影响，但反应4-24h，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯；反应时间对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值无明显影响，反应4-24h，对映体过量值均超过95％。
实施例5、不同菌体量对转化的影响
5.1、不同菌体量对巴氏毕赤酵母X-33的影响
用巴氏毕赤酵母X-33按实施例1方法发酵培养24h后，将发酵液于6000r/min离心5min，收集湿菌体。
分别称取1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g湿菌体置于25mL 0.1M，pH为6的磷酸钾缓冲液，加入葡萄糖3g，5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯0.1445g，于30℃，180r/min反应12h。
反应结束后，按实施例1中的方法，检测以不同菌体量进行催化，获得的反应液中的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率和(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值，结果如表5.1所示。
表5.1、不同菌体量对毕赤酵母X-33转化的影响
菌量(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 1.5 62.59 98.46 2.0 80.46 98.63 2.5 84.73 98.27 3.0 90.39 98.11 3.5 91.01 98.46 4.0 89.90 98.09 4.5 92.20 98.19 5.0 88.12 98.05 5.5 94.21 97.93
根据表5.1的结果，底物量一定，反应时间一定时，菌体量越多，得率越高，但菌体量的多少对对映体过量值影响不大。当湿菌体量为60-220g/L时，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯。
5.2、不同菌体量对巴氏毕赤酵母Gs115的影响
使用巴氏毕赤酵母Gs115，重复实施例5.1的上述步骤，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率的检测结果如表5.2所示。
表5.2、不同菌体量对毕赤酵母Gs115转化的影响
菌量(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 1.5 56.67 98.24
菌量(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 2.0 78.48 98.6 2.5 79.89 98.29 3.0 81.33 98.18 3.5 81.07 98.40 4.0 79.88 98.03 4.5 79.60 98.16 5.0 78.99 98.04 5.5 79.21 97.92
根据表5.2的结果，底物量一定，反应时间一定时，菌体量越多，得率越高，但菌体量的多少对对映体过量值影响不大。当湿菌体量为60-220g/L时，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯。
实施例6、不同底物量对转化的影响
6.1、不同底物量对巴氏毕赤酵母X-33的影响
用巴氏毕赤酵母X-33按实施例1方法发酵培养24h后，将发酵液于6000r/min离心5min，收集湿菌体。
称取8份湿菌体，每份3g，分别置于25mL 0.1M，pH为6的磷酸钾缓冲液中，然后向缓冲液中加入葡萄糖3g，并分别加入0.15g、0.1625g、0.175g、0.1875g、0.2g、0.2125g、0.225g、0.2375g5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯，于30℃，180r/min反应12h。
反应结束后，按实施例1中的方法，检测催化不同量的底物获得的反应液中(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率和对映体过量值，结果如表6.1所示。
表6.1、不同底物量对毕赤酵母X-33转化的影响
底物(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 0.1500 90.32 98.80 0.1625 89.67 98.75 0.175 88.89 98.34 0.1875 67.55 97.58 0.2000 62.21 98.24
底物(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 0.2125 57.54 97.69 0.2250 52.37 97.54 0.2375 47.39 97.53
根据表6.1的结果，菌体量一定时，在确定时间内，底物量越大，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的得率越低，但使用120g/L湿菌体催化6-9.5g/L 5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯12h时，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯；底物的量对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值影响不大。
6.2、不同底物量对巴氏毕赤酵母Gs115的影响
使用巴氏毕赤酵母Gs115，重复实施例6.1的上述步骤，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率的检测结果如表6.2所示。
表6.2、不同底物量对毕赤酵母Gs115转化的影响
底物(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 0.1500 88.12 98.69 0.1625 76.53 98.26 0.175 71.64 98.00 0.1875 66.26 97.58 0.2000 64.01 98.16 0.2125 56.42 97.64 0.2250 52.00 97.28 0.2375 48.78 97.35
根据表6.2的结果，菌体量一定时，在确定时间内，底物量越大，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的得率越低，但使用120g/L湿菌体催化6-9.5g/L 5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯12h时，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯；底物的量对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值影响不大。
实施例7、不同葡萄糖量对转化的影响
7.1、不同葡萄糖量对巴氏毕赤酵母X-33的影响
用巴氏毕赤酵母X-33按实施例1方法发酵培养24h后，将发酵液于6000r/min离心5min，收集湿菌体。
称取5份湿菌体，每份3g，分别置于25mL 0.1M，pH为6的磷酸钾缓冲液中，然后向缓冲液中加入0.1445g5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯，并分别加入1g、2g、3g、4g、5g葡萄糖，于30℃，180r/min反应12h。
反应结束后，按实施例1中的方法，检测添加不同量的葡萄糖所获得的反应液中(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的收率和对映体过量值，结果如表7.1所示。
表7.1、不同葡萄糖量对毕赤酵母X-33转化的影响
葡萄糖(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 1 69.98 98.05 2 77.87 98.43 3 89.42 98.32 4 79.63 97.98 5 62.21 98.21
根据表7.1的结果，在底物量、菌体量一定时，在确定时间内，在添加40-200g/L的葡萄糖的反应中，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，葡萄糖的添加量对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值影响不大，最优的是在添加葡萄糖120g/L的缓冲液中反应。
7.2、不同葡萄糖量对巴氏毕赤酵母Gs115的影响
使用巴氏毕赤酵母Gs115，重复实施例7.1的上述步骤，(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值和收率的检测结果如表7.2所示。
表7.2、不同葡萄糖量对毕赤酵母Gs115转化的影响
葡萄糖(g) 收率(％) 对映体过量值(％e.e.) 1 60.19 98.31 2 65.35 98.52 3 82.50 98.46 4 77.83 97.90 5 73.60 98.12
根据表7.2的结果。在底物量、菌体量一定时，在确定时间内，在添加40-200g/L的葡萄糖的反应中，均能获得(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，葡萄糖的添加量对(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值影响不大，最优的是在添加葡萄糖120g/L的缓冲液中反应。
根据实施例2-7的结果，使用巴氏毕赤酵母X-33和巴氏毕赤酵母Gs115催化5-邻苯二甲酰亚氨-3-氧代戊酸乙酯制备(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯，获得的(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯几乎全为S构型，其合适的催化条件为：在pH5-9的缓冲液中，反应4-24h，反应液中还需要加入供氢体葡萄糖，优选的，底物浓度为6-9.5g/L，湿菌体为60-220g/L，葡萄糖添加量为40-200g/L。
本发明提供的微生物全细胞催化法相对于传统的化学催化合成法及需要添加辅酶NADH/NAD+酶催化不对称还原方法具有以下优势：(1)生成的产物(S)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚氨基戊酸乙酯的对映体过量值，产品纯度高，收率高；(2)生物催化剂为微生物菌体，可以通过发酵高密度生产，发酵工艺成熟，产量稳定，成本低廉；(3)在反应体系中添加供氢体，可以获得高光学纯度、高反应收率、高产物浓度的目标产物；(4)在整个反应过程中不需要添加辅酶，可以大幅度降低生产成本；(5)反应条件温和，易操作易控制，且环境友好，污染少。