重组枯草芽孢杆菌分泌型表达载体 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能在枯草芽孢杆菌实现同源和异源基因分泌表达的通用表达载体pBC38C。
背景技术
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，单个细胞0.7-0.8×2-3μm，无荚膜，全身鞭毛，能运动。为典型的革兰氏阳性菌，芽孢呈椭圆或柱状，位于菌体中央或稍偏。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。细胞壁不含内毒素，只具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分泌到培养基中。能形成芽孢，具有很强的环境适应性和环境友好性，是一些重要工业酶制剂的生产菌。
自1958年Spizizen发现枯草芽孢杆菌能摄取外源基因以后，特别是金黄色葡萄球菌带抗性标志的质粒可作为其载体，人们开始研究枯草芽孢杆菌作为基因工程菌的优点。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌作为基因工程菌有许多优点：①细胞壁不含内毒素无毒性，对人和动物均安全。②分泌蛋白的能力强，可直接将目的蛋白分泌到培养基中，与胞内蛋白分离，毋需破碎细胞，利于分离纯化，简化生产工艺。③表达的产物可正确折叠，具有生物学活性。④具有良好的发酵工艺和生产技术，培养工艺成熟，短时间内可达到较高的浓度。
枯草杆菌表达系统一直吸引着研究者的关注，被认为是继大肠杆菌之后的又一重要的具有潜在应用价值的原核表达系统。
国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为克隆和表达系统方面做了许多工作，但到目前为止，仍没有一种商业化的表达载体出现，研制和开发枯草杆菌的表达载体已经成为人们研究的重点之一。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供能在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源基因的重组表达载体。该重组表达载体可将目的蛋白分泌到细胞外。可作为芽孢杆菌属的原核表达体系的通用载体。实现外源基因在枯草芽孢杆菌中大量分泌表达。
为实现上述目的，本发明将枯草芽孢杆菌自身启动子作为表达质粒表达盒的启动子，用于外源基因的引导表达；在多克隆位点下游加入终止信号序列，防止表达外源基因时出现通读现象；同时引入信号肽序列，以使得表达的外源蛋白能够分泌到胞外。
在本发明的一个实施例中，使用的启动子是枯草芽孢杆菌1700菌株的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述的信号肽是(枯草芽孢自身)信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述终止信号是枯草芽孢杆菌能够识别的终止信号，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。构建得到的pBC38C质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本领域技术人员应当理解，作为表达外源基因的表达盒，在表达盒中还具有多克隆位点MCS用于插入外源序列，以及转录终止序列用于终止转录。
本发明将枯草芽孢杆菌启动子基因、信号肽序列、多克隆位点序列、终止序列插入到枯草芽孢杆菌的质粒pGJ103中，构建枯草芽孢杆菌的分泌型表达载体pBC38C。将绿色荧光蛋白基因克隆到表达载体中，构建绿色荧光蛋白的重组表达质粒，通过检测荧光蛋白，评价分泌型表达载体的分泌表达水平和效果。结果表明，所构建的枯草芽孢杆菌的分泌型表达载体可实现外源基因在枯草芽孢杆菌中分泌表达，并具有生物学活性。
本发明表达载体pBC38C可以在枯草芽孢杆菌中分泌表达同源和异源基因，其所表达的蛋白具有较好的生物学活性，并且该表达载体所使用的宿主对动物和环境是安全的，具有生物安全性。此外，该表达载体具有很好的遗传稳定性，经多次传代后重组表达载体不丢失，可在枯草芽孢杆菌细胞中持续分泌表达外源基因。本发明表达载体将在蛋白表达及重大疾病的亚单位疫苗的制备中发挥重要作用。
【附图说明】
图1显示的是重组枯草芽孢杆菌分泌型表达载体pBC38C；
图2显示的是重组分泌型表达载体在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白的荧光检测，A为菌体的荧光显微镜下观察结果；B为菌落的荧光显微镜下观察结果；
图3显示的是重组分泌型表达载体表达绿色荧光蛋白的Western-blot检测结果。
【具体实施方式】
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1质粒pBC38C的构建
本发明从枯草芽孢杆菌1700菌株(购自中国科学院微生物所)中克隆得到一种新的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本例以枯草芽孢杆菌1700菌株的启动子为例，说明质粒pBC38C的构建方法。
1、启动子的克隆
提取枯草芽孢杆菌1700菌株地基因组DNA，以引物对：
上游引物：5′-CgACTCgAgTgTCgACgTgCATgCAggCCg-3′；
下游引物：5′-CgAATCgATTATAATggTACCgCTATCAC-3′，上游引物引入XhoI酶切位点(下划线部分)，下游引物引入ClaI酶切位点(下划线部分)，扩增枯草芽孢杆菌的启动子。
反应体系为：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、基因组DNA 3μL、TaKaRa Ex Taq酶0.25μL、灭菌蒸馏水35.75μL。
反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸反应10min。
扩增后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，按照T载体试剂盒说明书将扩增产物连接到pMD18-T载体(TAKARA公司)上，得到pMD18-T-LP，进行测序验证。
2、信号肽的设计与合成
根据枯草芽孢杆菌的识别信号肽的特点，应用计算机软件进行设计合成并登陆在线的信号肽预测网站：genome.cbs.dtu.dk/services/signal对所设计的序列进行评价。由上海生工合成并将其插入到pBlueScript II SK(+)载体的Cla I和Hind III之间，获得的质粒命名为pBSK-S。
3、终止序列的设计与合成
设计枯草芽孢杆菌识别的终止信号序列，经生物信息学软件检测，可以形成明显的发夹结构。序列由上海生物合成并连接在克隆载体pBluescript II SK(+)的BstXI和SacI之间，获得的质粒命名为pBSK-S-MCS-T。
4、pBSK-LP-S-MSC-T载体的构建
启动子测序正确后，用XhoI和ClaI双酶切pMD18-T-LP与pBSK-S-MCS-T载体，用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收430bp左右的目的基因片段和3kb左右的载体片段，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞。挑取单菌落接种含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜，以碱裂解法小量提取质粒，并用XhoI和ClaI酶切筛选出阳性克隆，命名为pBSK-LP-S-MSC-T。
5、pBC38C的构建
用XhoI和SacI双酶切重组中间质粒pBSK-LP-S-MSC-T，回收含有启动子、信号肽、多克隆位点和终止序列的片段，用同样的酶对枯草芽孢杆菌质粒pGJ103(Clontech公司)酶切，回收线性化载体片段，两段回收片段连接，并转化DH5α感受态细胞。挑取单菌落接种含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜，以碱裂解法小量提取质粒，并用XhoI和SacI酶切筛选出阳性克隆，构建得到重组分泌型表达载体pBC38C。
实施例2绿色荧光蛋白的分泌表达
本例以绿色荧光蛋白为报告基因，评价重组分泌型表达载体的表达水平
1、含有绿色荧光蛋白基因的重组表达载体的构建
Nhe I/EcoR I双酶切含有绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-C1(军事医学科学院军事兽医研究所病毒学研究室构建并保存)，回收小片段(GFP基因)，同样双酶切质粒pET-28a(+)(购自Invitrogen公司)回收大片段，对两个回收片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组的中间载体pET-28a-GFP，大量提取中间质粒，用Nhe I和Not I双酶切中间载体pET-28a-GFP并回收GFP基因片段。同时，用Spe I/Not I双酶切pBC38C并回收大片段，将两种回收片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，构建含有GFP的重组质粒pBC38C-GFP，并通过提取质粒和酶切进行鉴定。
2、枯草芽孢杆菌的转化及培养
通过酶切鉴定筛选阳性重组质粒。鉴定正确后，提取质粒，采用电转化方法(ECM 830)将重组质粒转入枯草芽孢杆菌AS.1700中。LB液体培养后，小量提取质粒，通过酶切鉴定筛选阳性转化子。
将携带重组质粒pBC38C-GFP的枯草芽孢杆菌在含有氯霉素的LB固体培养基中，37℃培养48h，置荧光显微镜下观察GFP的表达情况。
3、表达产物的检测
3.1荧光显微镜观测重组分泌型表达载体表达的绿色荧光蛋白
钓取阳性菌落接种于适量LB肉汤，37℃24h振荡培养过夜，取适量菌液，涂布到清洁的载玻片上，自然干燥后，同时设立阴性对照组，于荧光显微镜下观察和拍照(见附图2)。
3.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
大量液体培养阳性菌体，同时设立阴性对照，37℃24h振荡培养至细菌达到生长稳定期，收集于Eppendorf管中，3000r/min离心5min，弃菌体，上清液经硫酸铵沉淀，12000r/min离心，加入20μLTE缓冲液，-20℃保存备用。
取20μL经处理的菌体上清与等量2×上样缓冲液(100mmol/LTris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，使用前加入2.5％β-巯基乙醇)混匀，100℃煮沸5min，于12％凝胶进行SDS-PAGE电泳。
3.3免疫印迹(Western blot)
经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5-10min，将绿色荧光蛋白的单克隆抗体用封闭缓冲液稀释(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3-5次，碱性磷酸酶标记的羊抗兔的IgG(1∶1000)室温感作2h，洗涤3-5次后，每次5-10min，用10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/LTris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混匀后再加33μl BCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，显色10-20min，用蒸馏水中止反应。
4、重组分泌型表达载体表达绿色荧光蛋白的检测结果
经大量培养后涂布到清洁载玻片上的菌体在荧光显微镜下可见清晰的荧光，而阴性对照组则没有荧光出现，说明分泌型表达载体实现了绿色荧光蛋白的表达。将阳性枯草芽孢杆菌形成的菌落置荧光显微镜下观察，也出现较强的荧光，且这种荧光可持续6d左右。经Western blot分析：重组pBC38C-GFP所表达的蛋白与绿色荧光蛋白的单抗发生特异性结合，出现了明显的条带(见附图3)。
以绿色荧光蛋白为报告基因的试验证实，本发明的重组分泌型表达载体能实现外源基因在枯草芽胞杆菌的高效分泌表达。重组分泌型表达载体所表达的荧光蛋白可以特异性地与荧光蛋白的单克隆抗体发生特异性反应，证明所表达的荧光蛋白存在培养物中，具有生物学活性。
实施例3重组分泌型表达载体pBC38C-GFP的遗传稳定性分析
利用重组分泌型表达载体携带氯霉素抗性基因的特性，将其在含氯霉素和不含氯霉素的液体培养基中连续传代至120代，每隔5代做一次质粒稳定性测定。质粒稳定率等于从不含氯霉素的平板上选取100个单菌落，点种于含氯霉素的平板上最后长出的菌落数。具体操作如下：
挑取含有重组质粒pBC38C-GFP的枯草芽孢杆菌单菌落，接种一支LB肉汤和一支含氯霉素的LB肉汤，37℃振荡(180rpm/min)培养。当培养至5代、10代、15代、20代时，分别取LB肉汤和LB(氯霉素)肉汤培养物，分别划线接种2个LB平板，37℃培养24h。然后2支肉汤停止培养，4℃保存过夜。第2d，从这2支肉汤中各取100μl菌液接种于相应的新的肉汤管，重复前一天的振荡培养和相关操作。同时，将前一天各代划线平板上分别随机选取100个单菌落，点种于含氯霉素的平板，37℃培养24h，计数生长菌落数。重复以上操作至AS.1655/pBC38C-GFP传代至120代，停止传代。根据转种于氯霉素平板的菌落生长数，计算质粒的遗传稳定性。
将重组分泌型表达载体在枯草芽孢杆菌中连续传代120代，在选择压力条件下质粒的遗传稳定性为100％，无选择压力条件下，质粒的遗传稳定性为95％，说明所构建的表达质粒具有较高的遗传稳定性。
【序列表】
<110>宁一，金
<120>重组枯草芽孢杆菌分泌型表达载体
<130>KHP08113338.7
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>3878
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gagctctagc actttgccac tcattttttg cgttagcaaa aacataaagg gtatgggata 60
taatcccatc aagccggtat attcagaaca ggaacagcaa caagaacaac aaaagaatca 120
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aattggaata aagcaataaa aggagttgaa gaaatgaaat tcagagaagc ctttgagaat 360
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ttaccacccc tcaaccagaa ttaagttttg atgctatgac aatcgttggg aatttgaaca 840
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gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 3180
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tctggtaccc tcgagtgtcg acgtgcatgc aggccggggc atatgggaaa cagcgcggac 3300
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tgtagagctc agcattattg agtggatgat tatattcctt ttgataggtg gtatgttttc 3420
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ccctcttgct aaagcggcca aggacgctgc cgccggggct gtttgcgttt ttaccgtgat 3540
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agtgatagcg gtaccattat aatcgatatg cgcaacttga ccaagacatc tctattactg 3720
gccggctttg cacagcggcc caaatggttt ttgtaacaca tgcctcagct gaaaagcttg 3780
atatcgaatt cctgcagccc gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgt 3840
aatgaactta aaagaaacca tctatgatgg tttctttt 3878
<210>2
<211>426
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>2
tgtcgacgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacggagc ggaatttcca 60
atttcatgcc gcagccgcct gcgctgttct catttgcggc ttccttgtag agctcagcat 120
tattgagtgg atgattatat tccttttgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa 180
tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc 240
ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg cgtttttacc gtgatttcgt gtatcattgg 300
tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 360
ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 420
attata 426
<210>3
<211>86
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>3
atgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct ttgcacagcg gcccaaatgg 60
tttttgtaac acatgcctca gctgaa 86
<210>4
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<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>4
taatgaactt aaaagaaacc atctatgatg gtttctttt 39
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cgactcgagt gtcgacgtgc atgcaggccg 30
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgaatcgatt ataatggtac cgctatcac 29