化学限定水解乳蛋白细胞培养基的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种细胞培养基的制备方法，具体为一种化学限定水解乳蛋白细胞培养基的制备方法。
背景技术
水解乳蛋白作为动物细胞培养基已经有半个世纪的历史，所使用的乳蛋白为牛乳蛋白中提炼制得的天然物质，天然的乳蛋白在现代社会存在着一些污染源，如疯牛病、结核病等等。同时酸水解蛋白的工艺也会污染环境，不利之处颇多。现在乳蛋白的化学结构已经明确，用小分子的氨基酸来配制成细胞培养基已经成为可能。本研究试图以相同组成的氨基酸来配制成化学限定水解乳蛋白细胞培养基，使细胞在已知的氨基酸成分中成长。
【发明内容】
本发明的发明目的是为了提供一种化学限定水解乳蛋白细胞培养基的制备方法，以牛乳蛋白相同组成的20种氨基酸代替原来的水解乳蛋白。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
一种化学限定水解乳蛋白细胞培养基的制备方法，水解乳蛋白的氨基酸以表中所列数据配制：
氨基酸名称 含量(％) 氨基酸名称 含量(％) 氨基酸名称 含量(％) 丙氨酸 5.877 甘氨酸 1.415 脯氨酸 4.340 精氨酸 2.462 组氨酸 1.462 丝氨酸 2.971 天门冬酰胺 3.735 异亮氨酸 6.181 苏氨酸 4.490 天门冬氨酸 6.899 亮氨酸 13.598 色氨酸 1.925 半胱氨酸 2.855 赖氨酸 10.333 酪氨酸 3.415 谷氨酰胺 6.198 甲硫氨酸 20812 缬氨酸 5.520 谷氨酸 10.399 苯丙氨酸 3.113
按上述氨基酸的比例配制的粉末和欧氏平衡盐粉末按照重量比为1∶4.3混合，溶于适量双蒸水中，再加入适量小牛血清，其中小牛血清与双蒸水的体积比为1∶9，混合制成细胞培养液。
所述的细胞培养液除菌过滤后，存于4.8摄氏度的冰箱。
通过本发明技术方案制备的细胞培养液，具有避免引入动物性污染源，原料生产避免酸水解更环保，成分稳定，不与人争奶等四大好处。所以CDM水解乳蛋白培养基完全可以推广。
【附图说明】
图1为BHK_21加入加入本发明72小时后细胞在显微镜下的照片；
图2为加入水解乳蛋白的培养基培养的BHK_21细胞72小时后的显微镜照片；
图3为本发明培养基和进口对照培养基细胞生长曲线图。
【具体实施方式】
下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明的技术特点。
材料、试剂：
汉氏平衡盐溶液的配制：
氯化钠80g/L，葡萄糖1.0g/L，氯化钾0.40g/L，磷酸二氢钠0.048g/L，酚红0.01g/L。
欧氏平衡盐溶液(Earle’s balanced salt solution)旭太生物工程有限公司产品
倒置相差显微镜上海光学仪器厂
二氧化碳培养箱日本产。5％二氧化碳，36摄氏度
小北京瓶用于细胞静态培养
器皿经普通洗涤后，用磷酸三钠溶液浸泡，再清洗；110摄氏度干燥，高压消毒后使用。
接种细胞于10万级无菌室中，100级超净工作台上进行。
1、培养液配制方法：
氨基酸的规格为L-型医用标本。其他药品为分析纯或医用纯标本。BHK_21细胞来自中科院细胞库。
水解乳蛋白的氨基酸以表1所列数据配制
氨基酸名称 含量(％) 氨基酸名称 含量(％) 氨基酸名称 含量(％) 丙氨酸 5.877 甘氨酸 1.415 脯氨酸 4.340 精氨酸 2.462 组氨酸 1.462 丝氨酸 2.971 天门冬酰胺 3.735 异亮氨酸 6.181 苏氨酸 4.490 天门冬氨酸 6.899 亮氨酸 13.598 色氨酸 1.925 半胱氨酸 2.855 赖氨酸 10.333 酪氨酸 3.415 谷氨酰胺 6.198 甲硫氨酸 20812 缬氨酸 5.520 谷氨酸 10.399 苯丙氨酸 3.113
CDM水解乳蛋白培养基：秤取2克按表一氨基酸比例配制的粉末和8.6克欧氏平衡盐粉末，溶于900ml双蒸水中，再加入100ml小牛血清，制成细胞培养液，除菌过滤后，存于4.8摄氏度的冰箱中备用。
传统水解乳蛋白培养基：秤取5克水解乳蛋白粉末(Difco产品)，溶于900ml欧氏平衡盐溶液中，加入100ml小牛血清，制成天然水解乳蛋白细胞培养液，除菌过滤后存于4.8摄氏度的冰箱中备用。
2、两种培养基对细胞生长情况的比较：
用MEM培养液培养72小时的BHK21细胞悬液1ml，倾去MEM培养液，将含有0.25％胰蛋白酶的汉氏平衡盐溶液0.5ml加入到培养瓶中(汉氏平衡盐溶液不含钙和镁离子)，30摄氏度温浴1分钟后倾倒入离心管中，离心，使细胞沉淀，吸去溶液，用1mlCDM水解乳蛋白培养液洗涤细胞一次，离心，去除上层溶液，细胞沉淀用1mlCDM水解乳蛋白培养液将其制成悬浊液，加入到已经准备好的含有6ml相同培养液的小北京瓶中，一瓶母细胞可以分成3份。
将含有BHK21细胞的培养瓶在37摄氏度，5％二氧化碳的培养箱中培养72小时，按0、24、48、72小时观察细胞生长情况。
用Difco水解乳蛋白制成的水解乳蛋白培养基液，以上述相同的方式操作。
3、细胞定量和生长速度测定
1)分别取两种培养液，置于小北京瓶中每瓶6ml，每次各5瓶，各接入BHK 21细胞100000/ml；放入二氧化碳培养箱中按同样方法培养，经24小时，48小时，72小时观察细胞数量的变化。
2)细胞悬液的制备：从完成培养的细胞中，以0.25％的胰蛋白酶(250U/mg)消化贴于培养瓶上的细胞，制成细胞悬浊液，取出0.1ml，加入0.9ml培养液，配制成能计数细胞的液体。如细胞个数太多，再取0.1ml稀释成1ml。
3)细胞计数：用清洁的标准细胞计数板，放上盖玻片，将稀释好的细胞悬液滴在盖玻片和计数板之间，使悬液自由扩散，充满间隙，不留气泡。待细胞沉淀后计数，一般每一格一个细胞。
4)用低倍的物镜观察，以计数板格线和细胞看清楚为标准，观察对角的4大格，按以下公式计算细胞数：(四个大格细胞总数/4)×稀释倍数×104＝细胞数/ml；
5)将数据制表并制细胞生长曲线图。
4、利用乳蛋白的化学结构式，计算出乳蛋白的氨基酸的种类，和一个蛋白分子结构中每种氨基酸的数目和重量，根据此数量可以计算出各种氨基酸在乳蛋白中的百分比，根据此百分比来配制其各种氨基酸在水解乳蛋白培养基中地含量。
氨基酸名称 分子量 氨基酸个数 分子量×个数 丙氨酸 89.09 14 1247.26 精氨酸 174.20 3 522.6 天门冬酰胺 132.12 6 792.72 天门冬氨酸 133.1 11 1464.1 半胱氨酸 121.16 5 605.8 谷氨酰胺 146.15 9 1315.35 谷氨酸 147.13 15 2206.95 甘氨酸 75.07 4 300.28 组氨酸 155.16 2 310.32 异亮氨酸 131.17 10 1311.7 亮氨酸 131.17 22 2885.74 赖氨酸 146.19 15 2192.85 甲硫氨酸 149.21 4 596.84 苯丙氨酸 165.19 4 660.76 脯氨酸 115.13 8 921.04 丝氨酸 105.09 6 630.54 苏氨酸 119.12 8 952.96 色氨酸 204.23 2 408.46 酪氨酸 181.19 4 724.76
缬氨酸 117.15 10 1171.5 合计 162 21222.53
由此表计算出表1水解乳蛋白氨基酸成分
一般乳蛋白中除了构成蛋白质的氨基酸外，还有糖类、脂肪、无机盐(灰份)和有机物，故蛋白质的含量为80％。在天然蛋白质中氨基酸的氮含量为6.25％，而总氮的含量为12.5％，故氨基酸含氮量和总氮之比为0.5，故在文献中使用5g/L天然的水解乳蛋白，在化学限定的合成水解乳蛋白的数量为5×80％×50％，约为2g/L。故秤取2克化学限定的合成水解乳蛋白，即可相当于5克天然水解乳蛋白。
比较图1和图2，在72小时后无明显差异，因此CDM水解乳蛋白培养基和天然水解乳蛋白培养基在培养细胞上雷同。
5、细胞定量和生长速度
细胞的生长速度在工业生产中很重要，因为它可以节约生产成本，在实验过程中也表示了各种细胞的特性。不同培养时间取样读数后其结果如下表：
时间 0时 24小时 48小时 72小时 自制培养基 5×104 61×104 175×104 240×104 Difco培养基 5×104 62×104 180×104 250×104
其生长曲线图：以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线图如图3所示。可以看出，两者生长速度基本没有什么区别。