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1、10申请公布号CN101974080A43申请公布日20110216CN101974080ACN101974080A21申请号201010553754122申请日20101122C07K14/405200601C07K1/1620060171申请人中国科学院水生生物研究所地址430072湖北省武汉市武昌东湖南路7号72发明人肖邦定吴幸强李仁辉74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法57摘要本发明公布了一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其步骤A、藻粉材料收获野外水华蓝藻或室内培养的铜绿微囊藻冷冻干燥后制成。
2、干藻粉；B、固相萃取小柱制备在SPE柱中装入C18填料；C、藻毒素提取称取干藻粉，按比例加入甲醇，室温下置于摇床上振荡；D、杂质去除将上清液与有机萃取剂按比例加入分液漏斗，混合摇匀，静置，分层后弃去有机萃取剂；E、藻毒素分离纯化预处理后，试样溶液通过预先活化的串联组合的SPE小柱进行富集，用2050甲醇水溶液洗脱毒素；F、MC检测。方法分离效果好，上样量大，操作简便，成本低，一次性可得到不小于10MG、纯度较高的二种微囊藻毒素，HPLCUV/DAD检测达到8590。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN101974084A1/1页21。
3、一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其步骤如下A、藻粉材料收获野外水华蓝藻或室内培养的铜绿微囊藻冷冻干燥制成干藻粉，20C保存；固相萃取小柱制备在SPE柱中装入053GC18填料或SUNCHROM球形硅胶，用垫片压紧后保存待用；SPE柱临用前用3050ML甲醇和3050ML水进行活化，SPE柱的串连采用不锈钢针头穿孔橡皮塞进行连接，第一个SPE小柱的填料重量052G与待处理的藻粉重量的比例为110140；藻毒素提取称取干藻粉，按2050ML/G的比例加入75V/V甲醇水溶液，室温置于摇床上振荡40120MIN或在搅拌器上连续搅拌40120MIN，取出后以30004500R/MIN。
4、的转速离心1030MIN，取出上清液；杂质去除将所得的上清液与有机萃取剂按10112的比例加入分液漏斗，混合摇匀，静置1560MIN，分层后弃去有机萃取剂，再次加入上述比例的萃取剂重复萃取一次，弃去有机萃取剂；剩余溶液用旋转蒸发器减压蒸发除去有机溶剂，过045M的滤膜用高效液相色谱测定其毒素含量后，进入后续的藻毒素分离纯化步骤；藻毒素分离纯化预处理后，试样溶液通过预先活化的24个串联组合的SPE小柱进行富集，通过调节上样量，使第一个SPE小柱因富积大量色素杂质不能保留MC，MC被吸附固定于后续的小柱，富集完毕，用100300ML520V/V的甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗后弃去第一个SPE柱；继续用。
5、2050V/V的甲醇水溶液洗脱剩余SPE小柱中吸附的微囊藻毒素，上样、淋洗及洗脱的速度控制在25ML/MIN，通过实时监测毒素含量的变化，确定分段收集的洗脱液中含MC的组分及纯度，纯度达8590的含目标MC的组分于3040C旋转蒸发浓缩至干，用70V/V甲醇水溶液定容，保存于20C冰箱中；MC检测采用色谱条件，PHENOMENEXSYNERGI4MHYDRORP80A，46250MM，流动相甲醇005三氟乙酸6238等度洗脱，流速1ML/MIN，检测波长238NM，进样量10L，根据MCLR和MCRR标准品的色谱图对纯化的MCS进行定性定量；所述的C18填料是富集毒素后，采用低浓度3050，V。
6、/V的甲醇水溶液洗脱，其中2030V/V的甲醇水溶液实现MCLR与未知毒素的完全分离，3050V/V的甲醇水溶液实现MCLR与MCRR的完全分离。2根据权利要求1所述的一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其特征在于所述的有机萃取剂为三氯甲烷与二氯甲烷的混合液，比例10115。3根据权利要求1所述的一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其特征在于所述的第一个SPE小柱因富积色素杂质不能保留MC，采用24个小柱串联组合。权利要求书CN101974080ACN101974084A1/5页3一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法技术领域0001本发明涉及二种微囊藻毒。
7、素分离纯化的方法，属于生化分离技术领域，更具体涉及一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，特别适合于野外水华蓝藻或室内培养微囊藻中微囊藻毒素MCLR、MCRR的纯化。背景技术0002水体富营养化日益严重，有害蓝藻水华频繁暴发已成为全球性的生态环境问题。蓝藻毒素是蓝藻水华产生的次生代谢产物，研究表明蓝藻毒素不仅造成水生态系统恶化，而且可能威胁到人类健康。我国是世界上蓝藻水华发生强度、频率最高和持续时间最长的国家之一，更为严重的是，我国淡水湖泊中发生的水华80是有毒的，2007年震惊中外的无锡饮用水危机事件就与蓝藻水华有关。在有毒蓝藻水华产生的毒素中，微囊藻毒素（MC）可能是分布最广毒性。
8、最大的种类之一。迄今为止，已经鉴定的微囊藻毒素达80余种，但研究最多的仅限于MCLR、MCRR、MCYR、MCLA和MCLF等少数几种（其中前3种是我国和亚太地区有毒蓝藻水华经常检出的毒素），也仅美、日、德等少数几家公司（如SIGMAALDRICH、CALBIOCHEM、KANTOREAGENTS、WAKO等）可提供少量的这类纯品。由于方法和技术等因素使微囊藻毒素的制备比较困难，纯品MC价格昂贵（以SIGMAALDRICH提供的价格计算，1GMC纯品价格高达500,000美元）。许多研究如用纯毒素样品进行试验，其费用高得惊人，极大地限制了研究的深入。但是，如果采用纯度较高（8590）的毒素开展。
9、各种试验，定性定量时才采用纯品MC进行校正，既可大大降低研究费用，又可克服藻毒素纯度较低时含有较多杂质对研究造成的不利影响。我国近年来围绕MC的研究涉及其产生机制、环境介质中浓度测定、有效去除方法研发及生态毒理学效应等方面，这些研究均需要大量的纯度较高（8090）的MC。在这种背景下，研制开发在产量（10MG以上）和纯度上（8590）均满足国内需求的微囊藻毒素显得非常紧迫和必要。0003目前从微囊藻中提取纯化毒素的方法有多种，但是要同时获得二种或二种以上较高纯度的微囊藻毒素都比较困难，主要技术瓶颈在于如何将微囊藻中含有的多种毒素进行分离及如何去除杂质的干扰。目前，C18反相色谱（如反相快速色谱。
10、）是常用的藻毒素富集和去除杂质的方法，但这一方法存在诸多缺点。一方面上样量较大时，柱压非常高，限制了上样量，也限制了流速，很难将MCS洗脱下来；另一方面，在洗脱过程中，一部分色素和藻毒素同时被洗脱下来，很难分离，给后续的分离纯化工作带来很大影响；另一部分保留在柱子上导致柱子污染而报废整个色谱柱。因此，用常规的C18反相柱分离纯化的方法存在成本较高和上样量较低等缺点。0004通过对中国专利网进行检索，目前已有多项专利涉及分离纯化MC的专利。闰海等（CN011451211）利用单一的SPE小柱富集MCS，利用3050的甲醇水溶液淋洗杂质，用60100甲醇洗脱毒素，可以从野外水华中获得MCRR和MC。
11、LR，但不能将二者分开；或从室内培养藻中获得MCLR,但因使用单柱，限制了其分离效率，同时淋洗步骤（3050甲醇水溶液）会损失部分MCLR，导致产量和产率不高。徐立红等（CN2005100245739）利用多说明书CN101974080ACN101974084A2/5页4步层析法同时分离纯化MCLR和MCRR，可制备毫克级纯度90的毒素。该分离纯化过程复杂，包括一次反相硅胶柱分离，二次正相硅胶柱分离，得到的MCLR和MCRR再分别经制备HPLC和离子交换层析，最后用C18小柱脱盐。分离纯化过程使用的层析柱容量较大，耗费试剂量大，但产量低（仅能获得毫克级毒素）。宋立荣等（CN021390932）。
12、利用中空纤维超滤器除杂质，经C18柱初步纯化获得粗毒素，再经制备HPLC和薄层层析等步骤纯化微囊藻毒素，适于毫克级微囊藻毒素的制备。该过程亦较复杂，从薄层层析上获得毒素的过程较为繁琐。耿志明等（2009100336933）利用SPE柱先富集MCS,经淋洗去除部分杂质后洗脱毒素，毒素浓缩蒸干后再经过一个较大容量的C18层析柱进行分离，其分离纯化过程类似1996年EDWARDS等采用的反相快速色谱。由于洗脱液中含有甲酸或三氟乙酸，获得的毒素如不除酸，在长期的放置过程中会产生变化。虞锐鹏等（2007101906102）利用大孔吸附树脂替代C18填料，经二次大孔吸附树脂层析柱分离，得到纯度80的MCR。
13、R、MCYR和MCLR。但该方法需要使用大容量的层析柱（10100CM），且需经二次层析柱分离过程。大孔吸附树脂尽管价格便宜，但树脂中固有的有机物质很难洗净。除以上专利外，笔者的二项专利（CN2004100129216、CN2004100129201），前者涉及利用一种有机萃取剂有效去除大量色素及其它杂质，主要应用于前处理过程；后者利用反相制备液相色谱实现MCRR和DHA7MCRR的分离纯化，但一次纯化的毒素量不足毫克。0005从以上专利的申请可以看出,目前我国对MC的研究需求有力地推动了MC分离纯化的研发。但如前所述，上述方法还或多或少存在一些缺陷，具体表现在（1）一次性获得的毒素量普遍较低。
14、；（2）分离纯化步骤多，不能连续，毒素损失较大，产率低；（3）色素及其它杂质仍是影响毒素分离纯化工艺的主要因素，这一问题未能较好解决。发明内容0006本发明的目的在于提供了一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，方法采用多个内含硅胶颗粒的固相萃取小柱串联组合，实现微囊藻毒素的快速富集、分离和纯化。方法分离效果好，上样量大，操作简便，成本低，一次性可得到不小于10MG、纯度较高（HPLCUV/DAD检测达到8590）的二种微囊藻毒素（MCLR和MCRR）。0007为了达到上述目的，本发明在筛选多种色谱填料和优化色谱分离条件的基础上，确定了固相萃取小柱的填料及其合理的色谱分离条件。本发明。
15、对微囊藻毒素的分离纯化工艺进行了重大改进和优化，发明了一套利用串联的SPE柱进行高负载、高效分离纯化MCS的方法，该方法可以一次性获得10MG以上的纯度达8590的毒素，能满足国内众多实验室进行微囊藻毒素研究时需要大量较纯毒素（8090）的需求。0008一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其步骤如下A、藻粉材料收获野外水华蓝藻或室内培养的铜绿微囊藻（MICROCYSTISAERUGINOSA），冷冻干燥（54C冷冻干燥2448H）制成干藻粉，20C保存。0009B、固相萃取（SPE）小柱制备在SPE柱（10ML，内径15MM）中，装入053GC18填料（1535M，ODS或SUN。
16、CHROM球形硅胶，北京金欧亚科技发展有限公司），用垫片压紧后保存待用。SPE柱临用前用3050ML甲醇和3050ML水进行活化。SPE柱的串连采用不锈钢针头穿孔橡皮塞进行连接。第一个SPE小柱的填料重量（052G）与待处理的藻粉重量的比例为110140。说明书CN101974080ACN101974084A3/5页50010C、藻毒素提取称取干藻粉，按2050ML/G的比例加入75（V/V）甲醇水溶液，室温（2025C以下相同）下置于摇床上振荡40120MIN或在搅拌器上连续搅拌40120MIN，取出后以30004500R/MIN的转速离心1030MIN，取出上清液。0011D、杂质初步去除。
17、将所得的上清液与有机萃取剂按10112的比例加入分液漏斗，混合摇匀，静置1560MIN，分层后弃去有机萃取剂，再次加入上述比例的萃取剂重复萃取一次，弃去有机萃取剂；剩余溶液用旋转蒸发器减压蒸发除去有机溶剂，过045M的滤膜用高效液相色谱（HPLC）测定其毒素含量后，进入后续的藻毒素分离纯化步骤。所述的有机萃取剂为三氯甲烷与二氯甲烷的混合液（比例10115）。0012E、藻毒素分离纯化预处理后，试样溶液通过预先活化的24个串联组合的SPE小柱进行富集。通过调节上样量，使第一个SPE小柱因富积大量色素杂质而不能保留MC，MC被吸附固定于后续的小柱。富集完毕，用100300ML520（V/V）的甲醇。
18、水溶液淋洗小柱，淋洗后弃去第一个SPE柱；继续用2050（V/V）的甲醇水溶液洗脱剩余SPE小柱中吸附的微囊藻毒素。上样、淋洗及洗脱的速度控制在25ML/MIN。通过实时监测毒素含量的变化，确定分段收集的洗脱液中含MC的组分及纯度。纯度达8590的含目标MC的组分于3040C旋转蒸发浓缩至干，用70（V/V）甲醇水溶液定容，保存于20C冰箱中。0013F、MC检测采用如下色谱条件，PHENOMENEXSYNERGI4MHYDRORP80A，46250MM，流动相甲醇005三氟乙酸6238等度洗脱，流速1ML/MIN，检测波长238NM，进样量10L。根据MCLR和MCRR标准品的色谱图对纯化的。
19、MCS进行定性定量。0014其特征在于,所述的C18填料的特点是富集毒素后，采用较低浓度（3050，V/V）的甲醇水溶液洗脱即可实现微囊藻毒素的快速分离和纯化。其中2030（V/V）的甲醇水溶液可实现MCLR与未知毒素的完全分离,3050（V/V）的甲醇水溶液可实现MCLR与MCRR的完全分离。0015其特征在于，上样时使第一个SPE小柱因富积大量色素杂质而不能保留MC，经淋洗后弃去该小柱。0016其特征在于，采用24个小柱串联组合，可一次性实现大批量（10MG）的微囊藻毒素的富集与纯化。0017其特征在于，通过实时监测毒素含量的变化，确定分段收集的洗脱液中含MC的组分及纯度。0018本发明与。
20、现有的分离技术相比，有以下的优点和效果A解决了MCLR与未知毒素、MCLR与MCRR分离难的问题，利用优选的C18填料组装的串联固相萃取小柱，采用低浓度的甲醇水溶液可实现毒素的完全分离，节省了成本。0019B第一个固相萃取小柱富集了大量色素和其它杂质，导致负载量较大且不能保留MC，MC被吸附固定于后续的小柱。利用这一特性，将第一个小柱在洗脱前弃去，极大地避免了这些色素和杂质对后续洗脱程序的影响，这是以往分离纯化毒素过程中从未使用的关键技术。0020C毒素的上样量较大（10MG），操作简便，用多个固相萃取小柱代替大体积的反相色谱柱，可从微囊藻中一次性获得10MG以上较高纯度（8590）MCLR、。
21、MCRR。0021D成本低，固相萃取小柱串联组合后，可节省大量有机溶剂。同时，固相萃取小柱成本低，除必须弃用的第一个小柱外，其它小柱用100甲醇（含005TFA）再生后还可重复说明书CN101974080ACN101974084A4/5页6利用。附图说明0022图1为一种野外收集的蓝藻粗提物中MCRR、MCLR的HPLC色谱示意图。0023主要含有MCRR和MCLR二个毒素峰，杂质峰的干扰较大。0024图2为一种室内培养微囊藻粗提物中MCLR及多种未知MC毒素的HPLC色谱示意图。0025MCLR后面含有至少3个未知的毒素峰。0026图3为一种经串联小柱纯化后的MCRR的HPLC色谱示意图。0。
22、027最大紫外特征吸收峰为238NM，与MCRR标准品一致。0028图4为一种经串联小柱纯化后的MCLR的HPLC色谱示意图。0029最大紫外特征吸收峰为238NM，与MCLR标准品一致。具体实施方式0030一种利用串联固相萃取小柱分离纯化微囊藻毒素的方法，其步骤如下1藻粉材料收获野外水华蓝藻或室内培养的铜绿微囊藻（MICROCYSTISAERUGINOSA），冷冻干燥后制成干藻粉，保存于20C。00312固相萃取（SPE）小柱制备在SPE柱（10ML，内径15MM）中，装入1GC18填料（1535M，ODS或SUNCHROM球形硅胶，北京金欧亚科技发展有限公司），用垫片压紧后保存待用。SPE。
23、柱临用前用30ML甲醇和30ML水进行活化。SPE柱的串连采用不锈钢针头穿孔橡皮塞进行连接。第一个SPE小柱的填料重量（05或10或15或2G）与待处理的藻粉重量的比例为110140。00323藻毒素提取称取20G干藻粉（约含MC20MG），加入500ML75（V/V）甲醇水溶液，室温下置于摇床上振荡90MIN或在搅拌器上连续搅拌90MIN，取出后以4000R/MIN的转速离心20MIN，取出上清液；按此步骤重复提取两次，将三次提取的上清液合并，进行下一步处理。00334杂质去除将所得的上清液与有机萃取剂按31的比例加入分液漏斗，混合摇匀，静置30MIN，分层后弃去有机萃取剂，再次加入上述比例。
24、的萃取剂重复萃取一次，弃去有机萃取剂。剩余溶液用旋转蒸发器减压蒸发除去有机溶剂，过045M的滤膜用HPLC测定其毒素含量后，进入后续的藻毒素分离纯化步骤。所述的有机萃取剂为三氯甲烷与二氯甲烷的混合液（比例21）。00345藻毒素的分离纯化预处理后，使试样溶液通过串联的3个SPE小柱进行富集。为克服淋洗过程中毒素的流失，SPE串连小柱后再连接一个新的SPE小柱。用200ML10（V/V）甲醇水溶液淋洗，弃去第一个SPE小柱，余下的3个SPE小柱继续依次用25和40（V/V）的甲醇水溶液洗脱，通过实时监测毒素含量的变化，确定分段收集的洗脱液中含MC的组分及纯度。纯度达8590的含目标MC的组分于3。
25、2C旋转蒸发浓缩至干，用70（V/V）甲醇水溶液定容。00356MC检测用HPLC进行实时监测各个组分里MC含量的变化情况，采用如下色谱条件，PHENOMENEXSYNERGI4MHYDRORP80A，46250MM，流动相甲醇005三氟乙说明书CN101974080ACN101974084A5/5页7酸6238等度洗脱，流速1ML/MIN，检测波长238NM，进样量10L，根据MCLR和MCRR标准品的色谱图对纯化的MCS进行定性定量。0036其特征在于,所述的C18填料的特点是富集毒素后，采用较低浓度（30或35或40或45或50，V/V）的甲醇水溶液洗脱即可实现微囊藻毒素的快速分离和纯化。
26、。其中20或24或27或30（V/V）的甲醇水溶液可实现MCLR与未知毒素的完全分离,30或37或44或50（V/V）的甲醇水溶液可实现MCLR与MCRR的完全分离。0037其特征在于，上样时使第一个SPE小柱因富积大量色素杂质而不能保留MC，经淋洗后弃去该小柱。0038其特征在于，采用24个小柱串联组合，可一次性实现大批量（10MG）的微囊藻毒素的富集与纯化。0039其特征在于，通过实时监测毒素含量的变化，确定分段收集的洗脱液中含MC的组分及纯度。说明书CN101974080ACN101974084A1/2页8图1图2图3说明书附图CN101974080ACN101974084A2/2页9图4说明书附图CN101974080A。