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1、(10)授权公告号 CN 1919870 B (45)授权公告日 2010.11.24 CN 1919870 B *CN1919870B* (21)申请号 200610112963.6 (22)申请日 2006.09.13 C07K 14/56(2006.01) C12N 15/21(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 38/21(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 31/18(2006.01) A61P 31/12(2006.01) (73)专利权人 中。
2、国科学院微生物研究所 地址 100080 北京市海淀区中关村北一条 13 号 (72)发明人 刘文军 杨利敏 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 US 5508291 A,1996.04.16, 全文 . US 2004/0105841 A1,2004.06.03, 实施例 1-2、 SEQ ID NO ： 9-10. CN 1730491 A,2006.02.08, 全文 . Taira, O., Suzuki, M., Takeuchi, Y., Aramaki, Y., Sakurai, I.,Watanabe, T., Motokaw。
3、a, K., Arai, S., Sato, H., Maehara, N.Expression of feline interferon- subtypes in Esherichia coli,and their antiviral activity and animal species specificity.Journal of Veterinary Medical Science67 5.2005,67(5),543-545. Nagai,A., Taira,O., Ishikawa,M., Hiramatsu,K., Hohdatsu,T.,Koyama,H., Arai,S., 。
4、Sato,H., Nakano,K., Maehara,N.,.Cloning of cDNAs encoding multiple subtypes of felineinterferon- alpha from the feline epitherial cell line.J. Vet. Med. Sci.66.2004,66725-728. (54) 发明名称 一种猫 干扰素及其编码基因与其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种猫 干扰素及其编码基 因与其应用。该猫 干扰素， 是具有下述氨基酸 残基序列之一的蛋白质 ： 1)序列表中的SEQID ： 1 ； 2) 将序列表中 SEQID。
5、 ： 1 的氨基酸残基序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有 干扰素相关功能的蛋白质。本 发明猫 干扰素可作为活性成分， 制备抗猫白血 病病毒、 猫爱滋病毒以及狗细小病毒的抗感染药 物。本发明的设计合成的在大肠杆菌和毕赤酵母 中均能高效表达猫 干扰素编码基因， 在大肠杆 菌和毕赤酵母中高效表达， 表达量达菌体总蛋白 的 50以上， 周期短， 成本低。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王大鹏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 2 页 CN 1919870 B1/1 页 2 1. 一。
6、种猫 干扰素基因， 其核苷酸序列为序列表中 SEQ ID ： 2 所示的 DNA 序列。 2. 含有权利要求 1 所述猫 干扰素基因的重组表达载体。 3. 含有权利要求 1 所述猫 干扰素基因的工程菌。 4. 含有权利要求 1 所述猫 干扰素基因的转基因细胞系。 5. 一种表达猫 干扰素的方法， 是将权利要求 1 所述的猫 干扰素基因通过表达载 体导入宿主细胞， 筛选得到表达猫 干扰素的工程细胞， 培养工程细胞， 表达得到猫 干 扰素。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于 ： 所述宿主为大肠杆菌或酵母菌 ； 当所述宿 主为大肠杆菌时， 所述表达载体为 pBV220 ； 当所述宿主为酵母。
7、菌时， 所述表达载体为 pPICZ A。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述大肠杆菌为大肠杆菌 DH5 ； 所述酵 母菌为酵母菌 SMD1168H ； 所述猫 干扰素基因插入到 pBV220 的 BamHI 和 EcoRI 的酶切位 点间或插入 pPICZA 的 XhoI 和 XbaI 的酶切位点间。 8. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法中， 所述宿主为大肠肝菌时， 所 述工程细胞 42进行诱导表达， 诱导时间为 6 小时 ； 当所述宿主为酵母菌时， 所述工程细胞 用甲醇进行诱导表达， 所述甲醇的终浓度为 0.1-1.0 ； 所述百分含量为质量。
8、百分含量。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述甲醇的终浓度为 0.5 ； 所述百分含 量为质量百分含量。 权 利 要 求 书 CN 1919870 B1/11 页 3 一种猫 干扰素及其编码基因与其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种猫 干扰素及其编码基因与其应用。 背景技术 0002 干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应， 而产生并分泌的一类 天然生成的蛋白分子， 分子量为 15,000-21,000 道尔顿。已经确定的干扰素有两大类 ： I 型 和 II 型。I 型干扰素包括 IFN-、 IFN-、 IFN- 和 IFN- 四个亚型， II 型干扰。
9、素主要 有 IFN-。 0003 1992 年，日 本 东 丽 株 式 会 社 (Toray Industries， Inc.) 的 Nakamura 等 人 首次分离到了猫干扰素基因 (Molecular cloning of feline interferon cDNA by directexpression.Biosci Biotechnol Biochem.1992， 56(2) ： 211-4)， 并于 1993 年 将 其 归 类 于 型 干 扰 素 (Homogenous production of feline interferon in silkwormby replacin。
10、g single amino acid code in signal peptide region in recombinantbaculovirus and characterization of the product.J.Vet.Med.Sci.1993， 55(2) ： 251-8)。1994 年， 以其为基础的 Intercat重组干扰素药物在日本上市， 并被用于 治疗猫 calicivirus 感染和狗细小病毒感染。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种猫 干扰素及其编码基因与其表达方法。 0005 本发明所提供的猫 干扰素， 名称为 FeIFN-， 是如下 (a) 或 (b。
11、) 的蛋白质 ： 0006 (a) 由序列表中序列 1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质 ； 0007 (b) 将序列表中序列 1 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有 干扰素功能的由 (a) 衍生的蛋白质。 0008 其中， 序列表中的序列 1 由 171 个氨基酸残基组成。 0009 为了使 (a) 中的 FeIFN- 分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定， 可在由 序列表中序列 1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质的 N 端连接上信号肽序列， 为了 (a) 中的 FeIFN- 便于纯化， 可在由序列表中序列 1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质的 N 端。
12、或 C 端 连接上如表 1 所示的标签。 0010 表 1. 标签的序列 0011 标签残基序列 0012 说 明 书 CN 1919870 B2/11 页 4 Poly-Arg 5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR Poly-His 2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 11 EQKLISEEDL 0013 上述 (b) 中的 FeIFN- 可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再按照下述方法进 行生物表达得到。上述 (b) 中的 FeIFN- 的编码基因可通过将序列表中 SEQID ： 。
13、2 的 DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突 变， 和 / 或在其 5端连上信号肽的编码序列， 和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示 的标签的编码序列得到。 0014 上述 干扰素编码基因 (FeIFN-) 也属于本发明的保护范围。 0015 所述猫干扰素编码基因， 是优化的猫干扰素基因， 具体可为如下1)、 2)或3) 的基因 ： 0016 1) 序列表中 SEQ ID ： 2 的 DNA 序列 ； 0017 2) 编码序列表中 SEQ ID ： 1 蛋白质序列的多核苷酸 ； 0018 3) 在严格条件下与序列表中 SEQ 。
14、ID ： 2 限定的 DNA 序列杂交的核苷酸序列。 0019 所述严格条件可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)， 0.1 SDS 的溶液中， 在 65下杂 交， 并用该溶液洗膜。 0020 序列表中序列2是由516个脱氧核苷酸组成， 自5端第1-516位核苷酸序列为编 码序列， 编码具有序列表中序列 1 的氨基酸残基序列。 0021 含有上述基因的重组表达载体、 工程菌和转基因细胞系也属于本发明的保护范 围。 0022 本发明所提供的表达猫 干扰素的方法， 是将上述 FeIFN- 通过表达载体导入 宿主细胞， 筛选得到表达猫 干扰素的工程细胞， 培养工程细胞， 表达得到猫 干扰素。 。
15、0023 所述表达载体可为 pBV220、 pPICZA、 pET 载体系列、 pQE 载体系列、 pPIC9K 或 pPICZ ； 优选为 pBV220 或 pPICZA。 0024 所述宿主细胞为任一可表达外源基因的原核或真核细胞 ； 所述原核细胞可为大肠 肝菌， 如 E.coli DH5、 E.coli TB1 或 E.coli BL21(DE3) 等 ； 所述真核细胞可为酵母细 胞、 哺乳动物细胞和植物细胞等， 包括酵母菌 SMD1168H、 酵母菌 GS115、 酵母菌 X-33、 酵母菌 KM71H、 COS-7、 CHO 或 BHK-21 等。 0025 当所述表达载体为 pBV。
16、220， 所述 FeIFN- 插入 pBV220 的 BamHI 和 EcoRI 的酶切 位点间， 所述宿主为大肠杆菌 DH5。 0026 当所述表达载体为 pPICZA， 所述 FeIFN- 插入 pPICZA 的 XhoI 和 XbaI 的酶 说 明 书 CN 1919870 B3/11 页 5 切位点间， 所述宿主为酵母菌 SMD1168H。 0027 当所述宿主为大肠肝菌时， 需 42进行诱导表达， 诱导时间优选为 6 小时。 0028 当所述宿主为酵母菌时， 需加入甲醇进行诱导表达， 所加入甲醇的终浓度为 0.1-1.0， 优选为 0.5 ； 所述百分含量为质量百分含量。 0029 。
17、本发明所提供的猫 干扰素， 其氨基酸序列具备 干扰素应具有的保守半胱氨 酸和脯氨酸氨基酸序列， 具备 型干扰素的特征。该蛋白质对猫白血病病毒、 FIV 以及狗 细小病毒具有抗感染作用。本发明的猫 干扰素编码基因在大肠杆菌和毕赤酵母中均能 高效表达猫 干扰素编码基因， 表达量达菌体总蛋白的 50以上， 周期短， 成本低。 0030 本发明猫 干扰素可作为活性成分制备抗猫白血病病毒、 猫爱滋病毒以及狗细 小病毒的抗感染药物。以本发明的猫 干扰素作为活性成分制备的药物也属于本发明的 保护范围。 0031 需要的时候， 在所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀。
18、释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面 活性剂、 吸附载体等。 0032 本发明的药物可以制成注射液、 片剂、 粉剂、 粒剂、 胶囊、 口服液等多种形式。上述 各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 0033 所述药物的用量一般为 1-2.5mU/kg 体重， 连续给药或隔天给药， 疗程为 3-7 天。 附图说明 0034 图 1 为 SDS-PAGE 检测猫 型干扰素基因在大肠杆菌中的表达产物结果 0035 图 2 为 SDS-PAGE 检测猫 型干扰素基因在酵母中的表达产物结果 0036 图 3 为经纯化的大肠杆菌表达的重组猫 型干扰素的 S。
19、DS-PAGE 检测结果 0037 图 4 为经纯化的酵母菌表达的重组猫 型干扰素的 SDS-PAGE 检测结果 0038 图 5 为经纯化的重组猫 型干扰素的高效液相色谱检测结果 具体实施方式 0039 下述实施例中所用方法如无特别说明， 均为常规方法。 0040 所有引物合成及测序工作均由北京三博远志生物公司完成。 0041 下述实施例中， 所述百分含量如无特别说明， 均为质量百分含量。 0042 实施例 1、 猫 干扰素基因的合成及其表达 0043 一、 猫 干扰素基因的合成 0044 参照猫干扰素基因序列(GENBANK号 ： AB094996)， 重新优化序列， 替换稀有密码 子， 。
20、调节 AT 含量， 使其可在大肠杆菌和毕赤酵母中均可高效表达， 交由北京三博远志生物 公司采用重叠 PCR 的方法合成优化后目的序列， 合成的序列具有序列表中序列 2 的核苷酸 序列， 将其命名为FeIFN-， 其编码序列表中序列1的氨基酸残基序列， 与人的型干扰素 的氨基酸残基序列的同源性为 50。 0045 二、 猫 型干扰素基因的表达及其表达产物的纯化 0046 1、 猫 型干扰素基因在大肠杆菌中的表达及发酵生产 0047 1) 含猫 型干扰素基因的大肠杆菌表达载体 FeIFN-/pBV220 的构建 说 明 书 CN 1919870 B4/11 页 6 0048 将 FeIFN- 基因。
21、通过 PCR 引入限制性内切酶 BamHI 和 EcoRI 酶切位点 ( 其中 PCR 的模板为步骤一合成的 FeIFN- 基因， 引物为 ： pBVfeIFNfor ： 5 GCAGAATTCATGTGTG ATTTGCCTCAAACTC 3 (EcoRI) ； pBVfeIFNrev ： 5 GTGGATCCTTATTTCTCAGATCTTAATCT TTT 3 (BamHI)， 亚克隆入 pMD18-T 载体 (Takara)， 转化大肠杆菌 DH5， 挑取阳性单克隆进行 基因测序， 将测序表明含有 FeIFN- 基因的载体命名为 pMD18-FeIFN-I。 0049 将上述构建的 p。
22、MD18-FeIFN-I 用限制性内切酶 BamHI 和 EcoRI 双酶切后插 入载体 pBV220 的 BamHI 和 EcoRI 酶切位点之间， 转化大肠杆菌 DH5。经 PCR 和酶切鉴 定后获得阳性重组菌， 将经鉴定表明含有 FeIFN- 的正确的重组载体命名为 FeIFN-/ pBV220， 将 FeIFN-/pBV220 转化大肠杆菌获得的含有 FeIFN-/pBV220 的阳性克隆命名 为 DH5-FeIFN-/pBV220。扩增培养工程菌 DH5-FeIFN-/pBV220， 30， 200 转 / 分 ( 旋转半径为 13mm) 振摇培养菌液 OD600至 1， 在 42下。
23、诱导 6 小时。培养结束后， 进行如 下处理 ： 10000g、 离心 10 分钟收集菌体经 TE 缓冲液洗涤后， 超声破菌， PBS 洗涤包涵体， 6M 盐酸胍溶解包涵体， PBS 复性得到表达产物， 进行 SDS-PAGE 电泳检测， 检测结果如图 1 所示 ( 泳道 M 为低分子量蛋白 Marker， 泳道 1 为表达产物 )， 在 20kD 左右处出现一条蛋白条带， 与猫 型干扰素蛋白大小相符， 表明重组猫 型干扰素基因 (FeIFN-) 在大肠杆菌中正 确表达。 0050 2) 重组猫 干扰素的发酵生产 0051 挑取步骤 1) 获得阳性克隆单菌落 DH5-FeIFN-/pBV220。
24、， 将其接种于 100 毫升 含有 100 毫克 / 毫升氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37摇瓶培养 12 小时， 作为一级种子 液 ； 再以 1 ( 体积比 ) 接种量将一级种子液转接于含 6 升 LB 液体培养基的发酵罐中， 在 与步骤 1) 相同的条件下培养至 OD600值为 1.0， 快速升温至 42， 诱导 6 小时。 0052 2、 猫 型干扰素基因在酵母中的表达及发酵生产 0053 1) 含猫 型干扰素基因的酵母表达载体 FeIFN-/pPICZA 的构建 0054 将 FeIFN- 基因通过 PCR 引入限制性内切酶 XhoI 和 XbaI 酶切位点 ( 其中 PCR 的。
25、模板为步骤一合成的 FeIFN- 基因， 引物为 ： pICfeIFNfor ： 5 TCTCTCGAGAAAAGAT GTGATTTGCCTCAAACTC 3 (XhoI) ； pICfeIFNrev ： 5 GGATCCTTATTTCTCAGATCTTAATC TTTT 3 (XbaI)， 亚克隆入 pMD18-T 载体 (Takara)， 转化大肠杆菌 DH5， 挑取阳性单克隆进行基 因测序， 将测序表明含有 FeIFN- 基因的载体命名为 pMD18-FeIFN-II。 0055 分别将 pMD18-FeIFN-II 用限制性内切酶 XhoI 和 XbaI 双酶切后插入载体 pPICZ。
26、A( 购自美国 invitrogen 公司 ) 的 XhoI 和 XbaI 酶切位点之间， 将得到的质粒 电转化酵母菌株 SMD1168H(invitrogen 公司 )， 将转化子铺于含 zeocin(Invitrogen 公 司 )100g/mL 的 YPDS( 含 1酵母提取物， 2酵母培养用胰化蛋白胨， 2葡萄糖， 1M 山梨 醇， 2琼脂 ) 平板， 30培养 2-3 天， 直至长出单菌落， 经 PCR 鉴定后获得阳性重组菌， 将 经鉴定表明含有 FeIFN- 的正确的重组载体命名为 FeIFN-/pPICZA。将 FeIFN-/ pPICZA 转化酵母菌株 SMD1168H 获得的。
27、含有 FeIFN-/pPICZA 的阳性转化子命名为 SMD-FeIFN-/pPICZA。将 SMD-FeIFN-/pPICZA 先接种于 BMGY( 含 1酵母提取物， 2酵母培养用胰化蛋白胨， 100mM磷酸钾(pH6.0)， 1.34YNB， 410-5生物素， 1甘油) 培养基中， 30培养 18h-20h， 待 OD600值为 2-6 时， 1500g 离心 5min 收集菌体， 再换成 BMMY 培养基 ( 含 1酵母提取物， 2酵母培养用胰化蛋白胨， 100mM 磷酸钾 (pH 6.0)， 1.34 说 明 书 CN 1919870 B5/11 页 7 YNB， 410-5生物素。
28、， 0.5甲醇 )， 在相同条件下继续培养使其 OD600达到 1， 然后每 24 小 时加入终浓度为 0.5的甲醇诱导表达， 每 24 小时收集一次样品， 30诱导 48 小时。培养 结束后， 对发酵产物 10000g、 离心 10 分钟， 取上清进行 SDS-PAGE 电泳检测， 检测结果如图 2 所示 ( 泳道 M 为低分子量蛋白 Marker， 泳道 1 为表达产物 )， 在 24kD 左右处出现一条蛋白 条带， 与预期结果相符， 表明猫 型干扰素基因在酵母菌中正确表达。 0056 2) 重组猫 干扰素的发酵生产 0057 发酵罐为 B.Braun 公司的 Biostat B.， 容量。
29、为 5 升。具体的发酵过程为， 挑取步 骤 1) 获得的阳性克隆 SMD-FeIFN-/pPICZA 单菌落， 将其接种于 20mL 含 0.1g/mL zeocin 的 YPD 培养基 ( 含 1酵母提取物， 2酵母培养用胰化蛋白胨， 2葡萄糖 ) 中， 30、 250rpm( 旋转半径为 13mm) 培养 30 小时， 再接入 200mL 无 zeocin 的 YPD 培养基中， 30、 250rpm( 旋转半径为 13mm) 培养 24h。培养结束后， 离心收集菌体， 将菌体接种到 2 升 BMGY 培养基 ( 含 1酵母提取物， 2酵母培养用胰化蛋白胨， 100mM 磷酸钾 (pH 6。
30、.0)， 1.34 YNB， 410-5生物素， 1甘油 ) 中， 在 30、 溶氧 30以上、 pH 为 5.5 下， 培养 15h 后， 补加 50甘油， 流速 20mL 甘油 /L 菌液 / 小时， 当细胞湿重达 240g/L 时停补甘油， 当溶 氧大幅上升， pH 值上升， 培养基中甘油耗尽， 开始滴加 24甲醇诱导表达， 流速 3.6mL 甲醇 /L 菌液 /hr， 在 8 小时内， 将甲醇浓度增加到 70， 共诱导表达 5 天， 使猫 干扰素基因获 得表达。 0058 3、 重组猫 干扰素的纯化 0059 取 5L 步骤 1 得到的 DH5-FeIFN-/pBV220 发酵液， 1。
31、0000g、 离心 10min 收集菌 体， 经TE缓冲液洗涤后， 超声破菌， PBS洗涤包涵体， 6M盐酸胍溶解包涵体， PBS复性。 透析去 除盐酸胍后， 离心取上清。将步骤 2 得到的 1.5L SMD-FeIFN-/pPICZA 发酵液， 10000g、 离心 10min 沉淀菌体， 取上清。将获得的两种蛋白上清溶液分别用醋酸调节 pH 值为 4.8， 过阳离子交换层析柱 (HiTrap SP FF， AmershamBiosciences)， 收集目标洗脱峰， 再过阴离 子交换层析柱 (HiTrap Q FF， AmershamBiosciences)， 收集目标洗脱峰， 过 Sep。
32、hacry1 分 子筛层析柱 (AmershamBiosciences)， 收集目标洗脱峰， 过滤除菌后分别得到 100ml 纯化的 DH5-FeIFN-/pBV220 表达的重组猫 干扰素和 50ml 纯化的 SMD-FeIFN-/pPICZA 表达的重组猫 干扰素。以 Lowry 法测定蛋白含量。 0060 采用细胞病变抑制法对表达并纯化的猫 干扰素进行活性测定， 采用猫胚成纤 维细胞和水疱性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus， VSV)(ATCC 公司 ) 测定， 具体方 法为 ： 取怀孕 15 天的猫胚， 去头、 四肢及内脏， 无菌状态下用 PBS 洗三遍。
33、后， 剪碎。吹打成单 个细胞后上 96 孔板， 培养至全部贴壁生长后， 去除培养液， 分三组， 一组将日本产 intercat 猫干扰素(日本东丽株式会社， 货号CL01)稀释成107U/ml， 每孔加入0.1ml 4倍(40、 41、 42、 43直到411)倍比稀释， 一组每孔加入0.1ml 4倍(40、 41、 42、 43直到411)倍比稀释的步骤1获 得的 DH5-FeIFN-/pBV220 表达并经纯化的重组猫 干扰素， 另一组每孔加入 4 倍倍比 (40、 41、 42、 43直到 411) 稀释的步骤 2 获得的 SMD-FeIFN-/pPICZA 表达并经纯化的重组 猫 干扰。
34、素 0.1ml， 用 100 TCID50剂量的水疱性口炎病毒 (VSV) 进行攻毒， 对照孔加无病 毒的培养液， 同时设立阴性对照 ( 只加经倍比稀释的重组猫 干扰素， 不加病毒 )、 阳性对 照 ( 不加干扰素， 只加病毒 )、 空白对照 ( 不加干扰素， 不加病毒 )， 在倒置显微镜下观察日 本产 intercat 猫干扰素 1U/ml 的孔出现 50病变的时候判断结果。染色后在波长 570nm 说 明 书 CN 1919870 B6/11 页 8 处测定吸光度， 采用四参数回归计算法进行处理， 并按下式计算干扰素生物学活性。 0061 供试品生物学活性 Pr(DsEs)(DrEr) 0。
35、062 式中 Pr 为日本产 intercat 猫干扰素生物学活性 ； 0063 Ds 为供试品预稀释倍数 ； 0064 Dr 为日本产 intercat 猫干扰素预稀释倍数 ； 0065 Es 为供试品相当于日本产 intercat 猫干扰素半效量的稀释倍数 ； 0066 Er 日本产 intercat 猫干扰素半效稀释倍数。 0067 结果表明步骤 1 得到的 DH5-FeIFN-/pBV220 发酵的重组猫 干扰素活性为 5.9107U/ml 发酵液， 经微量蛋白测量仪测得， 其表达量为 120g/ml 发酵液， 6000g/ml 纯化液， 比活为 9.8106U/mg ； 步骤 2 得。
36、到的 SMD-FeIFN-/pPICZA 发酵的重组猫 干 扰素活性为 2.9107U/ml 发酵液， 经微量蛋白测量仪测得， 其表达量为 80g/ml 发酵液， 比活为 1.2107U/mg。 0068 对纯化的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳检测， 结果表明， 纯化的样品电泳在 20kD( 大肠 杆菌表达 ) 和 24kD( 毕赤酵母表达 ) 附近处均出现一条蛋白条带， 与预期结果相符， 表明获 得了纯度较高的猫 型干扰素， 部分检测结果如图 3 和图 4 所示 ( 泳道 M 为低分子量蛋白 Marker， 泳道 1 为纯化产物 )。 0069 对纯化的两种重组猫 干扰素进行液相色谱分析，。
37、 结果如图 5 所示， 目的蛋白峰 达 98以上 ( 图 5 中横坐标表示保留时间 ( 分钟 )， 纵坐标表示蛋白紫外吸收峰 )。 0070 实施例 2、 安全性实验 0071 1、 取 200 只 9 个月到两岁龄的猫 ( 雌雄各半 )， 每只按 107U/kg 体重的剂量静脉 注射实施例 1 获得的酵母菌表达并经纯化的重组猫 干扰素， 结果 43 只猫出现轻微嗜睡， 5-6 小时后症状消失。18 只猫体温略有升高， 但在正常范围之内。体液中电解质指标未见 异常。 0072 2、 取 200 只一岁到 7 岁龄的比格犬 ( 雌雄各半 )， 每只按 107U/kg 体重的剂量静 脉注射实施例 。
38、1 获得的大肠杆菌表达并经纯化的重组猫 干扰素， 结果 7 只犬出现轻微嗜 睡， 5-6 小时后症状消失。体液中电解质指标未见异常。 0073 实施例 3、 重组猫 干扰素的临床试用效果 0074 取经临床鉴定为患有急性腹膜炎的猫 30 只， 分为给药组和对照组， 每组 15 只。给 药组每天按 2.5106U/kg 体重剂量静脉注射实施例 1 获得的酵母菌表达的重组猫 干扰 素， 对照组只注射等量安慰剂 ( 生理盐水 )， 连续注射三天， 每天一次。每天观察试验动物， 对临床症状进行评分， 具体评分规则如表 2 所示， 结果表明给药组和对照组临床症状评分 统计学上存在明显差异 ( 表 3)，。
39、 注射重组猫 干扰素的患有急性腹膜炎的猫， 病情明显好 转， 具体表现为炎症减轻或消失， 发热症状消失， 表明实施例 1 获得的酵母菌表达的重组猫 干扰素可以有效地治疗猫腹膜炎病毒感染 ； 而注射安慰剂的对照组症状无改善。 0075 临床症状观察项目有无食欲、 是否呕吐、 腹泻状况、 精神状态、 脱水情况、 粪便 性状、 肛温、 体重等。 0076 临床症状评分标准按照下表给患病犬只进行打分， 分数越高， 体况越差， 满分 20 分时， 代表患犬死亡。 0077 评分时间和频率对试验动物从第一天开始每天评分一次。 说 明 书 CN 1919870 B7/11 页 9 0078 表 2. 临床症。
40、状进行评分标准 0079 症状 分数 死亡 20 肛温 39.5 37.1-39.4 37 1 2 3 精神状况 疲惫 ( 有意识， 有活力的 ) 萎靡 ( 有意识， 但无活力的 ) 昏迷 ( 无意识的 ) 1 3 4 脱水 5 ( 轻微皮肤开始出现褶皱 ) 8 ( 中等皮肤已存在褶皱 ) 12 ( 严重休克 ) 1 3 4 粪便性状 液态 ( 腹泻 ) 血便 2 4 腹痛 轻微 严重 1 2 呕吐 3 0080 表 3. 临床症状评分统计结果 0081 组别 给药组分数 对照组分数 给药前 给药后 给药前 给药后 1 15 6 14 15 说 明 书 CN 1919870 B8/11 页 1。
41、0 组别 给药组分数 对照组分数 2 17 4 13 13 3 14 5 15 14 0082 4 18 11 12 15 5 19 20 16 18 6 18 12 18 19 7 17 6 17 18 8 13 9 16 16 9 16 3 18 20 10 12 1 14 17 11 15 4 16 15 12 17 5 17 18 13 16 3 16 17 14 14 2 15 17 15 13 0 19 20 0083 2、 取经临床鉴定为患有肠炎型犬细小病毒病的犬 30 只， 分为给药组和对照组， 每 组 15 只。将给药组每天静脉注射 1.5106U/kg 的实施例 1 获得的。
42、大肠杆菌表达的重组猫 干扰素， 对照组只注射安慰剂 ( 生理盐水 )， 连续注射三天。每天观察试验动物， 对临床 症状进行评分， 具体评分规则如表 2 所示， 结果表明给药组和对照组临床症状评分统计学 上存在明显差异 ( 表 4) 大肠杆菌表达的重组猫 干扰素可以有效地治疗犬细小病毒感 染， 发病犬病情明显好转， 具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常， 发热、 呕吐、 腹泻 症状消失 ； 而注射安慰剂的对照组症状无改善。 0084 表 4. 临床症状评分统计结果 0085 说 明 书 CN 1919870 B9/11 页 11 组别 给药组分数 对照组分数 给药前 给药后 给药前 给药后 。
43、1 14 4 17 17 2 16 2 15 15 3 17 3 16 17 4 15 2 14 16 5 13 1 13 16 6 18 6 19 20 7 17 4 12 13 8 15 4 16 17 0086 9 14 3 18 17 10 12 2 12 10 11 15 3 16 17 12 11 2 14 14 13 10 0 12 13 14 12 0 11 15 15 13 3 19 20 0087 序列表 0088 2 0089 1 0090 171 0091 PRT 0092 人工序列 说 明 书 CN 1919870 B10/11 页 12 0093 0094 0095。
44、 1 0096 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr 0097 1 5 10 15 0098 Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp 0099 20 25 30 0100 Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser 0101 35 40 45 0102 His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Va。
45、l Thr Asn Gln Lys Ile 0103 50 55 60 0104 Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr 0105 65 70 75 80 0106 Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Arg 0107 85 90 95 0108 Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu Gly Glu Ala Pro Leu 0109 100 105 110 0110 Thr 。
46、Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Phe 0111 115 120 125 0112 Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 0113 130 135 140 0114 Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser 0115 145 150 155 160 0116 Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Ly。
47、s 0117 165 170 0118 2 0119 516 0120 DNA 0121 人工序列 0122 0123 0124 2 0125 tgtgatttgc ctcaaactca tggtttgttg aatagaagag ccttgacttt gttgggtcaa 60 0126 atgagaagat tgcctgcctc ttcctgtcaa aaggacagaa atgacttcgc cttcccacaa 120 0127 gacgttttcg gtggtgacca atcccacaag gcccaagcct tgtctgttgt tcacgttact 180 0128 aacc。
48、aaaaga tcttccactt cttctgtaca gaggcttcct cttctgctgc ttggaacacc 240 0129 accttgttgg aggagttctg tactggtttg gatagacaat tgaccagatt ggaggcctgt 300 0130 gtcctgcaag aggttgagga gggtgaggct ccattaacaa acgaggacat tcatcccgag 360 0131 gactccatct taagaaacta cttccaaaga ttatccttat acttacaaga gaagaaatac 420 说 明 书 CN 1919870 B11/11 页 13 0132 tctccttgtg cctgggagat cgtcagagca gagatcatga gatccttgta ttattcatca 480 0133 acagccttgc aaaaaagatt aagatctgag aaataa 516 说 明 书 。