发明领域
本发明涉及肽、组合物和其应用。本发明尤其涉及基于大蹼铃蟾缓激肽(maximakinin)(同义词铃蟾缓激肽M(bombinakinin M))的N-末端六肽并具有细胞生长刺激活性，尤其是促进血管发生的肽，以及其在治疗方法中的应用。
引言
来自两栖动物尤其是无尾动物的皮肤颗粒腺或毒腺的防御性分泌物是含有蛋白、生物胺、生物碱和过量生物活性肽的复杂分子混合物(Lazarus，L.H.和Atilla，M.(1993)Prog.Neurobiol.41，473-507)。许多皮肤肽展示与内源脊椎动物调节肽的高度结构相似性，但作为发生在保守的生物活性的核心序列之外的结构修饰的结果通常更具生物活性，这是其天然选择外源递送方式产生的特征(Erspamer等人(1985)Peptides 6，增刊3，7-12)。蛙皮素、铃蟾肽、皮啡肽和δ啡肽是两栖动物皮肤肽的实例，分别对内源脊椎动物缩胆囊素(CCK)、胃泌素释放肽(GRP)和μ-和δ阿片样受体展示增强的活性(Anastasi等人(1971)Experientia 27，166-167；Anastasi等人(1968)Archs.Biochem.Biophys.125，57-68；Broccardo等人(1981)Br.J.Pharmacol.73，625-631；Kreil等人(1989)Eur.J.Pharmacol.1 62，123-128 10)。
已从两栖动物皮肤分泌物分离大量缓激肽样肽，认为其中一些与两栖纲的防御机制相关(Conlon和Aronsson(1997)Peptides 18，361-365；Yasuhara等人(1979)Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)27，486-491；Nakajima，T.(1968)Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)16，769-774；Anastasi等人(1966)Br.J.Pharmacol.27，479-485；Yasuhara等人(1973)Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)21，138-139)。Lai等人(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.286，259-263描述从蟾蜍大蹼铃蟾(Bombina maxima)的皮肤分泌物分离缓激肽相关肽。尽管发现称为铃蟾缓激肽M的该肽对豚鼠回肠平滑肌具有收缩活性，该文 献的作者表示不清楚该肽的生理作用。
在与本申请共有主要发明人的WO 2004/069857中，描述了N-末端延伸的缓激肽大蹼铃蟾缓激肽。大蹼铃蟾缓激肽氨基酸序列为：Asp-Leu-Pro-Lys-Ile-Asn-Arg-Lys-Gly-Pro-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(SEQ ID NO：1)。发现与铃蟾缓激肽M(Lai等人(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.286，259-263)具有相同氨基酸序列的大蹼铃蟾缓激肽证实其对平滑肌作用的组织选择性。在WO 2004/069857中还鉴定了大蹼铃蟾缓激肽的大量C-末端活性片段。
发明概述
本发明人研究了大蹼铃蟾缓激肽的N-末端片段，并令人惊讶地证实，与预期相反，大蹼铃蟾缓激肽的N-末端片段对平滑肌展示有效的组织选择性作用。具体地，发现尽管不存在大蹼铃蟾缓激肽的C-末端残基(此前认为对其活性是必需的)，本文称为QUB 698.8的N-末端六肽证实对动脉平滑肌超过小肠平滑肌的高度选择性，导致有效地松弛动脉平滑肌，同时导致较不有效地收缩回肠平滑肌。
而且，这种N-末端片段不仅保持大蹼铃蟾缓激肽的组织选择性，还比大蹼铃蟾缓激肽显著更有效。
而且，本发明人意外地发现，尽管此前关于大蹼铃蟾缓激肽的研究表示该分子和其片段的促血管发生效应还依赖于大蹼铃蟾缓激肽C-末端残基的存在，N-末端六肽QUB698.8证实了有效的促血管发生活性。
因此，在第一方面，本发明提供一种促血管发生肽，其中所述促血管发生肽是QUB698.8或其生物活性片段或衍生物。
QUB698.8的氨基酸序列为：Asp-Leu-Pro-Lys-Ile-Asn(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案，本发明的促血管发生肽由氨基酸序列Asp-Leu-Pro-Lys-Ile-Asn(SEQ ID NO：2)组成。
在本发明上下文中，QUB698.8的片段是具有至少五个连续氨基酸的 肽，对应具有相同的五个连续氨基酸的QUB698.8区段。
QUB698.8的衍生物包括氨基酸序列为带有一个、两个或三个氨基酸取代、插入、缺失或其组合的SEQ ID NO：2的肽。
在一个实施方案，衍生物包含QUB 698.8的至少五个连续氨基酸。
具体的衍生物包括：
Leu-Pro-Lys-Ile-Asn(SEQ ID NO：3)
Asp-Leu-Pro-Lys-Ile(SEQ ID NO：4)
Asp-Leu-Pro-Lys-Ile-Asn-Arg-Lys(SEQ ID NO：5)
Leu-Pro-Lys-Ile-Asn-Arg-Lys-Gly(SEQ ID NO：6)
Asp-Leu-Pro-Lys-Ile-Asn-Arg-Lys-Gly(SEQ ID NO：7)
Leu-Pro-Lys-Ile-Asn-Arg-Lys-Gly-Pro(SEQ ID NO：8)。
而且，衍生物可在N-和/或C-末端包含附加的氨基酸。在这种实施方案，该衍生物优选地包含一至十一个附加的氨基酸，例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸。在本申请的上下文中，这种衍生物不包括具有大蹼铃蟾缓激肽自身氨基酸序列的肽。
这种片段和衍生物优选地保持促血管发生活性。
除非上下文另外要求，否则对本发明肽的提及包括这种衍生物和片段。
根据本发明的第二方面，提供编码根据本发明第一方面的肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸不编码包含序列ID No：1所示的氨基酸序列的多肽。
根据本发明的第三方面，提供引起动脉平滑肌细胞或组织松弛的方法，所述方法包括向所述细胞或组织施用根据本发明第一方面的促血管发生肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
在本发明的一个实施方案，本发明的促血管发生肽或用于本发明的促血管发生肽对动脉平滑肌的EC50小于大蹼铃蟾缓激肽对动脉平滑肌细胞 的EC50，和/或本发明的促血管发生肽对小肠细胞的EC50大于大蹼铃蟾缓激肽对小肠细胞的EC50。
令人惊讶地证实本发明的肽对平滑肌受体展示这种有效又选择性的效应，使得这种肽能够用来治疗心血管系统疾病同时将使用较不选择性的药剂带来的副作用减到最低。
因此，在本发明的第五方面，提供促进组织中血管舒张的方法，包括向所述组织施用根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
本发明的肽、多核苷酸和方法可对治疗心血管疾病特别有用，同时将例如对胃肠系统的有害副作用减到最低。
因此，在本发明的第六方面，提供治疗心血管疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
可使用本发明的心血管疾病包括血管舒张对其可有用的任何心血管疾病、病症或症状。例如，在一个实施方案，心血管疾病是高血压。在另一实施方案，心血管疾病是肺动脉高压。在进一步的实施方案，心血管疾病是冠状动脉疾病。在进一步的实施方案，心血管疾病是外周血管疾病。在进一步的实施方案，心血管疾病是缺血性病症，例如心绞痛或和中风。可使用本发明的肽和方法的其它疾病包括治疗血管痉挛，例如手术中或手术后的，以及勃起功能障碍。
本发明可用于治疗其中急性血管舒张可有益的急性病症。
如上所述，本发明人还已经令人惊讶地显示，本发明的肽证实了有效的促血管发生效应。因此本文公开的数据表示本发明的肽在促进新血管生长中的有效作用。
因此，根据本发明的第七方面，提供根据本发明第一方面的促血管发生肽或根据本发明第二方面的多核苷酸在生物样品中促进血管发生的应用。
在本发明上下文中，提到促进血管发生应理解为指引起或加速血管发 生毒性响应(taxic response)或引起或加速血管发生本身，即形成血管。
根据本发明的第八方面，提供刺激细胞中血管发生毒性响应的方法，包括向所述细胞施用根据本发明第一方面的促血管发生肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
培养的内皮细胞中的血管发生毒性响应涉及产生细胞之间棒样突起介导的粘附的位点和细胞定向到血管发生前管中。其可使用显微镜目视地评价。
本发明的方法可在体外或体内实践。在体内实践时，本发明的方法可用在治疗动物或人类的方法。
根据本发明的第九方面，提供促进血管发生的方法，包括向需要其的患者施用治疗有效量的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸的步骤。
促进血管发生可对大量临床病症有用。例如，本发明的促血管发生肽可在缺血性疾病、心肌梗塞期间或之后或在冠状动脉旁路手术之后用于促进心肌组织中侧支脉管系统的血管发生。通过提供本发明的肽可治疗的其它疾病或病症包括导致外周或中枢神经系统病理学的血管疾病和/或缺血性疾病。这种病症/疾病可包括脑血管意外，如凝块闭塞或动脉瘤破裂导致的脑血管意外，或造成神经元死亡或外周功能损伤诸如运动或感觉功能或语言损伤的全身性/局部缺血。因此，在一个实施方案，本发明的肽、方法和应用用于治疗脑血管意外。在另一实施方案，本发明的肽、方法和应用用于治疗可为全身性或局部的缺血性疾病。
而且，本发明的肽的促血管发生特征可用于促进组织修复，例如，创伤愈合。因此，在本发明的第七方面提供本发明的肽在促进组织修复和/或治疗创伤中的应用。
根据本发明的第十方面，提供促进组织修复的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸的步骤。
本发明的肽和方法可用于修复需要其的任何适合组织。例如，肽可用 于修复任何损伤的组织或愈合其中期望血管的血管发生和/或再血管化的任何创伤。例如，在一个实施方案，本发明的肽和方法可用于治疗的创伤包括溃疡，诸如皮肤溃疡，例如压疮、静脉溃疡和糖尿病性溃疡。在另一实施方案，该方法和肽可用于治疗组织外伤。在一个实施方案，组织外伤是创伤诸如撕裂。在另一实施方案，本发明可用于治疗的组织外伤是烧伤。该肽和方法可特别有用于其中移植的组织，例如，皮肤移植物用于修复这种创伤的应用场合。
在血管移植手术中，本发明的肽和方法可用于促进内皮化。当使用移植的或合成的材料的血管移植物被使用时，可向移植物的表面施加该肽以促进血管平滑肌和连接内皮细胞的外膜细胞生长。而且，当天然或合成的材料将被移植到身体中时，本发明的肽可用于包裹该材料以减少和/或最小化移植材料的排斥并刺激移植材料的血管形成。
因此，在第十一方面，本发明提供治疗或预防受治疗者移植排斥的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸的步骤。
这种肽还可用于修复动脉硬化造成的血管损伤或气囊血管成形术造成的损伤。通过促进修复这种组织，可将损伤减到最少并可防止再狭窄。因此在本发明的进一步实施方案，提供治疗受治疗者血管损伤的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸的步骤。
进一步，更通常地，本发明的肽还展示影响细胞生长的效力；例如位于身体表面或内部的细胞。尤其是本发明的肽如QUB 698.8可用于促进皮肤细胞的生长。
因此，本发明还可用于治疗病症诸如烧伤。本发明的肽的该特征还可用于促进移植再血管化并促进手术后、例如美容手术后愈合。
根据本发明的第十二方面，提供包含根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸和药物上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
而且，在第十三方面，提供用于药物的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸在药物。
本发明的第十四方面提供用于治疗心血管疾病的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
本发明的第十五方面提供用于治疗创伤或用于组织修复的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
本发明的第十六方面提供用于预防或抑制移植物排斥(graft rejection)或移植排斥(transplant rejection)的根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸。
本发明的第十七方面提供根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸制备用于治疗心血管疾病的药物。
本发明的第十八方面提供根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸在制备用于治疗创伤或用于组织修复的药物中的应用。
本发明的第十九方面提供根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸在制备用于治疗移植物排斥(graft rejection)或移植排斥(transplant rejection)的药物中的应用。
本发明的第二十方面是包含根据本发明第一方面的肽或根据本发明第二方面的多核苷酸的创伤敷料。
本发明每个方面的优选特征加以必要变更而适用每个其他方面。详述
本发明的肽和用于本发明的肽包括QUB 698.8(SEQ ID NO：2)、其衍生物和片段，尤其是上述的衍生物和片段。本文中术语衍生物与类似物可互换使用。
在一个实施方案，QUB 698.8的″片段″或衍生物或用于本发明的″片段″或衍生物保持QUB 698.8的松弛动脉平滑肌的能力，具有小于其对回肠肌肉的收缩(constrictory)效应的EC50的EC50。
在另一实施方案，QUB 698.8的片段或衍生物保持促进血管发生的能力。这种能力可使用任何已知技术评价，例如使用内皮细胞血管发生小管形成检测、内皮细胞创伤刮擦检测(assay)或MTT检测，例如实施例中所述的。
在一个实施方案本发明的片段或衍生物保持如上定义的动脉平滑肌血管舒张(vasodilatory)能力和促血管发生能力。
本发明的QUB 698.8肽的其它衍生物和用于本发明的QUB 698.8肽的其它衍生物包括多聚肽或融合肽，所述多聚肽或融合肽包括本发明的QUB698.8肽、类似物或片段，和包含这种序列的前药，该肽连接于偶联配偶体，如效应分子、标记、药物、毒素和/或载体或转运分子。将本发明的肽偶联于肽基和非肽基的偶联配偶体的技术是本领域中熟知的。
本发明的衍生物和用于本发明的衍生物进一步包括QUB 698.8肽的反向类似物(reverse-analogue)或向后类似物(retro-analogue)或其合成衍生物。参见例如，EP 0497 366、美国专利第5,519,115号、和Merrifield等人，1995，PNAS，92：3449-53，其公开内容通过引用的方式并入本文。如EP 0497 366所述，通过逆转天然存在肽或合成肽的氨基酸序列而产生反向肽。这种反向肽与母体肽保持相同的总体三维结构(如α螺旋)，除了内部蛋白酶-敏感位点周围的构象和N-和C-末端的特征。据说反向肽不仅保持非反向的″正常″肽的生物活性，还可具有增强的特征，包括生物活性增加。(参见Iwahori等人，1997，Biol.Pharm.Bull.20：267-70)。因此本发明的衍生物和用于本发明的衍生物可包含天然和合成的QUB 698.8肽的反向肽。
事实上，这种反向QUB 698.8肽和其衍生物和片段构成本发明的进一步独立方面。优选地这种反向QUB 698.8肽保持诸如引起细胞和组织内的促血管发生响应的能力和/或选择性地松弛动脉平滑肌的能力等生物活性。
在一个实施方案，本发明的反向肽具有SEQ ID NO.2所示的肽的反向氨基酸序列。
因此，在本发明的一个实施方案，反向肽具有氨基酸序列：
Asn-Ile-Lys-Pro-Leu-Asp(SEQ ID NO：9)
本发明的和用于本发明的肽(包括任一种肽的衍生物、反向肽和片段)可完全或部分地通过化学合成或通过从核酸表达来产生。例如，本发明的肽和用于本发明的肽可容易地根据本领域中已知的完善的标准液相肽合成方法或优选地，固相肽合成方法来制备(参见例如，J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，第2版，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Illinois(1984)、M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，ThePractice of Peptide Synthesis(肽合成的实践)，Springer Verlag，New York(1984))。
多聚肽
如上所述，本发明的肽可以是多聚物形式。因此多聚物(例如2、3或更多单独QUB 698.8类似物单体单元或片段的多聚物)在本发明的范围内。
通过制备包含单体单元和裂解位点(即酶促裂解位点)的多聚肽，并随后裂解多聚物以产生期望单体，这种多聚物可用于制备单体肽。
使用多聚物可增加对受体的结合亲合力。因此，在这种情况，本发明的肽对其受体的结合亲合力可通过使用2-5、例如2-3个受体结合部分的多聚物来增加。
多聚物可为同聚体或异聚体。本文所用的术语同聚体是指仅包含对应SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽或其片段、或本文所述的其它QUB698.8衍生物的多聚物。这些同聚体可包含具有相同或不同氨基酸序列的本发明的促血管发生肽。例如，多聚物可仅包括具有相同氨基酸序列的本发明的促血管发生肽，或可包括促血管发生肽的片段或衍生物。多聚物可为同二聚体(如，包含具有相同或不同氨基酸序列的促血管发生肽)、同三聚体或同四聚体。
本文所用的术语异聚体是指多聚物除了本文所述的QUB 698.8肽、其片段或衍生物，还包含一种或多种异源多肽(即，不是QUB 698.8肽、其片段或衍生物的肽)。
多聚物可为疏水、亲水、离子和/或共价缔合的结果和/或可通过例如形成脂质体间接连接。因此，在一个实施方案，当本文所述的本发明的促血管发生肽在溶液中互相接触时可形成多聚物。在另一实施方案，当本发明的促血管发生肽和不是QUB 698.8肽、其片段或衍生物的肽在溶液中接触针对本文所述的多肽的抗体(包括针对本文所述的融合蛋白中异源多肽序列的抗体)可形成异多聚物。在其它实施方案，通过与本文所述的本发明的促血管发生肽(且任选地不是QUB 698.8肽、其片段或衍生物的肽)共价缔合和/或本文所述的本发明的促血管发生肽(且任选地不是QUB 698.8肽、其片段或衍生物的肽)之间共价缔合，可形成本文所述的多聚物。
这种共价缔合可涉及QUB 698.8序列包含的一个或多个氨基酸残基(如，SEQ ID NO.2中所列的)。在一个实施方案，共价缔合是化学或重组操纵的结果。可选地，这种共价缔合可涉及QUB 698.8融合蛋白中的异源多肽序列包含的一个或多个氨基酸残基。在一个实例中，共价缔合是在本文所述的融合蛋白中包含的异源序列之间(参见例如，美国专利第5,478,925号)。在具体实例，共价缔合是在本文所述的QUB 698.8-Fc融合蛋白中包含的异源序列之间。在另一具体实例，本文所述的融合蛋白的共价缔合是在来自能够形成共价缔合的多聚物的另一蛋白(例如骨保护素(osteoprotegerin))的异源多肽序列之间，(参见例如WO 98/49305)。在另一实施方案，两种或多种本文所述的多肽由肽接头连接。实例包括美国专利第5,073,627号中描述的肽接头。包括多个被肽接头间隔的QUB 698.8肽的蛋白可使用常规重组DNA技术产生。
多聚物还可通过融合本发明的促血管发生肽到亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列而制备。在已知的亮氨酸拉链有天然存在的肽和其二聚或三聚的衍生物。适于产生本文所述的可溶多聚蛋白的亮氨酸拉链域的实例是WO 94/10308中描述的。包括与在溶液中二聚或三聚的多肽序列融合的本文所述多肽的重组融合蛋白可在合适的宿主细胞中表达，且所得的可溶多聚融合蛋白可使用本领域已知技术从培养物上清液回收。
多聚物还可使用本领域已知的化学技术产生。例如，期望包含在本文所述的多聚物中的多肽可使用本领域已知的接头分子和接头分子长度优化技术化学地交联(参见例如，美国专利第5,478,925号)。此外，可使用本领域已知技术产生多聚物以在位于期望包含在多聚物中的多肽的序列中的半胱氨酸残基之间形成一个或多个分子间交联(参见例如，美国专利第5,478,925号)。进一步地，通过向N-末端或C-末端添加半胱氨酸，或向位于本发明的肽的N-末端或Lys残基(例如在SEQ ID NO：2的Lys-4)的侧链的适合氨基基团添加生物素，可常规地修饰本文所述的多肽。可应用本领域已知技术以产生含有一种或多种这些修饰的多肽的多聚物(参见例如，美国专利第5,478,925号)。此外，本领域已知技术可用于制备含有期望包含在多聚物中的两种或多种本发明的肽的脂质体(参见例如，美国专利第5,478,925号)。
可选地，使用本领域已知的遗传工程技术可形成仅包含天然存在的氨基酸的多聚物。可选地，通过重组技术和化学修饰的联合可制备包括翻译后或其它修饰的多聚物。在一个实施方案，使用本文所述的融合蛋白技术或本领域已知的其它技术重组地产生本发明的促血管发生肽(参见例如，美国专利第5,478,925号，其通过引用的方式并入本文)。例如，通过将编码本文所述的本发明的促血管发生肽的多核苷酸序列连接于编码接头多肽的序列，并随后进一步连接于编码从原始C-末端至N-末端的反向定位的多肽翻译产物(缺少前导序列)的合成多核苷酸，可产生编码本文所述的同二聚体的多核苷酸(参见例如，美国专利第5,478,925号)。本文所述的重组技术或本领域已知的其它技术可应用于产生本发明的重组的促血管发生肽，该肽包含跨膜域(或疏水或信号肽)并可通过膜重构技术并入脂质体中(参见例如，美国专利第5,478,925号)。
前药
至少在一些实施方案，本文所述的肽预期施用于人类或其它哺乳动物用于医学治疗。肽通常肠胃外施用，并可容易被质膜蛋白酶代谢。可能是最有吸引力的施用途径的口服施用可能是甚至更有问题的。在胃中，酸降解和酶分解肽。幸存而完整地进入肠的那些肽在持续地被多种酶阻挡时经受另外的蛋白水解，所述酶包括胃和胰腺酶、外肽酶和内肽酶、和刷状缘肽酶。因此，肽从肠腔到血流的穿过可被严格限制。然而，已经开发了使得能够肠胃外和口服施用治疗肽的各种前药。
肽可轭合至各种部分，诸如聚合部分，以修饰肽药物的物理化学特征，例如，以增加对酸降解和酶降解的抵抗并增强这种药物跨粘膜的渗透。例如，Abuchowski和Davis已描述衍生化酶的各种方法以提供水溶的、非免疫原性、体内稳定的产物(″Soluble polymers-Enzyme adducts(水溶性聚合物-酶加合物)，″Enzymes as Drugs(作为药物的酶)，Holcenberg和Roberts编辑，J.Wiley and Sons，New York，N.Y.(1981))。Abuchowski和Davis讨论了轭合酶与聚合材料诸如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸的各种方式。所得的轭合的多肽保持其生物活性和水溶性用于肠胃外应用。美国专利第4,179,337号教导将肽偶联于具有500至20,000道尔顿的分子量的聚乙二醇或聚丙二醇(polypropylene glycol)以提供生理活性的非免疫原性水溶性多肽组合物。聚乙二醇或聚丙二醇保护多肽不失去活性且该组合物可注射到哺乳动物循环系统而基本没有免疫原性响应。
美国专利第5,681,811、5,438,040和5,359,030号公开稳定的、轭合的多肽复合体，其包括偶联于包含亲脂和亲水部分的寡聚物的治疗剂。Garmen等人描述一种蛋白-PEG前药(Garman，A.J.和Kalindjian，S.B.，FEBSLett.，1987，223，361-365)。使用该化学可制备前药，通过首先从多分散的MPEG5000制备马来酸酐反应物并随后将该反应物轭合于本文公开的肽。氨基酸与马来酸酐的反应是熟知的。水解马来酰基-酰胺键以重新形成含胺药物被相邻自由羧基基团的存在所帮助，且攻击的几何学被双键设定。该肽可在生理条件下释放(通过水解前药)。
该肽还可经由可降解的键合偶联于聚合物诸如多分散的PEG，例如经由在Roberts，M.J.等人，Adv.Drug delivery Rev.，2002，54，459-476所示的可降解的键合(关于聚乙二醇化的干扰素α-2b)。
[0088该肽还可连接于聚合物诸如PEG，使用1，6或1，4苄基消除(BE)策略(参见例如，Lee，S.等人，Bioconjugate Chem.，(2001)，12，163-169；Greenwald，R.B.等人，美国专利第6,180,095号，2001；Greenwald，R.B.等人，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667.)；使用三甲基锁内酯化(TML)(Greenwald，R.B.等人，J.Med.Chem.，2000，43，475-487)；偶联PEG羧酸于羟基-末端的羧酸接头(Roberts，M.J.，J.Pharm.Sci.，1998，87(11)，1440-1445)，和包括经由芳基氨基甲酸酯连接于含胺药物的MPEG苯基醚和MPEG苯酰胺家族的PEG前药(Roberts，M.J.等人，Adv.Drug Delivery Rev.，2002，54，459-476)，包括包含氨基甲酸酯和PEG酰胺或醚之间的间位关系的前药结构(美国专利第6,413,507号)；和包括与水解机制相反的还原机制的前药(Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.，1999，10(5)，703-707)。
一些方法包括使用酶抑制剂来减慢胃肠道中蛋白和肽的降解速率；操纵pH以使局部消化酶失活；使用渗透促进剂通过增加其细胞间和跨细胞转运以改善肽的吸收；使用纳米颗粒作为微粒载体以促进被肠道上皮尤其是派伊尔氏淋巴集结完整地吸收，并增加对酶降解的抗性；液态乳化剂以保护药物免受肠腔中化学和酶促的破坏；和对水溶性差的药物的胶束制剂。
在一些情况，该肽可以适合的胶囊或带有肠溶衣的片剂提供，以使该肽不在胃里释放。可选地，或此外，该肽可以前药提供。在一个实施方案，该肽以前药存在于这些药物递送装置中。
该肽的自由氨基、羟基、或羧酸基团可用于将肽转化为前药。前药包括其中氨基酸残基、或两个或多个(如，两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链经由肽键共价连接于各种聚合物例如聚烷撑二醇诸如聚乙二醇的自由氨基、羟基、或羧酸基团的化合物。前药还包括其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通过C-末端羧酸共价结合于上述肽的化合物。
包含本发明的肽的前药或本发明的肽(包括类似物和片段)从其释放或可从其释放的前药被认为是本发明的衍生物。
同位素标记的肽或肽前药也被本发明包括。这种肽或肽前药与本发明的肽或肽前药相同，只是一个或多个原子被具有不同于自然界常见的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子代替。可并入本发明的肽或前药的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别诸如 2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O和35S。本发明的肽、其前药、和/或含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的前药在本发明范围内。本发明的一些同位素标记的化合物，例如其中并入放射活性同位素诸如3H和14C的化合物可用于药物和/或基底组织分布检测。氚化的即3H和碳-14即14C同位素由于其易于制备和检测是特别优选的。进一步地，以较重同位素诸 如氘即2H取代可因为较大的代谢稳定性而提供一些治疗益处，例如增加体内半衰期或减少需要的剂量，并因此在一些情形可为优选的。同位素标记的肽和其前药通常可通过进行易于知道的方案制备，包括以易于获得的同位素标记的反应物(如标记的氨基酸)取代非同位素标记的反应物。
肽模拟物
本发明进一步包括可用作治疗肽的QUB698.8的肽模拟物。模拟QUB698.8肽是模拟QUB 698.8的生物活性的短肽。这种肽模拟物可从本领域已知方法获得，所述方法包括但不限于，噬菌体展示或组合化学反应。例如，Wrighton等人，Science 273：458-463(1996)公开的方法可用于产生模拟QUB 698.8肽。因此，在本发明的一个实施方案，术语衍生物包括这种模拟QUB 698.8肽。
核酸
本发明的肽和用于本发明的肽可通过表达系统中使用核酸而产生。
因此本发明还提供编码本发明的第一方面的肽的分离的多核苷酸。
根据本发明的多核苷酸可以分离物、以分离的和/或纯化的形式提供，或不含或基本不含其天然伴随的材料，诸如不含或基本不含在蟾蜍基因组中基因侧翼的核酸，除了可能用于表达的一种或多种调节序列。核酸可完全或部分地合成并可包括基因组DNA、cDNA或RNA。
本领域技术人员使用本文包含的信息和参考文献以及本领域已知技术可易于制备编码根据本发明的肽的核酸序列。
可对序列进行修饰，如使用定点诱变，以导致表达修饰的肽或以考虑到用于表达该核酸的宿主细胞中的密码子偏好。
在一个实施方案，该核酸包含如下核酸序列：
-GATTTGCCTAAGATCAAC-(SEQ ID NO：10)。
然而，编码本发明第一方面的肽的任何多核苷酸也被本发明包括。例如，由于遗传密码子的简并性，可使用编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的QUB698.8肽但具有不同于SEQ ID NO：10的核酸序列的多核苷酸。
然而，为了避免任何疑虑，在本发明上下文中，编码大蹼铃蟾缓激肽即具有序列ID No：1的氨基酸序列的多核苷酸不被本发明的多核苷酸包括。
本发明的和用于本发明的多核苷酸可包含其序列反映遗传密码子的简并性和其碱基组成将反映核酸类型的DNA或RNA。这些可重组地、合成地、或通过本领域技术人员可得的任何方式产生，包括使用标准技术克隆。多核苷酸可插入任何合适载体。本发明的进一步方面是包含本发明的核酸的这种载体。任何适合的载体可用于本发明。例如，该载体可为病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)、质粒、或粘粒DNA、杆状病毒；酵母载体、噬菌体、或染色体，例如人工染色体。
该核酸可可操作地连接于能够在宿主细胞中提供核酸表达的控制序列。用于本发明的适合的宿主细胞可为真核或原核细胞，并包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可使用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞、猴和人类细胞系和其衍生物、以及许多其它细胞系。
可使用调节基因产物表达、修饰基因产物、和/或具体地加工基因产物的宿主细胞株系。这种加工可包括糖基化、泛素化、形成二硫键和总的翻译后修饰。因此，本发明还提供包含本发明的一种或多种核酸或载体的宿主细胞。
本发明还包括产生本发明的促血管发生肽的方法，该方法包括在发生从多核苷酸表达肽的情况下培养包含本发明的多核苷酸(polynucleotide)的宿主细胞，并任选地分离和/或纯化该肽。
关于操纵核酸的已知技术和方案的进一步细节，例如，制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达、以及分析蛋白，参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，第5版，Ausubel等人编辑，John Wiley&sons，2005，和Molecular Cloning：aLaboratory Manual(分子克隆实验室手册)：第3版Sambrook等人，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001。
施用
本发明的肽和用于本发明的肽可单独施用，但优选地作为药物组合物施用，所述药物组合物将通常包含依据预期施用途径选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体。
肽可以通过任何合适的途径对需要治疗的患者施用。一些合适的施用途径包括(但不限于)口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉、皮内、鞘内和硬膜外)施用。
对于静脉注射或患处注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，它不含热原，具有合适的pH、等渗性和稳定性。使用例如等渗赋形剂，如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液，本领域技术人员能够制备合适的溶液。需要时可以含有防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常含有液体载体，如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可以含有生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液，或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
组合物还可经微球、脂质体、其他微粒递送系统或置于包括血液的某些组织的缓释制剂来施用。缓释载体的适合实例包括分份产品(sharedarticles)形式的半透性聚合物基质，如栓剂或微胶囊。可植入的或微胶囊化的缓释基质包括聚交酯(美国专利第3,773,919号；EP-A-0058481)、L-谷氨酸和γ-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22(1)：547-556，1985)、聚(2-异丁烯酸羟乙酯)或乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277，1981和Langer，Chem.Tech.12：98-105，1982)。含有多肽的脂质体由以下熟知的方法制备：DE3,218,121A；Epstein等人，PNAS USA，82：3688-3692，1985；HWang等人，PNAS USA，77：4030-4034，1980；EP-A-0052522；E-A-0036676；EP-A-0088046；EP-A-0143949；EP-A-0142541；JP-A-83-11808；美国专利第4,485,045和4,544,545号。通常，脂质体是小(约200-800埃)的单层型，其中脂质含量超过约30mol.％胆固醇，调节选择的比例至多肽渗漏的最佳速率。
本发明的肽和多核苷酸可提供在创伤敷料中。任何适合的创伤敷料可用于递送这种肽或多核苷酸。如本领域技术人员熟知的，许多类型的创伤敷料是常规已知的并可与本发明的肽或多核苷酸一起使用。这些可包括但不限于基于水胶体的创伤敷料、基于水凝胶的创伤敷料、基于藻酸盐的创伤敷料、基于泡沫的敷料、或抗菌敷料。
基于水胶体的敷料通常包含结合于半透膜载体或泡沫片的羧甲基纤维素钠、明胶、胶质、弹性体和粘合剂以形成平的、咬合的、粘性敷料。敷料在创伤表面上形成凝胶，从而促进潮湿的创伤愈合。水胶体纤维可以水纤维(hydrofibre)敷料提供，其中纤维接触渗出液后从干燥敷料转变为软的粘结的凝胶片。
基于水凝胶的敷料促进创伤清创并由具有高的水含量的不溶聚合物的基质组成。
基于藻酸盐的创伤敷料包含藻酸钙、任选地带有藻酸钠。接触创伤液后藻酸盐部分地溶解以形成亲水凝胶。它们很适合高度渗出的创伤。
泡沫敷料可包含聚氨基甲酸酯或硅氧烷泡沫。
抗菌敷料可包含抗菌剂，诸如含银或含碘化合物。
使用本领域通常已知的技术，本发明的肽或多核苷酸可用于联合这种敷料和并入这种敷料。
以上提及的技术和方案以及根据本发明可以使用的其它技术和方案的实例参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿氏药学原理和实践)，第21版，Gennaro AR等人编辑，.Lippincott Williams &Wilkins，2005。
通过使用靶向系统诸如抗体或细胞特异性配体，靶向治疗可用于向靶如动脉平滑肌递送活性剂。
剂量
本发明的肽、多核苷酸和/或组合物优选以“治疗有效量”施用于个体，所述治疗有效量足以对个体显示益处。施用的实际量和施用速率和时间进 程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。诸如剂量的确定等治疗处方最终由医师负责和判断，并且通常考虑待治疗的疾患、具体患者的病症、递送部位、施用方法以及医生所知的其他因素。
治疗应用
“治疗”或“疗法”包括可有益于人类或非人类动物的任何方法。所述治疗可以是针对已存在的病症或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以包括治愈、缓解或预防效应。
本发明的肽和方法可用于治疗认为促血管发生分子和/或血管舒张分子有用的任何病症或疾患。如上所述，发现本发明的肽具有有效的促血管发生作用。因此，本发明的肽可用于治疗新血管形成改善或治愈症状的任何病症。这种病症可包括冠状动脉疾病、外周血管疾病、缺血性心脏病、其它器官或器官系统例如外周或中枢神经系统的缺血性疾病、血管狭窄、如四肢的外周血管闭塞、和中风。
本发明还可用于治疗组织选择性缓激肽受体激动剂可有用的任何病症。如上所述，发现本发明的肽具有有效的血管舒张作用。因此，本发明的肽可用于治疗血管舒张改善或治愈症状的任何病症。这种病症可包括高血压、肺动脉高压、冠状动脉疾病、外周血管疾病、缺血性心脏病、其它器官或器官系统的缺血性疾病、血管狭窄、如四肢的外周血管闭塞、和中风。可应用本发明的其它情况包括治疗血管痉挛，例如手术中或手术后的血管痉挛、和勃起功能障碍。
在一个实施方案，本发明的肽的促血管发生效应可在缺血性疾病、心肌梗塞期间或之后或在冠状动脉旁路手术之后用于促进心肌组织中侧支脉管系统的血管发生。
通过提供本发明的肽可治疗的疾病或病症包括导致外周或中枢神经系统病理学的血管疾病和/或缺血性疾病。这种疾病可包括凝块闭塞或动脉瘤破裂导致的脑血管意外，或造成神经元死亡或外周功能损伤诸如运动或感觉功能或语言损伤的全身性/局部缺血。
如本文所述的，本发明的肽将可用于组织修复，例如创伤愈合，尤其是用于再血管化受损组织或在缺血期间和期望新的毛细管血管发生时刺激旁系血流。该肽可用于其中期望血管的血管发生和/或再血管化的任何受损组织的修复或任何创伤的愈合。因此本发明的肽和方法可用于治疗，例如溃疡，诸如皮肤溃疡，例如压疮、静脉溃疡和糖尿病性溃疡、撕裂、烧伤、和其它组织外伤。该肽和方法可特别有用于移植的组织例如皮肤移植物用于修复这种创伤的应用中。
在血管移植手术中，本发明的肽和方法可用于促进内皮化。当使用移植的或合成的材料的血管移植物时，可向移植物的表面施加该肽以促进血管平滑肌和连接内皮细胞的外膜细胞生长。而且，当天然或合成的材料将被移植到身体中时，本发明的肽可用于包裹该材料以减少和/最小化移植材料的排斥并刺激移植材料的血管形成。这种激动剂还可用于修复动脉硬化造成的血管损伤或气囊血管成形术造成的损伤。通过促进修复这种组织，可将损伤减到最少并可防止再狭窄。
可选地，肽可用于促进或加速内部和外部的细胞生长。尤其是该肽可用于促进或加速血管或外周或中枢神经系统的皮肤细胞生长。这可特别有用于促进移植再血管化，例如治疗烧伤时或美容手术后。
本发明进一步延伸至使用编码本发明的肽的核酸的基因治疗方法。
附图简述
本发明现在在下面的非限制性实施例中进一步描述。参照附图，其中：
图1显示QUB 698.8肽对分离的平滑肌制品的相对摩尔效力；图1a显示QUB 698.8肽对大鼠动脉的效应，图1b显示QUB 698.8肽对小肠的效应。
图2a显示QUB 698.8肽对创伤刮擦检测中人类微血管内皮细胞(HMEC-1)迁移的效应。
图2b显示与非处理对照相比，1x10-8M的浓度的QUB 698.8肽对创伤检测中HMEC-1时间依赖性迁移的效应。
图3说明QUB 698.8肽对HMEC-1在基质胶基质上形成小管的能力的效应。
图4说明与非处理对照相比，QUB 698.8肽对HMEC-1的72小时增殖的效应。
实施例
材料和方法
获取皮肤分泌物。
从商业来源获得四只成年大蹼铃蟾样本，并以22℃、12h/12h的光/暗周期圈养在动物饲养所，每周三次喂食带有多种维生素的蟋蟀。在这些条件下，蟾蜍在3年中保持好的健康状态。以两种方法获得防御性皮肤分泌物，且在这两种条件设定下，分泌物主要来自成对的腮腺(parotid)和胫腺。首先，以蒸馏水润湿皮肤表面，随后是各持续10秒的三个周期的经皮电刺激(5V、100Hz、140ms脉冲宽度)(Tyler等人(1992)J.Pharmacol.Toxicol.Lett.28，199-200)。以蒸馏水从背部皮肤洗去皮肤分泌物，快速冷冻于液氮并冻干。第二种和优选的技术包括以戴乳胶手套的手指轻轻按摩背部皮肤表面，发现这种方法在干重分泌物产量方面同等有效。两种技术都对动物不造成伤害和造成最少的刺激。
发现QUB 698.8。
在与人类唾液一起培养2小时的大蹼铃蟾缓激肽的反相HPLC级分中鉴定出QUB 698.8。通过唾液中存在的蛋白酶混合物的组合连续蛋白水解，QUB 698.8从其母体肽大蹼铃蟾缓激肽产生。
平滑肌生物检测
(A)动脉平滑肌：
雄性白化Wistar大鼠(200-350g)通过窒息随后颈脱位使其安乐死。如以前描述的制备尾动脉(Hirst等人(1994)Br.J.Radiol.67，795-799)。培养缓冲液是95％O2/5％CO2充氧的Krebs′溶液(NaCl 118mM、KCl 4.7mM、NaHCO3 25mM、NaH2PO4 1.15mM、CaCl2 2.5mM、MgCl2 1.1mM、葡萄糖5.6mM)。使用连接于MacLab系统(AD Instruments Pty Ltd.Australia)的压力传感器通过水柱代替(displacement)产生的压力增加或减少而检测动脉平滑肌制品的收缩或膨胀。在Macintosh计算机上用图表展示数据。通过使用一定范围的推注去氧肾上腺素(5μM-10μM)接触来确定生存力并以氧气鼓泡10s而除去动脉内皮层。以去氧肾上腺素(10μM)预收缩后缺少响应于30min灌注乙酰胆碱(50μM)的松弛来证实不存在内皮层。
(B)小肠平滑肌：
对于肠平滑肌制品，将1cm厚的回肠环小心地放到MacLab力传感器的别针上，一个别针作为静止的固定点而第二个别针是自由的，允许向平滑肌施加张力。将肌肉环逐渐地接触0.1g的静止张力增量直到来自0.5g静止张力的自发收缩。应用肽之前允许收缩肌肉制品稳定25min。以10μM去氧肾上腺素灌注动脉制品以获得收缩坪后，记录应用范围为1×10-5-1×10-10M的肽后的相对松弛。将肠平滑肌环制品接触如上述的肽剂量，并记录张力的相对变化。
结果
1.向大鼠尾动脉平滑肌制品应用QUB 698.8产生剂量依赖性松弛。与缓激肽和大蹼铃蟾缓激肽相比详细的响应概括于表1A和图1a。在该生物检测中，QUB 698.8与缓激肽几乎效力相当，但比大蹼铃蟾缓激肽更有效。
2.向大鼠回肠平滑肌环制品应用QUB 698.8产生剂量依赖性收缩。与缓激肽和大蹼铃蟾缓激肽相比详细的响应概括于表1A和图1b。在该生物检测中，QUB 698.8比缓激肽和大蹼铃蟾缓激肽较不有效。这些组合的数据显示与回肠平滑肌相比，QUB 698.8引起动脉最大效应的最优浓度低两个数量级。
3.选择性动脉平滑肌扩张剂通常具有促血管发生特征，因此对QUB698.8进行一定范围的适合的生物检测以确定活性谱。
4.在人类微血管内皮细胞创伤刮擦检测中，细胞生长在载玻片上至融合，以移液器的枪头制造标准大小的创伤并测量修复裂口需要的时间。在10纳摩尔的最优效应浓度，QUB 698.8比非处理对照促进创伤闭合快42％。(表1B和图2a和b)。
5.使用体外内皮细胞血管发生小管形成检测(基质胶)，在1纳摩尔的 最优浓度，QUB 698.8比时间匹配的对照引起多75％的小管(表1B和图3)。
6.使用标准MTT检测来监控有效的细胞增殖效应，与非处理对照相比，24h后QUB 698.8导致内皮细胞数目增加70％，尽管48h后无显著差异。(表1B和图4)。这可表示对细胞周期同步化的快速作用。
总之，这些数据表示QUB 698.8以致使该肽成为目前已知的最有效的药剂之一的浓度促进新血管生长的有效作用。结果还表示影响加速创伤闭合中的其它皮肤细胞类型生长的效力。
QUB 698.8、其片段和衍生物将因此在促进血管发生以及表面和内部的组织中创伤和组织修复具有临床效力。
本发明的肽施加其血管发生效应的作用机制可为通过结合受体或可牵涉在实际意义上不是受体的结合位点。不受限于任何一种具体理论，认为由于其与缓激肽受体配体结构完全不相似，该肽的靶不可能是缓激肽受体。其不明显地直接通过细胞骨架修饰来起作用。这将其促血管发生效应与大蹼铃蟾缓激肽的C-末端片段区别开，后者的确经由缓激肽受体起作用。
而且，本文的有效的选择性血管舒张效应支持肽用在其中期望血管舒张的应用中。
本说明书中涉及的所有文件在此通过引用并入。描述的本发明实施方案的各种修饰和改变对于本领域技术人员来说是明显的，不脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合特定优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不恰当地限于这些特定实施方案。实际上，对本领域技术人员明显的所述发明实施方式的各种修饰预期在本发明的范围之内。
表1A)生理筛选
筛选名称 肽活性 ％最大响应 最优浓度 QUB698.8 EC50 MxEC50 Bk EC50
[0167] 大鼠尾动脉 松弛预收缩的动脉 25％松弛 30％松弛 32％松弛 10-7M 10-7M 10-6M 7.00×10-9M 6.18×10-9M 1.18×10-8M 大鼠回肠 收缩自发收缩的回肠 52％收缩 52％收缩 37％收缩 10-5M 10-6M 10-6M 1.44×10-6M 5.34×10-7M 1.18×10-8M
表1B)体外血管发生筛选
筛选名称 肽效应 最优浓度 EC50 ％最大效应 其它信息 迁移创伤 刮擦T＝7 剂量响应 创伤闭合的有 效促进物 10-8M 3.39× 10-10 与时间匹配对 照相比，创伤闭 合增加42％ T＝3小时后 50％创伤闭合 创伤刮擦 至闭合的 总时间 初始内皮迁移 的有效刺激物 10-8M - - 16小时后完全 创伤闭合 内皮细胞 小管形成 检测 内皮小管形成 的有效刺激物 10-9M 5.26× 10-11 与时间匹配对 照相比，小管形 成增加75％ 内皮细胞 增殖检测 内皮细胞增殖 的有效刺激物 10-8M 6.59× 10-11 24小时后细胞 数目增加70％ 24小时后未观 察到增殖进一 步增加
序列表
<110>英国贝尔法斯特女王大学
克里斯多佛.肖
陈天宝
马丁.奥罗克
布莱恩.沃克
大卫.赫斯特
<120>肽、组合物及其应用
<130>P41451.WO.01
<150>GB0704352.4
<151>2007-03-07
<160>10
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)
<400>1
Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser
1 5 10 15
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<210>2
<211>6
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<213>大蹼铃蟾
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<213>大蹼铃蟾
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