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1、10申请公布号CN101935685A43申请公布日20110105CN101935685ACN101935685A21申请号201010287166822申请日20100920C12Q1/0420060171申请人上海成海生物科技有限公司地址200129上海市浦东新区五莲路204号231室72发明人孙战强张舒林孙庆文王洪海刘军74专利代理机构上海三方专利事务所31127代理人吴干权54发明名称一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法57摘要本发明涉及结核病的防控技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法，其特征在于在快速培养基体系下，进行变色快速药敏培养基的研发，选用。
2、无细胞毒性但对结核分枝杆菌有选择性的显色剂，培养基的颜色和菌体数量成量化关系，使用目视，可量化的比色卡，可快速得出药敏结果。这一培养基体系安全、无感染风险、可目视判读药敏结果。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页CN101935685A1/1页21一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法，其特征在于步骤如下A配制快速变色液体培养基，A液组分的百分数KH2PO476，七水MGSO416，柠檬酸镁30，天冬酰胺121，琼脂粉757；B液BOVINEALBUMIN牛血清白蛋白86，DEXTROSE葡萄糖123，CATALASE过氧化氢酶3。
3、7，OLEICACID油酸738，ATP01，辅酶A12，细胞色素丙01，ALFA萘乙酸02；BA液中盐类完全溶解后加入琼脂混匀后110高压20分钟，自然降温至4550；B液完全溶解后022NM过滤，温育至40后迅速加入A液中，完全混匀后尽快分装，制成斜面；C以不添加显色剂的非变色液体培养基和罗氏培养基、BACTECTB460、BACTECTB960为对照，在每种培养系统下绘制菌株随时间变化的生长曲线图；D在快速变色液体培养基上接种背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，测定显色程度和菌体数目的关系，制备比色卡；E以罗氏培养基上的比例法为对照，确定变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度。权利要求书C。
4、N101935685A1/3页3一种结核分枝杆菌快速变色药敏培养基的制备方法技术领域0001本发明涉及结核病的防控技术领域，具体涉及一种杆菌快速变色药敏培养基的制备方法。背景技术0002以BACTECTB460为代表的第一代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，对结核病的快速诊断起到了重要作用。BACTECTB460可显著缩短培养时间和药敏试验时间，同时提高阳性检出率，操作简便、自动化强，还可进行快速菌型鉴定3。但存在液体培养基中污染率高，仪器与试剂价格较贵、有放射性污染，难以全面推广应用等问题4。以BACTECMGIT960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，解决了BACTECTB460。
5、存在的放射性污染问题，并保留了其快速的优点，使结核病细菌学检查方法又有了进一步发展5。BACTECMGIT960的自动化程度虽然更高、操作更为简便，但价格昂贵6。与BACTECMGIT960相似的还有BBLMGIT分枝杆菌快速手工培养、鉴定、药敏检测系统。该法所用培养基同BACTECMGIT960，只是培养和检测需手工操作，结果判断采用小型紫外检测仪或普通紫外灯检测荧光强度，但其操作繁琐，紫外线使用存在对人体伤害的风险7。上述几种分枝杆菌快速培养、药敏检测系统均设有内置定标管，每小时自动进行校正，严格保证检测质量。但是样品的前处理、接种等操作不当，仍将影响检测结果。因此，必须加强质量控制。对于。
6、仪器判断为阳性的样品，仍须进行涂片、抗酸染色、显微镜下找到抗酸杆菌后方能判定阳性。WELSON发明的噬菌体裂解法检测结核分枝杆菌具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、安全等优点，并且检测出的是活菌分枝杆菌8。但是噬菌体裂解法为间接判断法，由于培养环境的不同，噬菌斑的大小受培养环境的影响，结果判读不易标准化。液体变色培养基最先由德国HEIPHA/BIOTEST公司研制，称为MBREDOX系统9。其检测原理是液体变色培养基中含有氧化还原显示器，为一种无色四唑鎓TETRAZOLIUM盐，当分枝杆菌在液体变色培养基中生长时，通过氧化还原系统，使培养基中的无色四唑鎓盐还原成粉红色、红色或紫色臢。由于甲臢不。
7、溶于水，以颗粒形式分泌至细胞表面，这样分枝杆菌菌落就变成了用肉眼可以观察到的红或紫色，此时取培养液涂片，染色镜检。目前国内已有学者在此基础上研发出此类培养基10。此类方法多以甲臢为显色剂，由于其水不溶性，而滞留于菌体表面，易造成负反馈，不利于再增殖；另外也无菌种选择性，特别是与分枝杆菌生长周期接近的菌类。发明内容0003本发明的目的在于克服现有技术的不足，研制出液体变色培养系统结合判读卡，有操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、无需特殊仪器、便于推广等优势的培养基。为结核病的防控提供一种简单、快速、廉价的诊断方法。0004本发明是通过以下技术方案实现的0005本发明包括以下步骤说明书CN。
8、101935685A2/3页40006使用背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，以快速培养系统培养基为基础，添加显色剂，从生长速度、标记物检测、细胞形态三个方面观察显色剂对结核分枝杆菌的影响；0007使用背景清晰的临床分离到的病原细菌，病原真菌，以快速培养系统培养基为基础，观察显色剂对这些菌株的影响；0008配制快速变色液体培养基，A液组分的百分数KH2PO476，七水MGSO416，柠檬酸镁30，天冬酰胺121，琼脂粉757；B液BOVINEALBUMIN牛血清白蛋白86，DEXTROSE葡萄糖123，CATALASE过氧化氢酶37，OLEICACID油酸738，ATP01，辅酶A12，细胞色。
9、素丙01，ALFA萘乙酸02；A液中盐类完全溶解后加入琼脂混匀后110高压20分钟，自然降温至4550；B液完全溶解后022NM过滤，温育至40后迅速加入A液中，完全混匀后尽快分装，制成斜面，以不添加显色剂的非变色液体培养基和罗氏培养基、BACTECTB460、BACTECTB960为对照，在每种培养系统下绘制菌株随时间变化的生长曲线图；0009在快速变色液体培养基上接种背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，测定显色程度和菌体数目的关系，制备比色卡；0010以罗氏培养基上的比例法为对照，确定变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度。0011所述的病原细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。0012所述的病原。
10、真菌为白色念珠菌、毛霉菌。0013所述的抗结核药物为一线、二线抗结核药物、菌型鉴定药物。0014本发明与现有技术相比，具有操作简单、易控制等特点，选用无细胞毒性但对结核分枝杆菌有选择性的显色剂，培养基的颜色和菌体数量成量化关系，使用目视，可量化的比色卡，可快速得出药敏结果。这一培养基体系安全、无感染风险、可目视判读药敏结果。附图说明0015图1为本发明的流程示意图；0016图2为本发明的变色剂对结核分枝杆菌生长影响图；0017图3为本发明的变色剂对结核分枝杆菌生长影响图；0018图4为本发明的菌株在不同培养系统下随时间生长变化图0019图5为本发明的变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度图表指定。
11、图1为摘要附图；具体实施方式0020下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。0021本发明包括以下步骤0022使用背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，以快速培养系统培养基为基础，添加显色剂，从生长速度、标记物检测、细胞形态三个方面观察显色剂对结核分枝杆菌的影响；参见图20023使用背景清晰的临床分离到的病原细菌，病原真菌，以快速培养系统培养基为基说明书CN101935685A3/3页5础，观察显色剂对这些菌株的影响；参见图30024配制快速变色液体培养基0025配方A液KH2PO4，MGSO4，柠檬酸镁，柠檬酸铁铵，天冬酰胺，琼脂粉0026B液BOVINEALBUMIN牛血清白蛋白，DEXTR。
12、OSE葡萄糖，CATALASE过氧化氢酶，OLEICACID油酸，ATP，辅酶A，细胞色素丙，ALFA萘乙酸0027制作方法A液中盐类完全溶解后加入琼脂混匀后110高压20分钟，自然降温至4550；B液完全溶解后022NM过滤，温育至40后迅速加入A液中，完全混匀后尽快分装，制成斜面。0028以不添加显色剂的非变色液体培养基和罗氏培养基、BACTECTB460、BACTECTB960为对照，在每种培养系统下绘制菌株随时间变化的生长曲线图；参见图40029在快速变色液体培养基上接种背景清晰的临床分离到的结核分枝杆菌，测定显色程度和菌体数目的关系，制备比色卡；0030以罗氏培养基上的比例法为对照，确定变色快速液体培养基中抗结核药物的浓度。参见图5说明书CN101935685A1/3页6图1说明书附图CN101935685A2/3页7图2图3说明书附图CN101935685A3/3页8图4图5说明书附图。