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1、10申请公布号CN101955934A43申请公布日20110126CN101955934ACN101955934A21申请号201010518245522申请日20101025C12N15/11200601C12Q1/6820060171申请人浙江省淡水水产研究所地址313001浙江省湖州市杭长桥南路999号72发明人朱俊杰练青平张爱菊原居林刘金殿74专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人张中南54发明名称花鱼骨微卫星位点及引物57摘要一种花鱼骨微卫星位点及多态性引物，其特征在于微卫星位点的核苷酸序列为SEQIDNO110，微卫星引物的序列为SEQIDNO1130。本发明。
2、从花鱼骨基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，所获引物的扩增结果具有高的多态性和稳定性，可用于花鱼骨的种群遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种领域。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN101955934A1/1页21花鱼骨微卫星位点，其特征在于1微卫星位点的核苷酸序列为SEQIDNO110；2是在严格条件下与1中的核苷酸杂交的微卫星位点。2花鱼骨微卫星引物，其特征在于，微卫星引物是在权利要求1所述的微卫星位点的侧翼序列上设计的，设计参数为1引物长度为1540BP；2GC含量3070。
3、；3退火温度4065；4预期PCR产物长度为80350BP。3如权利要求2所述的花鱼骨微卫星引物，其特征在于上述的微卫星引物序列为SEQIDNO1130。4权利要求2或3所述花鱼骨微卫星引物用于花鱼骨种群遗传多样性检测。5如权利要求4所述的花鱼骨种群遗传多样性检测，包括如下步骤1基因组DNA的提取采用酚抽提法提取花鱼骨基因组DNA；2微卫星PCR扩增用FAM、HEX和TMR荧光标记的微卫星引物扩增基因组DNA，获得花鱼骨个体微卫星扩增产物；3扩增产物电泳在ABI3100自动测序仪上检测，用ROX500作为分子量内标，个体微卫星扩增产物用软件GENEMAPPER32来分析分子量大小；4遗传多样性。
4、分析根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENEPOPVERSION34计算遗传多样性参数。权利要求书CN101955934A1/5页3花鱼骨微卫星位点及引物技术领域0001本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及花鱼骨微卫星位点及引物。背景技术0002花鱼骨HEMIBARBUSMACULATES，隶属鲤科、鮈亚科、鱼骨鱼属，广泛分布于我国江河湖泊中，是天然水体中一种常见的中小型野生经济鱼类。但过去的十几年中，由于过度捕捞、筑坝挖沙以及水体污染，花鱼骨的野生资源已被严重的破坏。为了满足市场的需求，已经对花鱼骨进行了大规模的人工养殖，但目前的苗种没有经过人工选育，存在着。
5、生长速率低、抗病性差等现象，因此，获得优良的养殖品种已经成为我国花鱼骨养殖产业健康、可持续发展急待解决的重要课题之一。0003家系选育是获得优良品种的重要手段之一，家系选育过程中，保持完整、准确的系谱信息才可以有效指导亲本选留，从而避免近交衰退现象。在良种培育中，为了实现家系遗传参数的准确评估，需要早期对选育品系进行标记。而采用物理标记对幼体进行标识存在较大的局限性，如标记存续时间短，成本高、工作量大，幼体达到标记大小才能标记，无法完全消除环境误差等问题。因此，选用有效的分子标记，进行高通量的亲子鉴定和家系管理已成为花鱼骨养殖业亟待解决的问题。发明内容0004本发明的目的是提供花鱼骨微卫星位点。
6、及多态性引物，即提供10个花鱼骨的微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为花鱼骨的遗传选育提供可用于种群、家系鉴定的分子标记，以弥补现有技术的不足。0005本发明通过磁珠杂交法从花鱼骨基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，其核苷酸序列分别是SEQIDNO110。0006微卫星序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重复单位的核苷酸序列分子。0007本发明的微卫星引物是从序列SEQIDNO110的微卫星重复的侧翼序列上设计的正向、反向引物。0008微卫星引物序列分别为SEQIDNO1130。0009微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表10010表110个微卫星位点及对。
7、应引物信息0011说明书CN101955934A2/5页400120013本发明的微卫星多态性引物用于花鱼骨种群遗传多样性检测，包括如下步骤00141基因组DNA的提取采用酚抽提法提取花鱼骨基因组DNA；00152微卫星PCR扩增用FMM、HEX和TMR荧光标记的微卫星引物扩增花鱼骨基因0016组DNA；获得花鱼骨个体微卫星扩增产物；00173扩增产物电泳在MBI3100自动测序仪上检测，用ROX500作为分子量内标，个体微卫星扩增产物用软件GENEMMPPER32来分析分子量大小；00184遗传多样性分析根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENEPOPVERSION34计。
8、算遗传多样性参数；0019上述的微卫星引物选自序列分别为SEQIDNO1130的微卫星引物。0020本发明从花鱼骨基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获引物的扩增结果具有高的多态性和稳定性，可用于花鱼骨的种群遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种领域。具体实施方式0021一、微卫星位点的筛选00221、基因组DNA提取、酶切及回收0023用酚抽提法提取花鱼骨基因组DNA每个个体称取100MG肌肉，用无菌水清洗两次后，剪碎后加入10MMTRISHCLPH80，20MMEDTAPH80，10MMNACL，1SDS，100G/MLPR。
9、OTEINASEK的裂解液600L，在55消化肌肉后，12000RPM离心10MIN，取上清到新的15ML离心管中，加入比例为25241的酚、氯仿和异戊醇并抽提两次，比例为241氯仿和异戊醇抽提一次后，水相转移到新管中加入20的无水乙醇，12，000RPM离心10MIN，75乙醇清洗沉淀两次，室温下晾干，溶于100L01TE中。00242、酶切、回收及接头连接0025取100G基因组DNA，用限制性内切酶SAU3AI部分酶切，使酶切片段大部分在250750BP，有机抽提法终止反应，无水乙醇沉淀回收，溶于200ML01TE中。将酶切的片段同BROWN接头5GTCAAGAATTCGGTACCGTC。
10、GAC3连接，16连接过夜，在6510MIN说明书CN101955934A3/5页5终止反应，并再次切胶回收。00263、微卫星序列分离和PCR扩增0027将接头连接的酶切基因组DNA片段和生物素标记的CA15探针进行杂交。50L杂交液中包括15L回收的DNA片段，3L10PMOL/LCA15探针，15L20SSC，05L10SDS和175L10PMOL/LDDW。混合均匀后，杂交液在95处理10MIN后，在60杂交1H。期间将100L磁珠DYNALA280清洗后重悬浮于50L杂交液中6SSC，01SDS。杂交结束后，将杂交反应液同磁珠混合，室温下振荡30MIN。然后在室温下用6SSC/01S。
11、DS清洗两次，43下6SSC/01SDS清洗两次，最后两次室温下6SSC清洗。用50LDDW悬浮磁珠，95处理5MIN后在磁柱上快速移出洗脱液，作为分离DNA模板。0028PCR反应体系25L，包含有5L洗脱的DNA模板和10PMOL的PRIMEROLIGOA，反应程序是94变性5MIN后，20个循环94变性30S，退火6030S，72延伸1MIN，最后72延伸7MIN。扩增产物出现在5001000BP范围内，割胶回收。00294、DNA片段克隆、测序0030割胶回收的目的DNA片段插入PGEMT载体后转化感受态大肠杆菌DH5。转化的细菌37摇床培养1H后涂布到添加IPTG0024MG/ML和。
12、XGAL004MG/ML的氨苄青霉素01MG/MLLB平板上，37培养过夜。挑选单个菌落到盛有500LLB/AMP培养基的96孔培养板中后，200R/MIN，37培养7H后，测序确定微卫星位点。0031本发明筛选出的10个微卫星位点，其DNA序列分别是SEQIDNOS110，表2中列出10个微卫星位点的微卫星重复单位等信息。0032二、在严格条件下与上述的DNA序列杂交的，包含相同微卫星重复单位的DNA序列0033本发明微卫星序列还包括在严格条件下与上述的序列为SEQIDNOS110的DNA序列分别能杂交的，包含相同微卫星重复单位的DNA序列分子；因为微卫星位点的重复单位可以有不同的重复次数，。
13、从而导致微卫星重复长度发生变化，这也是微卫星位点多态性产生的原因。另外，发生在微卫星重复侧翼序列的插入、缺失、转换和颠换而产生的差异序列，在严格条件下与上述的序列为SEQIDNO110的DNA序列分别能杂交的序列，也是本发明要保护的花鱼骨微卫星位点。0034上述的严格杂交条件如下，应用DIG杂交方法00351将1015MLHYB高效杂交液加入装有膜的杂交管或杂交袋中，68预杂交12小时，弃去预杂交液；00362将400NGDIG标记的探针在95变性5分钟，然后快速在冰浴中冷却5分钟；探针序列为SEQIDNO110；00373将探针加到1015ML68预热的HYB高效杂交液中，混匀，加入杂交管或。
14、杂交袋中，68杂交过夜；00384倒去杂交液，进行洗膜；00395洗膜0040A在室温下，用30ML2XSSC/01SDS洗涤2次，每次5分钟，0041B接下来在65，用1XSSC/01SDS洗涤2次，每次15分钟。0042洗膜结束后，按DIG杂交方法检测杂交结果。说明书CN101955934A4/5页60043能够与本发明分离的微卫星杂交的DNA序列，例如，与位点HMAC1的侧翼序列相同，但微卫星重复单位GTN的重复次数N为13的HMAC1V1的DNA，其序列为SEQIDNO31。或是与其他的微卫星位点的侧翼序列相同，但重复单位的重复次数不同的序列，还包括微卫星重复相同，但侧翼序列不同的DN。
15、A分子，例如序列为SEQIDNO32的HMAC2V1，同SEQIDNO2相比，只是5端的几个碱基发生了变化。0044三、微卫星引物0045本发明的微卫星引物是从微卫星重复序列两端的侧翼序列设计的，应用本发明的引物可以扩增出在上述严格条件下能杂交到序列为SEQIDNO110的DNA上的PCR产物。引物设计采用软件PRIMERPREMIER50，引物设计采用以下严谨度1引物长度为1540BP；2GC含量3070；3退火温度4065；4预期PCR产物长度为80350BP。设计的引物可在如上的严格条件下相对应的杂交到序列为SEQIDNO110的DNA上。0046本发明的微卫星多态性引物，其序列分别为S。
16、EQIDNO1130。0047四、花鱼骨种群遗传多样性检测00481基因组DNA的提取采用酚抽提法提取30个个体的花鱼骨基因组DNA；00492微卫星PCR扩增0050用FMM、HEX和TMR荧光标记的微卫星引物扩增花鱼骨基因组DNA；0051反应体系为25L，包括10PCRBUFFER25L、25MMMGCL220L、10MMDNTPS05L、10PMOL/L上下游引物各1L，5U/LTAQDNA聚合酶02L，基因组DNA1L1020NG。PCR反应程序为94变性5MIN，接下来94变性30S，引物特定的退火温度30S，72延伸45S，进行30个循环反应，最后72延伸7MIN。00523扩增。
17、产物电泳在MBI3100自动测序仪上检测，用ROX500作为分子量内标，个体微卫星扩增产物用软件GENEMMPPER32来分析分子量大小；00534遗传多样性分析根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，把基因型数据转换成GENEPOPVERSION34可以识别的0、1数据后，利用GENEPOPVERSION34计算遗传多样性参数；参数信息如表2。0054表210个微卫星位点的重复单位、引物的相关信息00550056说明书CN101955934A5/5页70057其中，TM代表微卫星引物的退火温度，N代表等位基因数目，HO代表观察杂合度，HE代表期望杂合度0058用本发明的引物对30个花鱼骨基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从6到18个不等，平均等位基因数目为107个。观察杂合度HO的范围从05873到08750，期望杂合度HE的范围从07451到09379。0059本发明的微卫星引物可用于花鱼骨种群遗传多样性检测、数量性状连锁作图QTL、遗传连锁作图以及家系、个体的鉴定。说明书。